一种柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料及其制备方法与流程

本发明涉及一种柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料及其制备方法，属于生物医用材料骨组织工程支架领域。

背景技术：

随着科技的进步，医学水平在不断提高，医用材料越来越来受到广泛的重视，其中利用人工骨替代材料来修复、替代骨缺损成为医学骨科领域的研究重点，也是治疗由于严重创伤、先天缺陷、骨肿瘤、骨髓炎等骨科疾病的有效手段。

由于聚乳酸具有易塑性，并且良好的生物相容性和可降解性，降解产物的绿色无毒，在生物医学领域受到重视，当今临床应用中也常常将聚乳酸与无机钙盐复合的骨修复材料用于治疗骨损伤。作用机理一方面聚乳酸作为基质材料提供支架结构，支撑骨组织，另一方面钙盐组分作为骨愈合初期钙离子提供来源，具有骨诱导和骨传导作用，利于骨组织的修复。目前，该类复合材料的研究成果已十分显著。

现如今使用较多的钙盐组分与聚乳酸复合有羟基磷灰石、磷酸三钙、磷酸氢钙等。羟基磷灰石属无机粒子，生物降解性较差，一般降解周期为1~2年甚至更长。从原理上来看，羟基磷灰石以及磷酸三钙等钙盐属于无机组分，表面亲水而憎油，这与聚合物基质的特性恰恰相反，这种差异易引起颗粒与聚合物的界面相容性差、导致结合界面不稳定、颗粒分散均匀性差且易团聚。为此，杨春瑜等人在改性羟基磷灰石/聚乳酸复合材料制备及其生物相容性评价中(杨春瑜,杨春莉,田晓红,等.改性羟基磷灰石/聚乳酸复合材料制备及其生物相容性评价[j].西安交通大学学报,2010,44(12):114-118.)，采用硅烷偶联剂十八烷基三氯硅烷(ots)对羟基磷灰石颗粒进行了表面改性，通过热诱导相分离法制备了ots-ha/plla多孔复合材料，改善了聚乳酸与羟基磷灰石之间的界面相容性，但方法涉及改性，过于复杂，工艺繁琐，且硅烷偶联剂的引入对材料的生物相容性存在一定程度影响，并不适用于生产或后续应用中。诸如此类的问题和不足就需要研究新的方向，为进一步实现临床治疗应用提供新的思路和方法。

柠檬酸钙是一种有机钙盐，其饱和溶液的钙离子浓度为5.14mmol/l，与有利于成骨细胞增殖分化的钙离子浓度相适应，是一种理想的可用于骨修复的材料。柠檬酸钙能在体内降解并被吸收，且降解吸收过程中并不明显的改变人体体液ph值，降解过程释放钙离子也平稳高效，利于有效的吸收。本课题组之前通控制合成柠檬酸钙（中国专利201410061265.2；201410612150.8；201410612039.9；201410612989.1），使柠檬酸钙的形态特征和降解特性得到调控，便于复合以应用于骨修复领域中，并已在无机体系中得到应用体现。例如，li等在preparationandpropertiesofcalciumcitratenanosheetsforbonegraftsubstitute(lij,liuy,gaoy,etal.preparationandpropertiesofcalciumcitratenanosheetsforbonegraftsubstitute[j].bioengineered,2016,7(5):376-381.)中提出了一种方便有效的方法合成纳米级片状柠檬酸钙，并研究了柠檬酸钙作为骨修复材料的应用。在随后的细胞和动物实验表明，柠檬酸钙可以促进新骨的形成。中国发明201511008235.6提供了一种含柠檬酸钙的骨水泥及其制备方法，该发明提供的含柠檬酸钙的骨水泥具有良好的骨引导性和骨诱导活性，但仍存在一定缺陷，比如力学性能较差，成型能力有限等。

通过以上研究我们发现，当柠檬酸钙单独作为骨修复材料应用，降解速度过快，长期疗效不显著等无法回避的问题目前仍未得到很好的解决。柠檬酸钙与无机体系复合也存在力学性能差，且无法与体内降解速度相匹配等问题。

于是，本发明采用易塑型，具有良好生物相容性和生物降解性能的聚乳酸与柠檬酸钙复合，制备柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨修复材料。一方面，由于柠檬酸钙是有机钙盐，与高分子有一个良好的亲和性，不同于磷酸三钙或羟基磷灰石与高分子亲和性不佳等情况，可与聚乳酸在不经过改性的情况下均匀共混分散制备复合材料，体现出良好的界面亲和性，同时基于聚乳酸基体的协调降解，可以解决普通柠檬酸钙粉降解过快，无法与新骨形成时间达成一致的问题。另一方面，聚乳酸自身在降解过程中，降解产物偏酸性，容易在体内引发炎症，从而一定程度上限制了其应用。而柠檬酸钙降解环境则相对偏碱性，在此基础上基于聚乳酸可达成一个良好适宜的可协调降解环境，可与聚乳酸降解导致的偏酸性环境相互抵消，提供更适宜骨修复的微环境。

