治疗创伤后应激障碍的粉防己碱鼻用制剂的制作方法

本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种治疗创伤后应激障碍的粉防己碱制剂。

背景技术：

创伤后应激障碍(post-traumaticstressdisorder，ptsd)指个体经历或目睹异乎寻常的灾难性事件(地震、洪灾、战争、车祸等)后，导致机体延迟出现或长期持续存在的一种精神障碍。ptsd的临床表现主要有创伤性再体验症状、回避和麻木类症状、警觉性增高症状等。对于ptsd的治疗，目前首选五羟色胺再摄取抑制剂(selectiveserotoninreuptakeinhibitor，ssri)，其中氟西汀、帕罗西汀、舍曲林疗效较好，但是长期用药所带来的副作用也是不容忽视的，常见的有恶心、头疼、失眠，严重者还可引起血液及淋巴系统不适、免疫失调、性功能障碍等。

粉防己碱是由中药汉防己科植物粉防己的干燥根中提取而来的一种双苄基异喹啉类生物碱，属于钙通道阻滞剂，临床上主要用于心血管疾病、风湿病等治疗，具有抗炎、抗肿瘤及免疫调节等药理作用。粉防己碱结构式如下所示。

在本发明中，温度敏感性凝胶是是一种在室温下为溶液并以液体状态给药，在用药部位因温度升高发生相转变，由溶液转化为凝胶的制剂。本发明中立方液晶是由两亲性分子溶解在极性溶剂中形成的体系，作为药物载体具有许多优点流动性低和生物黏附性大，能长时间黏附于皮肤或黏膜表面，提高药物的吸收。

生物黏附材料的加入除了具有药效持久、使用方便、可避开首过效应等生物粘附剂的特性外，它还具有分散性好、粘附力强、稳定性好、给药部位局部浓度高的特点。

技术实现要素：

本发明提供一种鼻用制剂组合物，用于治疗创伤后应激障碍，能有效抗抑郁和抗焦虑症状，较现有剂型疗效确切，使用方便，且制备工艺简单。

本发明提供一种鼻用制剂组合物，其包含药物溶液、温度敏感性凝胶。上述药物溶液，原料按重量份数含有0.1～10份粉防己碱、10～30份盐酸(0.1mol/l)。

所述温度敏感性凝胶，原料按重量份数含有0.1～10份泊洛沙姆188，1～10份泊洛沙姆407，15～35份水。

下面是对上述发明的进一步优化，在上述温度敏感性凝胶中，优选泊洛沙姆188与泊洛沙姆407重量之比为1∶5～7。

本发明提供的鼻用制剂组合物的制备方法，包括以下步骤：(1)将鼻用制剂组合物中包含的泊洛沙姆407和泊洛沙姆188加入超纯水在4℃下充分溶胀，继续加水至全量，混匀后即得温度敏感性凝胶；(2)将鼻用制剂组合物中包含的药物溶液或混悬液加入温度敏感性凝胶中混匀，即得鼻用凝胶制剂。

本发明提供了一种粉防己碱鼻用制剂组合物，原料按重量份数含有0.1～10份粉防己碱、30～90份立方液晶。

本发明提供的鼻用制剂组合物的制备方法，包括以下步骤：(1)将装有单油酸甘油酯的离心管放入45℃恒温水浴锅中加热至单油酸甘油酯完全融化，加入乙醇，涡旋使其混合均匀，作为油相：(2)加入药物混匀；(3)吸取预热至45℃的去离子水，边涡旋边将水滴加至油相中，搅拌均匀后于室温下放置7天。

本发明提供的鼻用制剂组合物的制备方法，包括以下步骤：(1)单油酸甘油酯中加入乙醇，将盛有二者的容器水浴加热，至单油酸甘油酯全融至澄清透明溶液；(2)将粉防己碱和水混匀，同放45℃加热；(3)手持离心管于漩涡混合器上，用1ml注射器吸取粉防己碱混悬液，迅速逐滴加入，至离心管内液体渐变稠厚，继续搅拌，继续滴加剩余溶液。

