一种岩藻黄素在抑制镉中毒所致肝损伤中的应用的制作方法

本发明属于海洋资源天然产物技术加工与应用领域，具体涉及一种源自海洋生物的岩藻黄素在抑制镉中毒所致肝损伤中的应用。

背景技术：

镉，是一种常见的工业和环境污染物，广泛存在于空气、土壤、游泥和水中，对动物和人类均可产生严重的毒性效应。镉主要来源于冶炼、电渡、蓄电池、釆矿等工业，被美国毒理委员会列为第6位危及人体健康的有毒物质。镉污染可使生物体内镉富集，通过多种形式进入人体引起慢性镉中毒。镉污染广泛，在全世界范围内均有发现—，在饮水，食物土壤，烟草中均能检测到镉的存在。镉进入人体排泄非常缓慢，在肾脏、肝脏、睾丸等脏器中富集，引发毒性效应。

一直以来，镉毒性作用的机制研究较多的偏向于其所产生的细胞氧化应激损伤方面，并且认为是毒性效应的主要机制。研究方向涉及镉诱导细胞或组织发生氧化损伤反应、DNA结构的缺失、损坏等。

岩藻黄素，又称岩藻黄质或褐藻素，是胡萝卜素的含氧衍生物，属于类胡萝卜素中的叶黄素类，是1种脂溶性色素，为偏极性类胡萝卜素。在自然界中，岩藻黄素广泛分布于藻类和无脊椎动物细胞中，异鞭藻门中除了真眼点藻纲和黄藻纲外其余各纲的藻类以及定鞭藻门中的藻类均以岩藻黄素为主要类胡萝卜素，尤其是褐藻纲和硅藻纲的藻类含量更为丰富，褐藻中岩藻黄素的含有量占自然界中类胡萝卜素总产量的10％以上，而硅藻这类单细胞微藻，因其含有大量岩藻黄素而呈现金褐色。

近年来，针对岩藻黄素的来源、提取与分离纯化方法、生物合成途径、生理活性及其在生物体内的代谢方式等方面所进行的研究一直是热点内容，一方面是因为海洋资源丰富，岩藻黄素来源广泛；另一方面，岩藻黄素结构独特，在多种药理活性方面展现出具有应用前景的潜在价值优势，其中抗炎、抗肿瘤、抗肥胖、抗氧化、抗痘、抗糖尿病、抗疟疾和抗血脂等生理活性已被部分证实，其它潜在的生理活性正在被科学家进行积极的研究和探索中。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种源自海洋生物的岩藻黄素在抗镉中毒所致肝损伤中的应用。

为实现上述目的本发明采用的技术方案：

一种岩藻黄素在抑制镉中毒所致肝损伤中的应用，从海洋藻类中提取获得岩藻黄素在抑制镉中毒所致肝损伤中的应用。

所述岩藻黄素为以海洋藻类为原料经酶解、有机溶剂提取、分离纯化所得。

进一步的说，

将原料加入其质量0-30倍体积(w/v)蒸馏水,配制成混浊液，再向混浊液中加入其体积质量的0.1-5wt％酶(v/w)，在温度25-45℃，摇床转数80-150r/min，振荡酶解2-10小时，即得到海洋藻类酶解液；

所述原料为新鲜样品含水量够高就可以不用额外添加水分直接进行酶解。

2)藻类酶解液中岩藻黄素的提取：将上述获得海洋藻类酶解液以3000-5000r/min的速度，离心5-20分钟，弃上清，向沉淀物中加入其质量10-30倍的有机溶剂A，使沉淀充分浸泡于溶剂A中，而后提取，提取液抽滤即得粗岩藻黄素提取液；

3)粗提液中岩藻黄素的分离纯化：将粗提液经过减压浓缩变为固体，加入其质量1-2倍体积的有机溶剂B(w/v)溶解；溶解后的样品上硅胶柱进行初步分离纯化，收集橘红色流出液，再进行减压浓缩，浓缩后再经过制备型高效液相进行分离纯化，收集岩藻黄素纯品出峰时间流出的液体，经减压浓缩得到纯度为95％以上的岩藻黄素纯品。

