一种快速分离小菜蛾幼虫完整肠道的方法与流程

本发明涉及节肢动物解剖学领域技术领域，尤其涉及一种快速分离小菜蛾幼虫完整肠道的方法。

背景技术：

小菜蛾属于节肢动物门昆虫纲鳞翅目绢丝昆虫，初孵化的幼虫为深褐色，随后变为绿色。末龄幼虫呈纺锤形，体节明显，表皮上长有黑色的刚毛。其腹部内有脂肪体，丝腺，中场，马氏管等组织。

小菜蛾幼虫是十字花科植物的害虫，分布广泛，对农业生产危害巨大，以其肠道为研究材料，对十字花科农作物的虫害防治及新型生物农药的开发具有重要意义。

小菜蛾幼虫解剖是研究其内部结构的重要技术，是进行小菜蛾幼虫肠道与其生理生化反应和生长发育之间联系的前提基础。然而小菜蛾幼虫体型较小，末龄幼虫的体长约为10-12mm，由于其肠道细长且脆弱，常规体表解剖法极易对其肠道造成机械损伤，造成肠道内容物外泄，污染体内其他组织，并且浪费大量时间，而长时间的解剖操作会造成样品组织材料的降解。

经过检索国内外现有文献，目前尚未有快速分离小菜蛾幼虫肠道的方法报道。

技术实现要素：

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种快速分离小菜蛾幼虫完整肠道的方法，该方法能在短时间内获得完整的小菜蛾幼虫肠道，避免了常规解剖造成的机械损伤，减少了实验材料的污染和浪费，为后续肠道组织特异性和肠道微生物分析等研究提供了良好的基础实验材料。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

一种快速分离小菜蛾幼虫完整肠道的方法，包括以下步骤：

步骤s1：将待解剖的小菜蛾幼虫致死后进行体表消毒；

步骤s2：将经步骤s1处理后的小菜蛾幼虫浸入解剖操作液中，并使其在解剖操作液中充分舒展开；

步骤s3：利用昆虫解剖镊夹住小菜蛾幼虫的口器部分，利用昆虫解剖刀在其尾部1.8-2.2mm处隔开一个直径为0.5-1mm的小口，露出黄绿色肠道；

步骤s4：用昆虫解剖刀背部钝面按压尾部表皮，并沿着昆虫身体轴线方向，轻轻快速拖拽出整个小菜蛾幼虫肠道，获得尾部沾有部分表皮和大量呈黄色线状组织的马氏管的肠道；

步骤s5：利用昆虫解剖刀，将步骤s4获得的肠道尾部的部分表皮与中肠切开，使用昆虫解剖镊将肠道尾部的马氏管摘除，获得完整的小菜蛾肠道，完整的小菜蛾肠道呈透明或浅绿色。

进一步优选地，所述步骤s1的致死方法包括：冷冻致死和乙醚毒杀。

进一步优选地，所述步骤s1的体表消毒方法包括：用含有75％质量比酒精的脱脂棉擦拭小菜蛾幼虫体表4-10次。

进一步优选地，所述步骤s2的使小菜蛾幼虫在解剖操作液中充分舒展开的方法包括：利用美工勾线笔的软毛刷抚刷小菜蛾幼虫表面，至小菜蛾幼虫充分舒展。

进一步优选地，所述解剖操作液为昆虫生理盐水或1×pbs(ph7.4)缓冲液。

与现有技术相比，本发明涉及的小菜蛾幼虫肠道解剖方法具有如下优点：在不破坏小菜蛾表皮和其他组织的情况下，以其尾部为突破口，并寻找着力点，快速抽拽出小菜蛾幼虫完整的肠道组织，能够最大限度保证幼虫肠道的完整性，避免机械损伤造成肠道内容物外泄和体内其他组织的污染。与传统解剖手段相比，整个解剖过程只需30-60s，大幅度缩短了解剖时间，且能减少材料的污染和浪费，避免组织的降解，为后续肠道组织特异性和肠道微生物分析等研究提供了良好的基础实验材料。