粉防己碱具有抗炎、抗肿瘤及免疫调节等药理作用。温度敏感性凝胶易于包裹药物，生物黏附性强，能延长药物在鼻腔内的停留时间，可提高药效且使用方便，毒副作用小，对创伤后应激障碍有很好的疗效。

附图说明

图1粉防己碱温度敏感性凝胶外观.a：t＜32℃，b：t＞32℃

图2粉防己碱温度敏感性凝胶流变学性质

图3温度敏感性凝胶鼻腔内停留时间.给药后0h(a)，0.5h(b)，1h(c)，2h(d)，4h(e)

图4不同制剂对蟾蜍上腭纤毛摆动的影响.a：生理盐水组；b：去氧胆酸钠组；c：温度敏感性凝胶组；d：粉防己碱温度敏感性凝胶组(n＝4，).

图5高架十字迷宫试验证明ptsd模型建立成功.a：正常小鼠路径；b：模型小鼠路径；c：给药前进入开臂百分比；d：给药前进入开臂潜伏期；e：给药前开臂中停留时间(n＝6，).与正常组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01

图6高架十字迷宫试验评价粉防己碱温度敏感性凝胶治疗ptsd的药效学.a：正常小鼠路径；b：模型小鼠路径；c：粉防己碱温度敏感性凝胶治疗组小鼠路径；d：给药后进入开臂百分比；e：给药后进入开臂潜伏期；f：给药后开臂中停留时间(n＝6，).与正常组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001；与模型组比较，^#p＜0.05，^##p＜0.01，^###p＜0.001

图7粉防己碱温度敏感性凝胶对小鼠僵住时间的影响(n＝3，).与正常组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01；与模型组比较，^#p＜0.05，^##p＜0.01

图8不同组别小鼠中海马、前额皮质、杏仁核h.e.病理切片(×200)

图9不同组别小鼠中海马、前额皮质、杏仁核c-fos蛋白免疫组化(×200)

以下将结合具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护不限于此。

本发明提供了一种粉防己碱鼻用制剂组合物，原料按重量份数含有0.1～10份粉防己碱、10～30份盐酸(0.1mol/l)、50～70份温度敏感性凝胶。

在一项优选的实施方案中，原料按重量份数含有0.1～5份粉防己碱、15～20份盐酸(0.1mol/l)、40～50份温度敏感性凝胶。

所述温度敏感性凝胶包含以重量份计的下列组合，0.1～10份泊洛沙姆188，1～10份泊洛沙姆407，15～35份水。

本发明提供了一种粉防己碱鼻用制剂组合物，原料按重量份数含有0.1～10份粉防己碱、30～90份立方液晶。

具体实施方式

实施例一：粉防己碱鼻用混悬制剂

取2g泊洛沙姆188和12g泊洛沙姆407加适量水在4℃下充分溶胀，继续加水至50ml，混匀后得温度敏感性凝胶；取1g粉防己碱，加入6ml1，2-丙二醇和8ml乙醇，混合均匀；将上述粉防己碱混悬液加至36ml上述温度敏感性凝胶，混匀后得粉防己碱鼻用制剂。

实施例二：粉防己碱鼻用立方液晶

1.处方

2.制备工艺

水浴锅保持45℃恒温，称取3.2g单油酸甘油酯放于50ml离心管中，加入乙醇0.3g，将离心管放在水浴锅内的烧杯内水浴加热，至离心管中单油酸甘油酯全融至澄清透明溶液。将0.75g粉防己碱、1.5g水放于烧杯内混匀，同放水浴锅45℃加热。手持离心管于漩涡混合器上，用1ml注射器吸取粉防己碱混悬液，迅速逐滴加入，至离心管内液体渐变稠厚，继续搅拌，继续滴加剩余溶液。

