本发明是关于从桑白皮、桑枝、桑叶中提取桑根酮D的制备方法及医药新用途，具体的说是桑根酮D单一成分具有抑制黄嘌呤氧化酶的应用，可在制备抗痛风、抗高尿酸血症药物中的应用，也涉及该药物的药物制剂，本发明属于医药技术领域。
背景技术：
痛风是一种嘌呤代谢紊乱导致尿酸形成的常见病，已被联合国列为21世纪20大顽症之一。最新的流行病学研究表明，我国痛风发病率逐年上升，已高于世界平均水平，传统的抗痛风药物—促尿酸排泄药(如丙磺舒、苯溴马隆等)常伴随有皮疹、发热、肾脏损害等副作用。黄嘌呤氧化酶抑制剂可以减少自由基造成的应激反应或对组织的伤害，也可以减少人体内尿酸的形成。研究发现以黄嘌呤氧化酶为作用靶点的抑制剂有很好的抗痛风作用，是治疗痛风的重要药物并能减少一些致命的痛风并发症。
黄嘌呤氧化酶抑制剂作为抗痛风药物，主要是上世纪60年代上市的别嘌呤醇，虽然一直沿用至今但是它有很多的副作用，应用后病人可有发热、过敏性皮疹、腹痛、腹泻、白细胞及血小板减少，甚至有肝功能损伤等副作用(黄嘌呤氧化酶抑制剂的研究进展，国外医学药学分册，2006，33(5)，351-353)。因此，研究新的黄嘌呤氧化酶抑制剂有十分重要的意义。我们发现新的黄嘌呤氧化酶抑制剂—桑根酮D，为从桑属植物桑白皮、桑枝、桑叶中提取分离得到。
有文献报道了桑枝的提取物具有降血脂作用(喻燕，西南大学，2017，硕士论文)；张晓丽研究报道了，桑枝提取物具有抑制脂肪酶活性(中国中药杂志，2012年，第37卷，第9期，1323页)；CN103156869A公开了一种从桑白皮、桑枝、桑叶中提取的桑根酮C、桑根酮D及以桑根酮C、桑根酮D为主要成分的组合物的医药新用途，具体的说是桑根酮C、桑根酮D单一成分及桑根酮C、桑根酮D与桑皮素、桑皮苷、氧化白藜芦醇、白藜芦醇、脱氧野尻霉素组成的组合物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂药物中的应用；王彩萍研究表明，桑枝提取物具有调节有机离子转运改善高尿酸血症的作用，这种提取物是一种粗提物，没有明确粗体物的化学成分，是一种复杂的混合物。
本发明首次发现从桑属植物中提取的桑根酮D具有抑制黄嘌呤氧化酶的活性。本发明完成前未发现有关桑根酮D作为黄嘌呤氧化酶抑制剂、在预防和治疗痛风方面应用的报道，本发明具有广泛的应用前景。
技术实现要素：
本发明的目的是首次发现了从桑白皮、桑枝、桑叶中提取的桑根酮D具有抑制黄嘌呤氧化酶的活性，具有在制备抗痛风、抗高尿酸血症药物中的新用途，具有明显的创新性和技术进步。
本发明的另一目的及特点是：桑根酮D具有抑制黄嘌呤氧化酶作用与以往文献报道桑枝提取物具有更加明显的药理活性，以往报道的提取物是粗提取物，所以具体的活性成分不清楚；本发明是成分明确，具有明显的技术进步和创新性。
本发明的另一目的是，提供一种桑根酮D制备方法：桑白皮或桑枝或桑叶粉碎成粗粉，用6～10倍量30-40％乙醇溶液回流提取2-3次，提取液直接通过大孔树脂柱，先用30-40％乙醇洗脱1～3个柱体积，弃去洗脱液，再用50～80％乙醇溶液洗脱2～5个柱体积，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩液加酸调pH为1～4，放置沉淀；沉淀物用5～10倍量有机溶剂回流，趁热过滤，加入硅胶柱，丙酮水溶液梯度洗脱，收集有效成分，回收丙酮放置结晶；粗结晶物滤出，以甲醇-水(70-30)为流动相，通过C18柱，收集，有效组分，合并，得桑根酮D。
本制备方法首次采用提取液不经过浓缩直接进行大孔树脂分离，除去杂质，解决了提物液经过浓缩导致有效成分析出，经过大孔树脂后损失严重的情况，提高了有效成分的收率，具有明显的技术进步和创新性。
而现有技术中，桑根酮D仅仅报道了具有抑制α-葡萄糖苷酶的作用及抑制脂肪酶的作用，但是对抑制黄嘌呤氧化酶的作用还未见报道。
本发明所述桑根酮D的纯度为95％-98％，例如可以是95％、96％、97％、98％等。本发明提供的桑根酮D的在上述纯度范围内，可以安全有效地进行应用。一般地，桑根酮D纯度在90％以上均可以达到正常的药理效果。
优选地，所述药物的剂型包括混悬剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、片剂、乳剂、溶液剂、滴丸剂、注射剂、栓剂、灌肠剂、气雾剂、贴剂或滴剂中的任意一种。
优选地，所述药物还包括药理学上可接受的辅料。
优选地，所述辅料包括载体、稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。
