一种纳米凝胶、其制备方法和抗肿瘤载药纳米凝胶与流程
本发明涉及高分子药物载体技术领域，特别涉及一种纳米凝胶、其制备方法和抗肿瘤载药纳米凝胶。
背景技术：
恶性肿瘤正在成为威胁人类健康的最严重疾病之一。肿瘤组织与正常组织的区别在于其微环境的ph值低，而肿瘤细胞内环境表现为低氧、低糖、低ph值和高谷胱甘肽浓度。
目前，临床上常用的癌症治疗手段有化疗、放疗和手术治疗等。其中，手术治疗是早期癌症的首选治疗方法。手术治疗癌症是对癌症组织进行全部或局部的切除，作用效果直接迅速。但手术无法做到彻底清除癌细胞，不能消灭微小病灶，且对于已经发生转移的癌症患者仅能做姑息性的局部切除。另外，由于手术给机体带来的损伤，会使患者的免疫力降低，术后容易出现一系列并发症。
放射治疗是用各种不同能量的射线照射肿瘤，以抑制和杀灭癌细胞。它主要是通过放射线使癌细胞核内的核糖核酸长链遭受致命性的破坏，最后致其死亡。但是，放疗不能杀死所有的癌细胞，并且会降低人体免疫力，对于癌症已经转移、扩散的患者，只能够起到姑息性治疗的作用。
相比之下，化学治疗是肿瘤治疗最常用的治疗途径。化学治疗是利用化学药物阻止癌细胞的增殖、浸润、转移，直至最终杀灭癌细胞的一种治疗方式。抗癌药物进入体内后很快分布到全身，既可杀灭局部的肿瘤也可杀灭远处转移的肿瘤。对于一些有全身播散倾向的肿瘤以及中晚期肿瘤，化学治疗是主要的、也是唯一可选择的治疗方法。
但是，临床上化学治疗所用的抗肿瘤药物在杀伤癌细胞的同时，也对正常组织细胞无选择性杀伤，因此，药物毒副作用大，并且，抗肿瘤药物在应用过程中存在水溶性及稳定性差，生物相容性差等缺陷，从而限制了肿瘤药物在治疗癌症中的应用。为了解决这些问题，可将药物与药物载体结合，以改善药物的水溶性和稳定性，并达到对药物的控制释放，从而减小药物对正常组织的毒副作用，充分发挥药物的功效。而为了提高治疗效果，对载药体系也逐渐提出更高要求，载药体系需对肿瘤部位具有较高的粘附渗透性以及响应敏感性，以便使载药体系在肿瘤部位靶向富集并易于被肿瘤细胞内吞且及时释放药物。因此，开发满足上述需求的载药体系具有重要意义。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种纳米凝胶、其制备方法和抗肿瘤载药纳米凝胶。本发明提供的纳米凝胶作为药物载体，能够提高抗肿瘤药物的黏附渗透性，有利于抗肿瘤药物在肿瘤部位靶向富集并易于被肿瘤细胞内吞，而且，其还具有还原敏感性，在肿瘤细胞内的高谷胱甘肽浓度下能够迅速释放抗肿瘤药物，增强肿瘤杀伤作用的同时降低毒副作用。
本发明提供了一种纳米凝胶，具有式(ⅰ)所示结构：
其中，m、x、y、n为聚合度，40≤m≤120，1≤x≤50，1≤y≤50，1≤n≤50；
cpps为末端为半光氨酸的细胞膜穿透肽修饰基。
优选的，所述末端为半光氨酸的细胞膜穿透肽选自r9、mlt、tat、arg7、vp22、map、pep-1、p22n或dpv3。
本发明还提供了一种上述技术方案中所述的纳米凝胶的制备方法，包括以下步骤：
a)在引发剂的作用下，将氨基化烯丙基聚乙二醇与2-(boc-氨基)乙硫醇在第一有机溶剂中反应，形成叔丁氧羰基-聚乙二醇-氨基化合物；
b)将所述叔丁氧羰基-聚乙二醇-氨基化合物与l-胱氨酸-n-环内酸酐及l-苯丙氨酸-n-环内酸酐在第二有机溶剂中反应，形成叔丁氧羰基-亚胺基-聚乙二醇-聚(l-苯丙氨酸-co-l-胱氨酸)；
c)在酸性条件下，将所述叔丁氧羰基-亚胺基-聚乙二醇-聚(l-苯丙氨酸-co-l-胱氨酸)在第三有机溶剂中进行脱除叔丁氧羰基的反应，形成式(ⅶ)化合物；
d)将所述式(ⅶ)化合物溶解于第四有机溶剂中，与3-马来酰亚胺基丙酸的水溶液混合反应，形成式(ⅷ)化合物；
e)将所述式(ⅷ)化合物与末端为半光氨酸的细胞膜穿透肽在第五有机溶剂中反应，形成式(ⅰ)所示的纳米凝胶；
其中，m、x、y、n为聚合度，40≤m≤120，1≤x≤50，1≤y≤50，1≤n≤50；
cpps为末端为半光氨酸的细胞膜穿透肽修饰基。
优选的，所述步骤a)中：
所述氨基化烯丙基聚乙二醇与2-(boc-氨基)乙硫醇的摩尔比为1：(5～50)；
所述引发剂包括偶氮二异丁腈和/或苯偶酰双甲醚；
所述引发剂与氨基化烯丙基聚乙二醇的摩尔比为1∶(1～10)；
所述反应的温度为15～50℃；
所述反应的时间为2～7天。
优选的，所述步骤b)中：
所述l-胱氨酸-n-环内酸酐与步骤a)中氨基化烯丙基聚乙二醇的摩尔比为(5～20)∶1；
所述l-苯丙氨酸-n-环内酸酐步骤a)中氨基化烯丙基聚乙二醇的摩尔比为(5～20)∶1；
所述反应的温度为15～50℃；
所述反应的时间为2～7天。
优选的，所述步骤c)中：
所述酸性条件由溴化氢溶于酸液中形成的酸性溶液提供；所述溴化氢与酸液的体积比为(0.5～5)：1；
所述第三有机溶剂为含氟乙酸，或为含氟乙酸与二氯甲烷的混合物；所述含氟乙酸为三氟乙酸和/或二氟乙酸；
所述酸性溶液与第三有机溶剂的体积比为(1～3)：(10～20)；
所述反应的温度为20～50℃；
所述反应的时间为0.5～4h。
优选的，所述步骤d)中：
所述式(ⅶ)化合物与3-马来酰亚胺基丙酸的摩尔比为1：(5～50)；
所述反应的温度为15～50℃；
所述反应的时间为2～7天；
所述反应在缩合剂和稳定剂的作用下进行；
所述缩合剂包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、二环己基碳二亚胺和二异丙基碳二亚胺中的一种或几种；
所述稳定剂包括n-羟基琥珀酰亚胺和o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯中的一种或几种。
优选的，所述步骤e)中：
所述式(ⅷ)化合物与细胞膜穿透肽的摩尔比为1：(2～20)；
所述反应的温度为15～50℃；
所述反应的时间为2～7天。
优选的，所述步骤a)中：
所述第一溶剂包括n,n-二甲基甲酰胺、二氧六环和氯仿中的一种或几种；
所述氨基化烯丙基聚乙二醇与第一有机溶剂的用量比为1g：(1～20)ml；
所述反应在惰性气体条件下进行；
所述步骤b)中：
所述第二溶剂包括n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺和三氯甲烷中的一种或几种；