实施例三：粉防己碱鼻用立方液晶

精密称取3.2g单油酸甘油酯置于离心管内，将离心管放入45℃恒温水浴锅中加热至单油酸甘油酯完全融化，加入0.3g乙醇，涡旋使其混合均匀，作为油相。加入0.1g粉防己碱，再次涡旋混匀，用1ml注射器吸取1.4g预热至45℃的去离子水，边涡旋边将水滴加至油相中，玻璃棒搅拌均匀后于室温下放置7天。

实施例四：粉防己碱鼻用温度敏感性凝胶(tetrandrinetemperaturesensitivegels，ttg)的制备

(1)制备上述温度敏感性凝胶；(2)精密称取0.2g粉防己碱于10ml离心管中，加入3ml盐酸(0.1mol/l)，混合均匀；(3)将(2)中混合物加到7ml温度敏感性凝胶中，旋涡混合器充分混合均匀使溶解，即得粉防己碱鼻用温度敏感性凝胶。

实验例一：粉防己碱鼻用温度敏感性凝胶的性质评价

1.评价方法

胶凝温度及胶凝时间测定将装有ttg的试管置于恒温水浴锅，试管溶液面始终低于水浴面，水浴温度由20℃缓慢升至40℃，升温速度为1℃/min，倒转试管，观察液体流动情况，液体不流动时的温度记为凝胶温度，液体由溶液状态转变为凝固状态时间为胶凝时间。

流变学性质考察采用安东帕高级旋转流变仪测定ttg的流变学性质，考察在10-40℃温度范围内ttg损耗模量(g’)储能模量(g”)、及复合黏度(viscosity)的变化；考察32℃条件下，在0.1-100rad/s剪切频率范围，ttg损耗模量(g’)储能模量(g”)、及复合黏度(viscosity)的变化。

凝胶鼻腔滞留时间考察称取10mgcy7加至5ml上述空白温度敏感性凝胶中(2mg/ml)，同时制备相同浓度cy7水溶液。将icr小鼠随机分为空白对照组、cy7溶液组和cy7温度敏感性凝胶组，cy7溶液组小鼠给予20μlcy7水溶液(2mg/ml)，cy7温度敏感性凝胶组小鼠给予等量cy7温度敏感性凝胶(2mg/ml)，空白对照组不作任何处理。选择745nm作为激发波长，分别在给药后0、1、2、4h进行小动物荧光成像并观察。

纤毛毒性考察将12只中华大蟾蜍随机分为生理盐水组(阴性对照)、去氧胆酸钠组(阳性对照)、空白温度敏感性凝胶组和ttg组，每组3只。蟾蜍处死后，暴露出上腭，用眼科剪和镊子小心地分离上腭黏膜，面积约为5mm×5mm，生理盐水冲洗血块及组织。将上腭黏膜纤毛面朝上置于载玻片上，分别滴加100μl生理盐水、1％去氧胆酸钠、空白温度敏感性凝胶和ttg，轻轻盖上盖玻片，于200倍光学显微镜下观察蟾蜍上腭黏膜纤毛摆动情况，记录从给药开始到纤毛停止摆动所持续的时间，即纤毛持续运动时间(persistentvibrationduration，pvd)。以各给药组蟾蜍的pvd除以生理盐水的pvd即得纤毛持续运动百分率(percentageofpersistentvibration，ppv)。ppv越高表示药物对纤毛的毒性越小，反之越大。

2.结果

ttg胶凝温度及胶凝时间4℃时，ttg外观为白色黏稠流动状液体(图1a)。37℃时，迅速转变成不流动凝胶态(图1b)。通过试管倒转法测定ttg的胶凝温度低于32℃，胶凝时间为1.32min。

