一种用于治疗或抑制实体肿瘤的药物组合、及包含该组合物的药盒的制作方法

[0001]
本项发明涉及一种用于治疗或抑制实体肿瘤的药物组合、包含该组合的药盒、以及一种抗实体肿瘤方法。


背景技术：

[0002]
多种类的物质曾经被用以制作肿瘤疫苗。微生物类物质最早被应用于开发实体肿瘤疫苗。早在1891年，威廉b.科利(william b.coley)便发现经灭活的化脓性链球菌和黏质沙雷菌(科利毒素)对某些肿瘤有疗效。卡介苗(bcg)也有类似效果。此后的研究者又发现，活的、减毒或基因修饰的专性或兼性厌氧细菌(例如梭菌属、沙门氏菌属、双歧杆菌属、埃希杆菌属的诸多细菌)可以释放某些抗原激活机体免疫系统，也可以选择性地在肿瘤内繁殖(可用作定植载体)。最迟在1912年，又有研究者发现感染流感病毒或注射狂犬病疫苗后肿瘤病情明显缓解的案例。后来的研究又发现，活的、减毒或基因修饰的溶瘤病毒可以通过两种方式(选择性肿瘤细胞杀伤和抗肿瘤免疫)抑瘤。此外，疟原虫、弓形虫等也被发现可抗肿瘤生长，而某些寄生虫和肿瘤具有相似的抗原表位(例如某些寄生虫细胞表面的黏蛋白型o-聚糖)，以及某些寄生虫亚单位(例如寄生虫肽段gk1)可启动有益似免疫应答。总之，微生物类疫苗要么显示出一定的有效性却有较高安全性风险，要么显示出较高安全性却有效性不高。除了卡介苗在膀胱癌治疗中还有所应用外，这类微生物疫苗在临床上仍然少有应用。
[0003]
为了提高特异性，包含肿瘤抗原的疫苗更引入关注。首先出现的是全肿瘤细胞疫苗。自体或同种异体肿瘤细胞经过局部消除致瘤性的处理后，其免疫原性仍然能显示出一定的抗肿瘤疗效。异种肿瘤细胞也是如此。肿瘤细胞通过添加佐剂或通过引入新的基因可以使其更具抗原性。全细胞疫苗表达较全面，但成分复杂、特异性仍然不强。研究人员于是寄望于在肿瘤细胞中筛选出个别有用无害的抗原部位(例如某些胞外体、表面蛋白质、核酸、多肽等)制成亚单位疫苗。所谓的肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的发现，曾经让人们欢欣鼓舞。然而，尽管这些亚单位疫苗成分较单一、特异性较强、安全性较高，其免疫原性却较低下，性(有效性)/价(安全性)比仍然不高。随着当代基因技术的发展，肿瘤新抗原(neoantigen)再次让人们为之一振。
[0004]
肿瘤新抗原是指由癌细胞基因突变所导致的、正常细胞所没有的、且能被免疫细胞所识别的一类蛋白/表位多肽。一个癌细胞所携带的突变基因数目往往巨大(成百上千)，其所产生的异常蛋白数目不小(数十至数千)，肿瘤新抗原只是其中一小部分。新技术(例妣基因测序技术、计算机模拟和蛋白质谱技术)的发展可以鉴定出这些突变基因和异常蛋白，并预测有新抗原潜力的蛋白，以及在体外筛选、合成这些新抗原。然而，多肽序列一般由几个或数十个氨基酸组成，分子量较小，化学结构简单，安全性虽高免疫原性却较弱，仍然难以诱发足够强度的免疫反应，仅有不多的成功案例被报道。
[0005]
亚单位抗原的准确度和微生物减毒活抗原(例如病毒和细菌)强有力的免疫原性的结合，衍生出载体疫苗。它们具有结合活减毒疫苗和重组病毒载体疫苗的优势，且无常见
的与活减毒疫苗安全方面和制备相关的问题。而在体外将树突状细胞(dc细胞)负载肿瘤抗原，有可能针对患者dc功能缺陷加强抗肿瘤免疫反应，衍生出dc疫苗。包括：dc与肿瘤细胞融合疫苗、肿瘤抗原肽或蛋自提取物致敏的dc疫苗、taa或tsa基因修饰的dc疫苗、肿瘤细胞胞外体致敏的dc疫苗等。然而，这些肿瘤抗原衍生疫苗仍然未显示出针对大多数实体肿瘤的有效性。
[0006]
尽管技术手段的快速发展有利于研究人员开发越来越具特异性的安全肿瘤疫苗，而从临床角度看现有实体肿瘤疫苗的有效性仍然进步不大。因而，仍然需要开发新的免疫策略，以满足现有技术尚不能满足的急需临床需求。


技术实现要素：

[0007]
本发明专利申请的目的，在于提供一种可以将瘤体改造为不相容移植物进行免疫清除、而不需抗原性(例如gvhd)又最小化的药物组合，以及包含它的组合物、该组合的应用、和一种抗实体肿瘤方法。
[0008]
本申请公开的一个方面提供瘤外移植物和基因全相合瘤体移植的抗移植药物的组合作为活性成分在制备抗实体肿瘤药物中的应用。
[0009]
本申请公开的另一个方面提供一种用于治疗或抑制实体肿瘤的药物组合物，其包含瘤外移植物和基因全相合瘤体移植的抗移植药物。
[0010]
本申请公开的再一个方面提供一种治疗或抑制实体肿瘤的方法，其包括向有此需要的个体给药瘤外移植物以及基因全相合瘤体移植的抗移植药物，其中所述瘤外移植物和所述抗移植药物是分开给药，其中所述瘤外移植物是瘤区以为的部位给药，而所述抗移植药物是在瘤区给药
[0011]
本申请公开的又一个方面提供一种用于治疗或抑制实体肿瘤的药盒，其包括：一个或多个容纳第一组合物的容器，一个或多个容纳第二组合物的容器，任选存在的容纳用于所述第一和第二组合物的载体，以及如何使用该药盒的标签；其中所述第一组合物是瘤外移植物，而第二组合物是基因全相合瘤体移植的抗移植药物。
[0012]
根据本发明的组合或组合物与现有技术的实体肿瘤疫苗相比具有以下优点：更高的实体肿瘤抑瘤有效性，更宽的实体肿瘤适应症谱。
[0013]
根据本发明的抗实体肿瘤方案更容易和其它相关治疗方案联合进行。此外，该应用和该疫苗制备可控、成本便宜，而该治疗方案简便易行，特别有助于使难以承受高额费用的广大人群也享受到安全、有效治疗。
具体实施方式
[0014]
根据本申请公开的一个方面，其提供提供瘤外移植物和基因全相合瘤体移植的抗移植药物的组合作为活性成分在制备抗实体肿瘤药物中的应用。
[0015]
根据本申请公开的另一个方面，其提供一种用于治疗或抑制实体肿瘤的药物组合物，其包含瘤外移植物和基因全相合瘤体移植的抗移植药物。
[0016]
根据本申请公开的再一个方面，其提供一种治疗或抑制实体肿瘤的方法，其包括向有此需要的个体给药瘤外移植物以及基因全相合瘤体移植的抗移植药物，其中所述瘤外移植物和所述抗移植药物是分开给药，其中所述瘤外移植物是瘤区以为的部位给药，其中
所述瘤外移植物是在瘤区以外局部给药，而所述抗移植药物是在瘤区给药或全身性给药。
[0017]
根据本申请公开的又一个方面，其提供一种用于治疗或抑制实体肿瘤的药盒，其包括：一个或多个容纳第一组合物的容器，一个或多个容纳第二组合物的容器，任选存在的容纳用于所述第一和第二组合物的载体，以及如何使用该药盒的标签；其中所述第一组合物是瘤外移植物，而第二组合物是基因全相合瘤体移植的抗移植药物。
[0018]
在本申请公开中，术语“实体肿瘤”是指可通过临床检查如x线摄片、ct扫描，b超、或触诊扪及到有形肿块的一类肿瘤，该有形肿块即为瘤体；术语“瘤区”是指瘤体内部和瘤体周围；术语“非实体肿瘤”是指实体肿瘤之外的肿瘤，例如血液骨髓肿瘤(例如白血病)。
[0019]
在本申请公开中，术语“组织”是指包含形态功能类似的动物细胞和细胞间质组成的多细胞结构；术语“器官”是指包含能形成一定生理功能的多个组织的多组织结构；术语“细胞制品”是指数量庞大的一种细胞的集合(例如细胞液、细胞沉淀等)。
[0020]
在本申请公开中，术语“移植”是指将源于动物供者的生物材料(例如器官、组织或细胞制品)植入动物受者体内的过程；术语“移植物”是指植入动物受者体内的供者材料；术语“瘤外移植物”是指植入动物受者体内瘤区之外的供者材料；术语“瘤区移植物”是指植入动物受者体瘤区的供者材料。
[0021]
在本申请公开中，术语“基因全相合移植”是指基因全相合供、受者之间的移植，包括自体移植和同基因异体移植；术语“基因全相合移植的排斥增强药物”是指施用后基因全相合组织或/和细胞的移植排斥反应得以呈现和变得明显的药物。
[0022]
在一个实施方案中，所述抗移植药物为瘤内用药或/瘤外用药。在一个实施方案中，所述抗移植药物为瘤内用药。
[0023]
在一个实施方案中，所述抗移植药物和瘤外移植物的单次使用剂量比(w：w或v：v)为(1～1000)：10。
[0024]
在一个实施方案中，所述抗移植药物和瘤外移植物的使用次数比(次：次)为(1～100)：20。
[0025]
在一个实施方案中，所述抗移植药物和瘤外移植物的使用次数比(次：次)为(1～100)：20，且所述抗移植药物和瘤外移植物的单次使用剂量比(w：w或v：v)为(1～1000)：10。
[0026]
在本发明的范围内，所述瘤外移植物作为抗原用于制备抗实体肿瘤药物组合物的应用。
[0027]
在本申请公开中，术语“抗原”是指既具有免疫原性又具有免疫反应性(能与免疫原性刺激产生的抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外发生特异性反应的性能)的物质。
[0028]
在本发明的范围内，所述抗移植药物为基因全相合瘤体移植的抗移植药物，其作为所述瘤外移植物抗原的协同成分用于抗实体肿瘤药物组合物的制备。
[0029]
在一个实施方案中，作为所述瘤外移植物抗原的协同成分的所述抗移植药物优选为选自能够在瘤区形成瘤外移植物的共同免疫原的药物。
[0030]
在本申请公开中，术语“免疫原性”是指物质刺激机体免疫系统产生免疫应答的性能，例如物质进入机体后刺激淋巴细胞活化、增殖、分化，产生抗体或致敏的效应淋巴细胞；术语“免疫原”是指具有免疫原性(immunogenicity)的物质；术语“共同免疫原”是指包含有共同免疫原性的不同免疫原。物质往往不只含有单一结构因素，而是具有多种免疫原决定要素(例如免疫原决定基)，或者说具有多种被免疫系统识别从而激活免疫应答的可能性
(免疫原性)。物质自身所特有的免疫原决定要素称作特异性免疫原要素，相应的免疫原性是其特异性免疫原性。而其它的免疫原决定要素则是非特异性免疫原要素，相应的免疫原性是其非特异性免疫原性。结构复杂的物质通常同时含有上述两类免疫原决定要素及免疫原性。不同物质往往具有不同的免疫原决定要素从而各自具有特异性，通常也具有相同的免疫原决定要素，例如：不同物种间存在共同的免疫原组成，不同免疫原分子间存在共同的免疫原表位，不同免疫原表位之间可能有部分结构相同。
[0031]
在一个实施方案中，所述抗移植药物作为所述瘤外移植物抗原的协同成分的必要条件是它将瘤体改造为不相容移植物，以方便所述瘤外移植物抗原介导的免疫清除。
[0032]
在一个实施方案中，所述抗移植药物选自包括所述瘤体移植的排斥增敏药物和/或所述瘤体的破坏药物之一种或多种。
[0033]
在一个实施方案中，所述排斥增敏药物为选自有助于受者免疫系统对瘤体组织的识别并有效增敏对它的排斥反应的药物。
[0034]
在一个实施方案中，所述瘤体破坏药物优选为选自能对瘤体组织造成严重损伤、以致于使得受者免疫系统产生对严重损伤组织的排斥反应的药物。
[0035]
在一个实施方案中，所述排斥增敏药物选自以下组之一种或多种：瘤区移植物、瘤区给药的微生物制品。
[0036]
在一个实施方案中，作为所述排斥增敏药物的瘤区移植物可以为选自有助于受者免疫系统将瘤体组织识别作异质移植物而加以免疫排斥的组织或/和细胞制品。
[0037]
在一个实施方案中，作为所述排斥增敏药物的微生物制品可以为选自有助于瘤体组织破坏或/和有助于受者免疫系统将瘤体组织识别作异质移植物而加以免疫排斥的源于微生物的制品(例如微生物、微生物亚单位、微生物基因)。
[0038]
在一个实施方案中，所述排斥增敏药物选自瘤区移植物之一种或多种。
[0039]
在一个实施方案中，所述排斥增敏药物选自瘤区给药的微生物制品之一种或多种。
[0040]
在本发明的范围内，所述瘤区移植物和瘤外移植物的使用次数比(次：次)为(1～50)：20、或/和量比(w：w)为(1～100)：10。
[0041]
在本发明的范围内，所述微生物制品和瘤外移植物的使用次数比(次：次)为(1～50)：20、或/和量比(w：w)为(1～100)：10。
[0042]
在一个实施方案中，所述破坏药物选自以下组之一种或多种：瘤区给药的组织破坏剂、靶向瘤体的细胞毒药物、靶向瘤区的抗肿瘤血管生成药物。
[0043]
在一个实施方案中，选作所述破坏药物的细胞毒药物优选为选自有助于瘤体组织破坏的细胞毒药物。
[0044]
在一个实施方案中，选作所述破坏药物的组织破坏剂优选为选自能使瘤体组织有效破坏的组织破坏剂。
[0045]
在一个实施方案中，选作所述破坏药物的抗肿瘤血管生成药物优选为选自能使瘤体血管有效破坏的抗肿瘤血管生成药物。
[0046]
在一个实施方案中，所述破坏药物选自瘤区给药的组织破坏剂之一种或多种。
[0047]
在一个实施方案中，所述破坏药物选自靶向瘤体的细胞毒药物之一种或多种。
[0048]
在一个实施方案中，所述破坏药物选自瘤区给药的组织破坏剂和靶向瘤体的细胞
毒药物之一种或多种。
[0049]
在一个实施方案中，所述细胞毒药物和组织破坏剂的量比(w：w)为(0.1～10)：100。
[0050]
在一个实施方案中，所述破坏药物选自靶向瘤区的抗肿瘤血管生成药物之一种或多种。
[0051]
在一个实施方案中，所述破坏药物选自瘤区给药的组织破坏剂和靶向瘤体的抗肿瘤血管生成药物之一种或多种。
[0052]
在一个实施方案中，所述组织破坏剂和瘤外移植物的使用次数比(次：次)为(1～100)：20、或/和量比(w：w)为(10～1000)：10。
[0053]
在一个实施方案中，所述细胞毒药物和瘤外移植物的使用次数比(次：次)为(1～100)：20、或/和量比(w：w)为(0.1～10)：10。
[0054]
在一个实施方案中，所述抗肿瘤血管生成药物和瘤外移植物的使用次数比(次：次)为(1～100)：20、或/和量比(w：w)为(1～100)：10。