在本发明中，所述药物的剂型包括混悬剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、片剂、乳剂、溶液剂、滴丸剂、注射剂、栓剂、灌肠剂、气雾剂、贴剂或滴剂中的任意一种。
在本发明中，药物的给药方式可以选择多种方式。例如可以是口服给药、经直肠、非消化道或局部给药等等。
本发明的药效学试验证明，桑根酮D具有比桑枝提取物具有更强的抑制黄嘌呤氧化酶作用(在浓度为0.5mg/ml时，桑根酮D抑制率为78.69％，桑枝提取物抑制率为10.18％)，这一结果也是本发明的另一个明显的技术进步、创新性和突出贡献。
由于本发明首次公开了桑根酮D具有抑制黄嘌呤氧化酶作用，因此，将桑根酮D单独或与其它活性组份或辅料配合制成药剂，只要是该药剂用于预防和治疗痛风及高尿酸血症，均属于本发明的保护范围。本发明的组合物在制成任何一种剂型时，均具有预防和治疗痛风、高尿酸血症的作用。
本发明提供的桑根酮D的应用，具有以下几点优势：1.原料价廉易得：以廉价的桑白皮、桑枝、桑叶为原料，经提取获得，工艺简单可行，且桑根酮D在桑白皮中含量较高；2.抑制活性强；3.安全性高：桑白皮、桑枝、桑叶是批准的可作为保健食品的物品之一，具有良好的安全性，避免了制备的治疗痛风药物的副作用。
由桑根酮D具有抑制黄嘌呤氧化酶作用，通过以下药效学实验得到证实。
1、实验原理
黄嘌呤氧化酶能催化黄嘌呤，形成尿酸。如果化合物能对黄嘌呤氧化酶有抑制作用，则黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤的量就会减少，相应生成的尿酸就会减少，相应的吸光度就会减小。
2、实验材料
本药效学试验用到的桑根酮D、桑枝提取物均为自制，别嘌呤醇、黄嘌呤，黄嘌呤氧化酶购于sigma公司。KH2PO4、K2HPO4、NaOH、二甲基亚砜(DMSO)为分析纯，蒸馏水。
3、体外活性测试方法
1)缓冲液的配制：精密称取0.9560g KH2PO4，5.3020g K2HPO4，加入蒸馏水溶解，定容至500mL即得(PBS)。
2)底物的配制：精密称取黄嘌呤3.65mg，加少量0.5M NaOH溶液溶解，用PBS定容至50mL即得0.48mM底物溶液，底物溶液需现配现用。
3)酶液配制：移液枪取黄嘌呤氧化酶100μL，加入PBS，定容至25ml即得0.04U·mL-1的黄嘌呤氧化酶溶液,酶溶液需现配现用。
4)供试样品的配制：精密称取适量样品，先用少量DMSO(含量低于5％)溶解样品，然后用PBS缓冲液稀释，使桑根酮D、提取物反应时浓度如表1所示。
5)采用别嘌醇作为阳性对照，将供试样品溶液、阳性对照溶液及空白溶液各200μL、酶液500μL、PBS 2800μL依次加入试管中，37℃孵育15min后，加入底物500μL启动反应，在295nm处，每隔30s读数1次，记录吸光度A，共计5min。
4、实验结果
抑制率(％)可通过样品组及空白组A值的变化，用下列公式计算：抑制率(％)＝(1-A样品/A空白)×100％，抑制率结果见下表。
表1待测物对黄嘌呤氧化酶的抑制率
结果表明，改变别嘌醇的浓度，别嘌醇对黄嘌呤氧化酶活性的抑制作用具有良好的量效关系。本发明桑根酮D在浓度为2.0，1.0，0.5，0.2，0.1，0.05mg/ml浓度下，对黄嘌呤氧化酶活性的抑制作用具有良好的量效关系，且抑制作用很强。并且比别嘌醇活性更强，比桑枝提取物活性强，其IC50大约为20倍左右。
具体实施方式
本发明是通过下面的实施例进行详细的说明，但不意味着本发明仅限于此，具体实施方案如下：
实施例1、桑根酮D的提取制备
桑白皮10kg粉碎成粗粉，用8倍量40％乙醇溶液回流提取3次，每次2小时，滤过，提取液直接通过大孔树脂柱，先用40％乙醇洗脱1个柱体积，弃去洗脱液，再用70％乙醇溶液洗脱4个柱体积，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩液加酸调pH为2，放置沉淀；沉淀物用6倍量丙酮回流，趁热过滤，加入硅胶柱，丙酮水溶液梯度洗脱，收集有效成分，回收丙酮放粗结晶物滤出，以甲醇-水(70-30)为流动相，通过C18常压柱，收集，有效组分，合并，得桑根酮D。
实施例2、桑枝提取物的制备
取干燥桑枝，加乙醇热回流三次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液经减压回收乙醇并浓缩至稠膏，减压干燥，即得桑枝提取物。