流变学表明ttg具有温度敏感性储能模量代表半固体状态，损耗模量代表液体状态。温度在23℃时，储能模量等于损耗模量，此温度即为液体向半固体转变的临界温度。当温度低于23℃时，损耗模量高于储能模量，液体的黏性特征占优势，说明此时的温度敏感性凝胶为流动的液体；当温度高于23℃时，储能模量大于损耗模量，固体的弹性特征占主导，此时的凝胶状态为半固体。当温度升高至35℃以后，储能模量及损耗模量均趋于稳定，且储能模量大于损耗模量，因此在鼻腔温度下，ttg以半固体状态黏附于鼻腔内，增加在鼻腔内的滞留时间。温度为32℃，剪切频率ω在0.1-100rad·s^-1范围内时，储能模量一直大于损耗模量，ttg一直处于半固体状态，表明鼻腔环境下，制剂的固体性质始终强于液体性质，凝胶结构稳定；随着剪切频率增加，凝胶黏度变小，存在剪切变稀现象(图2)。

ttg鼻腔滞留时间延长随时间延长，cy7溶液组和cy7温度敏感性凝胶组小鼠鼻腔中荧光强度均逐渐下降，其中cy7生理盐水溶液组下降较快，cy7温度敏感性凝胶组下降较慢。溶液流动性好，易通过鼻内纤毛运动排出，不在鼻腔内滞留，给药后很快通过鼻腔流到口腔内。而温度敏感性凝胶具有生物黏附性，给药后0.5、1、2、4h鼻腔内荧光强度均高于cy7生理盐水溶液(图3)。说明以凝胶作为药物载体至少可在鼻腔内停留4h以上，延长药物在鼻腔内滞留时间，减少鼻纤毛摆动引起的药物流失，提高药物生物利用度。

ttg对蟾蜍上腭黏膜纤毛摆动影响较小生理盐水组蟾蜍上腭黏膜纤毛结构排列整齐，清晰可见，运动活跃，有规律地向同一方向呈麦浪式摆动，且摆动频率较高。当给予1％去氧胆酸钠后，黏膜表面排列杂乱无章，纤毛结构被严重破坏，在短时间内停止摆动，部分脱落，毒性最大(图4)。空白温度敏感性凝胶组及ttg组，纤毛结构较清晰完整，运动较活跃，未出现明显细胞脱落现象，表明空白温度敏感性凝胶和ttg对纤毛几乎没有毒性，安全性较高，可用于鼻腔给药。各给药组的pvd和ppv由高到低排列顺序依次为生理盐水组＞空白温度敏感性凝胶组＞ttg组＞去氧胆酸钠组(表1)。与生理盐水组相比，去氧胆酸钠组的pvd和ppv显著降低(p＝0.000＜0.001)；与去氧胆酸钠组相比，空白温度敏感性凝胶及ttg组的pvd、ppv均显著升高(p＝0.000＜0.001)，说明空白温度敏感性凝胶和ttg安全性较高。

表1不同处方对纤毛摆动的影响(n＝3，).

注：与生理盐水组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001；与去氧胆酸钠组比较，^#p＜0.05，^##p＜0.01，^###p＜0.001

实验例二：粉防己碱鼻用制剂组合物治疗创伤后应激障碍的药效学评价

1材料与方法

1.1实验动物与分组

实验动物健康icr小鼠18只，spf级，体重为20±1g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：scxk(京)2016-0006。动物饲养环境：21-25℃，给予12h光照/12h黑暗，自由进食饮水。健康c57bl/6n小鼠9只，spf级，体重为20±1g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：scxk(京)2016-0006。动物饲养环境：21-25℃，给予12h光照/12h黑暗，自由进食饮水。

1.2给药方案与评价

小鼠单次延长应激(singleprolongedstress，sps)模型建立所有动物适应性饲养3d后，随机分为正常组、sps模型组、ttg治疗组，每组6只，共18只。

