制备用于神经修复的中空纤维导管及其集束结构物的方法与流程

本发明涉及生物医用材料领域，具体涉及一种制备用于神经修复的中空纤维导管及其集束结构物的方法。

背景技术：

中枢神经损伤后由于会产生神经再生的抑制性环境，目前临床上没有有效的治疗方法，给病患及家属造成极大的生理和心理负担。通过特定材料合成神经导管并植入损伤部位诱导神经细胞的再生，是目前中枢神经损伤修复的一种有效方式。合成神经修复导管的材料中，第一代不可降解材料以硅胶为代表，硅胶管虽然能在短时间内显示出神经感觉、运动良好的恢复效果，但不能与外界进行物质交换，也不能被人体吸收，长期滞留于人体内会压缩神经，影响神经功能，需行再次手术取出。与使用第一代不可降解的中空导管方案不同的是，新近的研究采用生物可降解中空导管集束及内含活性填充物进行植入式修复。生物可降解材料运用于神经损伤修复相比不可降解的材料具有诸多优势，包括：①化学和工程学特性的可变性，通过处理可以在生物相容性、几何形状、孔隙度、降解度以及机械强度进行调控；②最终的代谢产物能通过正常的生理途径被完全降解吸收，不影响神经本身的结构；③可通过改变降解速度定时定量释放有利于神经生长的物质，没有潜在的免疫反应等。现有技术中，在制备神经修复集束的材料方面，起到支撑作用的导管可使用合成材料(如plga、聚乳酸、聚氨酯等)或天然的动物源性材料(如胶原、丝素、壳聚糖、透明质酸、细菌纤维素等)制备，随导管材料植入的促进神经再生的材料有各种促神经再生药物、神经生长因子等。关于导管的制备方法，主要有模具浇筑、静电纺丝、3d打印、热致相分离、纤维丝编织等。专利cn101966090b利用plga细丝编织成中空导管，pga细丝填充在导管内部，外加雪旺细胞用于损伤视神经的修复。专利cn202654265u公布了一种三维复合仿生神经导管，包括一条导管外管和若干条导管内管，在导管内管的内外壁和外管内壁上分布有微囊，减少神经修复后所致运动、感觉异位发生率；其导管是通过金属模具浇筑成型批量生产的。专利cn103637857a公布了中间含纳米纤维束组成的“芯”，外面是取向层和无规纤维层组成的“鞘”；其中的“芯”和“鞘”都是通过将高聚物静电纺丝得到纳米级纤维后再包缠转辊而形成的。

上述静电纺丝方法制备导管尽管加工方便，但是需要使用到有机溶剂，溶剂残留会导致植入体内后引起过敏反应甚至毒性。水溶液浇筑到模具后冷冻干燥也存在着耗时长，效率低的弊端。3d打印尽管有可能不使用溶剂，但是很难使用较小的直径喷头实现连续打印，同时制作效率较低。采用熔融挤出成管的工艺可以具有高效、尺寸易于控制的优点，但是目前行业管状物内口模外径的加工极限最小在0.4mm，这种规格的导管用于神经修复仍然过粗，需要更细的管状物和或者管状物上更微观的取向结构，才能有效诱导神经细胞的再生修复。

技术实现要素：

鉴于上述背景，本发明的目的是提供一种高效制备神经修复结构物的方法，该方法可避免使用溶剂，能制备有更微观的取向结构、能负载活性组分的神经修复导管，进而形成集束。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

首先，提供一种制备用于神经修复的中空纤维导管的方法，包括以下步骤：

1)将含有至少1种断裂伸长率在30-1000％的可生物降解聚合物的混合物料制成内径≥0.3mm的管状物；

2)将0.01～0.2mm直径的刚性纤维插入步骤1)制成的管状物内部，其中所述刚性纤维的长度显著大于所述管状物的长度；

3)在常温常压下，仅对所述管状物两端施加牵引力，使得所述管状物长度增加而内径收缩，直到所述管状物紧密包覆在所述刚性纤维的外表面，即所述管状物内径与所述刚性纤维外径相同，得到成型的纤维导管；