所述酶为纤维素酶和\或果胶酶；其中，两种酶同时添加时，两种酶按质量比为0.1-5：0-5。

所述原料为海洋藻类或其加工废料；其中，原料可粉碎或整体直接使用；所述海洋藻类为是新鲜或干燥的海带、马尾藻、羊栖菜、三角褐指藻中的一种或几种混合。

所述步骤2)沉淀经有机溶剂A溶解，而后进行至少一次的提取，即得岩藻黄素粗提液；其中，每次提取为将沉淀物经有机溶剂A浸泡，浸泡后于25-50℃，在转数100-150r/min振荡条件下提取2-5小时，实现一次提取；每次提取后进行抽滤，抽滤后的固体残渣再次经有机溶剂A提取，提取时间为2-10小时，提取后再经抽滤得到滤液，合并每次提取得到的滤液，几次提取时间总和为2-10小时；所述有机溶剂A为乙醇或甲醇。

上述提取过程中仅为单次提取，则提取时间为2-10小时；若为多次提取，每次提取时间2-5小时，总提取时间2-10小时。

所述步骤3)硅胶柱分离纯化条件：洗脱剂为丙酮、正己烷、乙醚、石油醚、乙酸乙酯中任意两种按1-10：1-10的体积比混合，收集橘红色流出液；制备型高效液相分离纯化条件：洗脱剂为甲醇、乙腈、乙醇中任意两种按10-90：10-90的体积比混合，收集岩藻黄素标准品出峰时间段内流出的洗脱液；所述有机溶剂B为无水甲醇、无水乙醇或二氯甲烷。

一种镉中毒所致肝损伤的抑制制剂，制剂含所述的从海洋藻类中提取获得岩藻黄素。

镉中毒肝损伤小鼠模型，喂食以氯化镉造模的镉中毒肝损伤模型小鼠浓度为0.025％-0.1％分离纯化的岩藻黄素5-20天，通过肝脏细胞形态结构及氧化应激水平、肝脏镉浓度含量的变化表明由海藻中分离提纯的岩藻黄素具有明显的抗镉中毒所致肝损伤作用。

检测分离纯化岩藻黄素抗镉中毒所致肝损伤活性：

1)以氯化镉建立镉中毒肝损伤小鼠模型。

2)喂食模型小鼠浓度为0.1-2.0g/L分离0.025％-0.1％分离纯化的岩藻黄素5-20天。

3)通过小鼠肝脏细胞形态结构、氧化应激水平及肝脏中镉浓度的变化表明由海藻中分离提纯的岩藻黄素具有明显的改善镉中毒所致肝损伤作用。

本发明所具有的优点

1.本发明获得的岩藻黄素是从海洋藻类中分离纯化所得，为天然活性产物，具有无毒性，活性高的显著特点

2.由本发明可见所得岩藻黄素对肝脏的保护作用可以从多个方面得以实现：(1)岩藻黄素对肝细胞具有显著的保护作用；(2)岩藻黄素能提高机体的抗氧化性能，抵抗镉中毒导致的肝损伤。(3)岩藻黄素能促进肝脏内镉的代谢。

附图说明

图1为本发明实施例提供的肝脏在显微镜40倍物镜下的显微结构图，其中(a)正常组肝脏显微结构；(b)阴性对照组肝脏显微结构；(c)阳性对照组肝脏显微结构(d)分离提纯岩藻黄素组肝脏显微结构。

图2为本发明实施例提供的海藻中分离纯化所得岩藻黄素高效液相色谱图。

具体实施例

下面对本发明作进一步说明，并且本发明的保护范围不仅局限于以下实施例。

实施例1

1.将新鲜马尾藻用粉碎机粉碎后加入其质量5倍体积(w/v)蒸馏水,配制成混浊液，再向混浊液中加入其体积的0.5wt％纤维素酶(v/w)，置于恒温振荡培养箱中40℃酶解4小时，摇床转数120r/min，得到马尾藻酶解液；

2.马尾藻酶解液中岩藻黄素的提取：将上述获得马尾藻酶解液以3000r/min的速度，离心10分钟，弃上清，向沉淀物中加入其质量20倍的无水乙醇(w/v)，在40℃恒温摇床中提取色素，转数120r/min，提取4小时，而后避光下抽滤得到岩藻黄素粗提液；