步骤a)所得叔丁氧羰基-聚乙二醇-氨基化合物与第二有机溶剂的用量比为1g：(1～20)ml；
所述反应在惰性气体条件下进行；
所述步骤c)中：
所述第三有机溶剂与叔丁氧羰基-亚胺基-聚乙二醇-聚(l-苯丙氨酸-co-l-胱氨酸)的用量比为(8～12)ml：1g；
所述步骤d)中：
所述第四有机溶剂包括n,n-二甲基甲酰胺、二氧六环和氯仿中的一种或几种；
所述式(ⅶ)化合物与第四有机溶剂的用量比为1g：(1～20)ml；
所述步骤e)中：
所述第五溶剂包括n,n-二甲基甲酰胺、二氧六环和氯仿中的一种或几种；
所述式(ⅷ)化合物与第五有机溶剂的用量比为1g：(1～20)ml。
本发明还提供了一种抗肿瘤载药纳米凝胶，包括纳米凝胶和负载于所述纳米凝胶上的抗肿瘤药物；
所述纳米凝胶为上述技术方案中所述的纳米凝胶或上述技术方案中所述的制备方法制得的纳米凝胶；
所述抗肿瘤药物包括阿霉素、表阿霉素、吡喃阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、顺铂、卡铂、奥沙利铂、硼替佐米、喜树碱、10-羟基喜树碱、7-乙基喜树碱、7-乙基10-羟基喜树碱和紫草素中一种或几种。
本发明提供了一种纳米凝胶，如式(ⅰ)所示，其中，m、x、y、n为聚合度，40≤m≤120，1≤x≤50，1≤y≤50，1≤n≤50；cpps为末端为半光氨酸的细胞膜穿透肽修饰基。本发明提供的式(ⅰ)结构的纳米凝胶，作为抗肿瘤药物载体能够在肿瘤部位靶向富集，且能够提高对肿瘤细胞的黏附性及深层穿透性，使载药颗粒易于被肿瘤细胞内吞；同时，其还具有响应敏感性，在肿瘤细胞内的高光谷甘肽浓度下，其结构中的二硫键能够快速断裂，实现肿瘤细胞内部的药物智能释放，从靶向-内吞-释放多方面共同作用，提高抗肿瘤效果。此外，上述结构的纳米凝胶还具有寡聚乙二醇外壳，具有良好的水溶性及稳定性，且以可生物降解的聚氨基酸及寡聚乙二醇为结构单元，生物相容性好，在体内可降解，降解产物可随尿液直接排除体外，对人体无害。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为实施例28中核磁共振氢谱测试图；
图2为实施例44制备的纳米凝胶载药体系的流体动力学半径分布图；
图3为实施例44所得纳米凝胶载药体系的药物释放曲线测试图；
图4为细胞毒性实验结果测试图；
图5为黏附在膀胱壁内的光密度测试图。
具体实施方式
本发明提供了一种纳米凝胶，具有式(ⅰ)所示结构：
其中，m为聚合度，40≤m≤120；优选的，45≤m≤113。
x为聚合度，1≤x≤50；优选的，1≤x≤10。
y为聚合度，1≤y≤50；优选的，1≤y≤10。
n为聚合度，1≤n≤50；优选的，1≤n≤5。
其中，cpps为末端为半光氨酸的细胞膜穿透肽修饰基。本发明对所述末端为半光氨酸的细胞膜穿透肽的种类没有特殊限制，本领域技术人员可以根据实际情况、性能要求和产品要求进行选择和调整，本发明为提高与式(ⅰ)结构中主体结构的结合，与主体结构共同作用提高对肿瘤组织的深层穿透能力，从而进一步提高肿瘤细胞的内吞效果，所述末端为半光氨酸的细胞膜穿透肽选自r9、mlt、tat、arg7、vp22、map、pep-1、p22n或dpv3。
本发明中，所述纳米凝胶的粒度优选为10～100nm。
纳米凝胶本体是水凝胶，是一种三维网状聚合物，具有不溶不熔特性，只能溶胀。本发明提供的式(ⅰ)结构的纳米凝胶，作为抗肿瘤药物载体能够在肿瘤部位靶向富集，且能够提高对肿瘤细胞的黏附性及深层穿透性，使载药颗粒易于被肿瘤细胞内吞；同时，其还具有响应敏感性，在肿瘤细胞内的高光谷甘肽浓度下，其结构中的二硫键能够快速断裂，实现肿瘤细胞内部的药物智能释放，从靶向-内吞-释放多方面共同作用，提高抗肿瘤效果。此外，上述结构的纳米凝胶还具有寡聚乙二醇外壳，具有良好的水溶性及稳定性，且以可生物降解的聚氨基酸及寡聚乙二醇为结构单元，生物相容性好，在体内可降解，降解产物可随尿液直接排除体外，对人体无害。
本发明还提供了一种上述技术方案中所述的纳米凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)在引发剂的作用下，将氨基化烯丙基聚乙二醇与2-(boc-氨基)乙硫醇在第一有机溶剂中反应，形成叔丁氧羰基-聚乙二醇-氨基化合物；
b)将所述叔丁氧羰基-聚乙二醇-氨基化合物与l-胱氨酸-n-环内酸酐及l-苯丙氨酸-n-环内酸酐在第二有机溶剂中反应，形成叔丁氧羰基-亚胺基-聚乙二醇-聚(l-苯丙氨酸-co-l-胱氨酸)；
c)在酸性条件下，将所述叔丁氧羰基-亚胺基-聚乙二醇-聚(l-苯丙氨酸-co-l-胱氨酸)在第三有机溶剂中进行脱除叔丁氧羰基的反应，形成式(ⅶ)化合物；
d)将所述式(ⅶ)化合物溶解于第四有机溶剂中，与3-马来酰亚胺基丙酸的水溶液混合反应，形成式(ⅷ)化合物；
e)将所述式(ⅷ)化合物与末端为半光氨酸的细胞膜穿透肽在第五有机溶剂中反应，形成式(ⅰ)所示的纳米凝胶；
其中，m、x、y、n为聚合度，40≤m≤120，1≤x≤50，1≤y≤50，1≤n≤50；
cpps为末端为半光氨酸的细胞膜穿透肽修饰基。
按照本发明，先在引发剂的作用下，将氨基化烯丙基聚乙二醇与2-(boc-氨基)乙硫醇在第一有机溶剂中反应，形成叔丁氧羰基-聚乙二醇-氨基化合物。
本发明中，所述氨基化烯丙基聚乙二醇具有式(ⅱ)结构：
其中，m为聚合度，m优选为40≤m≤120，更优选为45≤m≤113。
本发明对所述氨基化烯丙基聚乙二醇的来源没有特殊限制，可为一般市售品，也可按照本领域技术人员熟知的制备方法制得；其制备方法如下：
s1：将烯丙基聚乙二醇溶液、三乙胺和甲基磺酰氯进行酯化反应，得到甲基磺酸烯丙基聚乙二醇酯；
s2：将所述甲基磺酸烯丙基聚乙二醇酯和氯化铵进行氨解反应，得到端氨基化的烯丙基聚乙二醇。
其中，所述烯丙基聚乙二醇溶液优选通过以下方式制得：
将烯丙基聚乙二醇和甲苯共沸，除去水和甲苯，再在有机溶剂混合，得到烯丙基聚乙二醇溶液。在本发明中，所述有机溶剂优选为二氯甲烷；所述烯丙基聚乙二醇的质量和有机溶剂的体积比优选为1g:(1～20)ml，更优选为1g:(3～18)ml，最优选为1g:(5～15)ml。