[0055]
在一个实施方案中，所述抗移植药物包含瘤区移植物以及选自以下组之一种或多种的其它药物：微生物制品、细胞毒药物、组织破坏剂，且其中所述其它药物和瘤区移植物的量比(w：w)为(0.1～30)：100。
[0056]
在本发明的范围内，所述瘤区移植物和所述瘤外移植物可以相同或不同。在本申请范围内，如不特别指明，术语“移植物”包括瘤区移植物和瘤外移植物，其描述和定义适用于瘤区移植物和瘤外移植物。
[0057]
在本发明的范围内，所述移植物选自包含组织和/或细胞制品的移植物。
[0058]
在一个实施方案中，所述移植物所包含的组织或/和细胞制品选自非瘤组织或/和非瘤细胞制品。
[0059]
在一个实施方案中，所述移植物所含所述组织和/或细胞制品中的细胞比容为>22％、优选为33％-86％或50％-86％。
[0060]
在一个实施方案中，所述移植物所含组织和/或细胞制品中的细胞比容为50％-86％。
[0061]
例如，肌肉组织的细胞比容通常大于50％、正常血液的细胞比容通常大于30％(例如人血液的血细胞比容正常范围为37-50％)、去掉部分血清后的浓缩血液的血细胞比容则可达45-85％、工程细胞和血液的组合物中细胞比容可达45-85％等。该细胞比容从组成上保证所述半流体移植物能在体内形成半流体结节、尤其是类瘤体半流体结节。
[0062]
在一个实施方案中，所述移植物所包含的组织所含细胞量为该组织正常平均含量的50％以上、优选为55％-200％或55％-300％。
[0063]
在本发明的范围内，所述移植物选自以下组之一种或多种：流体移植物、半流体移植物、半固体移植物。在一个实施方案中，所述移植物为半流体移植物。
[0064]
在本申请公开中，术语“半流体”是指在限时内(例如10秒)无外压则无肉眼可见的流动、而在临床(施用时)可接受的外压(例如可施加在注射器推进装置上的外压)下可以流动并导致不可逆形变的物体，其区别于流体(流体无外压时亦有流动性)、固体(固体在临床可接受的外压下亦不可流动)、半固体(半固体在临床可接受的外压下仅发生可逆形变)。例如，某些动物器官(例如肌肉块、肝、胃、肠、心、肺、胰腺、软骨、关节等)的组织、以及某些压
力下不流动的凝胶(例如纤维蛋白胶)是半固体，而不是半流体。
[0065]
在一个实施方案中，所述半流体移植物的组成和形态使得其在用药处形成半流体结节。
[0066]
在一个实施方案中，所述半流体移植物包括所述组织或/和细胞制品的半流体化产物，其中所述半流体化选自包括以下组之一种或多种：液体的半流体粘稠化、液体的半流体凝固化、凝固物的破碎化。
[0067]
在本申请公开中，术语“粘稠化”是指液体非病变组织或/和加入添加剂的量达到如此之高，以至于体系不再是流体而成为非流体粘稠物；术语“半流体粘稠化”是指非流体粘稠物为半流体粘稠物的粘稠化；术语“凝固化”是使将液体转化为非液体的处理；术语“半流体凝固化”是指非液体为半流体的凝固化，其包括选自本领域公知的任何半流体凝固化处理，例如：自凝固化(例如不加热、不加凝固剂的凝固)、热凝固化(例如中低温加热凝固)、凝固剂凝固化(例如血液中加入凝血酶和氯化钙凝固为非半固体)；术语“机械破碎”是指包括机械分割和剪切破碎在内的碎块化处理，其中所述剪切破碎可以通过搅拌机、研磨机或匀漿机(例如转速为≥10转/分、优选10-50000转/分的剪切)来进行。
[0068]
其中，所述粘稠化、凝固化和机械破碎都使非病变组织出现严重异常或严重损伤。
[0069]
在一个实施方案中，所述移植物优选为选自半流体移植物，其中所述半流体选自以下组之一种或多种：包含液体组织和/或细胞制品的半流体粘稠物、包含液体组织和/或细胞制品的半流体凝固物、包含非液组织的破碎物、包含液体组织和/或细胞制品的凝固物的破碎物。所述半流体移植物可以作为非正常组织、尤其是严重损伤组织诱导免疫应答的抗原。
[0070]
在一个实施方案中，所述凝固物包括液体组织的自凝固物、凝固剂致凝固物、热凝固物。
[0071]
在一个实施方案中，所述破碎物包括颗粒群。在一个实施方案中，所述颗粒优选为肉眼可辨的宏观颗粒。在一个实施方案中，所述颗粒的最长端的横切面的平均直径为≥100nm，优选为500nm-1mm或1μm-1mm。
[0072]
在一个实施方案中，所述半流体优选为可挤流半流体。在本发明的范围内，所述可挤流半流体是指可在临床接受的压力下流过针管的半流体。
[0073]
在一个实施方案中，所述半流体为植入剂、优选为注射剂，且其单个动物给药量为≥0.2ml、优选为0.4-25ml。所述半流体作为抗原的必要条件提供了多重仿瘤体特征，而较大的结节则使所述半流体结节更易被免疫识别作半流体结节抗原。
[0074]
在一个实施方案中，所述半流体的皮下半消失期为≥0.1日，优选为0.1-30日。
[0075]
在一个实施方案中，所述移植物的组成、性质、形态/结构和应用条件使得其在施用处形成体积≥200mm3、优选≥400mm3的半流体结节。在该技术方案下，所述移植物可以作为非正常或/和严重损伤组织的结节抗原、或严重损伤瘤体仿生抗原。
[0076]
在本申请公开中，术语“结节抗原”是指由结节本身的结构(形态)特点致其特异性免疫原的抗原，其区别于分子形态的抗原(例如微生物抗原、肿瘤抗原、异基因免疫细胞抗原等)、以及半固体形态的抗原(例如半固体移植物抗原等)。术语“微生物抗原”、“肿瘤抗原”、“异基因免疫细胞抗原”、“半固体移植物抗原”则是指分别以微生物的种属特异分子、肿瘤细胞的病原特异分子、异基因免疫细胞的异基因特异分子、半固体移植物的种属或异
基因特异分子为其特异性免疫原的抗原。当这些抗原被用作疫苗抗原时，相应的疫苗分别被称作“结节抗原疫苗”、“微生物疫苗”、“肿瘤抗原疫苗”、“异基因免疫细胞疫苗”等等。结构越复杂的物质，其携带的抗原决定要素(例如抗原决定基)通常也越多。例如，尽管微生物亚单位抗原更安全、更易制备，临床上应用的很多疫苗仍然主要还是活微生物疫苗。
[0077]
在本申请公开中，术语“严重损伤瘤体仿生抗原”是指具有多重仿瘤体特征(包括瘤体特征组分及形貌特点)、但却因严重损伤更易被免疫识别作异物的结节状抗原。
[0078]
根据本发明的移植物，所述组织选自以下组之一种或多种：自动物提取的天然组织、包含细胞和细胞间质的天然组织组分、源自天然组织的工程组织。
[0079]
根据本发明的移植物，所述细胞选自以下组之一种或多种：天然组织包含的细胞、天然组织组分包含的细胞、源自天然组织的天然细胞制备物和/或工程细胞、血浆与细胞(例如天然血细胞制备物和/或工程血细胞)混合物中的细胞。
[0080]
在一个实施方案中，所述移植物选自包含所述细胞和血浆的混合物，且其中所述混合物的的细胞比容为>22％(或细胞浓度为>5.6
×
109个细胞/ml)、优选为33％-86％(或细胞浓度为8.4
×
10
9-22
×
109个细胞/ml)或45％-86％(或细胞浓度为11.5
×
10
9-22
×
109个细胞/ml)。
[0081]
在一个实施方案中，所述移植物选自包含所述细胞和血液的混合物，且其中所述混合物的的细胞比容为>22％(或细胞浓度为>5.6
×
109个细胞/ml)、优选为33％-86％(或细胞浓度为8.4
×
10
9-22
×
109个细胞/ml)或45％-86％(或细胞浓度为11.5
×
10
9-22
×
109个细胞/ml)。
[0082]
在一个实施方案中，所述移植物选自包含所述细胞的粘稠物，且其中所述粘稠物的细胞比容为45％-86％(或细胞浓度为11.5
×
10
9-22
×
109个细胞/ml)、或70％-86％(或细胞浓度为17.9
×
10
9-22
×
109个细胞/ml)。
[0083]
根据本发明的移植物，所述细胞制品或组织所包含的细胞为选自以下组及其衍生物之一种或多种：肌细胞，血细胞、免疫细胞，干细胞例如间充质干细胞、造血干细胞，其中所述免疫细胞选自以下组及其衍生物之一种或多种：树突状细胞、巨噬细胞、白细胞，其中所述白细胞选自以下一种或多种：粒细胞、单核细胞、淋巴细胞，其中所述淋巴细胞选自以下一种或多种：t细胞、b细胞、裸细胞。
[0084]
根据本发明的移植物，优选为其优势抗原性为抗实体肿瘤抗原性而非抗宿主抗原性的移植物。
[0085]
在一个实施方案中，所述移植物优选为抑瘤率为≥抗宿主率、优选为≥150％抗宿主率的移植物。
[0086]
物质作为抗原所导致的免疫识别和免疫响应的复杂性，远远超过其作为化疗药物所导致的后果。在免疫系统的多层次、多元化的网络格局中，一个物质有可能导致多种免疫反应，显示多种抗原性。在本申请公开中，术语“优势免疫反应”是指所激活的主要免疫反应。术语“优势抗原性”是指在优势免疫反应中显示的抗原性。例如，异基因淋巴细胞可攻击受者正常细胞(移植物抗宿主反应)和癌细胞(移植物抗肿瘤反应)，也可激活受者淋巴细胞攻击癌细胞(宿主抗肿瘤反应)和异基因细胞(宿主抗移植物反应)。由于其优势免疫反应为移植物抗宿主反应，其次为移植物抗肿瘤反应，宿主抗肿瘤反应则较弱，故异基因淋巴细胞本质上是一种抗宿主抗原，可以用作抗肿瘤细胞(例如白血病)抗原，却很难被用作实体肿
瘤疫苗抗原。
[0087]
在本发明的范围内，所述移植物优选为选自源于哺乳动物的移植物。
[0088]
在本发明的范围内，所述哺乳动物选自以下之一种或多种：人、猪、马、羊、牛、兔、鼠。这些动物可以是完全自然进化的动物，也可以是经过生物技术(例如基因编辑技术)改造的动物(例如gal抗原敲除猪)。
[0089]
在一个实施方案中，所述移植物包含的组织和/或细胞制品选自以下组之一种或多种：源自受试者的异种动物的并不富含异种糖蛋白抗原的组织和/或细胞制品；源自受试者的同种异体的abo血型相符或hla相近甚至相同的组织和/或细胞制品；源自受试者自体的组织和/或细胞制品。
[0090]
在一个实施方案中，所述移植物包含的组织和/或细胞制品优选为选自以下之一种或多种：低血管密度的异种组织和/或细胞制品、abo血型相符或hla相近的同种异体异基因组织和/或细胞制品、严重损伤同种异体同基因组织和/或细胞制品、严重损伤自体组织和/或细胞制品。
[0091]
在本申请公开中，术语“异种组织”是指含有异种细胞的组织；术语“同种异体组织”是指含有同种异体细胞的组织；术语“自体组织”是指所含细胞均为自体细胞的组织。
[0092]
在一个实施方案中，所述移植物包含的组织和/或细胞制品选自自体组织和/或细胞制品。
[0093]
在一个实施方案中，所述组织优选为选自肌肉组织和/或结缔组织。
[0094]
在一个实施方案中，所述组织选自以下之一种或多种器官所包含的组织：肠、胃、肉、胰腺、脾脏、肝脏、肺、软骨、关节、皮、胎盘、脐带，优选为选自以下之一种或多种器官所包含的组织：肉、脾脏、肝脏、胎盘、脐带，更优选为选自以下之一种或多种器官所包含的组织：肉、胎盘、脐带。
[0095]
在一个实施方案中，所述组织选自结缔组织，优选为选自以下之一种或多种：血液、骨髓、脊髓，更优选为血液。
[0096]
在一个实施方案中，所述组织选自血液以及以下之一种或多种器官所包含的组织：肉、胎盘、脐带。
[0097]
在一个实施方案中，所述血液为选自以下组之一种或多种：天然血液、天然血液的血细胞富集组分(例如血浆含量为天然血液血浆含量的30～80％的血细胞浓缩血液)、包含血细胞制备物和血浆的工程血液(例入白细胞或/和淋巴细胞与血浆的混合物)。
[0098]
在一个实施方案中，所述血液为abo血型相符或hla相近的同种异体血液。在一个实施方案中，所述血液为自体血液。在一个实施方案中，所述血液为血细胞比容为≥45％、优选为50％-86％的血细胞浓缩血液，其中所述血细胞浓缩血液选自以下之一种或多种；自天然血液脱除20～60％血清的脱血清血液、往天然血液加入血细胞的加血细胞血液、包含血细胞和血浆蛋白的人造血液。
[0099]
在一个实施方案中，所述液体组织的半流体凝固物包括血液凝固物，其中所述血液凝固物包括血液自凝固物、血液热凝固物、血液/凝固剂凝固物。在本申请公开中，术语“血液自凝固物”是指血液自然凝固形成的凝固物。术语“血液热凝固物”是指血液经热处理形成的凝固物。术语“血液/凝固剂凝固物”是指血液加入凝固剂所形成的凝固物。
[0100]
在一个实施方案中，所述半流体包括血液自凝固物。
[0101]
在一个实施方案中，所述半流体包括血液/凝固剂凝固物。在一个实施方案中，所述凝固剂包括血液凝固剂，其中所述血液凝固剂选自包括以下之一种或多种：凝血酶例如牛凝血酶、猪凝血酶、重组人凝血酶、自体凝血酶，其它凝血蛋白例如凝血因子、凝血酶原复合物、及它们的活化形式，钙离子提供剂例如氯化钙、氢氧化钙、碳酸钙。
[0102]
所述细胞制品为选自包含以下之一种或多种天然细胞或工程化细胞的制品：组织富含的细胞，例如肌细胞、血细胞；免疫细胞，例如外周血单核细胞、t细胞、b细胞、nk细胞、淋巴细胞；干细胞，例如间充质干细胞、造血干细胞，其中所述细胞优选为选自同种异体细胞和/或自体细胞。
[0103]
在本发明的范围内，所述血细胞选自包括以下一种或多种：红细胞、白细胞、血小板；所述白细胞选自包括以下一种或多种：粒细胞、单核细胞、淋巴细胞；所述淋巴细胞选自包括以下一种或多种：t细胞、b细胞、裸细胞。
[0104]
在一个实施方案中，所述细胞优选为源自同种异体细胞和自体细胞。
[0105]
在一个实施方案中，所述移植物选自包含所述细胞和血浆的混合物的移植物，且其中所述混合物的细胞比容为>22％(或细胞浓度为>5.6
×
109个细胞/ml)、优选为33％-86％(或细胞浓度为8.4
×
10
9-22