本发明提供的一种柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料孔径大小为15~150μm，与骨细胞表面孔隙大小相匹配，易于加工，可降解，且在降解过程中能够平稳释放钙离子，提供适宜新骨生成的离子环境，促进新生骨组织的生长，诱导成骨细胞的生成。另外，还可以通过调节分子量结构和组成等手段可改善复合材料降解速度，以满足不同的临床要求。本发明制备的一种柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料为骨组织工程支架材料领域提供一种可行有效的新材料，有利于扩展骨修复材料领域应用和发展。

技术实现要素：

本发明针对现有骨组织工程支架复合材料的不足，提供一种柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料。该复合材料由聚乳酸和柠檬酸钙组成，柠檬酸钙为四水合柠檬酸钙，聚乳酸分子量为10~20万。以质量百分比计，柠檬酸钙含量为1~50%，其余为聚乳酸含量。其中，本发明提供的柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料的孔隙率为50~71%，孔隙大小为15~600μm。

本发明所述的一种柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料的制备方法，具体步骤如下：

(1)分别称量聚乳酸与对应复合比例的柠檬酸钙；

(2)用量筒量取二氯甲烷倒入烧杯中，将称量好的聚乳酸倒入烧杯中，搅拌至完全溶解得到呈透明状态的聚乳酸溶液；搅拌转速为100~300r/min；

(3)将对应比例所称量好的柠檬酸钙倒入(2)所述的聚乳酸溶液；

(4)将烧杯放入超声振动器中进行加热超声分散30~60min，加热温度为60~100℃，超声完成后得到白色乳浊状混合物；

(5)待(4)的白色乳浊状混合物注入到模具中进行成型；

(6)室温下放置12~24小时或放置于60~100摄氏度的加热板上30~60分钟，待溶剂蒸发完毕，即得柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料。

本发明的有益效果为：

本发明提供一种柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料。该复合体系，可以解决无机钙盐与聚乳酸亲和性不够好且降解较慢的问题，也可以解决柠檬酸钙粉体降解过快而无法与新骨形成时间达成一致的问题，并且柠檬酸钙降解形成的弱碱性环境可以中和聚乳酸降解形成的弱酸性环境，提供更适宜骨组织修复的离子微环境。由于柠檬酸钙和聚乳酸良好的亲和性使二者不用改性即可良好混合形成均匀分散的复合材料，并具有良好的力学性能和成型加工性能，同时二者复合能体现出良好的生物相容性，并且在骨修复的较长时间内随材料降解提供一个稳定适宜的钙离子环境，以促进新生骨组织的生长，表现出骨诱导和骨传导性能。

因此，本发明提供的一种柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料，具有均匀的孔隙大小与分布，与骨表面孔隙大小相匹配，并且能在骨修复初期提供一个平稳适宜的钙离子环境，具有良好的生物相容性、适宜的生物降解性、无生物毒性、同时具有良好的骨传导性和骨诱导性；另外，还可以通过调节分子量结构和组成等手段可改善复合材料降解速度，以满足不同的临床要求。本发明制备的一种柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料可用作骨修复组织工程支架材料等，适用于骨损伤修复医用材料领域，为骨修复材料领域提供一种可行有效的新的骨修复材料.。

附图说明：

图1为本发明实施例1的柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料的xrd图；

图2为本发明实施例1的柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料的sem图；

图3为本发明实施例1的柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料37℃浸泡sbf模拟体液7天后的sem图片；

图4为本发明实施例1-5的柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料浸泡在ph=7.4的pbs磷酸缓冲溶液中的降解情况图。

图5为本发明实施例6的柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料浸泡在ph=7.4的pbs磷酸缓冲溶液中的降解情况图。

图6为本发明实施例7的柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料的sem图；

具体实施方式：

下面将结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。

实施例1：

本实施例柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料由聚乳酸和柠檬酸钙组成，以质量百分比计，柠檬酸钙的含量为20%，其余为聚乳酸；其中柠檬酸钙为四水合柠檬酸钙，聚乳酸分子量为10万。具体步骤如下：