在本发明中，所述烯丙基聚乙二醇的数均分子量优选为2000g/mol～20000g/mol，更优选为1000g/mol～8000g/mol，最优选为1500g/mol～5000g/mol。
本发明中，所述步骤s1中，在混料时，优选将三乙胺和甲基磺酰氯加入到所述烯丙基聚乙二醇溶液中。在本发明中，所述三乙胺与烯丙基聚乙二醇的摩尔比优选为(2～20):1，更优选为(5～18):1，最优选为(8～14):1；所述三乙胺与甲基磺酰氯的摩尔比优选为(1～10):(10～30)，更优选为(3～8):(18～26)，最优选为(4～7):(15～24)。
本发明优选在无水条件下将三乙胺和甲基磺酰氯加入到所述烯丙基聚乙二醇溶液中。本发明优选在-10℃～10℃下将三乙胺和甲基磺酰氯加入到所述烯丙基聚乙二醇溶液中，更优选为-5℃～5℃。本发明优选以滴加的方式将甲基磺酰氯加入到所述烯丙基聚乙二醇溶液中。本发明优选在第一温度下进行酯化反应第一时间，升温至第二温度进行酯化反应第二时间。在本发明中，所述第一温度优选为-10℃～10℃，更优选为-5℃～5℃；所述第一时间优选为0.5小时～4小时，更优选为1小时～3.5小时，最优选为1.5小时～2.5小时。所述第二温度优选为12℃～40℃，更优选为18℃～35℃，最优选为15℃～28℃；所述第二时间优选为10小时～72小时，更优选为15小时～60小时，最优选为20小时～48小时。
酯化反应结束后，本发明优选将酯化反应产物过滤，得滤液；将滤液依次进行浓缩、沉降和过滤，将得到的沉降物进行洗涤和干燥，得到甲基磺酸烯丙基聚乙二醇酯。本发明优选采用乙醚进行沉降。在本发明中，所述干燥优选为真空干燥；所述真空干燥的温度优选为10℃～40℃，更优选为15℃～38℃，最优选为20℃～30℃；所述真空干燥的时间优选为15小时～35小时，更优选为18小时～30小时，最优选为22小时～28小时。
得到甲基磺酸烯丙基聚乙二醇酯后，本发明将所述甲基磺酸烯丙基聚乙二醇酯和氯化铵进行氨解反应，得到端氨基化的烯丙基聚乙二醇。本发明优选在氨水中进行氨解反应。在本发明中，所述甲基磺酸烯丙基聚乙二醇酯的质量、氯化铵的质量与氨水的体积比优选为1g:(0.2～3.5)g:(30～70)ml，更优选为1g:(0.5～3)g:(35～55)ml，最优选为1g:(1～1.8)g:(40～50)ml。
在本发明中，所述氨水的质量分数优选为20％～35％，更优选为35％。
在本发明中，所述氨解反应的温度优选为10℃～40℃，更优选为15℃～35℃，最优选为20℃～30℃，所述氨解反应的时间优选为40小时～100小时，更优选为50小时～85小时，最优选为60小时～75小时。
氨解反应结束后，本发明优选将得到的反应液依次进行萃取、洗涤、干燥、浓缩、沉降和过滤；将过滤物进行洗涤和干燥。本发明优选采用二氯甲烷进行萃取。本发明优选采用氯化钠水溶液进行洗涤。本发明优选采用无水硫酸钠进行反应液的干燥。本发明优选采用乙醚进行沉降。本发明优选将过滤物进行真空干燥；所述过滤物真空干燥的温度优选为10℃～40℃，更优选为15℃～35℃，最优选为20℃～30℃；所述过滤物真空干燥的时间优选为15小时～35小时，更优选为18小时～30小时，最优选为20小时～28小时。在干燥后，得到端氨基化的烯丙基聚乙二醇，即氨基化烯丙基聚乙二醇。
本发明中，所述2-(boc-氨基)乙硫醇具有式(ⅲ)结构：
其中，与末端单键相连的为甲基。本发明对所述2-(boc-氨基)乙硫醇的来源没有特殊限制，为一般市售品或按照本领域技术人员熟知的制备方法制得即可。
本发明中，所述氨基化烯丙基聚乙二醇与2-(boc-氨基)乙硫醇的摩尔比优选为1∶(5～50)，更优选为1∶(5～25)，最优选为1∶10。
本发明中，所述第一有机溶剂的种类没有特殊限制，能够将原料溶解即可，为保证原料充分溶解，提供均匀稳定的反应体系，本发明中，所述第一有机溶剂优选包括n,n-二甲基甲酰胺、二氧六环和氯仿中的一种或几种；更优选为n,n-二甲基甲酰胺或二氧六环；最优选为n,n-二甲基甲酰胺。
本发明中，所述氨基化烯丙基聚乙二醇与第一有机溶剂的用量比优选为1g：(1～20)ml，更优选为1g：(3～15)ml，最优选为1g：(5～10)ml。
本发明中，优选在惰性气体条件下进行氨基化烯丙基聚乙二醇与2-(boc-氨基)乙硫醇的反应。本发明对所述惰性气体的种类没有特殊限制，为本领域技术人员熟知的保护性气体即可，如氮气、氩气等。本发明中，所述惰性气体更优选为氮气。本发明中，优选在搅拌条件下进行氨基化烯丙基聚乙二醇与2-(boc-氨基)乙硫醇的反应。
本发明中，氨基化烯丙基聚乙二醇与2-(boc-氨基)乙硫醇反应的温度优选为15～50℃，更优选为20～40℃，最优选为25～35℃。所述反应的时间优选为2～7天，更优选为3～5天，最优选为4天；其中，1天即为常规意义上的24小时。
本发明中，在上述反应后，得到反应液，优选对反应液用醚类沉淀、固液分离和干燥。本发明对所述醚类的种类没有特殊限制，为本领域技术人员熟知的醚沉降用常规醚类即可，如乙醚等。用醚类沉淀后，通过固液分离获得固体产物；本发明对所述固液分离的方式没有特殊限制，为本领域技术人员熟知的常规分离操作即可，如抽滤等。本发明中，所述干燥优选为真空干燥。在所述干燥后，得到固体产物--叔丁氧羰基-聚乙二醇-氨基化合物，其结构如式(ⅵ)所示：
其中，m为聚合度，m优选为40≤m≤120，更优选为45≤m≤113。
按照本发明，在得到叔丁氧羰基-聚乙二醇-氨基化合物后，将所述叔丁氧羰基-聚乙二醇-氨基化合物与l-胱氨酸-n-环内酸酐及l-苯丙氨酸-n-环内酸酐在第二有机溶剂中反应，形成叔丁氧羰基-亚胺基-聚乙二醇-聚(l-苯丙氨酸-co-l-胱氨酸)。
本发明中，所述l-苯丙氨酸-n-环内酸酐具有式(ⅳ)结构：
本发明对所述l-苯丙氨酸-n-环内酸酐的来源没有特殊限制，可为一般市售品，也可按照本领域技术人员熟知的制备方式制得。本发明中，所述l-苯丙氨酸-n-环内酸酐优选按照如下方式制得：
将l-苯丙氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯进行缩合反应，得到l-苯丙氨酸-n-环内酸酐。