×
109个细胞/ml)或55％-86％(或细胞浓度为14.0
×
10
9-22
×
109个细胞/ml)。
[0106]
在一个实施方案中，所述移植物包含血细胞和血浆的混合物的移植物，且其中所述混合物的细胞比容为55～85％(或细胞浓度为14.0
×
10
9-22
×
109个细胞/ml)。
[0107]
在一个实施方案中，所述血浆为选自同种异体血浆和自体血浆。在一个实施方案中，所述血浆为自体血浆；所述细胞为自体细胞。
[0108]
在一个实施方案中，所述移植物选自包含所述细胞的粘稠物的移植物，且其中所述粘稠物的细胞比容为≥22％、优选为33％-86％或50％～85％。
[0109]
在一个实施方案中，所述微生物制品选自以下组之一种或多种：细菌制品、病毒制品、寄生虫制品。
[0110]
在一个实施方案中，所述微生物制品选自以下组之一种或多种：细菌制品例如源自以下细菌的制品之一种或多种：化脓性链球菌、豁质沙雷菌、卡介苗、破伤风梭菌、丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌；病毒制品例如源自以下病毒的制品之一种或多种：腺病毒、单纯疤疹病毒、牛痘病毒、腮腺炎病毒、新城鸡瘟病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、西尼卡谷病毒、柯萨奇病毒、呼肠孤病毒；寄生虫制品例如源自疟原虫的制品。
[0111]
在一个实施方案中，所述细胞毒药物包括抗肿瘤化疗药物。
[0112]
在本申请公开中，术语“细胞毒药物”是指在安全剂量下可以通过吸收作用有效的细胞毒药物，其选自药学上可接受的任何细胞毒药物，优选为选自本领域公知的细胞毒药物，更优选为选自中国、美国或欧洲官方主管行政部门(例如fda或中国药监局)己批准或将批准、或经中国、美国或欧洲官方药典己载入或将载入的抗肿瘤化疗药物。
[0113]
在一个实施方案中，所述抗肿瘤化疗药物可以为选自以下组之一种或多种：尿嘧啶衍生物类、环磷酰胺类、吉西他滨类、表柔比星类、抗肿瘤抗生素类、替尼泊苷、金属铂络合物、紫杉烷类；优选为选自以下药物及其类似衍生物一种或多种：5-氟尿嘧啶、吉西他滨、表柔比星、抗实体肿瘤抗生素、替尼泊苷、金属铂络合物、紫杉醇。
[0114]
在一个实施方案中，所述组织破坏剂选自包括以下组之一种或多种：化学消融剂、
常规无效局部有效化合物。
[0115]
在本申请公开中，术语“组织破坏剂”是指在安全剂量下瘤内给药可以造成瘤体组织有效破坏的药物；术语“化学消融剂”是指在安全剂量下瘤内给药可以造成瘤体化学消融的药物；术语“常规无效局部有效化合物”是指在安全剂量下通过吸收作用临床无效、但局部给药可以造成瘤体组织有效破坏的药物。
[0116]
在一个实施方案中，所述组织破坏剂包括选自所述化学消融剂之一种或多种，例如乙醇、乙酸、氢氧化钠。
[0117]
在一个实施方案中，所述组织破坏剂包括选自所述常规无效局部有效化合物之一种或多种。
[0118]
在一个实施方案中，所述常规无效局部有效化合物选自以下组之一种或多种：氨基酸类营养素、常规无效局部有效芳香化合物、常规无效局部有效植物或菌类活性成分。
[0119]
在一个实施方案中，所述常规无效局部有效化合物包括选自所述氨基酸类营养素之一种或多种。
[0120]
在本发明的范围内，作为所述氨基酸类营养素的氨基酸、氨基酸盐、寡肽优选为选自以下组中的氨基酸或其盐或者包含或由以下氨基酸构成的寡肽：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、β-丙氨酸、牛磺酸、γ氨基丁酸(gaba)、茶氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸；更优选为选自以下组中的氨基酸或其盐或者包含或由以下氨基酸构成的寡肽：精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸。
[0121]
在一个实施方案中，所述常规无效局部有效化合物包括选自所述常规无效局部有效芳香化合物之一种或多种。
[0122]
在本申请公开中，术语“常规无效局部有效芳香化合物”是指在安全剂量下通过吸收作用不能有效抑制肿瘤、但局部给药有效的芳香化合物。
[0123]
在一个实施方案中，所述常规无效局部有效芳香化合物为选自以下组之一种或多种：色素芳香化合物、水杨酸类化合物、喹啉类化合物。
[0124]
在一个实施方案中，所述常规无效局部有效芳香化合物包括选自所述色素芳香化合物之一种或多种。
[0125]
在本申请公开中，术语“色素芳香化合物”是指药学上可以接受的能够使靶区有选择性的将特定波长的光吸收或反射的芳香化合物，其可以例如包括活体染料、光敏剂和有色化疗药物。
[0126]
在一个实施方案中，所述色素芳香化合物可以为选自以下化合物及其衍生物之一种或多种：亚甲蓝(包括其水合物)、专利蓝、异硫蓝、孟加拉红、混合卟啉类光敏剂、卟啉类化合物(例如卟啉、卟吩、红紫素、内源性卟啉)、硝基酚化合物。
[0127]
在一个实施方案中，所述水杨酸类化合物为选自水杨酸和以下化合物及其衍生物之一种或多种：乙酰水杨酸、二氟苯水杨酸、双水杨酸酯、双香豆素、赖氨匹林。
[0128]
在一个实施方案中，所述喹啉类化合物选自水溶性喹啉类化合物，优选为选自以下之一种或多种：奎宁、盐酸奎宁、二盐酸奎宁、氯喹。
[0129]
在一个实施方案中，所述常规无效局部有效化合物包括选自所述常规无效局部有效植物或菌类活性成分之一种或多种。
[0130]
在本申请公开中，术语“常规无效局部有效植物或菌类活性成分”是指在安全剂量下通过吸收作用不能有效抑制肿瘤、但局部给药有效的植物或菌类活性成分；术语“植物或菌类活性成分”是指具有药学活性的生物提取物及其类似物；术语“生物提取物”是指以植物、微生物等生物材料为原料、通过分离过程及其它加工过程获取的特定组分(例如基于特定结构的纯化物)。术语“类似物”是指虽不相同、但结构或/和性质上相似的天然产物、衍生物、半合成物、或合成物。
[0131]
在本发明的范围内，所述植物或菌类活性成分选自具有以下之一种或多种结构的生物提取物及其类似物：苷、多酚、多糖、萜类、黄酮。
[0132]
在一个实施方案中，所述组织破坏剂选自包括以下组之一种或多种：化学消融剂例如乙醇、乙酸、氢氧化钠；常规无效局部有效化合物例如以下组之一种或多种：氨基酸类营养素例如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、或它们的盐、或包含它们的寡肽，无效芳香化合物例如亚甲蓝、乙酰水扬酸、奎宁、一盐酸奎宁、二盐酸奎宁，植物或菌类活性成分例如藻类多糖、药用植物多糖、真菌多糖、青蒿素。
[0133]
在一个实施方案中，所述组合物还包含疫苗佐剂，其中所述佐剂选自以下组之一种或多种：免疫调节类抗体例如靶物为以下之一种或多种的抗体：ctla-4、pd-1、pd-l1、ox40、cd137、4-1bb、tgf-p1；细胞因子例如gm-csf、il-2、il-12、干扰素；免疫调节类蛋白质片断例如cpg。
[0134]
根据本申请公开的组合或组合物还可进一步任选地包括赋形剂。所述赋形剂可以是本领域技术人员已知的任意合适者，其可包括例如以下之一种或多种：分散介质、防腐剂、稳定剂、湿润剂和/或乳化剂、增溶剂、增粘剂等。所述增粘剂例如为羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素、聚乙烯毗咯烷酮或明胶。所述防腐剂例如抗氧化剂例(如抗坏血酸)。
[0135]
在一个实施方案中，所述实体肿瘤优选为选自瘤体体积≥200mm3、更优选为瘤体体积≥300mm3的恶性肿瘤。
[0136]
在本发明的范围中，所述实体肿瘤包括：乳腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、肠癌、口腔癌、胃癌、结直肠癌、支气管癌、喉癌、睾丸癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤、脑瘤、肾细胞癌、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤。
[0137]
在一个实施方案中，所述瘤外移植物给药包括以下之一种或多种：皮下给药、肌肉给药、皮内给药。
[0138]
在一个实施方案中，所述瘤区给药包括瘤内给药和瘤周给药。在一个实施方案中，所述瘤外移植物和瘤区用药序贯施用或同日施用。
[0139]
在一个实施方案中，所述方法还包括与以下之一种或多种治疗合用：介入疗法、化疗、其它免疫疗法、光动力疗法、声动力疗法、手术干预。
[0140]
基于在下文中更详细描述的研究，尽管具体机理尚待进一步研究，本发明的组合和组合物显示出快速治疗和后续治疗、短效与长效的有机统一，且对患者正常组织几无损害，从而达到安全、有效治疗疾病的药学效果。
[0141]
实施例
[0142]
通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为对本发明的限制。在以下实施例中，所有的试验动物均依照相关法规及行业自律进行。如无特殊说明，所有试验均按常规方法进行。
[0143]
以下具体实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中所用的部分添加剂列于表1中。
[0144]
表1
[0145][0146][0147]
在本发明中，l-氨基酸均简写为氨基酸(例如l-精氨酸均简写为精氨酸)，还原型谷胱甘肽简写为谷胱甘肽。
[0148]
以下实施例中所用的实验动物均为通过专业实验动物公司购入，均为spf(specific pathogen free，无特定病原体)级动物。以小鼠为例，共有5种：balb/c小鼠、c57bl/6小鼠、cb6f1小鼠、cc3hf1小鼠、裸小鼠，其中：cb6f1小鼠为balb/c
×
c57bl/6杂交f1代雌性小鼠(表型为h-2
b/d
)，cc3hf1小鼠为balb/c
×
c3h杂交f1代雌性小鼠(表型为h-2
d/k
)、裸小鼠为裸基因(nu)导入balb/c小鼠获得的突变系(balb/c
–
nu)小鼠。小鼠均为6-8周龄健康雌性、体重17.5-20.5g。除非另有说明，在以下实施例中，balb/c小鼠被简写为b鼠，c57bl/6小鼠被简写为c鼠。
[0149]
实验动物器官和组织均为通过实验动物公司购入或用实验动物依规作常规制备，包括：血液、骨髓、脊髓、皮、肠、胃、肉、胰腺、脾、肝、肺、软骨。人胎盘、人脐带从法规规定的处置机构合法获得。
[0150]
在以下实施例中，除非另有说明，皮下移植瘤动物试验均依据药管当局颁发的试验指南、按常规的实体瘤细胞皮下接种方法进行。除非另有说明，实体瘤长至所需体积(例如小鼠荷瘤30-500mm3)则为建模成功，然后采用pems 3.2软件(四川大学华西公共卫生学院编制)随机分为若干个实验组，每组6只动物。试验观察、测量和分析的项目，包括一般状
态、体重、摄食量、动物移植物抗宿主病、实体瘤体积、瘤重、生存时间等。
[0151]
实体瘤体积计算公式如下：
[0152]
实体瘤体积(v)＝l/2
×
a
×
b2，其中a表示实体瘤长，b表示实体瘤宽。
[0153]
实体瘤生长抑制率(本发明中简记为抑瘤率)计算公式如下：
[0154]
抑瘤率y(％)＝(cw-tw)/cw
×
100％，其中tw为研究组的平均瘤重；cw为阴性对照组的平均瘤重。
[0155]
动物移植物抗宿主病的观察项目及评分如下表2所示。
[0156]
表2移植物抗宿主病评分
[0157]
观察指标0分1分2分体质量减轻<10％10％～25％>25％活动能力正常减弱静止不动皮毛正常轻度混乱色度差，混乱皮肤完整度正常脚趾、尾部轻度蜕皮严重脱毛姿势正常轻度弓背严重弓背向上
[0158]
每只动物评分为5项得分之和，最高10分，最低0分。
[0159]
移植物抗宿主率计算公式如下：
[0160]
抗宿主率z(％)＝(tp-cp)/10
×
100％，其中tp为研究组移植物抗宿主病评分的平均值；cp为阴性对照组移植物抗宿主病评分的平均值；10为每只动物移植物抗宿主病评分的可能最高值。
[0161]
在以下实施例中，实验结果(例如瘤重)采用均数
±
标准差(x
±
s)表示，两个实验动物组与组均数之间的差别采用统计学软件spss 19.0软件进行显著性检验来比较，检验选用统计量t来进行，检验水准α＝0.05，p<0.05表示差异有统计学意义，否则无统计学意义。
[0162]
在本发明的范围內，a药和b药的组合物记为b/a。以下实施例中，除非另有说明，a药和b药分别为瘤外移植物和瘤区用药。除非另有说明，a、b、a/b的药效均为抑瘤率。改善抗肿瘤药物的药效一直是世界最大的医药难题。哪怕百分之几的药效提高也难之又难，以致于联合用药的理论预期通常不高，而一旦实现就意义重大。药物联合使用产生的药效，理论上可依据于q判断进行：
[0163]
q＝实际合用效应/理论单纯相加预期效应。
[0164]
当q＝1时，实际合用效应符合理论预期，显示为相加作用；当q<1时，实际合用效应弱于理论预期，显示为拮抗作用；当q>1时，实际合用效应超理论预期，显示为协同作用。
[0165]
本申请公开中使用的q计算基于burgi法(burgi y.pharmacology；drug actions and reactions.cancer res.1978，38(2)，284-285)的金正均改进法(金正均，合并用药中的相加，中国药理学报1980；1(2)，70-76)：
