一种含绿原酸的鼻腔给药组合物的制作方法

本发明涉及一种含绿原酸的鼻腔给药组合物。

背景技术：

鼻腔作为全身治疗的给药途径，其研究非常活跃，特别是蛋白质和多肽类药物，鼻腔给药将有可能成为取代长期注射给药的有效方法。另外，鼻黏膜是实现脑靶向给药的有效途径。相对于口服、注射剂给药方式，鼻腔给药具有很多特点：(1)方式简便，顺应性良好，病人可自行完成用药，病人不能自主用药时，也可由家人给药；(2)药物经鼻腔给药后，可起局部作用，也可经鼻黏膜吸收进入体循环，到达脑部；(3)起效快，吸收迅速；(4)避免了口服引起的首过效应，生物利用度高。

绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸生成的缩酚酸，是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物，是一种重要的生物活性物质，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经系统等作用。绿原酸包含5个羟基和1个羧基极性基团，这个分子结构特点决定口服给药易发生降解，生物利用度低。因此，针对绿原酸的药物开发，多以注射剂为主，少部分采用结构改造等技术提高绿原酸口服生物利用度，亦获得显著效果。

目前，绿原酸在抗肿瘤领域，已获得临床进展，现有公司研发的注射用绿原酸已处于临床ii/iii期研究。除此之外，并无用于抗肿瘤的绿原酸其它剂型上市或者处于临床研究。专利cn105147656a提供了一种含绿原酸的鼻腔给药制剂，该制剂配方简单，虽然绿原酸含量高但经鼻吸收率低，仅能用于治疗过敏性鼻炎。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于抗肿瘤的鼻腔给药组合物，它是以绿原酸为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

进一步地，所述制剂为鼻粉剂、气雾剂、喷雾剂。

更进一步地，所述鼻粉剂的辅料为粘附剂和吸收促进剂。

进一步地，所述鼻粉剂的原辅料重量份为：绿原酸10-90份、粘附剂5-80份、吸收促进剂0-70份。

更进一步地，所述粘附剂选自卡波姆、壳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠中任意一种或几种；所述吸收促进剂选自卵磷脂、β-环糊精、胆酸钠中任意一种或几种。

更进一步地，所述鼻粉剂粒径为20-100μm。

进一步地，所述气雾剂的辅料为抛射剂、潜溶剂和吸收促进剂。

更进一步地，所述气雾剂的辅料重量份为：

抛射剂5-30份、潜溶剂10-50份、吸收促进剂1-10份。

更进一步地，所述抛射剂选自二氯二氟甲烷、三氯一氟甲烷、七氟丙烷、四氟乙烷、二甲醚中的任意一种或几种；所述潜溶剂选自乙醇、甘油、丙二醇中的任意一种或几种；所述吸收促进剂选自氮酮、乙二胺四乙酸钠、油酸、月桂酸、月桂醇硫酸中的任意一种或几种。