4)去除步骤3)所述成型的纤维导管中的刚性纤维，得到中空纤维导管。

本发明优选的一种方案中，步骤1)所述的混合物料中进一步含有含氨基的高聚物，步骤4)最终得到的中空纤维导管由此引入活性氨基官能团；所述的含氨基的高聚物可以选自壳聚糖、聚乙烯亚胺、带侧氨基聚天冬胺酸或聚赖氨酸中的任意一种或两种以上的组合物；优选聚赖氨酸、或壳聚糖。

本发明优选的另一种方案中，步骤1)所述的混合物料中进一步含有耐温性神经再生药物，步骤4)最终得到的中空纤维导管即负载有耐温性神经再生药物；所述的耐温性神经再生药物选自普立宁钾、乙酰l-肉碱、vb12、vb9或vb6中的任意一种或两种以上的组合物；优选vb6。

本发明更优选的方案中，步骤1)所述的混合物料由所述的可生物降解聚合物、耐温性神经再生药物和含氨基的高聚物共混组成，按重量百分比计，可生物降解聚合物占65～99％、耐温性神经再生药物占0.1～5％，含氨基的高聚物占0.1～30％；步骤4)最终得到的中空纤维导管负载有耐温性神经再生药物且引入了活性氨基官能团。

本发明中，步骤1)所述的可生物降解聚合物可选自以下任意一种或多种：聚己内酯、支化聚己内酯、聚氨酯、聚(丁二酸己二酸丁二醇酯)(pbsa)或聚(己二酸对苯二甲酸丁二醇酯)(pbat)；优选支化聚己内酯；更优选聚己内酯聚乙二醇、聚丙交酯己内酯或聚乙交酯丙交酯己内酯中的任意一种或两种以上的混合物。

制备所述聚合物优选采用分子量为2,000～400,000的脂肪族聚内酯，更优选含有200～20,000分子量聚乙二醇醚嵌段的脂肪族聚内酯。所述的脂肪族聚内酯包括但不限于：聚乳酸(pla)、聚己内酯(pcl)、丙交酯-乙交酯共聚物(plga)、丙交酯-己内酯共聚物(plc)、乙交酯-己内酯共聚物(pgc)、乙交酯-丙交酯-己内酯共聚物(pglc)、聚丙交酯-聚乙二醇嵌段共聚物(peg-b-pla)、聚乙交酯-聚乙二醇嵌段共聚物(peg-b-pga)、聚己内酯-聚乙二醇嵌段共聚物(peg-b-pcl)、聚(丙交酯-乙交酯)-聚乙二醇嵌段共聚物(peg-b-plga)、聚(丙交酯-己内酯)-聚乙二醇嵌段共聚物(peg-b-plc)、聚(乙交酯-己内酯)-聚乙二醇嵌段共聚物(peg-b-pgc)、聚(丁二酸己二酸丁二醇酯)(pbsa)或聚(己二酸对苯二甲酸丁二醇酯)(pbat)。

本发明中，步骤1)将混合物料制成管状物的方法可以是现有的多种方法，本发明优选利用带口模挤出机或制管机挤出成管的方法实现，制得的管状物最小外径为0.5mm。

本发明中，步骤2)所述的刚性纤维可以是现有的多种刚性纤维，本发明优选金属丝本发明中，步骤3)所述的牵引力可以利用现有的多种设备向管状物两端施加；优选采用拉力测试仪，对牵引力的控制方案如下：拉力测试仪的夹头夹住中空管向两端拉伸，拉伸速度可以控制。

本发明所述方法制备得到的用于神经修复的中空纤维导管是可降解的热熔性聚合物，外径在0.01～0.5mm之间，管壁厚度为0.02～0.2mm。用于对神经损伤的修复时，临床医生根据损伤神经直径的大小，可以很方便地选用不同数量的所述中空纤维制成的集束结构物用于植入，以满足损伤处缺损尺寸要求。