3.粗提液中岩藻黄素的分离纯化：将粗提液经过减压浓缩变为固体，加入其质量2倍体积的二氯甲烷(w/v)溶解。溶解后的样品上硅胶柱进行初步分离纯化，洗脱剂为丙酮：正己烷＝1:4(v/v)，收集橘红色流出液，进行减压浓缩，浓缩后再经过制备型高效液相进行分离纯化，条件：乙腈：水＝90:10(v/v)，流速为10ml/min,进样量为1ml,检测波长为448nm，Waters 2489紫外/可见光检测器，色谱柱为Sunfire Prep C18(19X150mm,10μm)；收集岩藻黄素纯品出峰时间流出的液体，经减压浓缩得到纯度在95％以上的岩藻黄素纯品(参见图2)。

实施例2

1.将新鲜三角褐指藻加入其质量1倍体积(w/v)蒸馏水,配制成混浊液，再向混浊液中加入其体积的0.5wt％纤维素酶(v/w)和其体积的0.5wt％果胶酶，置于恒温振荡培养箱中30℃酶解6小时，摇床转数150r/min，得到三角褐指藻酶解液；

2.三角褐指藻酶解液中岩藻黄素的提取：将上述获得三角褐指藻酶解液以3000r/min的速度，离心10分钟，弃上清，向沉淀物中加入其质量30倍的无水甲醇(w/v)，在40℃恒温摇床中提取色素，转数150r/min，提取6小时，而后避光抽滤得到岩藻黄素粗提液；

3.粗提液中岩藻黄素的分离纯化：将粗提液经过减压浓缩变为固体，加入其质量2倍体积的二氯甲烷(w/v)溶解。溶解后的样品上硅胶柱进行初步分离纯化，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝7:3(v/v)，收集橘红色流出液，进行减压浓缩，浓缩后再经过制备型高效液相进行分离纯化，条件：乙腈：水＝90:10(v/v)，流速为10ml/min,进样量为1ml,检测波长为448nm，Waters 2489紫外/可见光检测器，色谱柱为Sunfire Prep C18(19X150mm,10μm)；收集岩藻黄素纯品出峰时间流出的液体，经减压浓缩得到纯度在95％以上的岩藻黄素纯品。

实施例3

1.将干裙带菜粉碎成1mm²大小颗粒，向其中加入其质量20倍体积(w/v)蒸馏水,配制成混浊液，再向混浊液中加入其体积的0.5wt％纤维素酶(v/w)和其体积的0.5wt％果胶酶，置于恒温振荡培养箱中30℃酶解6小时，摇床转数150r/min，得到裙带菜酶解液；

2.裙带菜酶解液中岩藻黄素的提取：将上述获得裙带菜酶解液以4000r/min的速度，离心15分钟，弃上清，向沉淀物中加入其质量10倍的无水甲醇(w/v)，在40℃恒温摇床中提取色素，转数150r/min，提取3小时，而后避光抽滤，抽滤后的固体残渣再次加入其质量10倍的无水甲醇(w/v)，在40℃恒温摇床中提取色素，转数150r/min，提取3小时，而后避光抽滤，合并两次的抽滤液，得到岩藻黄素粗提液；

3.粗提液中岩藻黄素的分离纯化：将粗提液经过减压浓缩变为固体，加入其质量2倍体积的二氯甲烷(w/v)溶解。溶解后的样品上硅胶柱进行初步分离纯化，洗脱剂为丙酮：正己烷＝1:3(v/v)，收集橘红色流出液，进行减压浓缩，浓缩后再经过制备型高效液相进行分离纯化，条件：乙腈：水＝90:10(v/v)，流速为10ml/min,进样量为1ml,检测波长为448nm，Waters 2489紫外/可见光检测器，色谱柱为Sunfire Prep C18(19X150mm,10μm)；收集岩藻黄素纯品出峰时间流出的液体，经减压浓缩得到纯度在95％以上的岩藻黄素纯品。

应用例

利用上述从海洋藻类中分离纯化的岩藻黄素作为制备抗镉中毒所致肝损伤药物的应用，其抗镉中毒所致肝损伤作用的试验及其效果如下：

分离纯化岩藻黄素的抗镉中毒所致肝损伤试验：

实验动物：120只昆明种雄性小鼠18-22g/只。

动物模型：100只小鼠喂食0.003g/L氯化镉30天，创建镉中毒肝损伤模型小鼠。

药物配制：用上述各实施例分离纯化岩藻黄素经少量乙醇溶解，再加纯净水分别配制成岩藻黄素含量为0.025％、0.05％、0.1％的悬浊液。

实验分组：实验组分别为正常组和动物模型组；动物模型组均为镉中毒肝损伤模型小鼠，并将其随机分为5组，每组20只小鼠，分别为阴性对照组、阳性对照组以及岩藻黄素低剂量、中剂量和高剂量组。