进一步地，所述气雾剂的辅料还包括注射用水。

进一步地，所述气雾剂每1ml含绿原酸0.1-1g。

进一步地，所述喷雾剂的辅料为溶剂。

更进一步地，所述溶剂选自生理盐水和/或注射用水。

进一步地，所述喷雾剂的辅料还包含聚乙二醇。

更进一步地，所述聚乙二醇与绿原酸质量比为2：1。

进一步地，所述喷雾剂每1ml含绿原酸0.1-1g。

本发明还提供了一种前述组合物的方法，它包括如下步骤：

取绿原酸与吸收促进剂，加无水乙醇或含水乙酸乙酯溶解，干燥，粉碎，再加粘附剂混匀，过120～1000目筛，即得；

或：

取绿原酸、吸收促进剂和粘附剂混匀，过120～1000目筛，即得。

或：

取绿原酸，潜溶剂和少量溶剂，加热溶解，冷却，再加入抛射剂、吸收促进剂和余量溶剂溶解，过滤，取滤液即得；

或：

取绿原酸、聚乙二醇和少量溶剂，加热溶解，冷却，再加余量溶剂混匀，过滤，取滤液即得。

本发明还提供了前述的组合物在制备提高绿原酸血脑屏障透过率的药物中的用途。

进一步地，所述药物是缓解和/或治疗鼻咽癌或脑瘤的药物。

更进一步地，所述脑瘤为恶性脑瘤。

更进一步地，所述恶性脑瘤是胶质母细胞瘤、室管膜瘤或少突细胞瘤。

本发明提供的一种经鼻腔给药的绿原酸制剂，能够提高绿原酸鼻腔给药的生物利用度，透过血脑屏障，对脑部肿瘤及鼻咽癌具有显著抑制作用，还能增加绿原酸在治疗相应适应症领域(比如自身免疫疾病、神经退行性疾病等)的疗效。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1各试验组比格犬血液中绿原酸含量与时间关系曲线图

图2各试验组大鼠脑组织中绿原酸含量与时间关系曲线图

具体实施方式

实施例1鼻粉剂

配方

绿原酸20g

卵磷脂70g

卡波姆5g

壳聚糖5g

制备方法：

称取绿原酸和卵磷脂，用含水乙酸乙酯加热溶解，搅拌，负压回收乙酸乙酯并干燥，粉碎，加卡波姆和壳聚糖混合均匀，过120目筛，装喷粉器即可。

实施例2鼻粉剂

配方

绿原酸30g

β-环糊精60g

羟丙基纤维素5g

聚乙烯吡咯烷酮5g

制备方法：

称取绿原酸和β-环糊精，无水乙醇加热溶解，搅拌，负压回收乙醇并干燥，粉碎，羟丙基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮混合均匀，过120目筛，装喷粉器即可。

实施例3鼻粉剂

配方

绿原酸60g

卡波姆20g

羧甲基纤维素钠15g

胆酸钠5g

制备方法：称取各物料，混合均匀，过150目筛，装喷粉器即可。

实施例4鼻粉剂

配方：

绿原酸80g

羧甲基纤维素钠15g

卡波姆5g

制备方法：取各物料，混合均匀，过1000目筛，装喷粉器即可。

实施例5鼻粉剂

配方：

绿原酸90g

聚乙烯吡咯烷酮5g

胆酸钠5g

制备方法：称取各物料，混合均匀，过500目筛，装喷粉器即可。

实施例6气雾剂

配方

绿原酸20g

乙醇10g

甘油10g

氮酮5g

二氯二氟甲烷30g

注射用水加至100ml

制备方法：

称取绿原酸、乙醇及少量注射用水，加热溶解，冷却，加入剩余物料，再加注射用水至100ml，溶解，过滤，滤液装入专用鼻腔气雾剂瓶中。

实施例7气雾剂

配方

绿原酸50g

乙醇20g

丙二醇5g

乙二胺四乙酸钠3g

油酸2g

三氯一氟甲烷20g

注射用水加至100ml

制备方法：

取绿原酸、乙醇及少量注射用水，加热溶解，冷却，加入剩余物料，再加注射用水至100ml，溶解，过滤，滤液装入专用鼻腔气雾剂瓶中。

实施例8喷雾剂配方

配方

绿原酸10g

聚乙二醇20g

注射用水加至100ml

制备方法：

按处方称取绿原酸、聚乙二醇及少量注射用水，加热溶解，冷却，加注射用水至100ml，溶解，过滤，滤液装入专用鼻腔喷雾剂瓶中。

实施例9喷雾剂配方

配方

绿原酸10g

聚乙二醇20g

生理盐水加至100ml

制备方法：

按处方称取绿原酸、聚乙二醇及少量生理盐水，加热溶解，冷却，加注射用水至100ml，溶解，过滤，滤液装入专用鼻腔喷雾剂瓶中。

以下通过试验例的方式进一步说明本发明的有益效果：

试验例1比格犬鼻腔给药生物利用度试验考察

1材料及方法

1.1药品

(1)绿原酸原料药；(2)实施例1鼻粉剂；(3)实施例5鼻粉剂；(4)实施例6气雾剂；(5)实施例7气雾剂；

1.2动物

雄性比格犬6条，体重10-13kg

2试验方案

2.1动物给药

6条比格犬采用随机分组自身交叉给药，周期间隔为一周。受试动物禁食12小时后按4mg/kg绿原酸给药剂量鼻腔给予绿原酸、鼻粉剂、气雾剂，另一只按4mg/kg静脉注射绿原酸，给药3h后准许喂食；