在此基础上，本发明进一步提供制备用于神经修复的集束结构物的方法，包括以下步骤：

a.用氨等离子体对本发明所述方法制备的中空纤维导管进行表面处理；进一步引入活性氨基官能团；

b.用可生物降解的水凝胶将至少2根a所述处理后的中空纤维导管粘接成束，得到所述的用于神经修复的集束结构物。

本发明优选的方案中，步骤b所述的可生物降解的水凝胶进一步含有水溶性神经再生药物。

所述的可生物降解的水凝胶可以选自任意一种含有被n-羟基琥珀酰亚胺活化的羧基的水凝胶；优选壳聚糖聚乙二醇交联水凝胶，其中聚乙二醇的端羧基被nhs活化。

所述的水溶性神经再生药物选自神经生长因子、神经节甘脂、软骨素酶abc或三磷酸胞苷二钠中的任意一种或两种以上的组合物；优选神经生长因子、或软骨素酶。

与现有技术相比，本发明的方法具有以下几方面有益效果：

1.本发明的方法可以制备直径较小直径的中空纤维，最小达到直径达到10微米。同时管壁也在变薄，最薄可以达到20微米，为神经长入提供了更大空间。

2.本发明中通过常温下向管状物施加“冷拉”的方式使管状物形成更细的中空纤维，因为“冷拉”使高分子材料结晶区域被破坏，结晶区和非结晶区高分子链段重新取向，在拉力撤除后中空纤维也不会回缩；该过程在中空纤维内外壁同时产生微米级二次取向结构，更有利于神经的诱导再生。而且本发明方法中插入刚性纤维的方法可以保证管子内径均匀。

3.本发明通过成型前与含氨基高聚物共混或成型后再进一步经氨等离子体表面处理的方式，在中空纤维导管中空纤维导管表面和内部充分引入活性氨基，可以增加水凝胶的粘附强度，有利于水凝胶将中空纤维束本身以及同周围组织粘结起来。

4.本发明的方法可快速、准确地制备不同规格的中空纤维，为临床应用提供更灵活的选择。应用中，根据损伤神经直径的大小，临床医生可以很方便地选择不同数量的中空纤维满足损伤处缺损尺寸要求；另外，水凝胶同中空纤维的粘附最短可以在数分钟内完成，操作极为简便。

5.本发明的方法中，耐温性神经再生药物和水溶性的神经再生药物可以分别负载于中空纤维导管基材或水凝胶中，提供了灵活的载药方式或释放速度。

附图说明

图1是实施例1制备的中空纤导管外表面的取向结构电镜照片。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但不应该将此理解为本发明所涉及的主题仅限于下述实施例。

以下实施例中所使用的所有化合物及试剂均为现有产品，或可由现有方法制备的产品。

实施例1：用于神经修复的集束结构物i的制备

具体包括以下步骤：

1.水凝胶前体溶液的配制

首先将水溶性壳聚糖配成2.5％(w/v)浓度溶液，将nhs-pclpeg5000pcl-nhs配成20(w/v)％浓度溶液。

2.具有二级取向结构中空纤维的制备

2.1选择断裂伸长率为的pcl(mn＝8万)为原料，在制管机上挤出获得外径为0.6mm、壁厚0.2mm的管状物。

2.2截取一定长度的管状物中间插入直径0.1mm的316l不锈钢钢丝，在管状物两端向相反方向施加牵引力，对管状物进行“冷拉”处理，“冷拉”使得管状物直径开始收缩、厚度变薄、直到管状物紧密包覆在钢丝外表面上，即管状物的内径达到钢丝的直径，得到内径为0.1mm的成型的纤维导管。拔出纤维导管内的不锈钢钢丝，得到中空纤维导管i。