[0166]
q＝e
a+b
/(e
a
+e
b-e
a
·
e
b
)，
[0167]
其中e
a+b
为a药和b药实际合用效应，e
a
为a药单用效应，e
b
为b药单用效应，(e
a
+e
b-e
a
·
e
b
)为a药和b药理论单纯相加预期效应。为了更符合动物实验中的实际误差范围，他进一步用q＝1
±
15％代替q＝1作为相加作用的判定式。
[0168]
文献中常见的另一种抗肿瘤联合用药药效判断方法，基于显著性检验(例如p判断)。在以下抗肿瘤动物实验中，将既合乎q判断又合乎p判断的组合物的药学效应(抑瘤率)判断为实际合用效应与理论预期之间的明显关系：
[0169]
1).当0.85≤q≤1.15、以及e
a+b
与e
a
之间或e
a+b
与e
b
之间的差异无统计学意义(p≥0.05)，则判断为相加作用或未超预期的作用；
[0170]
2).当q<0.85、以及e
a+b
与e
a
之间和e
a+b
与e
b
之间的差异有统计学意义(p<0.05)，则判断为明显拮抗作用；
[0171]
3).当q>1.15、以及e
a+b
与e
a
之间和e
a+b
与e
b
之间的差异有统计学意义(p<0.05)，则判断为明显协同作用。
[0172]
实施例1：移植物的制备
[0173]
以下实施例中，所用组织选自以下组之一种或多种：1)自动物提取的天然组织。例如肌肉、血液、脊髄；2)包含细胞和细胞间质的动物天然组织组分。例如，动物天然组织(例如血液)的细胞富含组分(例如血细胞浓缩血液)；3)源自天然组织的包含细胞和细胞间质的工程组织。
[0174]
以下实施例中，所用细胞制品选自源自结缔组织和/或结缔组织之外的半固体组织的天然细胞制备物和/或工程细之一种或多种。例如，按照现有技术从天然血液分离获得白细胞沉淀、红细胞沉淀、血小板沉淀。又例如，按照现有技术从骨髓等组织提取和制备造血干细胞等。又例如，按照现有技术从动物脾经红细胞裂解去除处理后获得淋巴细胞，其液。淋巴细胞液的制备例如：按照现有技术抽取并获得正常血液，再通过离心分离获得白细胞、红细胞、血小板。又例如，按照现有技术从动物脾经红细胞裂解去除处理后获得淋巴细胞：将动物处死后取脾并温和破碎，再分别加入无血清dmem培养液、红细胞裂解液(0.0075％氯化铵/0.0026％tris除菌水溶液解并稀释至500ml)，温和搅拌后静止5钟，进行离心洗涤3次(离心条件为1 000rpm/min，沉淀重悬液为无血清dmem)，最后获得淋巴细胞沉淀。
[0175]
1、常规移植物的制备
[0176]
包含组织和/或细胞的常规移植物均可通过现有技术中的公知方法制备。
[0177]
动物器官和组织均为通过实验动物公司购入或用实验动物依规作常规制备，包括：血液、骨髓、脊髓、皮、肠、胃、肉、胰腺、脾、肝、肺、软骨。人胎盘、人脐带、人白细胞、人血浆从法规规定的处置机构合法获得。
[0178]
例如，可通过常规的器官、组织分离(例如割取、除去外膜等)从动物(例如猪)解剖中获得以下器官、组织：骨髓、脊髓、肝、肌肉、皮、肠、胃、肉、胰腺、脾、肝、肺、软骨。
[0179]
又例如，按照现有技术抽取并获得正常血液。正常血液的细胞比容通常大于30％(例如人血液的血细胞比容正常范围为37-50％)。细胞比容均从动物试验公司兽医处获得。
[0180]
细胞制品通过商业途径获得，天然细胞制品在实验室制备。例如，按照现有技术抽取并获得正常血液，再通过离心分离获得白细胞、红细胞、血小板。又例如，按照现有技术从动物脾经红细胞裂解去除处理后获得淋巴细胞液：将动物处死后取脾并温和破碎，再分别加入无血清dmem培养液、红细胞裂解液，温和搅拌后静止5钟，进行离心洗涤3次(离心条件为1 000rpm/min，沉淀重悬液为无血清dmem)。沉淀用pbs重悬为淋巴细胞液(109个细胞/ml)。
[0181]
所获得的器官、组织和细胞制品可直接用作移植物。
[0182]
2、半流体移植物的制备
[0183]
上述常规移植物均可通过本发明公开的半流体化方法制备为半流体移植物。例如，固体或半固体器官或组织可通过本发明公开的固体或半固体组织的颗粒化(例如下表中的x3)，制备为包含颗粒化组织的半流体移植物。又例如，液体组织可通过本发明公开的凝固化方法制备为包含凝固化组织的半流体移植物(例如下表中的x16)。又例如，细胞制品液体可通过加入凝胶介质(例如血液或血清)制备为包含细胞制品凝胶的半流体移植物(例如下表中的x24)。又例如，通过常规的组织取样(例如穿剌针取样)从动物活体获得以下破碎组织：骨髓、脊髓(例如下表中的x22)、肝组织、肌肉组织，可用作半流体移植物。
[0184]
固体、半固体、液体、半流体组织均可通过本发明公开的严重损伤方法(例如机械破碎、凝固化、超声损伤、热损伤、冻融损伤、照射损伤、化学损伤)制备为包含严重损伤组织的半流体。实际上，以上半流体化处理也导致组织的严重损伤。
[0185]
下表列举了本实施例制备的部分移植物(制备物编号)、用以制备它的优选组织、主要制备步骤、以及制备所达到的作用和其结节性。
[0186]
表3
[0187]
30khz、)中处理5-10分钟，便获得上表中制备物x8。
[0201]
使用与x5制备相同的方法，可分别进行上表中制备物x3、x9、x10、x11、x20和x21的制备。
[0202]
使用与x6制备相同的方法，可进行上表中制备物x4的制备。
[0203]
实施例1c：将20g取自猪背的皮块经组织提取(剥离除去脂肪)，所获皮组织为半固体组织，然后置于杯中并加可透气盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸120分钟，再趁热置于搅拌机中剪切破碎(转速3000-10000转/分、总时间1-3分钟)，便获得上表中制备物x12。x12加热(例如60-100℃)为半流体，可分装至注射器，在加热(例如60℃)时即可作为可注射疫苗使用。
[0204]
实施例1d：处死一只新西兰免并取15ml免血，在室温下静置30分钟，便获得自凝固血液(上表中x13)。
[0205]
实施例1e：处死一只新西兰免并取15ml免血于预置抗凝剂枸橼酸钠的杯中，慢搅拌均匀后将杯加可透气盖，再放在蒸汽(约100℃)中蒸20-50分钟，便获得热凝固血液(上表中x14)。
[0206]
使用与x14制备相同的方法，可分别进行上表中制备物x15和x16的制备。
[0207]
实施例1f：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)，混合在杯中获得约6ml血液，将杯放入超声仪(温度5-25℃、工作频率10-30khz、)中处理1-30分钟，再将杯加可透气盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸20分钟，便获得上表中制备物x17。
[0208]
实施例1g：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)，加入预置凝血剂(例如终浓度10-100u/1ml的凝血酶和5-25mmol/l的氯化钙)的杯中混合均匀，静置30分钟后再经搅拌破碎(转速3000-10000转/分、总时间1-3分钟)便获得上表中制备物x18。
[0209]
实施例1h：从多只小鼠眼眶分别取血，离心去除40％血清后加入杯中，再将杯加可透气盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸20分钟，便获得上表中制备物x19。
[0210]
使用人血液通过相同制备便获得上表中制备物x20。
[0211]
实施例1i：利用穿刺针在猪后腿上进行肌肉组织取样，然后将高度破坏的肌肉组织抽入注射器针筒，便获得上表中制备物x23。
[0212]
实施例1j：利用抽血针在马耳上抽出约10ml血液，然后取小针头将盛有血液的针筒竖立在微波炉中加热1分钟，便获得上表中制备物x24。
[0213]
实施例1k：从多只小鼠眼眶分别取血，离心去除45％血清后便获得上表中制备物x25。
[0214]
这些制备物均为可注射半流体，分装至注射器后即可作为可注射半流体移植物。
[0215]
3、包含活性成分、细胞或/和组织的半流体移植物的制备
[0216]
通过本发明公开的制备方法，在细胞或/和组织半流体化或/和严重损伤处理前、中、后加入活性成分并适当混合，便制备出本发明的包含活性成分、细胞或/和组织的半流体移植物(组合移植物)。其中所述活性成分包括生物制品和/或组织破坏剂。
[0217]
组织破坏剂和绝大多数生物制品通过商业途径获得(例如表1)。
[0218]
本实施例所用肿瘤抗原按如下方法制备：将肿瘤细胞液(10
8-109个细胞/ml)进行常规的冻融灭活处理(放入低于-80℃液氮中30分钟，然后在37℃解冻融化，此冷冻-融化进行3次)后，经常规的肿瘤细胞移植瘤实验验证为不致瘤，即可用作肿瘤抗原，自各自肿瘤细
胞液获得的肿瘤抗原包括包括自各自肿瘤细胞液获得的以下肿瘤抗原：肉瘤抗原(s180细胞)、肝癌抗原(h22细胞)、结肠癌抗原(ct26细胞)、乳腺癌抗原(4t1细胞)、黑色素瘤抗原(b16细胞)、肺癌抗原(llc细胞)。
[0219]
下表列举了本实施例制备的部分组合物半流体(制备物编号)、用以制备它的优选组织和优选活性成分、主要制备步骤、以及制备所达到的作用和其结节性。
[0220]
表4
[0221][0222]
[0223]
作用：a表示半流体化的有无(+为有)，b表示严重损伤的有无(+为有)。
[0224]
结节：表示能否在注射处形成半流体结节(+为能)，具体如下：将100μl上表中的制备物注射至balb/c小鼠左腋皮下形成结节，且该结节在食指和拇指掐压下可产生不可逆形变。上述半流体结节的皮下半消失期为1-30日。
[0225]
小鼠：表中的小鼠均为balb/c小鼠。
[0226]
混合搅拌：在本实施例中，除非另有说明，混合搅拌为机械搅拌(转速10-10000转/分、总时间1-3分钟)，其可造成组织的机械破碎和机械损伤。
[0227]
以下列出本发明的包含移植物和活性成分的半流体的制备试验的几个实施例。
[0228]
实施例1l：将4.9g从含膜猪脊髄经组织提取(穿刺提取或从解剖剥离除去外膜)所获猪脊髄组织与0.1g多西紫杉置于搅拌机中搅拌(转速1000-2000转/分、总时间1-3分钟)，便获得上表中y1(2％多西紫杉/98％猪脊髄半流体组合物)。
[0229]
如进一步将该y1置于杯中并加可透气盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸20-50分钟，便获得上表中的y2。使用与y1制备相同的方法，可进行上表中制备物y3的制备。
[0230]
使用与y2制备相同的方法，可分别进行上表中制备物y4、y5的制备。
[0231]
实施例1m：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合，将4.9g该血液与0.1g5-fu在杯中搅拌均匀，再对杯加可透气盖，放入蒸汽(约100℃)中蒸5-50分钟，便获得上表中制备物y6。
[0232]
使用与y6制备相同的方法，可分别进行上表中制备物y7、y8、y9的制备。
[0233]
实施例1n：将4.95g从含膜猪脊髄经组织提取(穿刺提取或从解剖剥离除去外膜)所获猪脊髄组织与0.05g cpg odn置于搅拌机中搅拌(转速1000-2000转/分、总时间1-3分钟)，便获得1％cpg odn/99％猪脊髄半流体组合物(制备物y10)。
[0234]
如进一步将该y10置于杯中并加可透气盖，放在水浴(约60℃)中加热5-50分钟，便获得热处理1％cpg odn/99％猪脊髄半流体组合物(制备物y11)。
[0235]
使用小鼠肌肉组织和与y10制备相同的方法，可制备1％cpg odn/99％小鼠肌肉半流体组合物(制备物y12)。
[0236]
使用小鼠肌肉组织组织和与y11制备相同的方法，可制备热处理1％cpg odn/99％小鼠肌肉半流体组合物(制备物y13)。
[0237]
实施例1o：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合，将5g该血液与500万单位α干扰素在杯中搅拌均匀，再对杯加可透气盖，放入蒸汽(约100℃)中蒸20-15分钟，便获得500万单位α干扰素/5g小鼠血液半流体组合物(制备物y14)。
[0238]
当使用其它动物的血液、或使用其它细胞因子时使用相同的方法，可分别制备细胞因子/血液半流体组合物(例如y15)。
[0239]
实施例1p：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合，将4.95g该血液与0.05g抗pd-1抗体在杯中搅拌均匀，再对杯加可透气盖，放入蒸汽(约100℃)中蒸20-15分钟，便获得1％抗pd-1抗体/99％小鼠血液半流体组合物(制备物y16)。
[0240]
当使用其它动物的血液、或使用其它免疫调节类抗体时使用相同的方法，可分别制备免疫调节类抗体/血液半流体组合物。
[0241]
实施例1q：将0.6g小鼠淋巴细胞沉淀和0.4ml小鼠血液加入杯中温和混合，再将杯加可透气盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸20分钟，便获得上表中制备物y17。
[0242]