本发明中，先将l-苯丙氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯混合；所述混合的温度优选为10℃～40℃，更优选为15℃～35℃，最优选为20℃～30℃。本发明中，所述l-苯丙氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯的摩尔比优选为1:(0.1～1.2)，更优选为1:(0.3～1)，最优选为1:(0.5～0.8)。本发明优选在无水条件下进行后续缩合反应，反应前，优选采用有机溶剂溶解上述反应原料。所述有机溶剂优选为四氢呋喃。所述有机溶剂的体积和l-苯丙氨酸的质量比优选为(8～12)ml:1g，更优选为10ml:1g。本发明中，所述缩合反应的温度优选为30℃～80℃，更优选为35℃～70℃，最优选为40℃～60℃；所述缩合反应时间优选为0.1～5小时，更优选为0.15～3小时，最优选为0.2～2小时。在所述缩合反应后，得到反应液。
本发明中，在上述缩合反应得到反应液后，优选对反应液用醚类沉淀、固液分离、洗涤和干燥。本发明对所述醚类的种类没有特殊限制，为本领域技术人员熟知的醚沉降用常规醚类即可，如石油醚等。用醚类沉淀后，通过固液分离获得固体产物；本发明对所述固液分离的方式没有特殊限制，为本领域技术人员熟知的常规分离操作即可，如抽滤等。在所述固液分离后，优选还进行重结晶，之后再进行干燥。经干燥后，得到式(ⅳ)所示l-苯丙氨酸-n-环内酸酐。
本发明中，所述l-胱氨酸-n-环内酸酐具有式(ⅴ)结构：
本发明对所述l-胱氨酸-n-环内酸酐的来源没有特殊限制，可为一般市售品，也可按照本领域技术人员熟知的制备方式制得。本发明中，所述l-胱氨酸-n-环内酸酐优选按照如下方式制得：
将l-胱氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯进行缩合反应，得到l-胱氨酸-n-环内酸酐。
本发明中，先将l-胱氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯混合；所述混合的温度优选为10℃～40℃，更优选为15℃～35℃，最优选为20℃～30℃。本发明中，所述l-胱氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯的摩尔比优选为1:(0.1～1.2)，更优选为1:(0.3～1)，最优选为1:(0.5～0.8)。本发明优选在无水条件下进行上述缩合反应，反应前，优选采用有机溶剂溶解上述反应原料。所述有机溶剂优选为四氢呋喃。所述有机溶剂的体积和l-胱氨酸的质量比优选为(8～12)ml:1g，更优选为10ml:1g。本发明中，所述缩合反应的温度优选为30℃～80℃，更优选为35℃～70℃，最优选为40℃～60℃；所述缩合反应时间优选为0.1～5小时，更优选为0.15～3小时，最优选为0.2～2小时。在所述缩合反应后，得到反应液。
本发明中，在上述缩合反应得到反应液后，优选对反应液用醚类沉淀、固液分离、洗涤和干燥。本发明对所述醚类的种类没有特殊限制，为本领域技术人员熟知的醚沉降用常规醚类即可，如石油醚等。用醚类沉淀后，通过固液分离获得固体产物；本发明对所述固液分离的方式没有特殊限制，为本领域技术人员熟知的常规分离操作即可，如抽滤等。在所述固液分离后，优选还进行重结晶，之后再进行干燥。经干燥后，得到式(ⅴ)所示l-胱氨酸-n-环内酸酐。
本发明中，所述l-胱氨酸-n-环内酸酐与步骤a)中氨基化烯丙基聚乙二醇的摩尔比优选为(5～20)∶1，更优选为(5～10)∶1，最优选为10∶1。所述l-苯丙氨酸-n-环内酸酐步骤a)中氨基化烯丙基聚乙二醇的摩尔比优选为(5～20)∶1，更优选为(5～10)∶1，最优选为10∶1。
本发明中，所述第二有机溶剂的种类没有特殊限制，能够将原料溶解即可，为保证原料充分溶解，提供均匀稳定的反应体系，本发明中，所述第二有机溶剂优选包括n,n-二甲基甲酰胺、二氧六环和三氯甲烷中的一种或几种。
本发明中，所述第二有机溶剂与步骤a)所得叔丁氧羰基-聚乙二醇-氨基化合物的用量比优选为1g：(1～20)ml。
本发明中，优选在惰性气体条件下进行上述反应。本发明对所述惰性气体的种类没有特殊限制，为本领域技术人员熟知的保护性气体即可，如氮气、氩气等。本发明中，所述惰性气体更优选为氮气。本发明中，优选在搅拌条件下进行上述反应。
本发明中，所述叔丁氧羰基-聚乙二醇-氨基化合物与l-胱氨酸-n-环内酸酐及l-苯丙氨酸-n-环内酸酐反应的温度优选为15～50℃，更优选为20～40℃，最优选为25～35℃。所述反应的时间优选为2～7天，更优选为3～5天，最优选为4天；其中，1天即为常规意义上的24小时。
本发明中，在上述反应后，得到反应液，优选对反应液用醚类沉淀、固液分离和干燥。本发明对所述醚类的种类没有特殊限制，为本领域技术人员熟知的醚沉降用常规醚类即可，如乙醚等。用醚类沉淀后，通过固液分离获得固体产物；本发明对所述固液分离的方式没有特殊限制，为本领域技术人员熟知的常规分离操作即可，如抽滤等。本发明中，所述干燥优选为真空干燥。在所述干燥后，得到固体产物--叔丁氧羰基-亚胺基-聚乙二醇-聚(l-苯丙氨酸-co-l-胱氨酸)，其结构如式(ⅵ-m)所示：
其中，m为聚合度，40≤m≤120；优选的，45≤m≤113。
x为聚合度，1≤x≤50；优选的，1≤x≤10。
y为聚合度，1≤y≤50；优选的，1≤y≤10。
n为聚合度，1≤n≤50；优选的，1≤n≤5。
按照本发明，在得到叔丁氧羰基-亚胺基-聚乙二醇-聚(l-苯丙氨酸-co-l-胱氨酸)后，在酸性条件下，将所述叔丁氧羰基-亚胺基-聚乙二醇-聚(l-苯丙氨酸-co-l-胱氨酸)在第三有机溶剂中进行脱除叔丁氧羰基的反应，形成式(ⅶ)化合物。
本发明中，所述酸性条件优选由溴化氢溶于酸液中形成的酸性溶液提供。所述酸液优选为乙酸。所述溴化氢与酸液的体积比优选为(0.5～5)：1，更优选为2：1。
本发明中，所述第三有机溶剂优选为含氟乙酸，或为含氟乙酸与二氯甲烷的混合物。所述含氟乙酸为三氟乙酸和/或二氟乙酸。
