香蕉叶提取物的制备方法和抗基孔肯雅病毒应用与流程

本发明属于基孔肯雅病毒治疗技术领域，尤其涉及一种香蕉叶提取物的制备方法和抗基孔肯雅病毒应用。

背景技术：

病毒为自然界微生物的一种，按核酸类型分为dna病毒和rna病毒两种，其在自然界中分布广泛，可感染细菌、真菌、植物、动物和人，常引起宿主发病。由病毒引起的人患疾病很多，基孔肯雅热(chikungunyafever)为其中一种。

基孔肯雅热是由基孔肯雅病毒(chikungunyavirus,chikv)引起的一种蚊媒传染病，主要特点是发热、头痛、肌肉痛、皮疹和关节疼痛。在其他症状消失后，一些患者的关节疼痛可持续多年，症状严重者只能保持弯曲体位，最初流行于非洲的热带和亚热带地区，并不断扩展到南亚、东南亚、印度洋岛屿及美洲地区。在过去十几年中，基孔肯雅热的暴发次数增多，流行范围不断扩大，已在全球100多个国家和地区出现，造成全球范围内每年大约100万人感染。

目前，基孔肯雅热尚无疫苗可供预防，临床上还没有确切有效的病原治疗药物，只能以对症治疗为主，因此研究抗基孔肯雅病毒药物为目前工作的重点。

香蕉(musananalour.)是芭蕉科芭蕉属多年生大型单子叶草本植物，广泛分布于南北纬30°以下的热带、亚热带地区。香蕉属高热量水果，果肉富含碳水化合物、蛋白质、脂肪、膳食纤维、多种微量元素以及维生素，为仅次于水稻、小麦和玉米的世界第四大粮食作物。大约有136个国家和地区生产香蕉，主产区集中在印度、菲律宾、中国、巴西等国。近年来，世界香蕉收获面积和产量均呈不断增长的趋势，在收获大量香蕉产品的同时也产生几乎等量的香蕉茎叶等农业废弃物。为此，如何对香蕉茎叶进行回收利用已成为一个亟待解决的课题。香蕉茎叶体积大，因而收集劳动强度高；含水量高，既不能直接燃烧又增加运输成本；但其本身具有较高的生物量，营养物质丰富，拥有巨大的开发潜力。目前大部分的香蕉茎秆、叶片等被用作饲料、肥料，或者用来生产低档纸、粗布、包装绳等产品，进一步则可发酵生产沼气或者酒精。而其药用价值的开发则鲜有报道，特别是用于抗病毒的研究则未见相关报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种香蕉叶提取物的制备方法和抗基孔肯雅热病毒应用，以充分发掘废弃物香蕉叶的医药价值，为治疗基孔肯雅热开辟中草药途径。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

香蕉叶提取物在制备抗基孔肯雅热病毒药物中的应用。

香蕉叶提取物为香蕉叶的乙醇提取物。

香蕉叶提取物的制备方法，取香蕉叶加乙醇超声提取，过滤，抽滤，滤液旋蒸回收溶剂至浓缩液状后，离心至干膏即得。

香蕉叶为香蕉叶绿色叶片部位鲜品。

乙醇为体积浓度95％的乙醇，加入量为8倍香蕉叶重量。

超声提取2h，旋蒸温度为40℃。

针对目前农作物废弃物香蕉叶价值尚未得到有效开发的问题，发明人经深入研究发现，香蕉叶的乙醇提取物具有一定的抑制登基孔肯雅病毒作用。据此，发明人还建立了香蕉叶乙醇提取物的相应提取方法。实验表明，香蕉叶乙醇提取物具有抗基孔肯雅病毒效果，其对基孔肯雅病毒ic50为8.73μg/ml。可见，香蕉叶具有抗基孔肯雅热药物的潜在价值。因此，本发明为进一步开辟香蕉叶的医药应用提供了有力依据和可靠保障，可提高香蕉资源利用率，减少资源浪费；也为治疗基孔肯雅热开辟了中草药途径，以降低药物生产成本。

附图说明

图1是本发明香蕉叶的乙醇提取物抗登革病毒空斑试验结果图。

图2是本发明香蕉叶的乙醇提取物抗基孔肯雅病毒空斑试验结果图。

图3是本发明香蕉叶的乙醇提取物对登革病毒及基孔肯雅病毒抑制率结果图。

具体实施方式

一、实验材料

1.香蕉叶提取物

取香蕉叶绿色叶片部位鲜品100.00g，加8倍量95％乙醇，超声提取2h，过滤后定性滤纸抽滤，取滤液置于旋转蒸发仪上40℃回收溶剂，至浓缩液状后，置于40℃离心浓缩，得787.40mg干膏备用。