实施例1r：将6g人血液与4g取自脱白细胞滤器中的人白细胞沉淀混合，再将杯加可透气盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸10分钟，便获得上表中制备物y18。
[0243]
实施例1s：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合，将1.5ml该血液与1ml肝癌细胞冻融灭活液(109个细胞/ml)在杯中搅拌均匀，再对杯加可透气盖，放入蒸汽(约100℃)中蒸5-50分钟，便获得上表中制备物y19。
[0244]
实施例1t：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合，将1.5ml该血液与1ml肺癌细胞液(109个细胞/ml)在杯中搅拌均匀，再置于塑料袋中密封好，放入液氮(低于-80℃)中30分钟冷冻，然后在37℃解冻融化，此冷冻-融化可进行一次或多次，便获得上表中制备物y20。
[0245]
实施例1u：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合、离心后获得血浆，将2ml该血浆与3ml淋巴细胞液(109个淋巴细胞/ml)在杯中搅拌均匀，再加盖可透气盖，放入蒸汽(约100℃)中蒸5-15分钟，便获得制备物y21。
[0246]
实施例1v：将2g人血浆与3g人白细胞沉淀在杯中搅拌均匀，再加盖可透气盖，放入蒸汽(约100℃)中蒸5-15分钟，便获得制备物y22。
[0247]
这些制备物均为可注射半流体，分装至注射器后即可作为移植物使用。
[0248]
4、本发明的组合或组合物的制备
[0249]
下表列举了本实施例制备的部分包含瘤外移植物和抗移植药物的组合物。
[0250]
表5
[0251][0252]
以下列出上表中本发明的组合或组合物的制备试验的几个实施例。
[0253]
实施例1w：以上述2中制备的半流体移植物作为瘤外移植物、以上述1中制备的同源常规移植物或/和2中制备的同源半流体移植物为瘤区移植物，且以瘤外移植物与瘤区移植物的量比(v：v)为(0.4ml～20ml)：(0.4ml～100ml)进行组合可得到上表中的制备物z1～z6。
[0254]
实施例1x：以上述2中制备的半流体移植物作为瘤外移植物、以上述2中方法制备的同种异体半流体移植物为瘤区移植物，且以瘤外移植物与瘤区移植物的量比(v：v)为(0.4ml～20ml)：(0.4ml～20ml)进行组合可得到上表中的制备物z7和z8。其中，c57bl/6小
鼠血液半流体和加里弗尼亚兔血液半流体通过balb/c小鼠血液半流体(x16)的方法制得。
[0255]
实施例1y：以上述2中制备的半流体移植物作为瘤外移植物、以上述2中方法制备的异种半流体移植物为瘤区移植物，且以瘤外移植物与瘤区移植物的量比(v：v)为(0.4ml～20ml)：(0.4ml～20ml)进行组合可得到上表中的制备物z9～z11。
[0256]
实施例1z：以上述2中制备的半流体移植物作为瘤外移植物、以组织破坏剂为瘤区用药，且以瘤外移植物与瘤区用药的量比(v：v)为(0.4ml～20ml)：(0.4ml～100ml)进行组合可得到上表中的制备物z12～z14。
[0257]
实施例1aa：以上述2中制备的半流体移植物作为瘤外移植物、以上述3中制备的半流体组合移植物作为瘤区移植物，且以瘤外移植物与瘤区移植物的量比(v：v)为(0.4ml～20ml)：(0.4ml～20ml)进行组合可得到上表中的制备物z15～z21。
[0258]
实施例2：瘤外移植物作为实体肿瘤抗原应用的基本技术方案研究
[0259]
在一个试验中，试验动物为balb/c小鼠，建模细胞为肉瘤s180细胞，以1
×
106个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物(瘤体平均体积342mm3)随机分为13个试验组(如下表所示)。试验组分为2个系列，尾静脉注射系列有1个阴性对照组(01组)和2个研究组，皮下注射系列有1个阴性对照组(02组)和10个研究组。阴性对照物均为生理盐水，研究药物如下表所示。研究药物的制备如下：
[0260]
c小鼠为c57bl/6小鼠，b小鼠为balb/c小鼠。小鼠肌肉半流体为以小鼠肉为原料按实施例1中的制备物x5的制备方法制备的半流体。4种小鼠血液制备如下：天然血液(血细胞比容42％、4341％)为取自小鼠的加有抗凝剂(枸橼酸钠)的新鲜血液。分出6ml天然血液离心，取出3ml血清，把离心管中剩下部分混匀为小鼠浓缩血液(血细胞比容68％)。将2ml血清与2ml天然血液混匀为小鼠稀释血液(1)(血细胞比容22％)。再将剩下的1ml血清与2ml天然小鼠血液混匀为小鼠稀释血液(2)(血细胞比容33％)。各血液的血细胞比容按常规方法测定。各小鼠血液半流体为相应的小鼠血液经加热凝固形成的半流体(分别按实施例1中的制备物x16、x19的制备方法制备)。小鼠血液半固体为小鼠血液中加入猪凝血酶(终浓度100u/1ml)和氯化钙(终浓度20mmol/l)形成的凝胶(半固体)，将其切割为体积约400mm3的小块使用。
[0261]
各实验组均如下表所示用药方式(皮下注射为在左腋皮下注射)用药1次，每次用药400μl/只。研究组10通过手术将半固体移植入小鼠左肋皮下。其它各实验组的药物均通过注射器注射。在该实验中，对研究组1、3、5和7-11的给药可被视作同种异基因给药模型(可以代表99％以上的同种异体给药)，对其它研究组的给药可被视作全相合给药模型和自体给药模型。给药后第14日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表5。
[0262]
表5
[0263][0264]
注：+为形成结节，-为不形成结节；x为瘤重平均值(以下表皆相同)
[0265]
在上表中，研究组1、2、3、4的抑率率均低的抑瘤率均低，它们与各自的阴性对照组之间的瘤重差异均无统计学意义(分别为p＝0.9332>0.05、p＝0.5340>0.05、p＝0.3788>0.05、p＝0.5458>0.05)。该结果说明，无论是同基因血液还是异基因血液、是静脉给药还是皮下给药，液态血液均未显示出明显的肿瘤负荷减小效应。更一般地，液体组织可能难以优选作为能够明显减小瘤体的实体瘤疫苗抗原。
[0266]
实际上，通常认为对肿瘤患者行同种异基因输血会引起白细胞介素-2、白细胞介素-10和白细胞介素-24分泌增加，抑制辅助t淋巴细胞分泌白细胞介素-2，使b淋巴细胞的刺激应答和抗体生成减少，产生细胞免疫的负向调节。于是，异基因血液被看作是免疫效应细胞的潜在抑制剂，也是免疫抑制细胞的刺激剂，这些免疫抑制作用可使有益的抑瘤免疫功能下调。可是，在上表中，研究组5和6均显示出较高的抑瘤率。它们各自与阴性对照组之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为p＝0.0004<0.05、p＝0.0002<0.05)。更进一步，研究组5和3之间(p＝0.0005)、5和1之间(p＝0.0004)、6和4之间(p＝0.0001)、6和2之间(p＝0.0002)的瘤重差异也都有统计学意义(p<0.05)。而研究组5和6之间的瘤重差异无统计学意义(p＝0.1375>0.05)。以上结果说明，血液(更一般地，液体组织)能否作为明显减小瘤体的实体瘤疫苗抗原与其状态(是液体还是半流体)的相关性明显高于其基因异同。
[0267]
在上表中，研究组10的抑瘤率小于研究组9，而研究组10和9之间的瘤重差异有统计学意义(p＝0.0147<0.05)。该结果说明，作为明显减小瘤体的实体瘤疫苗抗原的组织的优选状态为半流体，而非半固体。此外，半流体相较半固体还具有临床应用的较高操作便利性和较高患者顺应性。
[0268]
此外，在c小鼠血液半流体研究组中，抑瘤率自大而小的排列次序为：研究组5、研究组9、研究组8、研究组7。其中，研究组7和3之间(p＝0.2139)的瘤重差异无统计学意义(p>0.05)，而研究组8、9、5分别和7的瘤重差异有统计学意义(分别为p＝0.0107<0.05、p＝0.0227<0.05、p＝0.0008<0.05)。此外，研究组11(小鼠肌肉组织比容高于60％)的抑瘤率分别与研究组和6相当，它们之间的瘤重差异无统计学意义(p＝0.5241>0.05)。该结果说明，血液半流体(更一般地，包含组织的半流体)能否作为明显减小瘤体的实体瘤疫苗抗原与其所含细胞的浓度(>22％、优选为≥33％)的相关性高于其组织异同。
[0269]
根据上述研究及更多的类似研究，本发明的瘤外移植物(更一般地，也包括瘤区移植物)作为实体瘤疫苗抗原的必要条件为：其组成和形态使得其在用药处形成激活有效免疫应答的半流体结节。该必要条件似乎就是要在体内局部形成类似于瘤体组织、又更容易被机体有效识别(例如高度偏离天然状态或高度损伤的半流体)并激发针对它以及与它类似瘤体的有效特异性免疫响应。于是，本发明的基本技术方案为：
[0270]
包含组织和/或细胞制品的移植物、优选半流体移植物作为实体瘤疫苗抗原应用；
[0271]
上述半流体移植物优选为选自以下组之一种或多种：包含液体组织和/或细胞制品的半流体粘稠物、包含液体组织和/或细胞制品的半流体凝固物、包含非液组织的破碎物、包含液体组织和/或细胞制品凝固物的破碎物，更优选为选自以下组之一种或多种：包含液体组织和/或细胞制品的半流体凝固物、包含非液组织的破碎物、包含液体组织和/或细胞制品凝固物的破碎物；
[0272]
上述半流体移植物包含在所述疫苗的局部用药中；
[0273]
上述半流体移植物为半流体植入剂、优选为半流体注射剂。其中所述半流体注射剂为可以以半流体方式通过常规注射系统直接用药的注射剂，而半固体移植物则往往通过手术植入、或以流体(液体)方式通过常规注射系统用药后在用药处形成半固体(例如凝胶化)结节。
[0274]
此外，所述移植物的细胞比容为>22％(或细胞浓度为>5.6
×
109个/ml)、、45％-86％(或细胞浓度为11.5
×
10
9-22
×
109个细胞/ml)、或55％-86％(或细胞浓度为14.0
×
10
9-22
×
109个细胞/ml)。在其中所述半流体粘稠物组合物中，所述细胞和组合物的量比(v/v)为≥70％(或细胞浓度为≥17.9
×
109个细胞/ml)、优选为70％-86％(或细胞浓度为17.9
×
10
9-22
×
109个细胞/ml)。
[0275]
以下实验在基本技术方案基础上对技术方案进一步优选。
[0276]
以下实验对必要条件中的“半流体结节”技术方案进一步优选。
[0277]
在一个试验中，试验动物为balb/c小鼠，建模细胞为肉瘤s180细胞，以1
×
106个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物(瘤体平均体积313mm3)随机分为5个试验组(如下表所示，包括包括1个阴性对照组(0组)和4个研究组)。阴性对照物为生理盐水，研究药物为实施例1的制备物x16。各实验组均在左腋皮下用药1次，用药量如下表所示。用药后24小时测定用药处形成的凸出结节大小，并按上述瘤体计算方式计算结节体积。用药后10天对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表6。
[0278]
表6
[0279][0280]
在类似试验中，常规疫苗的量效关系敏感区通常≤100μl。然而在上表中，研究组1和0之间的瘤重差异无统计学意义(p＝0.2262>0.05)。研究组2和1之间用药量的成倍提高也未出现抑瘤率明显提高，它们之间的瘤重差异无统计学意义(p＝0.8565>0.05)。在这种情况下，通常就可能因为缺少量效关系而放弃进一步的研究了。出人意料的是，当用药量达到200μl后，抑瘤率突然升高。研究组3和2的瘤重差异有统计学意义(p＝0.0140<0.05)，研究组4和2的瘤重差异也有统计学意义(p＝0.0048<0.05)，显示出200μl是一个阈值、而非偶然值。根据该结果及一些其它结果，本发明的疫苗显示出与常规疫苗大不相同的量效关系敏感区，很可能具有大不相同的免疫作用机理。
[0281]
使用实施例1中的其它制备物(例如x7-x13等)，也可获得类似结果。
[0282]
根据上述研究及更多的类似研究，本发明的所述包含组织的半流体的组成和形态使得其在用药处形成的半流体结节的总体积优选为为>100mm3，优选为≥200mm3、更优选为≥400mm3。为满足该条件，本发明的半流体的单次施用总量为>0.1ml，优选为≥0.2ml或0.2-25ml，更优选为≥400mm3或0.4-25ml。
[0283]
实施例3：抗移植药物研究
[0284]
本发明组合物中的抗移植药物，通过基因全相合瘤体移植实验进行筛选，选择使得瘤体移植物出现消除的药物，亦即在以下实验中使得瘤体的移植成功率小于或等于60％的药物，其中：
[0285]
移植成功率＝(瘤体移植物体积增长的动物数/瘤体移植动物总数)％。
[0286]
1、排斥增敏药物的抗移植作用
[0287]
所述排斥增敏药物选自以下组之一种或多种：瘤区移植物、瘤区给药的微生物制品。以上实施例关于瘤外移植物对瘤体免疫效应的研究结论，也适于瘤区移植物。所述瘤区移植物可作为抗原、组织破坏成份和/或缓释载体用作瘤区用药、从而被用作排斥增敏药物。所述瘤区移植物作为组织破坏成份和/或缓释载体应用时还可以作为活性成分的协同成分，此时的移植物为包含活性成分、组织和/或细胞的半流体移植物(组合移植物)。以下实验以瘤区移植物为例，研究了排斥增敏药物的抗移植作用。