本发明中，所述酸性溶液与第三有机溶剂的体积比为(1～3)：(10～20)。采用所述酸性溶液与第三有机溶剂配合，能够是使交联结构的聚氨基酸较好的溶解并提供适宜的酸性环境，促进脱除叔丁氧羰基的反应。
本发明中，所述第三有机溶剂与叔丁氧羰基-亚胺基-聚乙二醇-聚(l-苯丙氨酸-co-l-胱氨酸)的用量比优选为(8～12)ml：1g，更优选为10ml：1g。
本发明中，所述脱除叔丁氧羰基的反应温度优选为20～50℃，更优选为30～35℃。所述反应的时间优选为0.5～4h，更优选为1～2h，最优选为1h。在所述反应后，得到反应液。
本发明中，在得到反应液后，优选对反应液用醚类沉淀和固液分离。本发明对所述醚类的种类没有特殊限制，为本领域技术人员熟知的醚沉降用常规醚类即可，如乙醚等。用醚类沉淀后，通过固液分离获得固体产物；本发明对所述固液分离的方式没有特殊限制，为本领域技术人员熟知的常规分离操作即可，如抽滤等。本发明中，在所述固液分离后，优选还进行水溶、透析和冻干，进而得到固体产物--式(ⅶ)化合物；
其中，m、x、y、n为聚合度，取值范围与上述技术方案中所述一致，在此不再赘述。
按照本发明，在得到式(ⅶ)化合物后，将所述式(ⅶ)化合物溶解于第四有机溶剂中，与3-马来酰亚胺基丙酸的水溶液混合反应，形成式(ⅷ)化合物。
本发明中，所述第四有机溶剂的种类没有特殊限制，能够将原料溶解即可，为保证原料充分溶解，提供均匀稳定的反应体系，本发明中，所述第四有机溶剂优选包括n,n-二甲基甲酰胺、二氧六环和三氯甲烷中的一种或几种；更优选为n,n-二甲基甲酰胺或二氧六环；最优选为n,n-二甲基甲酰胺。
本发明中，所述式(ⅶ)化合物与第四有机溶剂的用量比优选为1g：(1～20)ml，更优选为1g：(3～15)ml，最优选为1g：(5～10)ml。
本发明中，所述式(ⅶ)化合物与3-马来酰亚胺基丙酸的摩尔比优选为1：(5～50)，更优选为1：(5～25)，最优选为1：10。
本发明中，在将式(ⅶ)化合物的溶液与3-马来酰亚胺基丙酸的水溶液混合时，优选采用向式(ⅶ)化合物的溶液中缓慢滴加3-马来酰亚胺基丙酸水溶液的方式进行混合。
本发明中，在混料时，优选还加入缩合剂和稳定剂。本发明中，所述缩合剂优选包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、二环己基碳二亚胺和二异丙基碳二亚胺中的一种或几种；更优选为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐。所述缩合剂与式(ⅶ)化合物的质量比优选为(0.2～1)：1。本发明中，所述稳定剂用于稳定缩合生成的邻酰基异脲酯，优选包括n-羟基琥珀酰亚胺和o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯中的一种或几种。所述稳定剂与3-马来酰亚胺基丙酸的质量比优选为(0.2～1)：1。
本发明中，式(ⅶ)化合物溶液与3-马来酰亚胺基丙酸水溶液混合进行活化反应。所述反应的温度优选为15～50℃，更优选为20～40℃，最优选为25～35℃。所述反应的时间优选为2～7天，更优选为3～5天，最优选为4天。在所述反应后，得到反应液。本发明中，在上述反应得到反应后，优选对反应液进行透析和冻干，进而得到固体产物--式(ⅷ)化合物：
其中，m、x、y、n为聚合度，取值范围与上述技术方案中所述一致，在此不再赘述。
按照本发明，在得到式(ⅷ)化合物后，将所述式(ⅷ)化合物与末端为半光氨酸的细胞膜穿透肽在第五有机溶剂中反应，形成式(ⅰ)所示的纳米凝胶。
本发明对所述末端为半光氨酸的细胞膜穿透肽的种类没有特殊限制，本领域技术人员可以根据实际情况、性能要求和产品要求进行选择和调整，本发明为提高与式(ⅰ)结构中主体结构的结合，与主体结构共同作用提高对肿瘤组织的深层穿透能力，从而进一步提高肿瘤细胞的内吞效果，所述末端为半光氨酸的细胞膜穿透肽选自r9、mlt、tat、arg7、vp22、map、pep-1、p22n或dpv3。
本发明中，所述式(ⅷ)化合物与末端为半光氨酸的细胞膜穿透肽的摩尔比优选为1：(2～20)，更优选为1：(5～10)，最优选为1：10。
本发明中，所述第五有机溶剂的种类没有特殊限制，能够将原料溶解即可，为保证原料充分溶解，提供均匀稳定的反应体系，本发明中，所述第四有机溶剂优选包括n,n-二甲基甲酰胺、二氧六环和氯仿中的一种或几种；更优选为n,n-二甲基甲酰胺或二氧六环；最优选为n,n-二甲基甲酰胺。本发明中，所述式(ⅷ)化合物与第五有机溶剂的用量比优选为1g：(1～20)ml。
本发明中，所述式(ⅷ)化合物与末端为半光氨酸的细胞膜穿透肽的反应温度优选为15～50℃，更优选为20～40℃，最优选为25～35℃。所述反应的时间优选为2～7天，更优选为3～5天，最优选为4天。在所述反应后，得到反应液。
本发明中，在所述反应得到反应液后，优选对反应液用醚类沉淀和固液分离。本发明对所述醚类的种类没有特殊限制，为本领域技术人员熟知的醚沉降用常规醚类即可。用醚类沉淀后，通过固液分离获得固体产物；本发明对所述固液分离的方式没有特殊限制，为本领域技术人员熟知的常规分离操作即可，如抽滤等。本发明中，在所述固液分离后，优选还进行水溶、透析和冻干。所述透析优选采用截留分子量为3500的透析袋进行透析；所述透析的时间优选为4天，每4小时换一次透析液。透析后进行冻干，本发明对所述冻干的方法没有特殊限制，为本领域技术人员熟知的冻干方法即可；所述冻干的温度优选为-20℃；所述冻干的时间优选为72小时。在所得冻干后，得到式(ⅰ)所示的纳米凝胶：
其中，m为聚合度，40≤m≤120；优选的，45≤m≤113。
x为聚合度，1≤x≤50；优选的，1≤x≤10。
y为聚合度，1≤y≤50；优选的，1≤y≤10。
n为聚合度，1≤n≤50；优选的，1≤n≤5。
本发明中，所述纳米凝胶的粒度优选为10～100nm。
本发明对按照上述制备方法制得的纳米凝胶进行核磁共振氢谱测试，结果表明：所得纳米凝胶包括苯丙氨酸侧基苯环氢特征峰(7.0ppm～8.0ppm)，苯丙氨酸链段亚甲基氢的特征峰(5.20ppm)，末端为半胱氨酸的r9的代表性峰(1.4ppm～4.2ppm)。证明本发明的制备方法成功制备出式(ⅰ)所示的纳米凝胶。