3.氨等离子处理

利用氨等离子体对中空纤维导管i进行表面处理，在材料表面引入活性氨基官能团，同时改善材料表面亲水性，有利于水凝胶溶液的浸润，同时增强水凝胶和中空纤维导管的粘接强度。

4.中空纤维集束结构物的装配

4.1根据损伤部位的尺寸，选取不同长度和根数的中空纤维导管i集合成束；

4.2将步骤1制备的两种前体溶液共混，得到壳聚糖聚乙二醇交联水凝胶；

4.3用装载4.2制备的壳聚糖聚乙二醇交联水凝胶的注射器沿着4.1所得集束方向施胶。随着水凝胶粘度逐渐增大多根中空纤维导管被粘合成束，最终获得中空纤维导管表面引入活性氨基的集束结构物i，可供植入损伤部位用于修复。

实施例2：用于神经修复集束结构物ii的制备

具体包括以下步骤：

1.水凝胶前体溶液的配制

首先将水溶性壳聚糖配成2.5％(w/v)浓度溶液，将nhs-pclpeg5000pcl-nhs(mn＝7000)配成20(w/v)％浓度溶液。

2.具有二级取向结构的中空纤维的制备

2.1选择四臂支化pcl(mn＝7.6万)和pcl-poly(l-lysine)的共混物为原料，在制管机上挤出获得外径为0.6mm、壁厚0.2mm的管状物。

2.2截取一定长度的管状物中间插入直径0.2mm的316l不锈钢钢丝，在管状物两端施加反向牵引力，对管状物进行“冷拉”处理，“冷拉”使得管状物直径开始收缩、厚度变薄、直到管状物紧密包覆在钢丝外表面上，即管状物的内径达到钢丝的直径，得到内径为0.2mm的成型的纤维导管。拔出纤维导管内的不锈钢钢丝，得到管壁引入活性氨基的中空纤维导管ii。

3.中空纤维集束结构物的装配

3.1根据损伤部位的尺寸，选取不同长度和根数的中空纤维导管ii集合成束；

3.2将步骤1制备的两种前体溶液共混，而后加入edci进行混匀，得到壳聚糖聚乙二醇交联水凝胶；

3.3用装载3.2制备的壳聚糖聚乙二醇交联水凝胶的注射器沿着3.1所得集束方向施胶。随着水凝胶粘度逐渐增大多根中空纤维导管被粘合成束，最终获得中空纤维导管管壁引入活性氨基的集束结构物ii，可供植入损伤部位用于修复。

实施例3：用于神经修复集束结构物iii的制备

具体包括以下步骤：

1.水凝胶前体溶液的配制

分别配制四臂peg5000pcl-nhs和四臂peg5000pcl-nh2浓度为10％(w/t)pbs溶液。

2.具有二级取向结构的中空纤维的制备

2.1选择pcl(mn＝8万)和vb6的混合物为原料，在制管机上挤出获得外径为0.6mm、壁厚0.2mm的管状物。

2.2截取一定长度的管状物中间插入直径0.1mm的316l不锈钢钢丝，在管状物两端施加反向牵引力，对管状物进行“冷拉”处理，“冷拉”使得管状物直径开始收缩、厚度变薄、直到管状物紧密包覆在钢丝外表面上，即管状物的内径达到钢丝的直径，得到内径为0.1mm的成型的纤维导管。拔出纤维导管内的不锈钢钢丝，得到内部负载vb6中空纤维导管iii。

3.氨等离子处理

利用氨等离子体对中空纤维导管iii进行表面处理，在材料表面引入活性氨基官能团，同时改善材料表面亲水性，有利于水凝胶溶液的浸润，同时增强水凝胶和中空纤维导管的粘接强度。