[0288]
在一个试验中，试验动物为balb/c小鼠，建模细胞为肉瘤s180细胞，以1
×
106个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物(瘤体平均体积542mm3)被处死并解剖出瘤体。瘤体切作1mm3小块备用。然后，仍以balb/c小鼠为试验动物，随机分为7个试验组(1个阴性对照组和6个研究组，每组8只)，再按照常规的瘤体移植技术在动物右侧腋部皮下植入移植物(约500mm3/只)。阴性对照组的移植物为2/3总重的该瘤体碎块与1/3总重的生理盐水的混合物，研究移植物分别含为2/3总重的该瘤体碎块与1/3总重的如
下表所示的瘤区移植物。其中所用瘤区移植物与实施例2中“作为抗原应用的必要条件研究”实验中的相应瘤外移植物相同。
[0289]
在该实验中，阴性对照组和研究组2的移植可被视作同基因移植模型和自体移植模型，其它研究组的移植可被视作包含同基因和同种异基因的混合移植模型。分别于移植后21天和35天测量和比较植入处移植物体积的增长，并计算移植成功率，结果示于表8。
[0290]
表8
[0291][0292]
在上表中，细胞比容≥33％的组织显示出降低基因全相合瘤体移植成功率的效应。该效应可能是由于组织的渗入改变了瘤体的移植排斥性，例如增加了瘤体的移植排斥免疫原。根据上述研究及更多的类似研究，本发明的用作基因全相合瘤体的抗移植药物包括选自以下组之一种或多种：组织和/或细胞制品、微生物制品。和前者类似，后者渗入瘤体后可以增加异源性的移植排斥免疫原。
[0293]
根据实施例2和本实施例上述研究及更多的类似研究，本发明的瘤区移植物作为所述排斥增敏药物的优选条件为：所述移植物的组成和形态使得其在瘤区用药处形成半流体结节。于是，本发明的组合物中的瘤区移植物的技术方案为：
[0294]
所述移植物包含在瘤区用药中；
[0295]
所述移植物所包含的细胞比容为>22％、优选为33％-86％或45％-86％；
[0296]
所述移植物优选为选自以下组之一种或多种：包含组织和/或细胞的半流体粘稠物、包含组织和/或细胞的半流体凝固物、包含非液组织的破碎物、包含包含组织和/或细胞凝固物的破碎物，更优选为选自以下组之一种或多种：包含组织和/或细胞的半流体凝固物、包含非液组织的破碎物、包含包含组织和/或细胞凝固物的破碎物。
[0297]
此外，所述移植物为植入剂、优选为注射剂，且其单次施用量为≥0.2ml、优选为0.4-25ml。
[0298]
2、瘤体破坏药物的抗移植作用
[0299]
所述破坏药物选自以下组之一种或多种：瘤区给药的组织破坏剂、靶向瘤体的细胞毒药物、靶向瘤区的抗肿瘤血管生成药物。
[0300]
在本试验中，试验动物为balb/c小鼠，建模细胞为肉瘤s180细胞，以1
×
106个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物(瘤体平均体积561mm3)被处死并解剖出瘤体。瘤体切作1mm3小块备用。然后，仍以balb/c小鼠为试验动物，随机分
为6个试验组(1个阴性对照组和5个研究组，每组8只)，再按照常规的瘤体移植技术在动物右侧腋部皮下植入移植物。阴性对照组的移植物为2/3总重的该瘤体碎块与1/3总重的生理盐水的混合物，研究组的研究药物含2/3总重的该瘤体碎块和1/3总重的如下表所示的不同药物水溶液。分别于移植后21天和35天测量和比较植入处移植物体积的增长，并计算移植成功率，结果示于表9。
[0301]
表9
[0302][0303]
在上表中，细胞毒药物(5-fu)和常规无效局部有效化合物(亚甲蓝、二盐酸奎宁、乙酰水扬酸)在局部作用的有效浓度下显示出降低基因全相合瘤体移植成功率的效应。
[0304]
根据上述研究及更多的类似研究，本发明的组合或组合物中优选的组织破坏剂、或/和细胞毒药物的协同技术方案为：
[0305]
1、针对瘤区局部给药；
[0306]
2、以大于或等于其在单独局部给药时产生明显局部组织破坏的浓度给药，例如：
[0307]
所述细胞毒药物的浓度大于其饱和浓度的50％、优选为其饱和浓度的50％-500％；
[0308]
所述常规无效化合物的浓度为>0.25％、优选为0.35-30％(例如：所述氨基酸营养素的局部给药浓度为大于5％，优选为5％-30％；所述无效芳香化合物的局部给药浓度为大于0.25％、优选为0.35％-10％；所述植物或菌类活性成分的局部给药浓度为大于0.25％、优选为0.75％-15％)。
[0309]
3、瘤体破坏药物/排斥增敏药物组合物的抗移植作用
[0310]
在本试验中，试验动物为balb/c小鼠，建模细胞为肉瘤s180细胞，以1
×
106个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物(瘤体平均体积601mm3)被处死并解剖出瘤体。瘤体切作1mm3小块备用。然后，仍以balb/c小鼠为试验动物，随机分为7个试验组(1个阴性对照组和6个研究组，每组8只)，再按照常规的瘤体移植技术在动物右侧腋部皮下植入移植物。阴性对照组的移植物为2/3总重的该瘤体碎块与1/3总重的生理盐水的混合物，研究组的移植物含2/3总重的该瘤体碎块和1/3总重的如下表所示的不同药物。分别于移植后21天和35天测量和比较植入处移植物体积的增长，并计算移植成功率，结果示于表10。
[0311]
表10
[0312][0313]
在上表中，局部作用的有效浓度的细胞毒药物(5-fu)和常规无效局部有效化合物(亚甲蓝)与血液的组合物半流体显示出优于其中各单药的降低基因全相合瘤体移植成功率的效应。
[0314]
实施例4：瘤外移植物/抗移植药物协同作用方案
[0315]
在本试验中，试验动物为balb/c小鼠，建模细胞为乳腺癌4t1细胞，以1
×
106个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。建模后5日，成功建模的荷乳腺瘤小鼠(瘤体平均体积为201mm3)随机分为9个试验组(1个阴性对照组和8个研究组)。阴性对照物均为生理盐水，研究药物如下表所示。各实验组的用药方式(瘤外用药为在左腋皮下注射)如下表所示。各实验组均用药一次，用药后10天对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表11。
[0316]
表11
[0317][0318]
在上表中，在研究组5、2、1之间，组合物组的q判断(q＝1.18>1.15)显示出显示出协同作用，且研究组5与2之间、5与1之间的抑瘤率差异均有统计学意义(分别为p＝0.0082<0.05、p＝0.0035<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。在研究组6、3、1之间，组合物组的q判断(q＝1.17>1.15)显示出显示出协同作用，且研究组6与3之间、6与1之间的抑瘤率差异均有统计学意义(分别为p＝0.0003<0.05、p＝0.0003<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。在研究组7、4、1之间，组合物组的q判断(q＝1.19>1.15)显示出显示出协同作
用，且研究组7与4之间、7与1之间的抑瘤率差异均有统计学意义(分别为p＝0.0011<0.05、p＝0.0058<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。该结果及更多类似研究说明，本发明组合或组合物的瘤区用药和瘤外用药有明显的协同抑瘤作用。
[0319]
在一个试验中，试验动物为新西兰白兔(体重2.0～2.5kg，雌雄不限)，建模组织为经2次传代接种的兔
ⅴ
x2瘤体组织。通过手术向动物右侧腋部皮下植入瘤体组织细块(约1mm3/块、总量约500mm3/只)。建模成功的荷瘤兔(瘤体平均体积为1352mm3)随机分为4个试验组(1个阴性对照组和3个研究组)，每组4只。阴性对照物均为生理盐水，研究药物如下表所示。各实验组的用药方式(瘤外用药为在左腋皮下注射)、单次用药剂量、用药次数和用药间隔如下表所示。各实验组最后一次用药后7天对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表12。
[0320]
表12
[0321][0322]
*：其中2只(50％)在第11次瘤内用药后死亡
[0323]
根据上述研究及更多的类似研究，基因全相合瘤体移植的抗移植药物(本发明中简记为抗移植药物)可以作为瘤外移植物的增效组分应用于实体肿瘤疫苗的制备。具体而言，组合物通过抗移植药物致敏瘤体对瘤外移植物激活的移植免疫响应。于是，本发明的组合物的基本技术方案为：
[0324]
瘤外移植物和基因全相合瘤体移植的抗移植药物的组合作为活性成分应用于制备抗实体肿瘤药物，其中所述抗移植药物选自包括所述瘤体移植的排斥增敏药物(包括例如瘤区移植物、瘤区给药的微生物制品)和/或所述瘤体的破坏药物(包括例如瘤区给药的组织破坏剂、靶向瘤体的细胞毒药物、靶向瘤区的抗肿瘤血管生成药物)之一种或多种；所述瘤外移植物选自包含组织和/或细胞制品的移植物、优选为选自半流体移植物。
[0325]
上述半流体移植物优选为选自以下组之一种或多种：包含液体组织的半流体粘稠物、包含液体组织的半流体凝固物、包含非液组织的破碎物、包含液体组织凝固物的破碎物、包含非液组织的软化物，更优选为选自以下组之一种或多种：包含液体组织的半流体凝固物、包含非液组织的破碎物、包含液体组织凝固物的破碎物。这些半流体所包含的组织高度偏离天然状态或高度损伤。
[0326]
上述半流体移植物为半流体植入剂、优选为半流体注射剂。其中所述半流体注射剂为可以以半流体方式通过常规注射系统直接用药的注射剂，而半固体移植物则往往通过手术植入、或以流体(液体)方式通过常规注射系统用药后在用药处形成半固体(例如凝胶
化)结节。
[0327]
在更优选的条件下，本发明的包含瘤外移植物和抗移植药物的组合物显示出包含免疫协同作用在内的协同作用。该组合物的协同条件为：其中所述抗移植药物和瘤外移植物的量比为：单次使用剂量比(w：w或v：v)为(1～1000)：10、或/和使用次数比(次：次)为(1～100)：10，其中：
[0328]
所述瘤区移植物和瘤外移植物的量比为：单次使用剂量比(w：w或v：v)为(1～100)：10、或/和使用次数比(次：次)为(1～50)：10；
[0329]
所述微生物制品和瘤外移植物的量比为：单次使用剂量比(w：w或v：v)为(1～100)：10、或/和使用次数比(次：次)为(1～50)：10；
[0330]
所述组织破坏剂和瘤外移植物的量比为：单次使用剂量比(w：w或v：v)为(10～1000)：10、或/和使用次数比(次：次)为(1～100)：10；
[0331]
所述细胞毒药物和瘤外移植物的量比为：单次使用剂量比(w：w或v：v)为(1～100)：10、或/和使用次数比(次：次)为(1～100)：10；
[0332]
所述抗肿瘤血管生成药物和瘤外移植物的量比为：单次使用剂量比(w：w或v：v)为(1～100)：10、或/和使用次数比(次：次)为(1～100)：10。
[0333]
更优选地，所述抗移植药物的浓度和剂量为大于或等于其在单独给药时产生基因全相合瘤体移植作用的浓度和剂量，例如：
[0334]
所述微生物制品的局部用药浓度为>0.1％；
[0335]
所述细胞毒药物的局部用药浓度大于其饱和浓度的50％、优选为其饱和浓度的50％-500％；
[0336]
所述常规无效化合物的局部用药浓度为>0.25％、优选为0.35-30％(例如：所述氨基酸营养素的局部给药浓度为大于5％，优选为5％-30％；所述无效芳香化合物的局部给药浓度为大于0.25％、优选为0.35％-10％；所述植物或菌类活性成分的局部给药浓度为大于0.25％、优选为0.75％-15％)。
[0337]
根据上述研究及更多的类似研究，本发明的组合或组合物中所述瘤外移植物和抗移植药物的优选量比为：所述抗移植药物和瘤外移植物的使用剂量比(w：w)为(1～1000)：10、或/和使用次数比(次：次)为(1～50)：10量
[0338]
实施例5：移植物的特异性免疫原研究及组织优选
[0339]
构成本发明的组合或组合物的协同的一个方面，是瘤外移植物激活的针对瘤体的攻击、以及抗移植药物使得瘤体对该攻击的响应。因而，瘤外移植物、优选为半流体移植物的特异性免疫原，可以代表该组合或组合物的一个重要特异性免疫原。实际上，瘤区移植物也可以具有与瘤外移植物类似的特异性免疫原。
[0340]
在一个试验中，试验动物为cb6f1小鼠，建模细胞为肝肿瘤h22细胞，以2
×
106个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物中，一部分用于制备瘤体颗粒半流体，另一部分(瘤体平均体积213mm3)随机分为10个试验组(如下表所示，包括1个阴性对照组(0组)和9个研究组)。阴性对照物为生理盐水，8个研究药物如下表所示。研究药物的制备如下：
[0341]
cb6f1小鼠浓缩血液和cb6f1小鼠浓缩血液半流体的制备与实施例2中的制备相同。cb6f1小鼠肌肉块为一体积约400mm3的块状小鼠肉。4种小鼠肌肉颗粒半流体和cb6f1小
鼠瘤组织颗粒半流体的制备如下：分别剥取4种小鼠的肉块和荷肝癌cb6f1小鼠的瘤体，再分别将它们置于搅拌机中破碎(转速1000-10000转/分、总时间1-3分钟)，各自获得横截面平均尺寸小于1mm