本发明将上述制备方法制得的式(ⅰ)纳米凝胶带正电荷，与带负电荷的肿瘤细胞产生静电相互作用，且上述结构的纳米凝胶能够在肿瘤部位靶向富集，且能够提高对肿瘤细胞的黏附性及深层穿透性，使载药颗粒易于被肿瘤细胞内吞；同时，其还具有响应敏感性，在肿瘤细胞内的高光谷甘肽浓度下，其结构中的二硫键能够快速断裂，实现肿瘤细胞内部药物的可控释放，增强肿瘤杀伤作用。而且，本发明的制备方法简单易行，条件温和，产率高，达到75％以上，便于规模化生产应用。
本发明还提供了一种抗肿瘤载药纳米凝胶，包括纳米凝胶和负载于所述纳米凝胶上的抗肿瘤药物；其中，所述纳米凝胶为上述技术方案中所述的纳米凝胶或上述技术方案中所述的制备方法制得的纳米凝胶。
本发明中，所述抗肿瘤药物优选包括阿霉素、表阿霉素、吡喃阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、顺铂、卡铂、奥沙利铂、硼替佐米、喜树碱、10-羟基喜树碱、7-乙基喜树碱、7-乙基10-羟基喜树碱和紫草素中一种或几种。本发明中，所述抗肿瘤药物与纳米凝胶的质量比优选为10％～60％。
本发明还提供了一种上述技术方案中所述的抗肿瘤载药纳米凝胶的制备方法，包括：将纳米凝胶与抗肿瘤药物在有机溶剂与水中混匀后，透析及冻干，得到抗肿瘤载药纳米凝胶。其中，所述纳米凝胶与抗肿瘤药物的种类及用量等均与上述技术方案中所述一致，在此不再赘述。
其中，所述有机溶剂的种类没有特殊限制，能够将原料溶解即可，为保证原料充分溶解，提供均匀稳定的反应体系，本发明中，所述有机溶剂优选包括n,n-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜中的一种或几种；更优选为二甲基亚砜。本发明中，所述有机溶剂与纳米凝胶的用量比优选为10ml∶0.1g。所述水与纳米凝胶的用量比优选为10ml∶0.1g。
本发明中，在将纳米凝胶及抗肿瘤药物与液体介质混合时，优选先与有机溶剂混匀，再加入水混匀。所述混合优选在搅拌条件下进行。其中，在溶剂中搅拌的时间优选为8～24h，更优选为8～16h，最优选为8h。本发明中，所述透析的温度优选为4～20℃，更优选为4～8℃，最优选为4℃。所述透析的时间优选为4～12h，更优选为4～8h，最优选为8h。本发明对所述冻干的方法没有特殊限制，为本领域技术人员熟知的冻干方法即可。在所述冻干后，得到抗肿瘤载药纳米凝胶。
本发明还提供了一种抗肿瘤载药纳米凝胶体系，包括抗肿瘤载药纳米凝胶与缓冲液。其中，所述抗肿瘤载药纳米凝胶与上述技术方案中所述的抗肿瘤载药纳米凝胶一致，在此不再赘述。
本发明中，所述缓冲液优选为磷酸盐缓冲液。所述磷酸盐缓冲液的ph优选为7.4。本发明提供的抗肿瘤载药纳米凝胶体系能够增强药物对肿瘤细胞的黏附能力及向肿瘤组织深层穿透的能力，正电性的纳米凝胶有利于肿瘤细胞摄取，还原敏感性有利于肿瘤细胞内快速释放所载药物并在肿瘤细胞内特异性蓄积。
本发明提供了一种纳米凝胶，如式(ⅰ)所示或按照上述技术方案中的制备方法制得，其作为抗肿瘤药物载体能够在肿瘤部位靶向富集，且能够提高对肿瘤细胞的黏附性及深层穿透性，使载药颗粒易于被肿瘤细胞内吞；同时，其还具有响应敏感性，在肿瘤细胞内的高光谷甘肽浓度下，其结构中的二硫键能够快速断裂，促进纳米凝胶解体，从而快速释放药物，可根据需要调节其在肿瘤内的可控释放；从靶向-内吞-释放多方面共同作用，提高抗肿瘤效果。此外，上述结构的纳米凝胶还具有寡聚乙二醇外壳，具有良好的水溶性及稳定性，且以可生物降解的聚氨基酸及寡聚乙二醇为结构单元，生物相容性好，在体内可降解，降解产物可随尿液直接排除体外，对人体无害。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
实施例1：叔丁氧羰基-聚乙二醇-氨基的制备
将1g氨基化烯丙基聚乙二醇置于干燥的反应瓶中，加入10mln＇n-二甲基甲酰胺，再加入0.3g2-(boc-氨基)乙硫醇与2.3g偶氮二异丁腈，氮气气氛下搅拌反应3天，得到反应溶液。将所得反应溶液倾倒入100ml无水乙醚中，抽滤取得固体，真空干燥，得到叔丁氧羰基-聚乙二醇-氨基，即如式(ⅵ)所示的化合物。
其中，m为聚合度，40≤m≤120。
实施例2：l-苯丙氨酸-n-环内酸酐的制备
将1gl-苯丙氨酸与0.6g双(三氯甲基)碳酸酯在25℃下混合，加入50ml四氢呋喃，加热至50℃反应2h，反应结束后，将反应混合物在过量石油醚中沉降，分离、洗涤、重结晶、干燥后得到l-苯丙氨酸-n-环内酸酐。
实施例3：l-胱氨酸-n-环内酸酐的制备
将1g所述l-胱氨酸与0.6g双(三氯甲基)碳酸酯在25℃下混合，加入50ml四氢呋喃，加热至50℃反应2h，反应结束后，将反应混合物在过量石油醚中沉降，分离、洗涤、重结晶、干燥后得到l-胱氨酸-n-环内酸酐。
实施例4～8：不同交联度的叔丁氧羰基-亚胺基-聚乙二醇-聚(l-苯丙氨酸-co-l-胱氨酸)的制备
将0.57gl-苯丙氨酸-n-环内酸酐分别与0.48g、0.95g、1.43g、1.90g、2.37gl-胱氨酸-n-环内酸酐混合均匀，加入到实施例1所得叔丁氧羰基-聚乙二醇-氨基的n,n-二甲基甲酰胺溶液中(溶液浓度为0.02g/ml，用量为50ml)，氮气气氛下搅拌反应3天，将反应后溶液倾倒入100ml无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到叔丁氧羰基-亚胺基-聚乙二醇-聚(l-苯丙氨酸-co-l-胱氨酸)，分别记为1a、1b、1c、1d、1e，产率达到85％～90％。
实施例9～11：不同聚苯丙氨酸链节的叔丁氧羰基-亚胺基-聚乙二醇-聚(l-苯丙氨酸伴-co-l-胱氨酸)的制备
分别将1.14g、1.71g、2.28gl-苯丙氨酸-n-环内酸酐与1.90gl-胱氨酸-n-环内酸酐混合均匀，加入到实施例1所得叔丁氧羰基-聚乙二醇-氨基的n,n-二甲基甲酰胺溶液中(溶液浓度为0.02g/ml，用量为50ml)，氮气气氛下搅拌反应3天，将反应后溶液倾倒入100ml无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到叔丁氧羰基-亚胺基-聚乙二醇-聚(l-苯丙氨酸-co-l-胱氨酸)，分别记为2f、2g、2h，产率达到85％～90％。