2.2血样采集

分别于比格犬给药后10min、30min、60min、90min、120min、150min静脉取血3ml，肝素抗凝，离心分离血清1ml，置-20℃冰箱冻藏。

2.3血样处理

取血清100μl，加入甲醇-0.2％磷酸(80:20)溶液、50mg/ml葛根素甲醇内标溶液和甲醇各100μl，漩涡振荡3min，静置，离心(12000rpm)10min，取出上清液，作为血清供试品溶液

2.4血样检测

采用十八烷基硅烷键合硅胶柱(150mm×4.6mm，5μm)及保护柱；以流动相a(甲醇)与流动相b(0.2％磷酸)，按梯度洗脱程序进行脱；检测波长为325nm；流速为1ml/min；柱温40℃。

精密量取血清供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。采用内标法，以随行标准曲线计算血清中绿原酸的含量。

3、统计处理

实验数据以均数±标准差表示，t检验。

4、试验结果

各试验组比格犬给药后各时间点血液中绿原酸含量结果见表1和图1。

表1各试验组比格犬给药后各时间点血液中绿原酸含量结果

5小结

各实验组比格犬血药浓度结果显示，鼻粉剂和气雾剂均能够显著提高绿原酸鼻腔给药的生物利用度，血药浓度最高点与静脉给绿原酸基本接近，初步判断鼻粉剂和气雾剂在药效方面与注射剂具有近似效果。

试验例2大鼠鼻腔给药血脑屏障透过率试验考察

1、材料及方法

1.1药品

(1)绿原酸原料药；(2)实施例1鼻粉剂；(3)实施例5鼻粉剂；(4)实施例6气雾剂；(5)实施例7气雾剂；

1.2动物

sd大鼠，150只，雌雄各半，体重180-220g。

2、试验方案

2.1动物给药

取sd大鼠，随机分成5组，每组30只，按20mg/kg绿原酸剂量鼻腔给予各受试药物，并给药后第10min、30min、60min、90min、120min、150min时间点采集组织样本。

2.32脑组织采集

给药结束后，各试验组根据时间点腹腔注射0.2ml的1％戊巴比妥钠进行深度麻醉，再从左心室入针，剪破右心室，用注射器打入生理盐水进行心脏灌注，直至肝脏、脾脏变灰白，取出脑组织。

2.3脑组织处理

取脑组织置于匀浆器中，按脑组织：生理盐水＝1:1(w/v)加入0.9％氯化钠注射液匀浆；取匀浆液200μl，加入50mg/ml葛根素内标溶液200μl及甲醇200μl，漩涡混匀，离心，取上清液作为脑组织供试品溶液。

2.4脑组织检测

采用十八烷基硅烷键合硅胶柱(150mm×4.6mm，5μm)及保护柱；以流动相a(甲醇)与流动相b(0.2％磷酸)，按梯度洗脱程序进行脱；检测波长为325nm；流速为1ml/min；柱温40℃。

精密量取脑组织供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。采用内标法，以随行标准曲线计算血清中绿原酸的含量。

3、统计处理

实验数据以均数±标准差表示，t检验。

4、试验结果

各试验组大鼠鼻腔给药后各时间点脑组织中绿原酸含量结果见表2和图2。

表2各试验组大鼠鼻腔给药后各时间点脑组织中绿原酸含量结果

5、小结

血脑屏障透过率试验结果显示，短时间内气雾剂血脑屏障透过率最高，其次为鼻粉剂，绿原酸原料药透过率较低，说明鼻粉剂和气雾剂处方有助于绿原酸透过血脑屏障，其中以气雾剂为最佳，说明鼻粉剂和气雾剂在脑颅相关疾病治疗方面具有较高的临床价值。