×
1mm的、肉眼可辨的组织颗粒(按实施例1中的制备物x5的制备方法制备)。猪肌肉颗粒半流体为实施例1中的制备物x4。马血液半流体为实施例1中的制备物x24。
[0342]
各实验组均在左腋皮下用药1次，用药400μl/只。研究组3通过手术将小鼠肌肉块移植入小鼠左肋皮下。其它各实验组的药物均通过注射器注射至cb6f1小鼠左肋皮下。在该实验中，对研究组1-4和8的给药可被视作全相合给药移植模型或自体给药模型，对研究组5的给药可被视作同种半相合给药模型，对研究组6的给药可被视作同种异基因给药模型，对研究组7的给药可被视作异种给药模型。给药后第14日对动物进行移植物抗宿主病评分测量，然后处以安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表13。
[0343]
表13
[0344][0345]
通常认为，分子形态的抗原(例如全肿瘤细胞抗原、异源糖蛋白抗原、异基因细胞抗原、亚单位抗原)有着与正常机体明显不同的独特结构成分(例如病原体相关分子模式，pathogen-associated molecμlar patterns，pamps)，而机体内的天然免疫系统细胞上存在可识别这些结构成分(例如pamp)的模式识别受体(pattern-recognition receptors，prrs)，prrs被刺激并启动适应性免疫应答去攻击相同或类似的结构成分(例如肿瘤细胞中的交叉抗原成分)。于是，异源或异基因移植物通过其抗原分子(例如异源糖蛋白、异基因细胞等)介导的较高的移植物抗宿主反应可以导致较高的移植物抗肿瘤反应性。
[0346]
在上表中，研究组2和1之间比较，其抗宿主病评分无统计学意义(p＝0.3016>0.05)，说明其移植排斥免疫原性(针对宿主正常细胞和肿瘤细胞)相当，然而其瘤重差异(针对宿主瘤体)却有统计学意义(p＝0.0023<0.05)。研究组4和3之间比较，其抗宿主病评分有统计学意义(p＝0.0034<0.05)，说明其移植排斥的免疫原性(针对宿主细胞)明显不同，然而瘤重差异(针对宿主瘤体)却无统计学意义(p＝0.8408>0.05)。根椐这些结果，包含组织的半流体作为实体瘤疫苗抗原的表现与其抗宿主反应没有明显的正相关性。于是，在本发明公开的必要条件下，本发明的组织半流体的抗原性显示出明显不同于现有技术中的
移植物，后者的抗肿瘤免疫原性往往与其移植排斥免疫原性正相关。
[0347]
在上表中，小鼠肌肉颗粒半流体的移植物抗宿主病评分(抗宿主率)由大至小依次为研究组7、研究组6、研究组5和研究组4，大致反应了移植物抗宿主病与异分子抗原(异源抗原和异基因抗原)的相关性。例如，研究组7和4之间的抗宿主病评分有统计学意义(p＝0.0040<0.05)。然而，研究组7和4之间的瘤重差异却无统计学意义(p＝0.6085>0.05)。通常认为，在常规移植物的免疫反应中，异种抗原性远高于同基因抗原性。在上表中，在本发明公开的必要条件下，尽管研究组9(含马血液)和2(含鼠血液)之间的移植物抗宿主病评分的差异确有统计学意义(p＝0.0005<0.05)，但它们之间的瘤重差异却无统计学意义(p＝0.7295>0.05)。
[0348]
此外，本实验的一个初衷，是将cb6f1小鼠肌肉颗粒半流体作为cb6f1小鼠瘤体颗粒半流体的阴性对照物来研究的。然而在上表中，研究组8(药物组织富含瘤细胞)和研究组4(药物组织不含瘤细胞)的瘤重差异无统计学意义(p＝0.8375>0.05)。
[0349]
使用实施例1中的其它制备物，也可获得类似结果。例如，在一个试验中，试验动物为balb/c小鼠，建模细胞为乳腺癌4t1细胞，以1
×
106个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。建模后14日，成功建模的荷乳腺瘤小鼠(瘤体平均体积为306mm3)随机分为8个试验组(如下表所示，包括1个阴性对照组和7个研究组)。阴性对照物为生理盐水，研究药物如下表所示，均选自实施例1的制备物。各实验组均在左腋皮下用药1次，用药400μl/只，用药后10天对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表14。
[0350]
表14
[0351]
组号研究药物所包含的组织抑瘤率0生理盐水-01x10猪肺23％2x11猪肝25％3x12猪皮21％4x20人胎盘36％5x21人脐带37％6x22猪肌肉组织33％7x23猪血液38％
[0352]
本实施例的以上结果，进一步证实了本发明的包含组织的半流体具有不同于常规移植物(通常为流体、半固体或固体)的抗实体肿瘤免疫原性，后者的抗原性通常与其异分子(例如异基因抗原分子、异源抗原分子等)的抗宿主抗原性相关。而本发明的包含组织的半流体似乎具有与高度损伤的肿瘤组织相当的抗实体肿瘤免疫原性。
[0353]
根据上述研究及更多的类似研究，对本发明的半流体抗原的技术方案进一步优选如下：本发明的半流体优选为其优势抗原性为抗所述实体肿瘤抗原性而非抗宿主抗原性的半流体，例如抑瘤率为≥抗宿主率、优选为≥150％抗宿主率的半流体。于是：
[0354]
本发明的半流体的必要组成不包含瘤体组织，优选为选自非瘤体组织；
[0355]
本发明的半流体的必要组成可以包含天然组织和/或严重损伤组织，优选为选自
严重损伤组织。
[0356]
本发明的半流体的必要组成不包含移植物抗宿主反应强烈的组织(例如富含异种糖蛋白抗原)，优选为选自移植物抗宿主反应不大的组织，例如以下组之一种或多种：并不富含异种糖蛋白抗原的异种组织、并不富含异基因抗原的同种组织，更优选为选自以下之一种或多种：低血管密度的异种组织、abo血型相符或hla相近的同种异体异基因组织、同种异体同基因组织、并不富含自身隐蔽抗原的自体组织。
[0357]
在本发明公开的必要条件和优选条件下，本发明的半流体所包含的组织优选为胎盘、脐带、肌肉、血液，更优选为胎盘、脐带、血液。
[0358]
根据以上结果以及对导致这些结果的免疫策略的初步分析，在本发明公开的基本技术方案(必要条件)下，本发明的优选技术方案中的半流体(形态的)抗原可以有别于现有技术中的分子形态的抗原(例如病原体抗原、常规移植物抗原、和异基因单一细胞抗原)，显示出具有与高度损伤的肿瘤组织相似的针对瘤体组织的特异性免疫原。众所周知，化疗药物的主要特征在其组成，而疫苗抗原的主要特征在其特异性免疫原。该免疫原很可能是因为其形成了一种类瘤体组织结节，但其半流体性和高损伤性(半流体中的组织远离其在天然器官中的状态)却又比瘤体组织更易被免疫系统识别，从而激发出针对其所仿生的瘤体的有效免疫应答。以下实验将对此进行进一步的研究。
[0359]
实施例6：移植物的靶向研究及适应症优选
[0360]
瘤外移植物、优选为半流体移植物的靶向，可以代表该组合或组合物的一个重要靶向。实际上，瘤区移植物也应当具有与瘤外移植物类似的靶向。
[0361]
在一个试验中，试验动物为balb/c小鼠，建模细胞为乳腺癌4t1细胞，以1
×
106个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。建模后4日，成功建模的荷乳腺瘤小鼠(瘤体平均体积为43mm3)随机分组，并随机选出1个阴性对照组(01组)和2个研究组(1、2组)，其它组重新混合后分笼饲养。然后在建模后7日将荷乳腺瘤小鼠(瘤体平均体积为85mm3)随机组，并随机选出1个阴性对照组(02组)和1个研究组(3组)，其它组重新混合后分笼饲养。然后分别在建模后14、17日分别进行类似分组(如下表所示，分别为03组、4组和04组、5组)。
[0362]
阴性对照物均为生理盐水，2个研究药物分别为balb/c小鼠浓缩血液和实施例1的制备物x19。小鼠浓缩血液按实施例2中小鼠浓缩血液的制备方法制备。各实验组均在左腋皮下用药一次，用药400μl/只。用药后第14日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从各自的阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表15。
[0363]
表15
[0364][0365]
以异基因造血干细胞移植物(allo-hsct，通常为液体)为例，其作为抗原介导的免疫响应的靶向无特异性，针对宿主健康细胞(移植物抗宿主病(gvhd))的同时亦可针对肿瘤细胞(例如抗白血病反应(cvl))。实际上，现有技术中的肿瘤疫苗抗原几乎都靶向肿瘤细胞及其中的结构成分(例如移植物的交叉抗原)，而非瘤体、尤其是较大瘤体。因而，它们尽管可以显示出对非实体肿瘤(例如白血病)的最好疗效，以及对较小实体肿瘤的较好疗效，对于较大瘤体的实体瘤则往往无能为力。在文献中，几乎所有的实体肿瘤疫苗研究均在建模后7日内(瘤体平均体积<100mm3)用药。在上表中，研究组1(液体药物)和2(半流体药物)均未显示有意义的抑瘤率，它们各自与阴性对照组之间的瘤重差异也无统计学意义(分别为p＝0.9068>0.05、p＝0.7146>0.05)。这样看上去，本发明的半流体会同绝大多数肿瘤疫苗抗原一样，或许会带来一些免疫学分子参数的有利变化，但不大可能显示出更直接更明显的肿瘤负荷减小效应。
[0366]
出人意料的是，本发明的半流体抗原的效应与现有技术中的肿瘤疫苗抗原相反，居然在以上实验中随着所治疗瘤体的增长而升高。研究组4(初始瘤体平均体积301mm3)与03之间的瘤重差异有了统计学意义(p＝0.0005<0.05)，且其与研究组3(初始瘤体平均体积85mm3)之间的瘤重差异也有统计学意义(p＝0.0023<0.05)。而研究组5(初始瘤体平均体积407mm3)的抑瘤率甚至于比研究组4还高，且其与04之间的瘤重差异有统计学意义(p＝0.0001<0.05)，以及其与研究组3(瘤体平均体积85mm3)之间的瘤重差异仍有统计学意义(p＝0.0050<0.05)，说明该瘤体体积(>85mm3)并非一个偶然数据。
[0367]
使用实施例1中的其它制备物，也可获得类似结果。
[0368]
在一个试验中，试验动物为新西兰白兔(体重2.0～2.5kg，雌雄不限)，建模组织为经2次传代接种的兔
ⅴ
x2瘤体组织。通过手术向动物右肺部植入瘤体组织细块(约1mm3/块、总量约500mm3/只)。建模成功的荷肺癌兔(接种后14天行ct检查，肿瘤直径6～13mm者)随机分为2个试验组(1个阴性对照组和1个研究组)，每组6只。阴性对照物均为生理盐水，研究药物为取自加利福尼亚兔的血液按实施例1中的制备物x19方法制备的同种异基因浓缩血液半流体。各实验组均在左腋皮下用药3次，每7天1次，用药2ml/只。用药后第7日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，从阴性对照组计算出研究组的抑瘤率为27％。此外，研究组5只兔
子在治疗后出现皮下可触硬结节。众所周知，这种结节通常是机体内局部急性炎症的并发症状。该结果进一步显示，本发明的半流体抗原似乎是作为类瘤体半流体结节抗原通过诱发瘤体急性炎症而靶向瘤体。
[0369]
根据上述研究及更多类似研究的结果，本发明的半流体抗原不同于现有技术的其它抗原(尤其是能在血液中自由分布的分子形态的抗原)，还在于其靶向性、从而适应症不同。肿瘤抗原靶向肿瘤细胞，从而其应用的适应症与具体肿瘤种类相关。常规移植物(通常为半固体)或allo-hsct(通常为液体)靶向细胞(正常细胞和肿瘤细胞)，从而其应用的适应症与肿瘤细胞的暴露难易(液体癌易，实体瘤难，瘤体越大越难)相关。
[0370]
这些结果进一步加强了上述关于本发明半流体抗原是一种瘤体仿生抗原的分析。一个可能的解释为：本发明的免疫策略，其必要条件模拟出瘤体而非肿瘤细胞的成分、形状、电荷、尺寸等三维特性，以及瘤体的四维动态重构现象(粘弹性的软物质)。于是，本发明的半流体抗原在本质上是一种类瘤体，却又比瘤体更易被免疫系统识别从而激发出靶向其也靶向其所仿生的瘤体的有效免疫应答的新式抗原。当然，瘤体的有效破坏又可能次生地释放出肿瘤抗原并导致自体肿瘤疫苗。因而，本发明的半流体抗原的适应症，与瘤体体积相关，尤其是优选为较大而不是较小的瘤体体积，而对于瘤内具体是什么肿瘤细胞、这些肿瘤细胞的暴露难易的依赖性不强。
[0371]
按照这些结果，本发明的包含作为实体瘤治疗疫苗抗原的瘤外移植物、优选为半流体移植物的组合或组合物的适用症优选为瘤体体积>85mm3、优选为≥200mm3、更优选为瘤体总体积≥300mm3的实体瘤。根据其适应症，本发明的半流体抗原的单动物给药量为≥0.2ml、优选为0.2-25ml或0.3-25ml。
[0372]
实施例7：组合物的更多应用
[0373]
按照上述研究结果，本发明的组合或组合物用于抗实体肿瘤药物的制备的更多的应用被研究。
[0374]
在以下一个包括5个实验的实验系列中，试验动物和建模细胞分别如下所示。建模细胞分别在动物右侧腋部皮下进行常规的移植瘤建模。每个系列实验中成功建模的试验动物随机分为4个试验组，其中1个阴性对照组和3个研究组(a、b、c组)。阴性对照物为生理盐水，a、b、c组研究药物分别为实施例1中的制备物z1、z12、z21。各实验组均瘤内(分别使用x3、1％5-fu/20％精氨酸水溶液、y22)和左腋皮下(分别使用x3、x20、y26)各注射用药1次，每处各用药250μl/只。用药后第14日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从各系列的阴性对照组计算抑瘤率，实验结果示于以下。