实施例4～11所得产物的结构如式(ⅵ-m)所示：
其中，m、x、y、n为聚合度，40≤m≤120，1≤x≤50，1≤y≤50，1≤n≤50。
实施例12～19：不同分子量的叔丁氧羰基-亚胺基-聚乙二醇-聚(l-苯丙氨酸-co-l-胱氨酸)脱保护
分别称取1g实施例4～11制备的叔丁氧羰基-亚胺基-聚乙二醇-聚(l-苯丙氨酸-co-l-胱氨酸)，分别放入8个不同的50ml圆底烧瓶中，各加入10ml三氟乙酸溶解，再加入3ml溴化氢的乙酸溶液(溴化氢与乙酸的体积比为2:1)。室温搅拌反应1h；然后分别将反应液倒入8份100ml乙醚中，抽滤，得到的固体用水溶解，用截留分子量为3500的透析袋在去离子水中透析3天，每4h换一次透析液；最终得到如式(ⅶ)所示的化合物，分别记为3a、3b、3c、3d、3e、3f、3g、3h。
其中，m、x、y、n为聚合度，40≤m≤120，1≤x≤50，1≤y≤50，1≤n≤50。
实施例20～27：不同分子量的聚氨基酸纳米凝胶的末端氨基封端
分别称取1g实施例12～19制备的式(ⅶ)所示化合物，分别放入8个不同的50ml圆底烧瓶中，各与0.3g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐溶解于10mln,n-二甲基甲酰胺中。将8份0.1gn-羟基琥珀酰亚胺与0.1g3-马来酰亚胺基丙酸溶于去离子水中活化半小时，然后缓慢滴加到上述8份n,n-二甲基甲酰胺溶液中室温搅拌反应24h，透析，冻干，最终得到如式(ⅷ)所示的化合物，分别记为4a、4b、4c、4d、4e、4f、4g、4h，产率达到75％～85％。
其中，m、x、y、n为聚合度，40≤m≤120，1≤x≤50，1≤y≤50，1≤n≤50。
实施例28～35：不同分子量的纳米凝胶的制备
分别称取1g实施例20～27制备的式(ⅷ)所示化合物分别放入8个不同的50ml圆底烧瓶中，各加入10mln,n-二甲基甲酰胺溶解，再各加入0.5g末端为半胱氨酸的r9，搅拌反应24h，透析，冻干，最终得到如式(ⅸ)所示的纳米凝胶，分别记为r9-a、r9-b、r9-c、r9-d、r9-e、r9-f、r9-g、r9-h，产率达到75％～85％。
其中，m、x、y、n为聚合度，40≤m≤120，1≤x≤50，1≤y≤50，1≤n≤50。
对纳米凝胶及组装前原料分别进行核磁共振氢谱测试，结果如图1所示，图1为实施例28中核磁共振氢谱测试图。具体的，对实施例28制备得到的式(ⅸ)所示纳米凝胶(即r9-a)进行核磁共振氢谱测试，测试结果如图1a所示；对本实施例20制备得到的式(ⅷ)所示的化合物(即4a)进行核磁共振氢谱测试，测试结果如图1b所示；对末端为半胱氨酸的r9进行核磁共振氢谱测试，测试结果如图1c所示。由图1可以看出：图1b中式(ⅷ)所示的化合物(即4a)的苯丙氨酸侧基苯环氢特征峰(7.0ppm～8.0ppm)，苯丙氨酸链段亚甲基氢的特征峰(5.20ppm)，图1c中末端为半胱氨酸的r9的代表性峰(1.4ppm～4.2ppm)与图1a中式(ⅸ)所示的纳米凝胶的信号完全匹配，说明实施例20制备得到的式(ⅷ)所示的化合物与末端为半胱氨酸的r9发生键合，本实施例28成功制备式(ⅸ)所示的纳米凝胶。
同样地，按照上述测试方法对实施例29～35(即r9-b、r9-c、r9-d、r9-e、r9-f、r9-g、r9-h)进行核磁共振氢谱测试，结果与实施例28相同，证明实施例29～35同样成功制备出式(ⅸ)所示的纳米凝胶。
实施例36～43：键合不同细胞膜穿透肽的纳米凝胶的制备
分别称取1g实施例20制备的式(ⅷ)所示化合物(即4a)分别放入8个不同的50ml圆底烧瓶中，各加入10mln,n-二甲基甲酰胺溶解，再分别加入0.5g末端为半胱氨酸的mlt、0.5g末端为半胱氨酸的tat、0.5g末端为半胱氨酸的arg7、0.5g末端为半胱氨酸的vp22、0.5g末端为半胱氨酸的map、0.5g末端为半胱氨酸的pep-1、0.5g末端为半胱氨酸的p22n、0.5g末端为半胱氨酸的dpv3，搅拌反应24h，透析，冻干，最终得到如式(ⅰ)所示的纳米凝胶，分别记为mlt-a、tat-a、arg7-a、vp22-a、map-a、pep-1-a、p22n-a、dpv3-a，产率达到75％～85％。
其中，cpps代表细胞膜穿透肽，分别为mlt、tat、arg7、vp22、map、pep-1、p22n或dpv3；
m、x、y、n为聚合度，40≤m≤120，1≤x≤50，1≤y≤50，1≤n≤50。
实施例44～59：纳米凝胶载药颗粒的制备
分别称取100mg实施例28～43中制备的纳米凝胶(即r9-a、r9-b、r9-c、r9-d、r9-e、r9-f、r9-g、r9-h、mlt-a、tat-a、arg7-a、vp22-a、map-a、pep-1-a、p22n-a、dpv3-a)与20mg10-羟基喜树碱溶解于10ml二甲基亚砜中，搅拌12h，各加入10ml去离子水，搅拌24h，透析，冻干，得到载药纳米凝胶，载药率为5％～20％。
对本实施例44制备得到的纳米凝胶载药体系(载体对应r9-a)进行流体动力学分析，测试结果如图2所示，图2为实施例44制备的纳米凝胶载药体系的流体动力学半径分布图，其流体动力学半径为48.9±0.7nm。
对本实施例44制备得到的纳米凝胶载药体系(载体对应r9-a)进行药物释放曲线的测试，测试结果如图3所示，图3为实施例44所得纳米凝胶载药体系的药物释放曲线测试图；其中，曲线1为10-羟基喜树碱在磷酸盐缓冲溶液中的药物释放曲线，曲线2为纳米凝胶载药体系在二硫苏糖醇(dtt)浓度为10mm的磷酸盐缓冲溶液中的药物释放曲线，曲线3为纳米凝胶载药体系在二硫苏糖醇浓度为5mm的磷酸盐缓冲溶液中的药物释放曲线，曲线4为纳米凝胶载药体系在磷酸盐缓冲溶液中的药物释放曲线。从图3可以看出：纳米载药体系具有氧化还原响应的效果，可以在肿瘤细胞内部高谷胱甘肽浓度的条件下发生离解，快速释放出包载的药物；具体的，曲线1突释效应严重，相比之下，曲线2～4的纳米凝胶体系能阻滞药物在较短时间内快速释放，使药物平稳、缓慢释放，并提高10-羟基喜树碱的安全性和有效性；且随着dtt浓度的增高，药物释放速率逐渐提高，证明纳米载药体系具有氧化还原响应的效果，药物释放是可控的。