试验例3大鼠鼻腔给药与腹腔注射给药对脑胶质瘤抑制效果对比试验考察

1、材料及方法

1.1药品

1.1.1鼻腔给药受试药物：(1)绿原酸原料药；(2)实施例1鼻粉剂；(3)实施例5鼻粉剂；(4)实施例6气雾剂；(5)实施例7气雾剂；

1.1.2腹腔注射给药受试药物：注射用绿原酸

1.1.3阳性对照药：替莫唑胺

1.2动物

sd大鼠，40只，雌雄各半，体重180-220g。

1.3细胞株

大鼠c6胶质瘤细胞

2试验方案

2.1细胞培养

大鼠c6胶质瘤细胞培养于10％小牛血清dmem完全培养液中，单层培养法传代培养生长至所需的细胞数，在接种前再传代1次。取对数生长期细胞，用胰酶消化，离心，用hanks液制成1×10^4/10μl细胞悬液，置于4℃冰箱中待接种。

2.2接种建模

以10％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，剪去大鼠头顶部毛发，碘酒消毒，剪开头皮暴露颅骨，用电子牙科钻于冠状缝后1mm、矢状缝右3mm处开颅，注射c6细胞悬液10μl，骨蜡封闭骨孔，线缝合切口。接种肿瘤后5d大鼠采用影像检查，挑选出成瘤大鼠。

2.3动物给药

将成瘤大鼠，随机分成8组，每组5只，分别为鼻腔给药的绿原酸原料药组、实施例1鼻粉剂组、实施例5鼻粉剂组、实施例6气雾剂组、实施例7气雾剂组；腹腔注射的注射用绿原酸组，替莫唑胺阳性对照药物组，空白组。鼻腔给药的各受试药物组每天按20mg/kg绿原酸剂量鼻腔给予各受试药物；腹腔注射给药的注射用绿原酸组每天按20mg/kg绿原酸剂量给药；替莫唑胺阳性对照组每天按25mg/kg剂量灌胃给药。各试验组于接种肿瘤后第6天开始给药，连续给药20天，并于第21天各药物组与空白组影像检查肿瘤大小。

3统计处理

用spss软件进行t检验、方差分析和多重比较检验。实验数据均以均数±标准差表示，p<0.05为差异具有统计学意义。

4试验结果

采用用后处理平台在3dfspgr序列上测量肿瘤体积，并计算抑瘤率，结果见表3。

表3各药物组对大鼠脑胶质瘤抑瘤率结果

注：#表示与空白组有显著性差异(p<0.05)。

5小结

试验结果显示，鼻腔给药的鼻粉剂和气雾剂处方组抑瘤率均在50％以上，优于替莫唑胺阳性对照组，与空白组相比，具有显著差异性(p<0.05)，绿原酸原料药组无统计学意义(p>0.05)。

腹腔注射给药的注射用绿原酸组，略优于替莫唑胺阳性对照组，与空白组相比，具有显著差异性(p<0.05)。

鼻腔给药的鼻粉剂和气雾剂处方组的抑瘤率高于腹腔注射给药的注射用绿原酸组抑瘤率，说明给予同等剂量绿原酸的鼻腔给药的鼻粉剂和气雾剂处方组对大鼠c6胶质瘤细胞的抑瘤效果比腹腔注射给药抑瘤效果好，说明通过鼻腔给予绿原酸鼻粉剂和气雾剂治疗脑胶质瘤具有良好的临床应用前景。