sps模型的建立共分为三个步骤：

(1)禁锢：将小鼠置于50ml离心管(离心管穿孔以保证动物正常呼吸)，水平放置禁锢2h；

(2)强迫游泳：将禁锢后的小鼠放到水深11cm，水温(25±1)℃的2l烧杯中强迫游泳20min；

(3)乙醚麻醉：将强迫游泳后的小鼠放到饲养笼中恢复15min后，用无水乙醚将小鼠麻醉至意识丧失，后将其置于通风处待其自然苏醒，而后正常饲养。

给药方案与评价指标模型建立成功后第2d开始给药，ttg组单侧鼻孔给予20mg·kg^-1ttg20μl，每日1次，连续7d，正常组及模型组不给药。

高架十字迷宫小鼠高架十字迷宫(elevatedplusmaze，epm)由长臂、短臂及中央区连接而成，长臂长为700mm，宽为80mm；短臂长为665mm，宽为55mm，底部和四周均为黑色，整体置于可升降的不绣钢支架上，调节高架十字迷宫底座到地面的距离为80cm。模型建立后第2d，将小鼠头朝开臂方向由中央区域自由放下，记录300s内小鼠分别进入开放臂和闭合臂的次数和滞留时间，以验证sps模型是否建立成功。给药7d后再次进行epm检测，评价ttg是否具有抗ptsd作用。每只小鼠实验结束后均清理粪便，用75％酒精擦拭，最后干抹布擦干后进行下一轮实验，避免排泄物及气味对实验小鼠的影响。

小鼠条件恐惧模型建立条件恐惧实验(不可逃避足底电击)中所有动物适应性饲养3d后，随机分为正常组、条件恐惧模型组、ttg治疗组，每组3只，共9只。

条件恐惧模型建立是将小鼠放到幽闭电击箱中接受两个阶段的刺激：

(1)自发活动阶段：将小鼠放到幽闭电击箱中自由活动300s，不予以任何刺激；

(2)刺激阶段：15次间断的、不可逃避的足底电击(电击参数：0.8ma，间隔10s，持续10s，共300s)。

上述步骤持续两天，正常组置于幽闭电击箱，但不给予电击，共600s。每只小鼠实验结束后清理粪便，并用75％乙醇擦拭幽闭电击箱底部及侧面，避免排泄物及气味对实验小鼠的影响。

给药方案与评价指标模型建立成功后第2d开始给药，ttg组单侧鼻孔给予20mg·kg^-1ttg20μl，每日1次，连续7d，正常组及模型组不给药。

小鼠僵住行为检测给药7d后，将动物置于电击箱中进行环境重现实验，不给予任何刺激(每只动物放在与造模时同样的电击箱内)，采用视频分析软件检测小鼠在300s内的不动时间。

h.e.病理切片观察条件恐惧模型小鼠在给药7d且僵住行为检测后，麻醉后取全脑组织置于4％甲醛中保存固定、脱水、石蜡包埋、切成薄片，苏木精-伊红(h.e.)染色，200倍光学显微镜下观察脑组织形态学变化^[23]。

免疫组化检测c-fos蛋白表达不可逃避足底电击模型小鼠在给药7d且僵住行为检测后，麻醉后取全脑组织置于4％甲醛中保存，切海马及前额叶皮层横切面，200倍镜下观察c-fos蛋白的表达情况。

统计学方法利用spss16.0分析软件，多组间数据采用单因素方差分析，p＜0.05表示有显著性差异，实验数据均以表示。

2实验结果

2.1高架十字迷宫验证模型建立成功

从正常、模型两组的路径分析，与正常组相比，模型组在开臂滞留的时间与路程均明显缩短，表明单次延长应激模型建立成功(图5a、b)。通过oe、ol及ot三个指标分析，与正常组相比，模型组的oe(图5c)明显比正常组低(p＝0.009＜0.01)，ol(图5d)比正常组高(p＝0.033＜0.05)，ot(图5e)比正常组短(p＝0.004＜0.01)，表明sps模型建立成功。