(1)分别称量聚乳酸8克与对应复合比例的柠檬酸钙2克；

(2)用量筒量取二氯甲烷50毫升倒入烧杯中，将称量好的聚乳酸倒入烧杯中，200r/min转速搅拌至完全溶解，聚乳酸溶液呈现透明状态；

(3)将对应比例所称量好的柠檬酸钙倒入（2）所述的聚乳酸溶液中；

(4)将烧杯放入超声振动器中进行加热超声分散30分钟，加热温度为60℃，超声完成后，溶液呈现白色乳浊状混合物；

(5)超声分散完成后，将烧杯取出，待5分钟自然冷却至室温后，将其注入到模具中进行成型。

(6)室温下放置12小时，待溶剂完全蒸发，即得柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料。

利用电子密度天平进行孔隙率测定本实例中制备的柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料的孔隙率为59.16%。

图1为本实例中制备的一种柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料的xrd谱图。

图2为本实例中制备的一种柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料的sem图片，从图中可以看出，材料具有连通的孔隙结构，孔径大小在微米级别，范围大致为15~100μm。

将本实例所制备的一种柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料37℃恒温浸泡于sbf模拟体液中，经过7天后取样后再通过扫描电子显微镜进行观察。图3即为本实例做制备的柠檬酸钙/聚乳酸多孔复合骨组织工程支架材料浸泡sbf模拟体液7天后的sem图片。通过图3可以看到，浸泡模拟体液7天后的一种柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料表面观察到新的沉积物。

将本实例中制备的柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料通过浸泡在ph=7.4的pbs磷酸缓冲溶液中，来测定一种柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料在磷酸盐缓冲溶液中的降解情况。每隔两天测定一次样品的干重，观察制备的一种柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料在pbs磷酸缓冲溶液中28d的降解情况（图4）。

实施例2：

本实施例柠柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料由聚乳酸和柠檬酸钙组成，以质量百分比计，柠檬酸钙的含量为1%，其余为聚乳酸；其中柠檬酸钙为四水合柠檬酸钙，聚乳酸分子量为10万。具体步骤如下：

(1)分别称量聚乳酸9.9克与对应复合比例的柠檬酸钙0.1克；

(2)用量筒量取二氯甲烷50毫升倒入烧杯中，将称量好的聚乳酸倒入烧杯中，100r/min转速搅拌至完全溶解，聚乳酸溶液呈现透明状态；

(3)将对应比例所称量好的柠檬酸钙倒入（2）所述的聚乳酸溶液中；

(4)将烧杯放入超声振动器中进行加热超声分散30分钟，加热温度为60℃，超声完成后，溶液呈现白色乳浊状混合物；

(5)超声分散完成后，将烧杯取出，待5分钟自然冷却至室温后，将其注入到模具中进行成型。

(6)室温下放置24小时，待溶剂完全蒸发，即得一种柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料。

利用电子密度天平进行孔隙率测定本实例中制备的柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料的孔隙率为70.68%。

实施例3：

本实施例柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料由聚乳酸和柠檬酸钙组成，以质量百分比计，柠檬酸钙的含量为30%，其余为聚乳酸；其中柠檬酸钙为四水合柠檬酸钙，聚乳酸分子量为10万。具体步骤如下：

(1)分别称量聚乳酸8克与对应复合比例的柠檬酸钙8克；

(2)用量筒量取二氯甲烷50毫升倒入烧杯中，将称量好的聚乳酸倒入烧杯中，200r/min转速搅拌至完全溶解，聚乳酸溶液呈现透明状态；

(3)将对应比例所称量好的柠檬酸钙倒入（2）所述的聚乳酸溶液中；

(4)将烧杯放入超声振动器中进行加热超声分散30分钟，加热温度为60℃，超声完成后，溶液呈现白色乳浊状混合物；

(5)超声分散完成后，将烧杯取出，待5分钟自然冷却至室温后，将其注入到模具中进行成型。

(6)室温下放置12小时，待溶剂完全蒸发，即得一种柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料。

利用电子密度天平进行孔隙率测定本实例中制备的柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料的孔隙率为56.86%。

实施例4：

本实施例柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料由聚乳酸和柠檬酸钙组成，以质量百分比计，柠檬酸钙的含量为40%，其余为聚乳酸；其中柠檬酸钙为四水合柠檬酸钙，聚乳酸分子量为10万。具体步骤如下：

(1)分别称量聚乳酸6克与对应复合比例的柠檬酸钙4克；

(2)用量筒量取二氯甲烷50毫升倒入烧杯中，将称量好的聚乳酸倒入烧杯中，300r/min转速搅拌至完全溶解，聚乳酸溶液呈现透明状态；

(3)将对应比例所称量好的柠檬酸钙倒入（2）所述的聚乳酸溶液中；

(4)将烧杯放入超声振动器中进行加热超声分散40分钟，加热温度为80℃，超声完成后，溶液呈现白色乳浊状混合物；

(5)超声分散完成后，将烧杯取出，待5分钟自然冷却至室温后，将其注入到模具中进行成型。

(6)室温下放置12小时，待溶剂完全蒸发，即得一种柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料。