附图说明

图1为采用本发明方法解剖流程图；

图2为按照本发明解剖顺序得到的小菜蛾幼虫完整肠道实验结果图；其中图2a为步骤s1固定小菜蛾幼虫，图2b-2c为分离小菜蛾幼虫的肠道过程图，图2d为分离后的小菜蛾幼虫肠道和其余组织图，图2e为小菜蛾完整肠道图；

图3为常规体表解剖法解剖过程及结果图；其中图3a为解剖过程图，图3b为解剖结果图。

具体实施方式

下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。

本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为常规或市售产品。

实施例1

材料和试剂：无菌培养皿，75％酒精，解剖操作液。本实施例中，解剖操作液选用昆虫生理盐水，也可以用1×pbs(ph7.4)缓冲液代替。

仪器和工具：体式显微镜，微小昆虫解剖刀，微小昆虫解剖镊，美工勾线软毛笔。

具体包括以下步骤：

步骤s1：取小菜蛾5日龄幼虫，在通风橱中，将其置于含有乙醚的密封瓶内进行毒杀(或冷冻致死)，然后用含有75％质量比酒精的脱脂棉擦拭幼虫体表4-10次，进行体表消毒；

步骤s2：将经步骤s1处理后的小菜蛾幼虫浸入解剖操作液中，利用美工勾线笔的软毛刷抚刷小菜蛾幼虫表面，使小菜蛾幼虫在解剖操作液中充分舒展开；

步骤s3：在体式显微镜下，利用微小昆虫解剖镊夹住小菜蛾幼虫的口器部分，利用微小昆虫解剖刀在其尾部约2mm处隔开一个直径为0.5-1mm的小口，露出黄绿色肠道，如图2a；

步骤s4：用昆虫解剖刀背部钝面按压尾部表皮，并沿着昆虫身体轴线方向，轻轻快速拖拽出整个小菜蛾幼虫肠道，获得尾部沾有部分表皮和大量呈黄色线状组织的马氏管的肠道，如图2b-2d；

步骤s5：利用昆虫解剖刀，将步骤s4获得的肠道尾部的部分表皮与中肠切开，使用昆虫解剖镊将肠道尾部的马氏管摘除，获得完整的小菜蛾肠道，完整的小菜蛾肠道呈透明或浅绿色，如图2e。

步骤s6：将摘除多余组织后的肠道用美工勾线软毛笔轻轻挑起放入盛有干净解剖操作液的ep管中；

以上便得到了完整的小菜蛾幼虫肠道，整个过程耗时30-60s。

对比例1

材料和试剂：无菌培养皿，75％酒精，解剖操作液，所述解剖操作液同实施例1，也选用昆虫生理盐水。

仪器和工具：体式显微镜，微小昆虫解剖刀，微小昆虫解剖镊，美工勾线软毛笔。

具体包括以下步骤：

步骤s1：取小菜蛾5日龄幼虫，在通风橱中，将其置于含有乙醚的密封瓶内进行毒杀，然后用含有75％质量比酒精的脱脂棉擦拭幼虫体表4-10次，进行体表消毒；

步骤s2：在体式显微镜下，使用微小昆虫解剖刀从小菜蛾背部或腹部划开，露出脂肪体和丝腺包裹的中肠；

步骤s3：使用昆虫镊剖捏拨开丝腺和脂肪体，如图3b所示，由于中肠较为脆弱，在体式显微镜下清晰可见肠道表面破损，内容物外泄；

整个解剖过程耗时5min。

实施例1与对比例1相比，可以看出，本发明的解剖方法能够在不破坏小菜蛾幼虫表皮的情况下，最大限度保证幼虫肠道的完整性，避免了机械损伤造成的肠道内容物外泄和体内其他组织的污染。并且本发明的操作时间相比较传统解剖方法大大缩短。因此无论在操作时间上、还是保持肠道标本完整性的结果上来看，本发明的解剖方法都具有明显优势。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。