2.病毒株

登革病毒、基孔肯雅病毒。

3.细胞株

人肝癌细胞huh-7、人宫颈癌细胞hela、乳仓鼠肾细胞bhk21。

4.主要试剂与仪器

dmem培养基、rpmi-1640培养基、fbs、trypsin、alamarblue、细胞培养板、dmso、结晶紫溶液、离心浓缩仪、旋转蒸发仪、生物安全柜、co2培养箱、移液枪、酶标仪。

二、实验方法

1.药物细胞毒性试验

(1)取对数生长期的huh-7(hela)肿瘤细胞适量至75ml培养瓶中，37℃培养至细胞生长状态良好，trypsin消化细胞后按6.5×10³个/孔(1.3×10⁴个/孔)的细胞量接种于96孔板中，继续培养24h，备用。

(2)将各提取物用dmso溶解之后，用含血清的dmem培养基配制成药物浓度为100.00μg/ml、50.00μg/ml、25.00μg/ml、12.50μg/ml、6.25μg/ml的含药培养基，备用。0.1％dmso作为溶剂对照。

(3)取出已经培养24h的细胞，倾去96孔板中的培养基，加入含药物培养基，每个样品每个浓度设3个平行，另设模型组及溶剂对照组，模型组加入不含药培养基，溶剂对照组加入含0.1％dmso的培养基，均设3个平行，继续37℃培养48h。

(4)取出培养48h后的细胞，倾去培养基，均加入100μl(1:10配置)的alamarbule溶液，另取三个孔加入相同量的alamarblue溶液作为空白组，37℃孵育2h(以模型组颜色完全变化为粉红色为度)，取出后于酶标仪(激发波长570nm，发射波长585nm)检测荧光度值。

计算公式为：(含药物组荧光度值平均值-空白组荧光度值平均值)/(模型组荧光度值平均值-空白组荧光度值平均值)×100％

2.抗病毒药效试验

(1)取培养至对数生长期的huh-7(hela)细胞，消化后按5×10⁴个/孔(7×10⁴个/孔)的量加至24孔板中，培养24h。

(2)取出培养了24h的24孔板，倾去每个孔中的培养基。37℃水浴解冻denv-2(chikv)病毒30s～1min，用dmem培养基配制成含病毒为5×10⁵pfu/ml(7×10⁵pfu/ml)的稀释液，往每孔加入100μl病毒稀释液使接种于24孔板中每个孔的病毒单位为5×10⁴pfu(7×10⁴pfu)，37℃孵育1h，取出后加pbs清洗两次。然后进行给药，香蕉叶提取物给药浓度参考细胞毒性实验中的安全浓度(给药后huh-7/hela细胞存活率≥80％)，即为6.25μg/ml、12.50μg/ml、25.00μg/ml、50.00μg/ml。设三个平行孔，以0.1％dmso为溶剂对照组，每孔给药体积1ml。37℃培养48h，培养结束后将每个孔中的培养基吸出装至1.5ml的离心管中做标记后，-80℃保存。

(3)取处于对数生长期的bhk21细胞，消化后按5×10⁴个/孔的量加至24孔板中，每个流分每个浓度需要接种6孔，培养24h。培养结束后取出，倾倒培养基。取出(2)项下-80℃保存的含病毒样本，每个样品均需按10倍梯度稀释成6个浓度，分别为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6，将每个稀释后的含病毒稀释液分别按100μl/孔的剂量加入至培养好的bhk21细胞中，37℃孵育1h，取出后加入pbs清洗两次，之后再加入培养基(1％cmc+2％fbs)1ml/孔。37℃培养6d(4d)。取出后倒去培养基，加入结晶紫溶液，摇床震摇过夜。倒去结晶紫溶液，清水清洗后擦干，进行空斑计数。

(4)取已擦干的24孔板，肉眼计数，记录空斑数量为1～20个之间的孔相应的空斑数，按给药组与对照组的总空斑数的对数值进行比较(总空斑数＝肉眼空斑数×对应的稀释倍数×10)，以对照组空斑数对数值的均值-给药组空斑数对数值的均值≥1为药物在该浓度下具有显著抗病毒作用，若1≥对照组空斑数对数值的均值-给药组空斑数对数值的均值≥0.5则表示药物在该浓度下具有抗病毒效果，同时根据抑制率计算ic50值。

三、实验结果

如图1至图3所示，香蕉叶提取物给药浓度大于或等于12.50μg/ml时具有抗病毒效果，给药浓度为50.00μg/ml时均能完全抑制病毒增殖，香蕉叶对登革病毒ic50为3.79μg/ml，对基孔肯雅病毒ic50为8.73μg/ml。