利用电子密度天平进行孔隙率测定本实例中制备的柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料的孔隙率为53.79%。

实施例5：

本实施例柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料由聚乳酸和柠檬酸钙组成，以质量百分比计，柠檬酸钙的含量为50%，其余为聚乳酸；其中柠檬酸钙为四水合柠檬酸钙，聚乳酸分子量为10万。具体步骤如下：

(1)分别称量聚乳酸5克与对应复合比例的柠檬酸钙5克；

(2)用量筒量取二氯甲烷50毫升倒入烧杯中，将称量好的聚乳酸倒入烧杯中，300r/min转速搅拌至完全溶解，聚乳酸溶液呈现透明状态；

(3)将对应比例所称量好的柠檬酸钙倒入（2）所述的聚乳酸溶液中；

(4)将烧杯放入超声振动器中进行加热超声分散60分钟，加热温度为100℃，超声完成后，溶液呈现白色乳浊状混合物；

(5)超声分散完成后，将烧杯取出，待5分钟自然冷却至室温后，将其注入到模具中进行成型。

(6)室温下放置12小时，待溶剂完全蒸发，即得一种柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料。

利用电子密度天平进行孔隙率测定本实例中制备的柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料的孔隙率为52.06%。

实施例6：

本实施例柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料由聚乳酸和柠檬酸钙组成，以质量百分比计，柠檬酸钙的含量为20%，其余为聚乳酸；其中柠檬酸钙为四水合柠檬酸钙，聚乳酸分子量为20万。具体步骤如下：

(1)分别称量聚乳酸8克与对应复合比例的柠檬酸钙2克；

(2)用量筒量取二氯甲烷50毫升倒入烧杯中，将称量好的聚乳酸倒入烧杯中，200r/min转速搅拌至完全溶解，聚乳酸溶液呈现透明状态；

(3)将对应比例所称量好的柠檬酸钙倒入（2）所述的聚乳酸溶液中；

(4)将烧杯放入超声振动器中进行加热超声分散30分钟，加热温度为60℃，超声完成后，溶液呈现白色乳浊状混合物；

(5)超声分散完成后，将烧杯取出，将其注入到模具中进行成型。

(6)室温下放置12小时，待溶剂完全蒸发，即得柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料。

利用电子密度天平进行孔隙率测定本实例中制备的柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料的孔隙率为56.18%。

将本实例中制备的柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料通过浸泡在ph=7.4的pbs磷酸缓冲溶液中，来测定柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料在磷酸盐缓冲溶液中的降解情况。每隔两天测定一次样品的干重，观察制备的柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料的在pbs磷酸缓冲溶液中56d的降解情况（图5）。

本实例与实例1的区别在于聚乳酸分子量为20万，通过降解情况可以看到聚乳酸分子量的差异会导致其降解速度有所差异。因此本发明提供的柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料可以通过调节聚乳酸分子量等手段来改善复合材料降解速度，以满足不同的临床要求。

实施例7：

本实施例柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料由聚乳酸和柠檬酸钙组成，以质量百分比计，柠檬酸钙的含量为50%，其余为聚乳酸；其中柠檬酸钙为四水合柠檬酸钙，聚乳酸分子量为10万。具体步骤如下：

(1)分别称量聚乳酸5克与对应复合比例的柠檬酸钙5克；

(2)用量筒量取二氯甲烷50毫升倒入烧杯中，将称量好的聚乳酸倒入烧杯中，300r/min转速搅拌至完全溶解，聚乳酸溶液呈现透明状态；

(3)将对应比例所称量好的柠檬酸钙倒入（2）所述的聚乳酸溶液中；

(4)将烧杯放入超声振动器中进行加热超声分散60分钟，加热温度为100℃，超声完成后，溶液呈现白色乳浊状混合物；

(5)超声分散完成后，将烧杯取出，将其注入到模具中进行成型。

(6)将模具放置于温度为60℃加热板上30分钟，待溶剂完全蒸发，即得一种柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料。

图6为本实例中制备的柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料的sem图片，从图中可以看出，材料具有连通孔隙结构，孔径大小在微米级别，范围大致为200~600μm。

利用电子密度天平进行孔隙率测定本实例中制备的柠檬酸钙/聚乳酸复合多孔骨组织工程支架材料的孔隙率为58.96%。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围。