[0375]
1)、在肝癌治疗中的应用
[0376]
在本试验中，试验动物为balb/c小鼠，建模细胞为肝癌h22细胞(2
×
106个细胞/只)，在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的荷瘤动物(瘤体平均体积203mm3)随机分为4个试验组(1个阴性对照组和3个研究组)。a、b、c组的抑瘤率均值分别为52％、61％、53％。
[0377]
2)、在肠癌治疗中的应用
[0378]
在本试验中，试验动物为balb/c小鼠，建模细胞为结肠癌ct26细胞(1
×
106个细胞/只)，在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的荷瘤动物(瘤体平均体积211mm3)随机分为4个试验组(1个阴性对照组和3个研究组)。a、b、c组的抑瘤率均值分别为
52％、62％、51％。
[0379]
3)、在乳腺癌治疗中的应用
[0380]
在本试验中，试验动物为balb/c小鼠，建模细胞为乳腺癌4t1细胞(1
×
106个细胞/只)，在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的荷瘤动物(瘤体平均体积209mm3)随机分为4个试验组(1个阴性对照组和3个研究组)。a、b、c组的抑瘤率均值分别为47％、51％、53％。
[0381]
4)、在恶性黑色素瘤治疗中的应用
[0382]
在本试验中，试验动物为c57bl/6小鼠，建模细胞为黑色素瘤b16细胞(1
×
106个细胞/只)，在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的荷瘤动物(瘤体平均体积214mm3)随机分为4个试验组(1个阴性对照组和3个研究组)。a、b、c组的抑瘤率均值分别为56％、61％、51％。
[0383]
5)、在肺癌治疗中的应用
[0384]
在本试验中，试验动物为c57bl/6小鼠，建模细胞为肺癌(llc细胞)(1
×
106个细胞/只)，在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的荷瘤动物(瘤体平均体积208mm3)随机分为4个试验组(1个阴性对照组和3个研究组)。a、b、c组的抑瘤率均值分别为47％、51％、53％。
[0385]
使用实施例1中的其它的组合物制备物，也可获得以上类似结果。
[0386]
根据上述研究及更多的类似研究，本发明的半流体移植物于是具有较大的瘤细胞种类广谱性，可以应用于广谱的实体瘤的治疗制备。所述实体瘤包括例如乳腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、肠癌、口腔癌、胃癌、结直肠癌、支气管癌、喉癌、睾丸癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤、脑瘤、肾细胞癌等。
[0387]
本申请包括包括以下项目：
[0388]
项目1、瘤外移植物和基因全相合瘤体移植的抗移植药物的组合作为活性成分在制备抗实体肿瘤药物中的应用。
[0389]
项目2、一种用于治疗或抑制实体肿瘤的药物组合物，其包含瘤外移植物和基因全相合瘤体移植的抗移植药物。
[0390]
项目3、一种治疗或抑制实体肿瘤的方法，其包括向有此需要的个体给药瘤外移植物以及基因全相合瘤体移植的抗移植药物，其中所述瘤外移植物和所述抗移植药物是分开给药，其中所述瘤外移植物是在瘤区以外局部给药，而所述抗移植药物是在瘤区给药或全身性给药。
[0391]
项目4、一种用于治疗或抑制实体肿瘤的药盒，其包括：一个或多个容纳第一组合物的容器，一个或多个容纳第二组合物的容器，任选存在的容纳用于所述第一和第二组合物的载体，以及如何使用该药盒的标签；其中所述第一组合物是瘤外移植物，而第二组合物是基因全相合瘤体移植的抗移植药物。
[0392]
项目5、根据项目1-4之一的应用、组合物、方法或药盒，其中所述抗移植药物和瘤外移植物的量比为：单次使用剂量比(w：w或v：v)为(1～1000)：10，或/和使用次数比(次：次)为(1～100)：10。
[0393]
项目6、根据项目1-4之一的应用、组合物、方法或药盒，其中所述抗移植药物选自以下之一种或多种：所述瘤体移植的排斥增敏药物和/或所述瘤体的破坏药物。
[0394]
项目7、根据项目5的应用、组合物或方法，其中所述排斥增敏药物选自以下组之一种或多种：瘤区移植物、瘤区给药的微生物制品。
[0395]
项目8、根据项目6的应用、组合物、方法或药盒，其中所述排斥增敏药物和瘤外移植物的量比为：单次使用剂量比(w：w或v：v)为(1～100)：10，或/和使用次数比(次：次)为(1～50)：10，且其中：
[0396]
所述瘤区移植物和瘤外移植物的量比为：单次使用剂量比(w：w或v：v)为(1～100)：10，或/和使用次数比(次：次)为(1～50)：10；或/和
[0397]
所述微生物制品和瘤外移植物的量比为：单次使用剂量比(w：w或v：v)为(1～100)：10，或/和使用次数比(次：次)为(1～50)：10。
[0398]
项目9、根据项目5的应用、组合物、方法或药盒，其中所述破坏药物选自以下组之一种或多种：瘤区给药的组织破坏剂、靶向瘤体的细胞毒药物、靶向瘤区的抗肿瘤血管生成药物。
[0399]
项目10、根据项目9的应用、组合物、方法或药盒，其中所述破坏药物和瘤外移植物的量比为：单次使用剂量比(w：w或v：v)为(1～1000)：10，或/和使用次数比(次：次)为(1～100)：10，且其中：
[0400]
所述组织破坏剂和瘤外移植物的量比为：单次使用剂量比(w：w或v：v)为(10～1000)：10，或/和使用次数比(次：次)为(1～100)：10；
[0401]
所述细胞毒药物和瘤外移植物的量比为：单次使用剂量比(w：w或v：v)为(1～100)：10，或/和使用次数比(次：次)为(1～100)：10；或/和
[0402]
所述抗肿瘤血管生成药物和瘤外移植物的量比为：单次使用剂量比(w：w或v：v)为(1～100)：10，或/和使用次数比(次：次)为(1～100)：10。
[0403]
项目11、根据项目1-7之一的应用、组合物、方法或药盒，其中所述抗移植药物包含瘤区移植物以及选自以下组之一种或多种的其它药物：微生物制品、细胞毒药物、组织破坏剂，且其中所述其它药物和瘤区移植物的量比(w：w)为(0.1～30)：100。
[0404]
项目12、根据项目1-9之一的应用、组合物、方法或药盒，其中所述抗移植药物包含选自组织破坏剂和细胞毒药物的药物，且其中所述细胞毒药物和组织破坏剂的量比(w：w)为(0.1～10)：100。
[0405]
项目13、根据项目1-10之一的应用、组合物、方法或药盒，其中所述移植物包含细胞比容为>22％、优选为33％-86％或50％-86％的组织和/或细胞制品。
[0406]
项目14、根据项目13的应用、组合物、方法或药盒，其中所述移植物为选自半流体移植物，其中所述半流体选自以下组之一种或多种：包含液体组织和/或细胞制品的半流体粘稠物、包含液体组织和/或细胞制品的半流体凝固物、包含非液组织的破碎物、包含液体组织和/或细胞制品的凝固物的破碎物。
[0407]
项目15、根据项目13或14的应用、组合物、方法或药盒，其中所述组织选自以下组之一种或多种：自动物提取的天然组织、包含细胞和细胞间质的天然组织组分、源自天然组织的工程组织。
[0408]
项目16、根据项目15的应用、组合物、方法或药盒，其中所述天然组织选自结缔组织和/或结缔组织之外的半固体组织，其中所述结缔组织选自以下之一种或多种：血液、骨髓、脊髓，优选为血液；所述结缔组织之外的半固体组织选自以下之一种或多种器官所含组
织：肠、胃、肉、胰腺、脾脏、肝脏、肺、软骨、关节、皮、胎盘、脐带，优选为选自以下之一种或多种器官所含组织：肉、胎盘、脐带。
[0409]
项目17、根据项目16的应用、组合物、方法或药盒，其中所述血液为选自以下组之一种或多种：天然血液、天然血液的血细胞富集组分(例如血浆含量为天然血液血浆含量的30～80％的血细胞浓缩血液)、包含血细胞制备物和血浆的工程血液(例入白细胞或/和淋巴细胞与血浆的混合物)。
[0410]
项目18、根据项目13-17之一的应用、组合物、方法或药盒，其中所述细胞制品或组织所包含的细胞为选自以下组及其衍生物之一种或多种：肌细胞、血细胞、免疫细胞、干细胞，例如间充质干细胞、造血干细胞，其中所述免疫细胞选自以下组之一种或多种：树突状细胞、巨噬细胞、白细胞及其衍生物，其中所述白细胞选自以下一种或多种：粒细胞、单核细胞、淋巴细胞，其中所述淋巴细胞选自以下一种或多种：t细胞、b细胞、裸细胞。
[0411]
项目19、根据项目13-18之一的应用、组合物、方法或药盒，其中所述组织和/或细胞制品选自以下组之一种或多种：并不富含异种糖蛋白抗原的异种组织和/或异种细胞；abo血型相符或hla相近甚至相同的同种异体组织和/或细胞；同种异体同基因组织和/或细胞；自体组织和/或细胞。
[0412]
项目20、根据项目13-19之一的应用、组合物、方法或药盒，其中所述细胞为选自以下组之一种或多种：同种异体组织和/或细胞、自体组织和/或细胞。
[0413]
项目21、根据项目13-20之一的应用、组合物、方法或药盒，其中所述移植物选自包含所述细胞和血浆的混合物，且其中所述混合物的的细胞比容为>22％(或细胞浓度为>5.6
×
109个/ml)、优选为33％-86％(或细胞浓度为8.4
×
10
9-22
×
109个细胞/ml)或45％-86％(或细胞浓度为11.5
×
10
9-22
×
109个细胞/ml)。
[0414]
项目22、根据项目13-20之一的应用、组合物、方法或药盒，其中所述移植物选自包含所述细胞和血液的混合物，且其中所述混合物的细胞比容为>22％(或细胞浓度为>5.6
×
109个/ml)、优选为33％-86％(或细胞浓度为8.4
×
10
9-22
×
109个细胞/ml)或45％-86％(或细胞浓度为11.5
×
10
9-22
×
109个细胞/ml)。
[0415]
项目23、根据项目13-20之一的应用、组合物、方法或药盒，其中所述移植物选自包含所述细胞的粘稠物，且其中所述粘稠物的细胞比容为45％-86％(或细胞浓度为11.5
×
10
9-22
×
109个细胞/ml)、或70％-86％(或细胞浓度为17.9
×
10
9-22
×
109个细胞/ml)。
[0416]
项目24、根据项目9或11的应用、组合物或方法，其中所述微生物制品选自以下组之一种或多种：细菌制品、病毒制品、寄生虫制品。
[0417]
项目25、根据项目9、11或24的应用、组合物、方法或药盒，其中所述微生物制品选自以下组之一种或多种：细菌制品，例如源自以下细菌的制品之一种或多种：化脓性链球菌、豁质沙雷菌、卡介苗、破伤风梭菌、丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌；病毒制品，例如源自以下病毒的制品之一种或多种：腺病毒、单纯疤疹病毒、牛痘病毒、腮腺炎病毒、新城鸡瘟病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、西尼卡谷病毒、柯萨奇病毒、呼肠孤病毒；寄生虫制品，例如源自疟原虫的制品。
[0418]
项目26、根据项目9-12之一的应用、组合物、方法或药盒，其中所述细胞毒药物选自包括抗肿瘤化疗药物，例如以下之一种或多种：5-氟尿嘧啶、吉西他滨、表柔比星、抗局部病变疾病抗生素、替尼泊苷、金属铂络合物、紫杉醇。
[0419]
项目27、根据项目9-12之一的应用、组合物、方法或药盒，其中所述组织破坏剂为选自以下组之一种或多种：化学消融剂，例如乙醇、乙酸、氢氧化钠；常规无效局部有效化合物，例如以下组之一种或多种：氨基酸类营养素，例如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、或它们的盐、或包含它们的寡肽，无效芳香化合物，例如亚甲蓝、乙酰水扬酸、奎宁、一盐酸奎宁、二盐酸奎宁，植物或菌类活性成分，例如藻类多糖、药用植物多糖、真菌多糖、青蒿素。
[0420]
项目28、根据项目1-27之一的应用、组合物、方法或药盒，其中所述组合物还包含疫苗佐剂，其中所述佐剂选自以下组之一种或多种：免疫调节类抗体，例如靶物为以下之一种或多种的抗体：ctla-4、pd-1、pd-l1、ox40、cd137、4-1bb、tgf-p1；细胞因子，例如gm-csf、il-2、il-12、干扰素；免疫调节类蛋白质片断，例如cpg。
[0421]
项目29、根据项目1-10之一的应用、组合物、方法或药盒，其中所述肿瘤选自乳腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、肠癌、口腔癌、胃癌、结直肠癌、支气管癌、喉癌、睾丸癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤、脑瘤、肾细胞癌、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤。
[0422]
除本文中描述的那些外，根据前述描述，本发明的多种修改对本领域技术人员而言会是显而易见的。这样的修改也意图落入所附权利要求书的范围内。本申请中所引用的各参考文献(包括所有专利、专利申请、期刊文章、书籍及任何其它公开)均以其整体援引加入本文。