20只正常组(健康小鼠每日喂食纯净水，水源供给充足)；

20只阴性对照组(肝损伤小鼠每日喂食纯净水，水源供给充足)；

20只阳性对照组(肝损伤小鼠每日喂食澳洲swisse护肝片，服用剂量参照服用说明书，水源供给充足)；

20只低剂量分离纯化岩藻黄素组(肝损伤小鼠每日喂食浓度为0.025％的悬浊液20ml，水源供给充足)；

20只中剂量分离纯化岩藻黄素组(肝损伤小鼠每日喂食浓度为0.05％的悬浊液20ml，水源供给充足)；

20只高剂量分离纯化岩藻黄素组(肝损伤小鼠每日喂食浓度为0.1％的悬浊液20ml，水源供给充足)

实验方法：镉中毒肝损伤小鼠喂食纯净水，澳洲swisse护肝片，含分离纯化岩藻黄素的不同浓度悬浊液14天后心脏取血，取肝脏组织进行各项指标测定及肝细胞结构观察。各项指标测量利用酶联免疫分析试剂盒和分光光度计比色法；肝细胞结构观察采用常规切片HE染色，显微镜下镜检(参见表1-3、图1)。

检测指标：血液中CAT含量、MDA含量，肝脏中镉含量，肝细胞显微结构变化。

表1各组小鼠血液CAT含量

过氧化氢酶(CAT)，是催化过氧化氢分解成氧和水的酶，存在于细胞的过氧化物体内。过氧化氢酶是过氧化物酶体的标志酶,约占过氧化物酶体酶总量的40％。过氧化氢酶存在于所有已知的动物的各个组织中，特别在肝脏中以高浓度存在。过氧化氢酶在食品工业中被用于除去用于制造奶酪的牛奶中的过氧化氢。过氧化氢酶也被用于食品包装，防止食物被氧化。过氧化氢酶存在于红细胞及某些组织内的过氧化体中，它的主要作用就是催化H2O2分解为H2O与O2，使得H2O2不至于与O2在铁螯合物作用下反应生成非常有害的-OH。

由表1可以看出服用岩藻黄素后，血液的CAT含量要明显高于阴性对照组，虽然稍低于正常组，但与阳性对照组无显著性差异。证明分离提纯的岩藻黄素可降低有害-OH的生成，减少肝细胞对氧化剂的敏感性，提升肝组织的抗逆性，对被镉离子损害的肝脏组织具有保护作用。

表2各组小鼠血液MDA含量

丙二醛(MDA)是膜脂过氧化最重要的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤因此在组织脏器衰老生理和抗性生理研究中丙二醛含量是一个常用指标，可通过丙二醛了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度以及组织脏器的抗逆性。由表2可知服用分离提纯的岩藻黄素后，血液中的丙二醛含量要明显低于阴性对照组，且与正常组和阳性对照组之间无显著性差异，证明分离提纯的岩藻黄素能显著降低由镉离子引起的膜质过氧化，对肝脏组织具有保护作用，可降低肝细胞膜系统受损程度，提升肝组织的抗逆性。

表3各组小鼠肝脏中镉含量

由表3可知，喂食中、高剂量分离提纯岩藻黄素组镉中毒肝损伤小鼠血液中镉水平得到显著降低，且显著低于阴性对照组和阳性对照组，证明海藻中分离纯化的岩藻黄素对机体内镉的代谢有明显的促进作用。

同时由图1肝细胞形态结构变化结果所示：正常组肝细胞排列紧密，细胞核位于细胞中央，细胞膜界限清晰；阴性对照组肝细胞密度变小，排列松散，细胞膜界限不清晰；阳性对照组和喂食高剂量(0.1％)分离提纯岩藻黄素组的肝脏损伤现象有明显改善，肝细胞密度高于阴性对照组，且细胞膜界限清晰，细胞核位于细胞中央。因此高剂量岩藻黄素对氯化镉诱导的肝脏损伤具有明显的改善作用，使肝细胞组织结构趋于正常化，且与阳性对照组之间无明显差异。

不同浓度的岩藻黄素对镉中毒所引起的肝损伤均有改善作用，其改善效果和岩藻黄素的浓度并无明显的剂量效应关系，但高剂量岩藻黄素(0.1％或以上)可能会有更好的改善效果。