4.中空纤维集束结构物的装配

4.1根据损伤部位的尺寸，选取不同长度和根数的中空纤维导管iii集合成束；

4.2将步骤1制备的两种前体溶液共混，得到聚乙二醇交联水凝胶；

4.3用装载4.2制备的聚乙二醇交联水凝胶的注射器沿着4.1所得集束方向施胶。随着水凝胶粘度逐渐增大多根中空纤维导管被粘合成束，最终获得在中空纤维导管内部负载vb6且表面引入活性氨基的集束结构物iii，可供植入损伤部位用于修复。

实施例4：用于神经修复集束结构物iv的制备

具体包括以下步骤：

1.水凝胶前体溶液的配制

分别配制四臂peg5000pcl-nhs和四臂peg5000pcl-nh2浓度为10％(w/t)pbs溶液。

2.具有二级取向结构的中空纤维的制备

2.1选择pcl(mn＝8万)和叶酸的混合物为原料，在制管机上挤出获得外径为0.5mm、壁厚0.3mm的管状物。

2.2截取一定长度的管状物中间插入直径0.05mm的316l不锈钢钢丝，在管状物两端施加反向牵引力，对管状物进行“冷拉”处理，“冷拉”使得管状物直径开始收缩、厚度变薄、直到管状物紧密包覆在钢丝外表面上，即管状物的内径达到钢丝的直径，得到内径为0.05mm的成型的纤维导管。拔出纤维导管内的不锈钢钢丝，得到内部负载叶酸的中空纤维导管iv。

3.中空纤维集束结构物的装配

3.1根据损伤部位的尺寸，选取不同长度和根数的中空纤维导管iv集合成束；

3.2将步骤1制备的两种前体溶液共混，得到聚乙二醇交联水凝胶；再向水凝胶内加入神经生长因子，混合均匀备用；

3.3用装载3.2制备的聚乙二醇交联水凝胶的注射器沿着3.1所得集束方向施胶。随着水凝胶粘度逐渐增大多根中空纤维导管被粘合成束，最终获得中空纤维导管内部负载叶酸且水凝胶内负载神经生长因子的集束结构物iv，可供植入损伤部位用于修复。

实施例5：用于神经修复集束结构物v的制备

具体包括以下步骤：

1.水凝胶前体溶液的配制

分别配制四臂peg5000pcl-nhs和四臂peg5000pcl-nh2浓度为10％(w/t)pbs溶液。

2.具有二级取向结构的中空纤维的制备

2.1选择四臂支化pcl(mn＝7.6万)、pcl-poly(l-lysine)和vb6的共混物为原料，在制管机上挤出获得外径为0.5mm、壁厚0.1mm的管状物。

2.2截取一定长度的管状物中间插入直径0.01mm的316l不锈钢钢丝，在管状物两端施加反向牵引力，对管状物进行“冷拉”处理，“冷拉”使得管状物直径开始收缩、厚度变薄、直到管状物紧密包覆在钢丝外表面上，即管状物的内径达到钢丝的直径，得到内径为0.01mm的成型的纤维导管。拔出纤维导管内的不锈钢钢丝，得到内部负载vb6且引入活性氨基的中空纤维导管v。

3.氨等离子处理

利用氨等离子体对中空纤维导管v进行表面处理，在材料表面进一步引入活性氨基官能团，同时改善材料表面亲水性，有利于水凝胶溶液的浸润，同时增强水凝胶和中空纤维导管的粘接强度。

4.中空纤维集束结构物的装配

4.1根据损伤部位的尺寸，选取不同长度和根数的中空纤维导管v集合成束；

4.2将步骤1制备的两种前体溶液共混，得到聚乙二醇交联水凝胶；再向水凝胶内加入神经生长因子，混合均匀备用；

4.3用装载4.2制备的聚乙二醇交联水凝胶的注射器沿着4.1所得集束方向施胶。随着水凝胶粘度逐渐增大多根中空纤维导管被粘合成束，最终获得中空纤维导管内部负载vb6和活性氨基、导管表面引入活性氨基且水凝胶内负载神经生长因子的集束结构物v，可供植入损伤部位用于修复。