本发明涉及生物医学技术领域，尤其是涉及一种骨科复合生物羊膜其制备方法。
背景技术：
交通事故、建筑事故、年龄增长及其它各种原因导致的骨损伤降低了人们的生活质量，使人们正常工作及生活受到严重影响，从而使骨移植成为仅次于输血的人体组织移植。而由于自体骨容易引起二次创伤，神经损伤或感染等副作用，严重制约着骨修复重建学科的发展，成为制约骨科治疗学科发展的瓶颈。
近二十年来，组织工程由于其能够运用工程学和生命科学的方法开发出用于修复、重建或改进组织功能的生物替代品而受到了人们的关注。骨修复材料的发展是骨组织工程的一个重要方面，随着各种新型材料的出现，丰富了大家对骨损伤修复的认识和方法，研发真正的生物活性人工骨最直接的途径就是模仿天然骨的结构，合成一种与骨有相似纳米结构、组成成分和生物学反应的材料。理想的骨修复材料应该具有以下特性：(1)生物相容性：可与骨直接进行化学结合，不阻止骨细胞在其表面的正常活性或干扰其周围骨细胞的自然再生过程，对骨组织的分解吸收具有传导性。(2)机械耐受性：以小梁骨为例，抗压强度应大于5mpa，抗压模量在45-100mpa之间。(3)生物降解性：在一定时间内被宿主骨替代，不影响骨组织的修复，无毒副作用。(4)诱导再生性：通过自身或添加骨诱导因素，刺激或诱导骨骼生长。(5)可操作性：具有与修复部位相匹配的外形，有利于手术移植。
在现代医学水平飞速发展的今天，传统医用金属或合金材料、陶瓷及有机填充物等已越来越不能满足当前临床医疗实践的需要。羊膜(厚约0.02～0.05mm)来源于胚胎，是一种透明、无神经、血管和淋巴管、低抗原性且具有韧性的组织，由上皮细胞层、基底膜、基质层、纤维母细胞层、海绵层组成。羊膜免疫原性低，具有减轻炎性反应、抑制纤维组织增生等作用，可作为一种理想的组织工程修复材料。
技术实现要素：
为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供一种羊膜泪道修复支架，采用如下技术方案实现：
一种骨科复合生物羊膜，是由羊膜和涂覆在羊膜的基底膜上的复合胶原蛋白海绵预备液发生交联后，经冷冻干燥处理得到的双层复合结构；所述复合胶原蛋白海绵预备液是：将胶原蛋白粉、壳聚糖粉、银杏黄酮苷、硫酸软骨素、季戊四醇、肉豆蔻酸异丙酯、透明质酸钠分别溶解于水或稀醋酸水溶液制成混合溶液，加入生物交联剂，搅拌均匀制得复合胶原蛋白海绵预备液；所述羊膜上涂覆的所述复合胶原蛋白海绵预备液的厚度为2～5μm。
进一步的，所述生物交联剂在所述混合溶液中的质量分数为0.01～0.1wt％；所述混合溶液中各组分的质量百分数为：胶原蛋白粉10～65wt％、壳聚糖粉2～10wt％、银杏黄酮苷0.5～2wt％、硫酸软骨素0.2～0.3wt％、季戊四醇0.1～0.2wt％、肉豆蔻酸异丙酯0.1～0.2wt％、透明质酸钠1～2wt％。
进一步的，所述生物交联剂是京尼平。
本发明还提供一种骨科复合生物羊膜的制备方法，包括以下步骤：
1)按标准进行羊膜取材，然后用紫外灯照射灭菌20分钟以上，再在洁净环境下，将新鲜羊膜用工艺用水清洗除去血渍；具体为：将新鲜羊膜用工艺用水清洗3至5遍，每遍用水量300至500毫升，每遍清洗时间3分钟以上；
2)将胶原蛋白粉、壳聚糖粉、银杏黄酮苷、硫酸软骨素、季戊四醇、肉豆蔻酸异丙酯、透明质酸钠分别溶解于水或稀醋酸水溶液制成混合溶液，加入生物交联剂，搅拌均匀制得复合胶原蛋白海绵预备液；
3)将步骤2)中制备的所述复合胶原蛋白海绵预备液涂覆在步骤1)中制备的所述羊膜的基底膜上使得所述基底膜与所述复合胶原蛋白海绵预备液发生交联，再置于冷冻干燥机冷冻干燥至含水量为1～20％；具体为：先将发生交联后的羊膜置于冷冻干燥机工作室预冻0.2～10小时，冷冻干燥机工作室温度控制在0℃～-56℃；再打开冷凝室制冷至-10℃～-56℃，开启真空泵，控制真空度在1pa～40pa，真空冷冻干燥2～10小时；
4)将步骤3)处理后的羊膜经裁剪包装后，进行钴60辐照灭菌，即制得所述骨科复合生物羊膜。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明的复合生物羊膜既具有良好的可塑性，又具有良好的引导骨组织再生性，还具有良好的手术操作性、细胞相容性和骨再生性；所述羊膜能够在体液中降解释放得到有利于骨修复的多种细胞活性因子，能促进成骨细胞增殖，同时可以促血管化，提供一种仿生度极高的细胞生长微环境，更好的引导组织形成；所述复合胶原蛋白混合液能够抑制骨吸收；通过所述羊膜和所述复合胶原蛋白混合液的结合，能够达到促进骨形成和抑制骨吸收的协同作用，促进骨修复过程中破骨-成骨的平衡，大大缩短骨细胞的愈合时间，降低患者感染的几率，且价格合适，有利于在临床中的应用及推广。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明一种骨科复合生物羊膜其制备方法作进一步的详细说明。
实施例1
本发明提供一种骨科复合生物羊膜，是由羊膜和涂覆在羊膜的基底膜上的复合胶原蛋白海绵预备液发生交联后，经冷冻干燥处理得到的双层复合结构，所述羊膜上涂覆的所述复合胶原蛋白海绵预备液的厚度为3μm；所述复合胶原蛋白海绵预备液是：将胶原蛋白粉、壳聚糖粉、银杏黄酮苷、硫酸软骨素、季戊四醇、肉豆蔻酸异丙酯、透明质酸钠分别溶解于水制成混合溶液，加入京尼平，搅拌均匀制得复合胶原蛋白海绵预备液。
所述京尼平在所述混合溶液中的质量分数为0.05wt％；所述混合溶液中各组分的质量百分数为：胶原蛋白粉35wt％、壳聚糖粉5wt％、银杏黄酮苷1wt％、硫酸软骨素0.25wt％、季戊四醇0.15wt％、肉豆蔻酸异丙酯0.15wt％、透明质酸钠1.5wt％。
上述骨科复合生物羊膜的制备方法如下，包括以下步骤：
1)按标准进行羊膜取材，然后用紫外灯照射灭菌20分钟以上，再在洁净环境下，将新鲜羊膜用工艺用水清洗除去血渍；具体为：将新鲜羊膜用工艺用水清洗4遍，每遍用水量400毫升，每遍清洗时间3分钟以上；
2)将胶原蛋白粉、壳聚糖粉、银杏黄酮苷、硫酸软骨素、季戊四醇、肉豆蔻酸异丙酯、透明质酸钠分别溶解于水或稀醋酸水溶液制成混合溶液，加入京尼平，搅拌均匀制得复合胶原蛋白海绵预备液；
3)将步骤2)中制备的所述复合胶原蛋白海绵预备液涂覆在步骤1)中制备的所述羊膜的基底膜上使得所述基底膜与所述复合胶原蛋白海绵预备液发生交联，再置于冷冻干燥机工作室预冻2时，冷冻干燥机工作室温度控制在-20℃～-30℃；再打开冷凝室制冷至-40℃～-45℃，开启真空泵，控制真空度在10pa～20pa，真空冷冻干燥8小时，至含水量为5％；
4)将步骤3)处理后的羊膜经裁剪包装后，进行钴60辐照灭菌，即制得所述骨科复合生物羊膜。
实施例2