试验例4大鼠鼻腔给药与腹腔注射给药对对鼻咽癌抑制效果试验考察

1、材料及方法

1.1药品

1.1.1鼻腔给药受试药物：(1)绿原酸原料药；(2)实施例1鼻粉剂；(3)实施例5鼻粉剂；(4)实施例6气雾剂；(5)实施例7气雾剂；

1.1.2腹腔注射给药受试药物：注射用绿原酸

1.1.3阳性药物：维甲酸

1.2动物

sd大鼠，40只，雌雄各半，体重180-200g。

1.3试验方案

2.1诱癌促癌

将sd大鼠，随机分成8组，每组5只，分别为鼻腔给药的绿原酸原料药组、实施例1鼻粉剂组、实施例5鼻粉剂组、实施例6气雾剂组、实施例7气雾剂组，腹腔注射给药的注射用绿原酸组，阳性药物组和空白组。其中各鼻腔给药受试药物组每天按20mg/kg绿原酸剂量鼻腔给药，一天一次；腹腔注射给药的注射用绿原酸组每天按20mg/kg绿原酸剂量给药，，一天一次；维甲酸阳性药物组每天灌胃给药90mg/kg，，一天一次。各试验组大鼠均给二亚硝基哌嗪和波佛二酯促癌，每周2次腋下注射二亚硝基哌嗪40mg/kg诱发癌变，共计15周，第二周后注射波佛二酯50ng/只，2次/周，共计15周，于第20周处死大鼠，解剖鼻炎组织，观察组织病理学并检测端粒酶。

2.2组织病理形态观察

大鼠鼻咽组织经10％甲醛固定，jenkin’s液脱钙，再中性福尔马林固定，石蜡包埋制成连续切片，苏木素伊红染色，显微镜下观察。

2.3端粒酶检测

称取鼻咽组织匀浆，离心，取上清液，按照telomeraseelisa-pcr试剂盒说明书试验操作(上海宝灵曼公司)，获取pcr反应产物后，定量检测端粒酶活性，浓缩并于聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色。

3、统计处理

实验数据以均数±标准差表示，t检验。

4、试验结果

(1)石蜡镜检结果显示，空白组大鼠鼻咽组织有2只上皮内有上皮癌细胞，基底膜完整，判断为原位癌，另3只上皮细胞数量、层面增加，细胞形态排列不规整，核深染，多个核，判断为异型增生。阳性对照组有1只上皮内局部细胞数量增加，层次增多，细胞形态正常，无核异质细胞，判断为单纯性增生；另4只上皮细胞3-5层，细胞排列整齐，大小一致，判断为正常性组织。鼻腔给药受试药物中绿原酸原料药试验组有3只为异型增生，另2只中其中一只为单纯性增生，另一只为正常性组织。鼻粉剂处方和气雾剂处方各试验组，除实施例5鼻粉剂组和实施例6气雾剂组各有1只为单纯性增生，其他均未正常性组织。腹腔注射给药组，1只为异型增生，2只为单纯性增生，另一只为正常性组织。具体见表4。

表4鼻咽组织石蜡镜检结果表

(2)端粒酶检测结果显示，鼻粉剂和气雾剂处方端粒酶活性较低(0.21±0.09)，与维甲酸阳性对照组端粒酶活性(0.22±0.12)基本一致(p>0.05)；与绿原酸原料药组(0.56±0.17)、腹腔注射给药组(0.41±0.58)以及空白组(0.86±0.21)有显著差异(p<0.05)。

5、小结

鼻腔给药鼻粉剂和气雾剂处方组，能有效阻断大鼠鼻咽癌变的进程，与绿原酸原料药组有显著差异性，且优于腹腔注射给药，药效作用与维甲酸阳性对照药基本一致，结果说明本发明鼻粉剂和气雾剂能够有效提高绿原酸在鼻腔给药的生物利用度，在治疗鼻咽癌方面具有更显著的效果，可作为临床用药。

综上，本发明绿原酸鼻腔给药制剂，能够提高绿原酸鼻腔给药的生物利用度，透过血脑屏障，对脑部肿瘤及鼻咽癌具有显著抑制作用，具备临床推广应用价值。