同样地，按照上述测试方法对实施例45～59进行药物释放测试，结果呈现出类似的效果，实施例45～59制得的纳米载药体系同样具有氧化还原响应的效果，可以在肿瘤细胞内部高谷胱甘肽浓度的条件下发生离解，快速释放出包载的药物。其中，r9-a～r9-h中，r9-a的效果更好。r9-a、mlt-a～dpv3-a中，r9-a的效果更好，证明式(ⅰ)所示的纳米凝胶载体中，细胞膜穿透肽cpps为r9时，能够进一步提升纳米载药凝胶的响应敏感性，更有利于药物的快速释放。
实施例60：肿瘤细胞抑制率表征
将5637细胞均匀种在96孔板中，分为3组，每孔细胞数约为7000，用ph7.4的dmem培养基培养，培养基体积为200μl。
然后将浓度为10μgml-1、5μgml-1、2.5μgml-1、1.25μgml-1、0.63μgml-1、0.31μgml-1、0.16μgml-1、0.08μgml-1、0.04μgml-1和0.02μgml-1的10-羟基喜树碱溶液(溶剂为磷酸盐缓冲液)加入到其中一组ph＝7.4的dmem培养基孔板中。再将浓度为10μgml-1、5μgml-1、2.5μgml-1、1.25μgml-1、0.63μgml-1、0.31μgml-1、0.16μgml-1、0.08μgml-1、0.04μgml-1和0.02μgml-1的实施例44所得载10-羟基喜树碱纳米凝胶颗粒(载体对应r9-a)的溶液(溶剂为磷酸盐缓冲液)加入到另一组ph＝7.4的dmem培养基的孔板中。最后一组ph7.4的dmem培养基不加载10-羟基喜树碱纳米凝胶以及游离10-羟基喜树碱，作为对照组。将上述3组再次培养24小时。
培养结束后吸去培养基，用含有噻唑蓝的溶液处理，测试其在490纳米处的吸收值。细胞存活率使用以下公式计算：
具体结果见图4，图4为细胞毒性实验结果测试图。图4中，
同样地，按照上述测试方法对实施例45～59进行肿瘤细胞抑制率测试，结果与实施例44的载药纳米凝胶呈现出类似的效果，实施例45～59制得的纳米载药体系同样具有对肿瘤细胞杀伤抑制的效果。其中，r9-a～r9-h中，r9-a的效果更好。r9-a、mlt-a～dpv3-a中，r9-a的效果更好，证明式(ⅰ)所示的纳米凝胶载体中，细胞膜穿透肽cpps为r9时，能够进一步提升纳米载药凝胶的对肿瘤细胞的杀伤抑制效果。
实施例61：在膀胱壁内黏附性实验
选取体重为170g左右的雄性sd大鼠54只，定期膀胱灌注甲基亚硝基脲(mnu)，每次2mg，每2周1次，共4次诱导原位膀胱癌发生。将荷瘤鼠随机分为三组，每组18只，分别经尿道膀胱灌注生理盐水、10-羟基喜树碱、实施例44的载药纳米凝胶，其灌注的10-羟基喜树碱剂量为6mgkg-1。其中所述灌注生理盐水的组为对照组。
预定时间点处死，取出膀胱，用生理盐水充分洗净，制成膀胱组织薄片样品，通过激光共聚焦检测其荧光强度。结果见图5，图5为黏附在膀胱壁内的光密度测试图。图5中，1为载药纳米凝胶的光密度，2为游离10-羟基喜树碱的光密度。可以看出，相比于游离10-羟基喜树碱，本发明制得的载药纳米凝胶的光密度明显提高，证明本发明制得的载药纳米凝胶明显增强了对肿瘤组织的黏附性，载药凝胶能够有效在肿瘤组织处富集，进而提升载药纳米凝胶被肿瘤细胞的内吞效果以及更多地释放抗肿瘤药物，从而有效实现药物在肿瘤部位的蓄积和释放。
同样地，按照上述测试方法对实施例45～59进行膀胱壁内黏附性测试，结果与实施例44的载药纳米凝胶呈现出类似的效果，实施例45～59制得的载药纳米凝胶同样能够明显增强对肿瘤组织的黏附性，从而提升载药纳米凝胶被肿瘤细胞的内吞效果。其中，r9-a～r9-h中，r9-a的黏附性更强。r9-a、mlt-a～dpv3-a中，r9-a的黏附性更强，证明式(ⅰ)所示的纳米凝胶载体中，细胞膜穿透肽cpps为r9时，能够进一步提升纳米载药凝胶对肿瘤组织的黏附性，进而提升载药纳米凝胶被肿瘤细胞的内吞效果。
实施例62～71：负载不同药物的纳米凝胶的制备
称取10份100mg实施例28中制备的纳米凝胶(即r9-a)分别与20mg阿霉素、20mg表阿霉素、20mg吡喃阿霉素、20mg紫杉醇、20mg多西紫杉醇、20mg顺铂、20mg卡铂、20mg奥沙利铂、20mg硼替佐米、20mg喜树碱、20mg7-乙基喜树碱、20mg7-乙基10-羟基喜树碱、20mg紫草素溶解于10ml二甲基亚砜中，搅拌12h，再分别加入10ml去离子水，搅拌24h，透析，冻干，得到载药纳米凝胶。
按照实施例44中的测试方法测试上述载药纳米凝胶的药物释放性，结果与实施例44类似，所得纳米载药体系同样具有氧化还原响应的效果，可以在肿瘤细胞内部高谷胱甘肽浓度的条件下发生离解，快速释放出包载的药物。
按照实施例60中的测试方法测试上述载药纳米凝胶的肿瘤细胞抑制率，结果显示，载药纳米凝胶对肿瘤细胞的杀伤作用显著高于相同浓度的游离药。
按照实施例61中的测试方法测试上述载药纳米凝胶在膀胱壁内的黏附性，结果与实施例61类似，相比于游离抗肿瘤药物，本发明制得的载药纳米凝胶的光密度明显提高，证明本发明制得的载药纳米凝胶明显增强了对肿瘤组织的黏附性，载药凝胶能够有效在肿瘤组织处富集，进而更多地释放抗肿瘤药物，从而有效实现药物在肿瘤部位的蓄积和释放。
本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，包括最佳方式，并且也使得本领域的任何技术人员都能够实践本发明，包括制造和使用任何装置或系统，和实施任何结合的方法。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。本发明专利保护的范围通过权利要求来限定，并可包括本领域技术人员能够想到的其他实施例。如果这些其他实施例具有近似于权利要求文字表述的结构要素，或者如果它们包括与权利要求的文字表述无实质差异的等同结构要素，那么这些其他实施例也应包含在权利要求的范围内。
- 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞！