一种抗动脉粥样硬化药物组合物及其制备方法与流程

本发明属于药物
技术领域：
，具体涉及一种抗动脉粥样硬化药物组合物及其制备方法。
背景技术：
：动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心血管系统疾病中最常见的疾病，也是危害人类健康的常见病。动脉粥样硬化的特点是受累动脉的病变从内膜开始，先后有多种病变合并存在，包括局部有脂质和复合糖类积聚、纤维组织增生和钙质沉着形成斑块，并有动脉中层的逐渐退变，继发性病变尚有斑块内出血、斑块破裂及局部血栓形成(称为粥样硬化-血栓形成，atherosclerosis-thrombosis)。由于在动脉内膜积聚的脂质外观呈黄色粥样，因此称为动脉粥样硬化。黄连，苦寒，归心、脾、胃、肝、胆、大肠经，具有清热燥湿、泻火解毒的功效，尤以清泄中焦湿热擅长，主治湿热中阻、脘腹痞满等，善清心胃之火和肝热。花椒，辛温，归脾、胃、肾经，具有温通散结止痛散寒祛湿之功。目前，现有技术中，黄连的研究主要集中在其主要成分小檗碱的药理作用及机制探讨；花椒的研究大多停留在生理作用效果，没有对其生理作用机制进行深入的研究，导致对花椒的开发多限于食用方面，在新药的开发和利用方面欠缺；关于黄连-花椒配伍对AS的作用尚未见报道。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种抗动脉粥样硬化药物组合物及其制备方法，采用本发明提供的制备方法制备得到的药物组合物能够有效地抗动脉粥样硬化。为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：本发明提供了一种抗动脉粥样硬化药物组合物的制备方法，包括如下步骤：1)将花椒粉碎过10～20目筛或不粉碎，加水提取挥发油1～3h，得到花椒挥发油和花椒残渣；所述花椒和水的质量比为1:8～12；2)将所述步骤1)得到的挥发油用环糊精溶液在25～45℃下包合1～2h，干燥，得到挥发油包合物；所述环糊精溶液的浓度为8～12％，所述挥发油和环糊精的体积比为1:6～10，所述包合在电动搅拌下进行；3)将所述步骤1)得到的挥发油剩余物过滤，得到第一滤液和第一滤渣；4)将所述步骤3)得到的第一滤渣、黄连和水混合，在98～102℃进行一次煎煮0.5～3h，过滤，得到第二滤液和第二滤渣；所述黄连、花椒残渣和水的质量比为1:0.1～2:8～12；5)将所述步骤4)得到的第二滤渣和水混合，在98～102℃进行二次煎煮0.5～3h，过滤，得到第三滤液；6)将所述步骤3)得到的第一滤液、所述步骤4)得到的第二滤液和所述步骤5)得到的第三滤液合并浓缩，减压干燥，得提取物干粉；7)将所述步骤6)得到的提取物干粉与所述步骤2)得到的挥发油包合物混合，得到抗动脉粥样硬化药物组合物；所述花椒和黄连的质量比为(0.1～5):1。优选的，所述步骤1)中花椒提取挥发油的方法为依据《中国药典》2015版的挥发油测定方法。优选的，所述步骤2)中环糊精包括α-环糊精、β-环糊精、羟乙基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、β-环糊精甲基化衍生物和支链环糊精中的一种或几种。优选的，所述步骤4)中所述黄连在混合前用水浸泡20～40min。优选的，所述步骤5)中第二滤渣和水的质量比为1:8～12。优选的，所述步骤3)、步骤4)和步骤5)中过滤用滤网的孔径独立为0.25～0.60mm。优选的，所述步骤6)浓缩的温度为90～100℃，所述减压干燥的温度不高于60℃。优选的，所述步骤7)提取物干粉与挥发油包合物混合，加入各种剂型所需的辅料制成相应的剂型。本发明提供了一种上述方法制备得到的抗动脉粥样硬化药物组合物。本发明提供了一种抗动脉粥样硬化药物组合物及其制备方法，本发明中，采用提取花椒中的挥发油和花椒残渣，将挥发油用环糊精包合，得到挥发油包合物，将黄连与花椒残渣进行一次和二次煎煮，合并滤液，浓缩、干燥得到提取物干粉，将挥发油包合物和提取物干粉混合后，能够有效地抑制小鼠主动脉斑块的生长；减轻肝细胞脂肪变性程度，调节血脂代谢，抑制炎性因子的表达，通过调控肝脏HMG-CoA还原酶活性和基因表达抑制胆固醇合成，对NF-κB/MAPK信号通路具有抑制作用；与单味药相比，黄连和花椒配伍后抗AS作用增强。附图说明图1为实施例6各组小鼠主动脉照片；图2为实施例6各组小鼠主动脉大体油红O染色照片；图3为实施例6各组小鼠主动脉根部HE染色图；图4为实施例7各组小鼠肝脏油红O染色图。具体实施方式本发明提供了一种抗动脉粥样硬化药物组合物的制备方法，包括如下步骤：1)将花椒粉碎过10～20目筛或不粉碎，加水提取挥发油1～3h，得到花椒挥发油和花椒残渣；所述花椒和水的质量比为1:8～12；2)将所述步骤1)得到的挥发油用环糊精溶液在25～45℃下包合1～2h，干燥，得到挥发油包合物；所述环糊精溶液的浓度为8～12％，所述挥发油和环糊精溶液的体积比为1:6～10，所述包合在电动搅拌下进行；3)将所述步骤1)得到的花椒残渣过滤，得到第一滤液和第一滤渣；4)将所述步骤3)得到的第一滤渣、黄连和水混合，在98～102℃进行一次煎煮0.5～3h，过滤，得到第二滤液和第二滤渣；所述黄连、花椒残渣和水的质量比为1:0.1～2:8～12；5)将所述步骤4)得到的第二滤渣和水混合，在98～102℃进行二次煎煮0.5～3h，过滤，得到第三滤液；6)将所述步骤3)得到的第一滤液、所述步骤4)得到的第二滤液和所述步骤5)得到的第三滤液合并浓缩，减压干燥，得提取物干粉；7)将所述步骤6)得到的提取物干粉与所述步骤2)得到的挥发油包合物混合，得到抗动脉粥样硬化药物组合物；所述花椒和黄连的质量比为(0.1～5):1。本发明将花椒粉碎过10～20目筛或不粉碎，加水提取挥发油1～3h，得到花椒挥发油和花椒残渣；所述花椒和水的质量比为1:8～12。本发明中，所述花椒提取挥发油的方法优选采用《中国药典》2015版第四部挥发油测定的方法进行提取。本发明对所述花椒的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。在本发明中，所述花椒加水提取挥发油的时间优选为1.5～2.5h，更优选为2h。在本发明中，所述花椒和水的质量比优选为1:10。本发明优选在微沸的条件下提取花椒挥发油。本发明将得到的挥发油用环糊精溶液在25～45℃下包合1～2h，干燥，得到挥发油包合物；所述环糊精溶液的浓度为8～12％，所述挥发油和环糊精溶液的体积比为1:6～10，所述包合在电动搅拌(转速为80～100r/min)下进行。在本发明中，所述环糊精溶液的浓度优选为10％。在本发明中，所述环糊精优选包括α-环糊精、β-环糊精、羟乙基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、β-环糊精甲基化衍生物和支链环糊精中的一种或几种。本发明对所述环糊精的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。在本发明中，所述环糊精的作用是防止挥发油挥发，提高其稳定性。得到花椒残渣后，本发明将所述花椒残渣过滤，得到第一滤液和第一滤渣。在本发明中，所述过滤优选在提取挥发油后趁热过滤。在本发明中，所述过滤用滤网的孔径优选为0.25～0.60mm，更优选为0.35mm。得到第一滤液和第一滤渣后，本发明将所述第一滤渣、黄连和水混合，在98～102℃进行一次煎煮0.5～3h，过滤，得到第二滤液和第二滤渣；所述黄连、花椒残渣和水的质量比为1:0.1～2:8～12。在本发明中，所述一次煎煮的时间优选为0.5～2h，更优选为1h。在本发明中，所述一次煎煮优选在微沸的条件下进行。在本发明中，所述过滤用滤网的孔径优选为0.25～0.60mm，更优选为0.35mm。在本发明中，所述黄连、花椒残渣和水的质量比优选为1:0.5:10。在本发明中，所述黄连优选先用水浸泡20～40min后，再与第一滤渣和水混合；更优选浸泡30min。本发明对所述黄连的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。得到第二滤液和第二滤渣后，本发明将所述第二滤渣和水混合，在98～102℃下二次煎煮0.5～3h，过滤，得到第三滤液。在本发明中，所述第二滤渣和水的质量比优选为1:8～12，更优选为1:10。在本发明中，所述二次煎煮的时间优选为0.5～2h，更优选为1h。在本发明中，所述二次煎煮优选在微沸的条件下进行。在本发明中，所述过滤用滤网的孔径优选为0.25～0.60mm，更优选为0.35mm。得到第三滤液和第三滤渣后，本发明合并第一滤液、第二滤液和第三滤液，得到总滤液，将得到的总滤液合并浓缩，减压干燥，得到提取物干粉。在本发明中，所述浓缩的温度优选为90～100℃，所述减压干燥的温度优选不高于60℃。本发明将提取物干粉和挥发油包含物混合，得到抗动脉粥样硬化的药物组合物。在本发明中，得到总滤液后，优选还进行浓缩；所述浓缩的温度优选为90～100℃，更优选为98℃。在本发明中，所述浓缩的方式优选为加热浓缩。本发明提供了一种上述方案所述方法制备得到的抗动脉粥样硬化药物组合物。在本发明中，所述抗动脉粥样硬化的药物组合物中含有花椒挥发油、花椒水提物和黄连水提物。本发明中，采用黄连与花椒配伍，能够有效地抑制小鼠主动脉斑块的生长；减轻肝细胞脂肪变性程度，调节血脂代谢，抑制炎性因子的表达，通过调控肝脏HMG-CoA还原酶活性和基因表达抑制胆固醇合成，对NF-κB/MAPK信号通路具有抑制作用。本发明提供了一种上述方法制备得到的抗动脉粥样硬化药物组合物，加入各种剂型所需的辅料制成相应的剂型。本发明对所述药物的剂型没有特殊限定，采用药剂学可接受的任意常规剂型即可。如胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液等制剂。在本发明中，在制备上述剂型时加入药学可接受的辅料。所述辅料优选为填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质。在本发明中，所述填充剂优选包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖。所述崩解剂优选包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠。所述润滑剂优选包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅。所述助悬剂优选包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素。所述粘合剂优选包括：淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素。所述甜味剂优选包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸。所述矫味剂优选包括：甜味剂及各种香精。所述防腐剂优选包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油。所述基质优选包括：PEG6000，PEG4000，虫蜡。为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1称量100g花椒，粉碎过10目筛，根据《中国药典》2015版的挥发油测定法，加800g水提取挥发油3h，得到花椒挥发油和花椒残渣。将得到的挥发油用8％环糊精溶液(挥发油和环糊精溶液的体积比为1:6)在45℃下电动搅拌包合2h，干燥，得到挥发油包合物。将得到的花椒残渣采用孔径为0.25mm筛过滤，得到第一滤液和第一滤渣。将第一滤渣、50g黄连和1.2Kg的水混合，在98℃下一次煎煮0.5h，采用孔径为0.35mm过滤，得到第二滤液和第二滤渣。将第二滤渣和水混合(第二滤渣和水的质量比为1:8)，在102℃下二次煎煮0.5h，采用孔径为0.60mm过滤，得到第三滤液。合并所述第一滤液、第二滤液和第三滤液，在100℃下浓缩，减压干燥，得到提取物干粉。将得到的提取物干粉与挥发油包合物混合，得到抗动脉粥样硬化的药物组合物。实施例2称量50g花椒，粉碎过20目筛，根据《中国药典》2015版的挥发油测定法，加600g水提取挥发油2h，得到花椒挥发油和花椒残渣。将得到的挥发油用10％环糊精溶液(挥发油和环糊精溶液的体积比为1:8)在35℃下电动搅拌包合1.5h，干燥，得到挥发油包合物。将得到的花椒残渣采用孔径为0.60mm筛过滤，得到第一滤液和第一滤渣。将第一滤渣、100g黄连和1.8Kg的水混合，在102℃下一次煎煮3h，采用孔径为0.35mm过滤，得到第二滤液和第二滤渣。将第二滤渣和水混合(第二滤渣和水的质量比为1:12)，在98℃下二次煎煮3h，采用孔径为0.35mm过滤，得到第三滤液。合并所述第一滤液、第二滤液和第三滤液，在90℃下浓缩，减压干燥，得到提取物干粉。将得到的提取物干粉与挥发油包合物混合，得到抗动脉粥样硬化的药物组合物。实施例3称量100g花椒，将花椒根据《中国药典》2015版的挥发油测定法，加1Kg水提取挥发油1h，得到花椒挥发油和花椒残渣。将得到的挥发油用12％环糊精溶液(挥发油和环糊精溶液的体积比为1:10)在25℃下电动搅拌包合1h，干燥，得到挥发油包合物。将得到的花椒残渣采用孔径为0.35mm筛过滤，得到第一滤液和第一滤渣。将第一滤渣、100g黄连和2Kg的水混合，在100℃下一次煎煮1h，采用孔径为0.35mm过滤，得到第二滤液和第二滤渣。将第二滤渣和水混合(第二滤渣和水的质量比为1:10)，在100℃下二次煎煮1h，采用孔径为0.35mm过滤，得到第三滤液。合并所述第一滤液、第二滤液和第三滤液，在98℃下浓缩，减压干燥，得到提取物干粉。将得到的提取物干粉与挥发油包合物混合，得到抗动脉粥样硬化的药物组合物。实施例4称量100g花椒，将花椒根据《中国药典》2015版的挥发油测定法，加1Kg水提取挥发油1h，得到花椒挥发油和花椒残渣。将得到的挥发油用12％环糊精溶液(挥发油和环糊精溶液的体积比为1:10)在25℃下电动搅拌包合1h，干燥，得到挥发油包合物。将得到的花椒残渣采用孔径为0.35mm筛过滤，得到第一滤液和第一滤渣。将第一滤渣和1Kg的水混合，在100℃下一次煎煮1h，采用孔径为0.35mm过滤，得到第二滤液和第二滤渣。将第二滤渣和水混合(第二滤渣和水的质量比为1:10)，在100℃下二次煎煮1h，采用孔径为0.35mm过滤，得到第三滤液。合并所述花椒第一滤液、第二滤液和第三滤液，在98℃下浓缩，减压干燥，得到花椒提取物干粉。将得到的花椒提取物干粉与挥发油包合物混合，得到花椒提取物。实施例5称量100g黄连，加入1Kg的水，在100℃下一次煎煮1h，采用孔径为0.35mm过滤，得到第一滤液和第一滤渣。将第一滤渣和水混合(第一滤渣和水的质量比为1:10)，在100℃下二次煎煮1h，采用孔径为0.35mm过滤，得到第二滤液。合并所述第一滤液和第二滤液，在98℃下浓缩，减压干燥，得到黄连提取物。实施例6按照《中华人民共和国药典》2015版第四部挥发油测定法项下的相对密度在1.0以下的花椒挥发油提取操作，记录花椒挥发油提取量，水的用量是花椒的8倍，提取时间为1h，不粉碎，花椒挥发油的提取量为1.38mL。实施例7按照《中华人民共和国药典》2015版第四部挥发油测定法项下的相对密度在1.0以下的花椒挥发油提取操作，记录花椒挥发油提取量，水的用量是花椒的8倍，提取时间为2h，粉碎粒度为10目，花椒挥发油的提取量为1.49mL。实施例8按照《中华人民共和国药典》2015版第四部挥发油测定法项下的相对密度在1.0以下的花椒挥发油提取操作，记录花椒挥发油提取量，水的用量是花椒的8倍，提取时间为3h，粉碎粒度为20目，花椒挥发油的提取量为1.53mL。实施例9按照《中华人民共和国药典》2015版第四部挥发油测定法项下的相对密度在1.0以下的花椒挥发油提取操作，记录花椒挥发油提取量，水的用量是花椒的10倍，提取时间为1h，粉碎粒度为10目，花椒挥发油的提取量为1.42mL。实施例10按照《中华人民共和国药典》2015版第四部挥发油测定法项下的相对密度在1.0以下的花椒挥发油提取操作，记录花椒挥发油提取量，水的用量是花椒的10倍，提取时间为2h，粉碎粒度为20目，花椒挥发油的提取量为1.45mL。实施例11按照《中华人民共和国药典》2015版第四部挥发油测定法项下的相对密度在1.0以下的花椒挥发油提取操作，记录花椒挥发油提取量，水的用量是花椒的10倍，提取时间为3h，不粉碎，花椒挥发油的提取量为1.48mL。实施例12按照《中华人民共和国药典》2015版第四部挥发油测定法项下的相对密度在1.0以下的花椒挥发油提取操作，记录花椒挥发油提取量，水的用量是花椒的12倍，提取时间为1h，粉碎粒度为20目，花椒挥发油的提取量为1.46mL。实施例13按照《中华人民共和国药典》2015版第四部挥发油测定法项下的相对密度在1.0以下的花椒挥发油提取操作，记录花椒挥发油提取量，水的用量是花椒的12倍，提取时间为2h，不粉碎，花椒挥发油的提取量为1.34mL。实施例14按照《中华人民共和国药典》2015版第四部挥发油测定法项下的相对密度在1.0以下的花椒挥发油提取操作，记录花椒挥发油提取量，水的用量是花椒的12倍，提取时间为3h，粉碎粒度为10目，花椒挥发油的提取量为1.45mL。实施例15采用电动搅拌法对花椒挥发油进行包合，称取2份β-CD各10.0g，加入一定量的蒸馏水，加热溶解制成浓度为8％的β-CD饱和水溶液。精密量取1.0mL花椒挥发油用10mL95％乙醇溶解，在电动搅拌下将挥发油的乙醇溶液滴加到β-CD溶液中，包合1h，置冰箱中冷藏过夜。抽滤，沉淀物置40℃恒温烘箱干燥，得到白色粉末状包合物，称重，测定包合物中挥发油的含量，计算包合物挥发油的利用率，包合物重量为6.767g，回收油量为0.62mL，油利用率为63.917％。实施例16采用超声法对花椒挥发油进行包合，称取2份β-CD各10.0g，加入一定量的蒸馏水，加热溶解制成浓度为8％的β-CD饱和水溶液。精密量取1.0mL花椒挥发油用10mL95％乙醇溶解，在超声状态下将挥发油的乙醇溶液滴加到β-CD溶液中，包合1h，置冰箱中冷藏过夜。抽滤，沉淀物置40℃恒温烘箱干燥，得到白色粉末状包合物，称重，测定包合物中挥发油的含量，计算包合物挥发油的利用率，包合物重量为7.950g，回收油量为0.52mL，油利用率为53.608％。实施例17称取β-CD10.0g，加入125.0mL蒸馏水，加热溶解制成8％β-CD饱和水溶液。精密量取1.0mL花椒挥发油，不用乙醇溶解，采用电动搅拌法进行包合，测定包合物中挥发油的含量，计算包合物挥发油的利用率，回收油量为0.79mL，挥发油利用率为80.412％。实施例18取β-CD10.0g，加入125.0mL蒸馏水，加热溶解制成8％β-CD饱和水溶液。精密量取1.0mL花椒挥发油，用10mL95％乙醇溶解，采用电动搅拌法进行包合，测定包合物中挥发油的含量，计算包合物挥发油的利用率，回收油量为0.62mL，挥发油利用率为63.917％。实施例19取β-CD10.0g，加入125.0mL蒸馏水，加热溶解制成8％β-CD饱和水溶液。精密量取1.0mL花椒挥发油，用5mL95％乙醇溶解，采用电动搅拌法进行包合，测定包合物中挥发油的含量，计算包合物挥发油的利用率，回收油量为0.69mL，挥发油利用率为71.134％。实施例20取β-CD10.0g，加入125.0mL蒸馏水，加热溶解制成8％β-CD饱和水溶液。精密量取1.0mL花椒挥发油，用1mL95％乙醇溶解，采用电动搅拌法进行包合，测定包合物中挥发油的含量，计算包合物挥发油的利用率，回收油量为0.76mL，挥发油利用率为78.351％。实施例21称取β-CD于平底烧瓶中，加入一定量的蒸馏水，约80℃水浴加热溶解，制成β-CD饱和水溶液，取出备用；取花椒挥发油，在电动搅拌条件下，将挥发油滴加到β-CD水溶液中，油：β-CD的体积比为1:6，β-CD浓度为8％，电动搅拌包合，包合的温度为25℃，包合的时间为1h。取出平底烧瓶，室温放置1h后，置冰箱中冷藏过夜，滤取析出的沉淀物置40℃恒温烘箱干燥，得到白色粉末状包合物，称重，测定包合物中挥发油的含量，计算包合物挥发油利用率，挥发油利用率为70.103％。实施例22称取β-CD于平底烧瓶中，加入一定量的蒸馏水，约80℃水浴加热溶解，制成β-CD饱和水溶液，取出备用；取花椒挥发油，在电动搅拌条件下，将挥发油滴加到β-CD水溶液中，油：β-CD的体积比为1:6，β-CD浓度为10％，电动搅拌包合，包合的温度为35℃，包合的时间为1.5h。取出平底烧瓶，室温放置1h后，置冰箱中冷藏过夜，滤取析出的沉淀物置40℃恒温烘箱干燥，得到白色粉末状包合物，称重，测定包合物中挥发油的含量，计算包合物挥发油利用率，挥发油利用率为65.979％。实施例23称取β-CD于平底烧瓶中，加入一定量的蒸馏水，约80℃水浴加热溶解，制成β-CD饱和水溶液，取出备用；取花椒挥发油，在电动搅拌条件下，将挥发油滴加到β-CD水溶液中，油：β-CD的体积比为1:6，β-CD浓度为12％，电动搅拌包合，包合的温度为45℃，包合的时间为2h。取出平底烧瓶，室温放置1h后，置冰箱中冷藏过夜，滤取析出的沉淀物置40℃恒温烘箱干燥，得到白色粉末状包合物，称重，测定包合物中挥发油的含量，计算包合物挥发油利用率，挥发油利用率为69.072％。实施例24称取β-CD于平底烧瓶中，加入一定量的蒸馏水，约80℃水浴加热溶解，制成β-CD饱和水溶液，取出备用；取花椒挥发油，在电动搅拌条件下，将挥发油滴加到β-CD水溶液中，油：β-CD的体积比为1:8，β-CD浓度为8％，电动搅拌包合，包合的温度为35℃，包合的时间为2h。取出平底烧瓶，室温放置1h后，置冰箱中冷藏过夜，滤取析出的沉淀物置40℃恒温烘箱干燥，得到白色粉末状包合物，称重，测定包合物中挥发油的含量，计算包合物挥发油利用率，挥发油利用率为81.443％。实施例25称取β-CD于平底烧瓶中，加入一定量的蒸馏水，约80℃水浴加热溶解，制成β-CD饱和水溶液，取出备用；取花椒挥发油，在电动搅拌条件下，将挥发油滴加到β-CD水溶液中，油：β-CD的体积比为1:8，β-CD浓度为10％，电动搅拌包合，包合的温度为45℃，包合的时间为1h。取出平底烧瓶，室温放置1h后，置冰箱中冷藏过夜，滤取析出的沉淀物置40℃恒温烘箱干燥，得到白色粉末状包合物，称重，测定包合物中挥发油的含量，计算包合物挥发油利用率，挥发油利用率为82.474％。实施例26称取β-CD于平底烧瓶中，加入一定量的蒸馏水，约80℃水浴加热溶解，制成β-CD饱和水溶液，取出备用；取花椒挥发油，在电动搅拌条件下，将挥发油滴加到β-CD水溶液中，油：β-CD的体积比为1:8，β-CD浓度为12％，电动搅拌包合，包合的温度为25℃，包合的时间为1h。取出平底烧瓶，室温放置1.5h后，置冰箱中冷藏过夜，滤取析出的沉淀物置40℃恒温烘箱干燥，得到白色粉末状包合物，称重，测定包合物中挥发油的含量，计算包合物挥发油利用率，挥发油利用率为82.474％。实施例27称取β-CD于平底烧瓶中，加入一定量的蒸馏水，约80℃水浴加热溶解，制成β-CD饱和水溶液，取出备用；取花椒挥发油，在电动搅拌条件下，将挥发油滴加到β-CD水溶液中，油：β-CD的体积比为1:10，β-CD浓度为8％，电动搅拌包合，包合的温度为45℃，包合的时间为1.5h。取出平底烧瓶，室温放置1.5h后，置冰箱中冷藏过夜，滤取析出的沉淀物置40℃恒温烘箱干燥，得到白色粉末状包合物，称重，测定包合物中挥发油的含量，计算包合物挥发油利用率，挥发油利用率为84.536％。实施例28称取β-CD于平底烧瓶中，加入一定量的蒸馏水，约80℃水浴加热溶解，制成β-CD饱和水溶液，取出备用；取花椒挥发油，在电动搅拌条件下，将挥发油滴加到β-CD水溶液中，油：β-CD的体积比为1:10，β-CD浓度为10％，电动搅拌包合，包合的温度为25℃，包合的时间为2h。取出平底烧瓶，室温放置1.5h后，置冰箱中冷藏过夜，滤取析出的沉淀物置40℃恒温烘箱干燥，得到白色粉末状包合物，称重，测定包合物中挥发油的含量，计算包合物挥发油利用率，挥发油利用率为86.598％。实施例29称取β-CD于平底烧瓶中，加入一定量的蒸馏水，约80℃水浴加热溶解，制成β-CD饱和水溶液，取出备用；取花椒挥发油，在电动搅拌条件下，将挥发油滴加到β-CD水溶液中，油：β-CD的体积比为1:10，β-CD浓度为12％，电动搅拌包合，包合的温度为35℃，包合的时间为1h。取出平底烧瓶，室温放置1.5h后，置冰箱中冷藏过夜，滤取析出的沉淀物置40℃恒温烘箱干燥，得到白色粉末状包合物，称重，测定包合物中挥发油的含量，计算包合物挥发油利用率，挥发油利用率为85.567％。实施例30将花椒加入8倍量的水，提取挥发油1h，得到花椒挥发油和花椒残渣；将挥发油与12％的环糊精以1:10的比例，在25℃下电动搅拌包合1.0h，干燥，得到挥发油包合物；将花椒残渣过滤，得到第一滤液和第一滤渣；将第一滤渣、黄连和水混合，一次煎煮1h，过滤，得到第二滤液和第二滤渣；将第二滤渣和水混合，二次煎煮1h，过滤，得到第三滤液；将第一滤液、第二滤液和第三滤液合并浓缩，加入挥发油包合物，制得黄连-花椒合煎液。花椒的用量为15g，黄连的用量为6g。动物分组与给药：ApoE-/-小鼠随机分为给药组，进行高脂饮食；同时给药组按折算成小鼠剂量灌胃给药，给药剂量为10mL·Kg-1，根据小鼠体质量(每周称重1次)以校正给药剂量，连续给药16周后停止药物干预。主动脉根部病理检测：末次给药后，禁食12h(不禁水)，对各组小鼠麻醉后取血，离心后分离血清以备检测。在体视显微镜下剥取小鼠心脏和主动脉，剥离血管外附着组织，置于4％甲醛溶液固定。分别将各组固定的主动脉进行切片观察：从心脏底部横断面连续切片，切片厚5μm。主动脉根部以主动脉瓣为标志选取4个切面，分别为：升主动脉最近端横截面，切面形态呈圆形；主动脉瓣起始横截面；主动脉瓣附着部位，并有冠状动脉开口；主动脉瓣完全出现并汇合在一起。统一选取第四切面，分别进行病理HE染色并进行扫描后，利用Image-ProPlus6.0软件圈选出斑块区域进行分析，计算出斑块面积为579092.95μm2。实施例31花椒的用量为6g，黄连的用量为9g，其它条件同实施例30，斑块面积为588269.72μm2。实施例32花椒的用量为25g，黄连的用量为12g，其它条件同实施例30，斑块面积为482411.12μm2。实施例33花椒的用量为12g，黄连的用量为15g，其它条件同实施例30，斑块面积为613990.84μm2。实施例34花椒的用量为3g，黄连的用量为20g，其它条件同实施例30，斑块面积为607425.00μm2。实施例35花椒的用量为20g，黄连的用量为25g，其它条件同实施例30，斑块面积为657938.65μm2。实施例36花椒的用量为9g，黄连的用量为30g，其它条件同实施例30，斑块面积为574134.92μm2。实施例37黄连-花椒配伍前后对AS小鼠主动脉斑块的影响动物：小鼠在试验前在动物房内温度18～22℃和相对湿度60～80％的条件下适应性饲养7天。动物分组及建模方法将C57BL/6小鼠10只作为野生对照组，将80只ApoE-/-小鼠随机分为8组，分别为空白组、模型组、阳性对照组、黄连组、花椒组、黄连-花椒低剂量组、黄连-花椒中剂量组和黄连-花椒高剂量组；除野生组和空白组给予普通饲料外，其余7组小鼠进行高脂饮食(高脂饲料含78.85％基础饲料，0.15％胆固醇和21％脂肪、食料量为4～8克/天)；同时，阳性对照组、黄连组、花椒组依次分别给予阿托伐他汀钙片(给药剂量为2.6mg·Kg-1)、实施例5制备的黄连提取液(给药剂量为1.56g·Kg-1)、实施例4制备的花椒提取液(给药剂量为1.56g·Kg-1)；低剂量组、中剂量组和高剂量组分别给予实施例3制备的抗动脉粥样硬化药物组合物(给药剂量分别为1.56g·Kg-1、3.12g·Kg-1和6.24g·Kg-1)。根据小鼠体质量(每周称重1次)以校正给药剂量，给药剂量为10mL·Kg-1，一天一次，连续给药16周后停止药物干预，并观察各组小鼠主动脉斑块形态及斑块面积，具体结果如表1、图1～3所示。由图1所示，主动脉(主动脉弓用圆形虚线标出)整体染色可以非常直观地反应出AS的病变程度，是AS研究中常用的一种分析手段。同时，在本实验中，经油红O染色后，主动脉中的沉积脂肪被染成红色，具体结果见图2。由图2可以看出，野生组小鼠主动脉基本无红染，模型组小鼠最为严重；与模型组相比，花椒组小鼠主动脉沉积脂肪无明显减少，其余各给药组小鼠主动脉沉积脂肪明显减少。由图3可以看出，在光镜下(×100)观察各组小鼠主动脉根部经HE染色后的切片，野生组小鼠主动脉内皮表面光滑，厚度分布均匀，结构完整，未检测到斑块；其余各组小鼠主动脉根部出现不同程度的斑块：空白组内膜稍增厚，有少量的脂质斑块；与空白组相比，模型组可见向腔内凸起的大量斑块(P＜0.01)，内膜出现明显增厚，可见胆固醇结晶，斑块有成熟的纤维帽覆盖；与模型组相比，各给药组小鼠主动脉根部病变得以不同程度的控制，斑块面积均不同程度的减小(结果见表1)，其中，黄连组和低剂量组小鼠主动脉斑块面积缩小显著(P＜0.05)，阳性对照组、中剂量组和高剂量组小鼠主动脉斑块面积缩小极显著(P＜0.01)。同时，采用本发明制备得的抗动脉粥样硬化药物与各单味药相比，小鼠主动脉根部斑块均减小；其中，与黄连组和花椒组相比，中剂量组和高剂量组的斑块面积均缩小极显著(P＜0.01)。表1各组小鼠主动脉根部斑块面积对比组别斑块面积/μm2野生组0空白组390896.29±69914.12模型组682994.87±26349.55**阳性对照组524011.64±68124.36##黄连组615237.86±58485.25#花椒组644899.26±50419.70低剂量组605056.94±27021.56#中剂量组519357.43±23663.03##△△§§高剂量组504087.45±86065.89##△△§§注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与黄连组比较，△△P＜0.01；与花椒组比较，§§P＜0.01。主动脉根部是小鼠AS病变的好发部位，对该位置的病理分析已成为AS病变程度评价的一个主要指标。AS的最终结果为形成脂质斑块，斑块的厚度及分布范围的大小直接反映了AS的病变程度。由表1可以看出：在本实验中，模型组小鼠主动脉根部内膜增厚，斑块明显，可见胆固醇结晶，有成熟的纤维帽覆盖，证明AS动物模型建模成功，该小鼠可用于下一步的药物干预和病理机制的研究。同时，黄连可明显减缓斑块的生长，花椒对AS斑块无明显作用，黄连-花椒配伍后对斑块的抑制作用增强。与模型组相比，除花椒组外，各给药组小鼠主动脉根部斑块均不同程度的减少，说明黄连和黄连-花椒药对均可抑制斑块的生长；与黄连、花椒单味药相比，二者配伍后作用增强。实验结果表明：本发明制备得到的药物能够有效地抗动脉粥样硬化。实施例38观察实施例37实验后的各组小鼠肝脏病理组织变化在光镜下(×100)观察各组小鼠肝细胞由油红O染色后的切片，具体结果如图4所示。由图4可以看出，野生组小鼠肝细胞排列整齐，细胞间隙清晰，细胞核蓝色居中，细胞内未见明显红色脂滴；空白组小鼠肝细胞排列较整齐，有少量炎性细胞浸润，偶见散在的红染脂滴；模型组小鼠肝细胞肿胀，排列紊乱，细胞内可见大片的红染脂滴，相邻肝细胞内可见脂滴融合现象；各给药组的肝细胞脂滴较模型组明显减少。同时可以看出，黄连-花椒配伍前后均可减轻肝细胞脂肪变性程度，与单味药相比，黄连-花椒配伍后，可明显减轻肝细胞脂肪变性程度，特别是中、高剂量组，肝细胞结构较清晰，排列较整齐，脂肪变性程度较模型组明显减轻。实验结果表明，黄连-花椒配伍后均可减轻肝细胞脂肪变性程度。实施例39连续给药16周后，对实施例37中各组小鼠血清中的血脂水平进行检测，具体结果如表2所示。表2各组小鼠血脂水平比较注：与野生组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与空白组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05由表2可以看出，与野生组比较，其余各组小鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平均显著升高(P＜0.01)；与空白组相比，模型组小鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平均显著升高(P＜0.01或P＜0.05)；与模型组相比，各给药组小鼠血清TC、TG和LDL-C水平有所降低，其中，阳性对照组、中剂量组和高剂量组小鼠血清TC水平降低显著(P＜0.05)，高剂量组小鼠血清LDL-C水平降低显著(P＜0.05)；与模型组相比，除花椒组外，其余各给药组小鼠血清HDL-C水平均升高，但差异无统计学意义；与黄连组和花椒组相比，低、中、高3个剂量组小鼠血清TC、TG和LDL-C水平均有所降低，但无统计学差异。实验结果表明：黄连和花椒单味药均具有降脂作用，二者配伍后降脂作用无明显增强。在本实验中，模型组小鼠与空白组小鼠相比，血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平均显著升高，出现了血脂异常的现象；与模型组相比，各给药组小鼠血清的血脂水平均有不同程度的降低，特别是阳性对照组、中剂量组和高剂量组小鼠血清TC水平、高剂量组小鼠血清LDL-C水平均降低显著；与黄连、花椒单味药相比，二者配伍后降脂作用无明显增强。实施例40连续给药16周后，对实施例37中各组小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6进行检测，具体结果如表3～5所示。表3各组小鼠血清TNF-α水平比较组别TNF-α(pg·mL-1)野生组15.76±1.20空白组19.41±1.67*模型组23.19±2.61**阳性对照组17.58±1.63##黄连组21.44±1.38花椒组20.16±2.83#低剂量组18.03±1.43##△△中剂量组17.63±1.09##△△高剂量组16.98±1.31##△△§注：与野生组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与黄连组比较，△△P＜0.01；与花椒组比较，§P＜0.05表4各组小鼠血清IL-1β水平比较组别IL-1β(pg·mL-1)野生组18.10±3.87空白组42.34±4.39**模型组50.76±4.31**阳性对照组31.14±3.47##黄连组44.35±3.37#花椒组38.05±3.78##△低剂量组35.82±1.83##△△中剂量组33.72±2.54##△△高剂量组31.76±4.79##△△§注：与野生组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与黄连组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与花椒组比较，§P＜0.05表5各组小鼠血清IL-6水平比较组别lL-6(pg·mL-1)野生组17.18±3.74空白组23.04±1.24**模型组27.92±2.35**阳性对照组20.05±2.21##黄连组25.94±1.39花椒组23.73±3.46#低剂量组22.21±0.94##△中剂量组19.60±1.32##△△§高剂量组19.00±1.65##△△§§注：与野生组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与黄连组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与花椒组比较，§P＜0.05，§§P＜0.01由表3～5可以看出，黄连-花椒药对和单味药均具有抗炎作用，且二者配伍后抗炎作用增强。在本实验中，AS模型组小鼠与野生组相比，血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6含量均显著升高，说明这些炎症因子与AS相关联，参与了AS病变的进程。与模型组相比，各给药组小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量不同程度的降低，其中黄连组小鼠血清中的IL-1β及花椒组、低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6含量均显著降低，说明黄连、花椒单味药和药对均可抑制炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达。与黄连组相比，低、中、高剂量组小鼠血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6含量均显著降低；与花椒组相比，低、中、高剂量组小鼠血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6含量不同程度的降低，特别是中剂量组小鼠血清中的的IL-1β和高剂量组小鼠血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6含量均显著降低，说明黄连-花椒配伍后，对炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的抑制作用增强，同时可推测黄连-花椒可通过调控炎症反应起到抗AS的作用。实施例41连续给药16周后，对实施例37中各组小鼠肝脏HMG-CoA还原酶活性和HMG-CoA还原酶的基因表达水平进行检测，具体结果如表6和7所示。表6各组小鼠肝脏HMG-CoA还原酶活性比较组别活性(ng·mL-1)野生组0.87±0.21空白组1.62±0.2**模型组2.39±0.17**阳性对照组1.16±0.19##黄连组1.82±0.28##花椒组2.13±0.28低剂量组1.74±0.13##§中剂量组1.43±0.09##△△§§高剂量组1.26±0.23##△△§§注：与野生组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01；与黄连组比较，△△P＜0.01；与花椒组比较，§P＜0.05，§§P＜0.01表7各组小鼠肝脏HMG-CoA还原酶基因表达比较组别基因相对表达野生组1.00空白组1.91±0.11模型组2.51±0.12**阳性对照组1.38±0.04##黄连组1.71±0.12##花椒组1.83±0.07##低剂量组1.65±0.05##中剂量组1.57±0.09##§高剂量组1.49±0.05##§§注：与野生组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01；与花椒组比较，§P＜0.05，§§P＜0.01由表6和7可以看出，黄连-花椒药对和单味药均可抑制肝脏HMG-CoA还原酶的表达，且二者配伍后抑制作用增强。在本发明中，与野生组相比，模型组小鼠肝脏HMG-CoA还原酶活性和基因表达水平均显著升高，说明HMG-CoA还原酶参与了AS进程；与模型组相比，各给药组小鼠肝脏HMG-CoA还原酶活性和基因表达水平均显著降低，说明黄连、花椒单味药和药对均可抑制肝脏HMG-CoA还原酶的表达，减少胆固醇的合成从而达到治疗AS的效果。与黄连、花椒单味药相比，低、中、高3个剂量组肝脏HMG-CoA还原酶活性和基因表达均不同程度的降低，说明二者配伍后对肝脏HMG-CoA还原酶的抑制作用增强。但由第三章结果可知，黄连-花椒配伍后降脂作用无明显增强，这可能是由于HMG-CoA还原酶虽是参与胆固醇代谢的重要酶之一，但其具有可独立于胆固醇代谢的功能。实施例42连续给药16周后，对实施例37中各组小鼠肝脏NF-κB/MAPK、主动脉p-ERK1/2蛋白表达水平、主动脉MEK1的基因表达水平和主动脉VCAM-1的基因表达水平进行检测，具体结果如表8～11所示。表8各组小鼠主动脉NF-κB表达比较组别基因相对表达蛋白相对表达野生组1.001.00空白组1.36±0.17**1.36±0.08*模型组1.64±0.05**2.18±0.24**阳性对照组1.05±0.09##0.99±0.07##黄连组1.3±0.06##1.5±0.08##花椒组1.33±0.07#1.52±0.04##低剂量组1.07±0.12##§1.09±0.09##△△§§中剂量组1.06±0.02##§1.07±0.10##△△§§高剂量组1.01±0.09##△§§1.05±0.13##△△§§注：与野生组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与黄连组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；花椒组比较，§P＜0.05，§§P＜0.01表9各组小鼠主动脉主要激酶蛋白表达比较组别p-ERK1/2p-JNKp-p38野生组1.001.001.00空白组1.28±0.07**1.71±0.15**1.41±0.06**模型组1.84±0.10**1.90±0.05**1.76±0.12**阳性对照组1.28±0.07##1.37±0.03##1.15±0.07##黄连组1.58±0.02##1.61±0.04##1.38±0.02##花椒组1.47±0.03##1.67±0.04#1.47±0.10#低剂量组1.36±0.09##△1.56±0.06##1.21±0.08##§中剂量组1.20±0.03##△△§§1.56±0.13##1.21±0.08##§高剂量组1.16±0.10##△△§§1.38±0.04##△§§1.14±0.07##△§§注：与野生组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与黄连组比较，△,P＜0.05，△△P＜0.01；花椒组比较，§P＜0.05，§§P＜0.01表10各组小鼠主动脉MAPK信号通路上游信号分子基因表达比较注：与野生组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与黄连组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；花椒组比较，§P＜0.05，§§P＜0.01表11各组小鼠主动脉MAPK信号通路下游炎症因子基因表达比较组别VCAM-1ICAM-1MCP-1野生组1.001.001.00空白组2.44±0.36**1.67±0.22**2.11±0.26**模型组4.34±0.20**2.22±0.20**2.68±0.17**阳性对照组1.63±0.12##1.25±0.10##1.45±0.09##黄连组3.31±0.11##1.48±0.09##1.73±0.19##花椒组3.49±0.18##1.51±0.07##1.83±0.13##低剂量组3.25±0.13##1.14±0.09##△§1.46±0.14##中剂量组2.44±0.17##△△§§1.10±0.04##△§1.28±0.11##§高剂量组1.60±0.18##△△§§1.06±0.10##△△§§1.23±0.20##△§§注：与野生组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01；与黄连组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；花椒组比较，§P＜0.05，§§P＜0.01由表8～11可以看出，黄连-花椒药对和单味药均可抑制NF-κB/MAPK信号通路的激活，二者配伍后抑制作用增强。在本实验中，与野生组相比，AS模型组小鼠主动脉NF-κB的基因水平和蛋白表达均显著升高，说明在AS病变过程中，NF-κB信号通路激活。与模型组相比，各给药组小鼠主动脉NF-κB的基因水平和蛋白表达不同程度的降低，这说明黄连、花椒单味药和药对均可抑制NF-κB信号通路激活。同时，与黄连、花椒单味药组相比，低、中、高3个剂量组对NF-κB信号通路的抑制作用更强，说明黄连-花椒配伍后对NF-κB信号通路的抑制作用增强。AS中MAPK信号通路的变化和其上、下游因子的表达水平完全一致。AS模型组小鼠与野生组相比，主动脉ERK1/2、JNK、p38蛋白磷酸化水平升高，同时，ERK1/2上游信号分子MEK1和MEK2、JNK上游信号分子MKK4和MKK7、p38上游信号分子MKK3和MKK6的基因水平均有升高的趋势，下游炎症因子VCAM-1、ICAM-1和MCP-1的基因水平亦升高，说明AS病理过程中，MAPK信号通路中的ERK1/2、JNK、p38信号通路均激活，从而促进其下游炎症因子的表达，加重AS的发生、发展。与模型组相比，各给药组小鼠主动脉ERK1/2、JNK、p38蛋白磷酸化水平降低，同时，ERK1/2上游信号分子MEK1和MEK2、JNK上游信号分子MKK4和MKK7、p38上游信号分子MKK3和MKK6的基因水平均有降低的趋势，下游炎症因子VCAM-1、ICAM-1和MCP-1的基因水平均显著降低，说明黄连、花椒单味药和药对均可抑制ERK1/2、JNK、p38信号通路的激活，下调主要激酶的蛋白表达和上游信号分子的基因表达，从而抑制各种炎症因子的表达而发挥抗炎作用。与黄连、花椒单味药相比，低、中、高3个剂量组对MAPK信号通路的抑制作用更强，说明黄连-花椒配伍后对MAPK信号通路的抑制作用增强。实施例43由实施例3制备得到的抗动脉粥样硬化药物组合物，加入糊精(药物与糊精的质量比为1:0.5)，混匀，制粒，干燥(水分不超过8.0％)，整粒，制成颗粒剂。实施例44由实施例3制备得到的抗动脉粥样硬化药物组合物，加入淀粉(药物与淀粉的质量比为1:0.5)，混匀，按照常规工艺装入0-1号胶囊，制成胶囊剂。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3