2.2高架十字迷宫证明粉防己碱温度敏感性凝胶具有抗ptsd样效果

与正常组相比，模型组在开臂滞留的时间与路程明显缩短，表明单次延长应激模型建立成功。与模型组相比，ttg组在开臂滞留的时间与路程明显增大，表明ttg对ptsd具有良好的改善作用(图6a、b、c)。经统计学分析，与正常组相比，模型组oe明显降低(p＝0.000＜0.001)，ot降低但不明显(p＝0.101＞0.05)；ol比正常组升高(p＝0.671＞0.05)。尽管ol及ot指标无统计学差异，但与正常组相比仍有焦虑现象，进一步证明sps模型建立成功。与模型组相比，ttg单侧鼻孔给药7d后oe、ot明显增高(p＝0.002＜0.01，p＝0.033＜0.05)，ol降低(p＝0.201＞0.05)(图6d、e、f)。尽管ol无统计学差异，但ttg组与模型组相比仍有改善的趋势，表明ttg具有良好的抗ptsd作用。

2.3僵住行为说明ttg具有良好的抗ptsd的作用

与正常组相比，模型组不动时间明显增高(p＝0.004＜0.01)，说明环境重现使小鼠产生恐惧记忆，条件恐惧模型建立成功；与模型组相比，ttg组的不动时间显著降低(p＝0.049＜0.05)，表明ttg具有良好的抗ptsd的作用(图7)。

2.4h.e.病理切片说明ttg能明显逆转海马、前额叶皮层及杏仁核部位的病变

通过倒置荧光显微镜(×200)观察海马(ca1区、ca2区、ca3区、dg区)、前额叶皮层及杏仁核结构，发现正常组海马、前额叶皮层及杏仁核部位均核型规整，排列整齐。与正常组相比，模型组ca1区、前额叶皮层及杏仁核部位核型不规整，排列不整齐不均匀，并且出现核固缩深染的现象，表明不可逃避足底电击导致ca1区、前额叶皮层及杏仁核部位发生了病变。与模型组相比，ttg组核固缩深染现象消失，且细胞核排列整齐，说明ttg能缓解ptsd所致小鼠病理学改变。对于海马ca2区、ca3区和dg区，正常组、模型组、ttg组并无差异，因此初步判断ptsd病变部位主要在海马的ca1区、前额叶皮层及杏仁核部位^[24](图8)。

2.5免疫组化结果说明ttg能显著降低足底电击导致的c-fos蛋白表达

c-fos作为在原癌基因家族中的快速反应基因，参与神经纤维对伤害性刺激的反应，表明神经元的兴奋性。倒置荧光显微镜(×200)观察海马(ca1区、ca2区、ca3区、dg区)、前额叶皮层及杏仁核结构，蓝色为细胞核，棕黄色为c-fos阳性信号。ptsd模型建立后，海马ca1区、前额叶皮层及杏仁核部位c-fos的表达量显著增高，而海马ca2、ca3、dg区未见明显差异。ttg给药一周后，可降低海马ca1区、前额叶皮层以及杏仁核部位c-fos的表达量，表明ttg对足底电击导致的ptsd症状具有良好的改善作用，且小鼠的病变部位主要在海马ca1区、前额叶皮层以及杏仁核部位(图9)，与h.e.结果一致。

3结论

通过高架十字迷宫进行行为学评价，小鼠在ptsd应激后，开臂进入次数比例及开臂滞留时间明显比正常组减少，开臂进入潜伏期比正常组高，表明动物处于焦虑状态；ttg鼻腔给药一周后，再次进行高架十字迷宫评价，三个指标显示焦虑的情绪大有改观，表明ttg能够改善小鼠焦虑的情绪，产生抗ptsd的作用。僵住行为检测结果显示，足底电击能够使小鼠产生恐惧记忆，延长不动时间，而ttg则可缩短小鼠在幽闭恐惧箱内的不动时间，进而产生抗ptsd的作用。h.e.及c-fos免疫组化病理切片反映了ptsd的病变部位主要在海马ca1区、前额叶皮层以及杏仁核。综上所述，粉防己碱温度敏感性凝胶作为一种中药单体脑靶向制剂，鼻腔滞留时间长，安全性高，可显著改善ptsd症状，产生抗ptsd的作用。