本发明提供一种骨科复合生物羊膜，是由羊膜和涂覆在羊膜的基底膜上的复合胶原蛋白海绵预备液发生交联后，经冷冻干燥处理得到的双层复合结构，所述羊膜上涂覆的所述复合胶原蛋白海绵预备液的厚度为2μm；所述复合胶原蛋白海绵预备液是：将胶原蛋白粉、壳聚糖粉、银杏黄酮苷、硫酸软骨素、季戊四醇、肉豆蔻酸异丙酯、透明质酸钠分别溶解于水制成混合溶液，加入京尼平，搅拌均匀制得复合胶原蛋白海绵预备液。
所述京尼平在所述混合溶液中的质量分数为0.01wt％；所述混合溶液中各组分的质量百分数为：胶原蛋白粉10wt％、壳聚糖粉10wt％、银杏黄酮苷0.5wt％、硫酸软骨素0.3wt％、季戊四醇0.1wt％、肉豆蔻酸异丙酯0.1wt％、透明质酸钠2wt％。
上述骨科复合生物羊膜的制备方法如下，包括以下步骤：
1)按标准进行羊膜取材，然后用紫外灯照射灭菌20分钟以上，再在洁净环境下，将新鲜羊膜用工艺用水清洗除去血渍；具体为：将新鲜羊膜用工艺用水清洗3遍，每遍用水量500毫升，每遍清洗时间3分钟以上；
2)将胶原蛋白粉、壳聚糖粉、银杏黄酮苷、硫酸软骨素、季戊四醇、肉豆蔻酸异丙酯、透明质酸钠分别溶解于水或稀醋酸水溶液制成混合溶液，加入京尼平，搅拌均匀制得复合胶原蛋白海绵预备液；
3)将步骤2)中制备的所述复合胶原蛋白海绵预备液涂覆在步骤1)中制备的所述羊膜的基底膜上使得所述基底膜与所述复合胶原蛋白海绵预备液发生交联，再置于冷冻干燥机工作室预冻0.2小时，冷冻干燥机工作室温度控制在0℃～-10℃；再打开冷凝室制冷至-15℃～-20℃，开启真空泵，控制真空度在20pa～40pa，真空冷冻干燥2小时，至含水量为20％；
4)将步骤3)处理后的羊膜经裁剪包装后，进行钴60辐照灭菌，即制得所述骨科复合生物羊膜。
实施例3
本发明提供一种骨科复合生物羊膜，是由羊膜和涂覆在羊膜的基底膜上的复合胶原蛋白海绵预备液发生交联后，经冷冻干燥处理得到的双层复合结构，所述羊膜上涂覆的所述复合胶原蛋白海绵预备液的厚度为5μm；所述复合胶原蛋白海绵预备液是：将胶原蛋白粉、壳聚糖粉、银杏黄酮苷、硫酸软骨素、季戊四醇、肉豆蔻酸异丙酯、透明质酸钠分别溶解于稀醋酸水溶液制成混合溶液，加入京尼平，搅拌均匀制得复合胶原蛋白海绵预备液。
所述京尼平在所述混合溶液中的质量分数为0.1wt％；所述混合溶液中各组分的质量百分数为：胶原蛋白粉65wt％、壳聚糖粉2wt％、银杏黄酮苷2wt％、硫酸软骨素0.2wt％、季戊四醇0.2wt％、肉豆蔻酸异丙酯0.2wt％、透明质酸钠1wt％。
上述骨科复合生物羊膜的制备方法如下，包括以下步骤：
1)按标准进行羊膜取材，然后用紫外灯照射灭菌20分钟以上，再在洁净环境下，将新鲜羊膜用工艺用水清洗除去血渍；具体为：将新鲜羊膜用工艺用水清洗5遍，每遍用水量300毫升，每遍清洗时间3分钟以上；
2)将胶原蛋白粉、壳聚糖粉、银杏黄酮苷、硫酸软骨素、季戊四醇、肉豆蔻酸异丙酯、透明质酸钠分别溶解于水或稀醋酸水溶液制成混合溶液，加入京尼平，搅拌均匀制得复合胶原蛋白海绵预备液；
3)将步骤2)中制备的所述复合胶原蛋白海绵预备液涂覆在步骤1)中制备的所述羊膜的基底膜上使得所述基底膜与所述复合胶原蛋白海绵预备液发生交联，再置于冷冻干燥机工作室预冻10小时，冷冻干燥机工作室温度控制在-45℃～-56℃；再打开冷凝室制冷至-50℃～-56℃，开启真空泵，控制真空度在1pa～10pa，真空冷冻干燥10小时；至含水量为1％；
4)将步骤3)处理后的羊膜经裁剪包装后，进行钴60辐照灭菌，即制得所述骨科复合生物羊膜。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。