本发明属于干细胞
技术领域：
，具体涉及一种人源间充质干细胞因子及其制备方法和用途，特别是涉及一种由脐带间充质干细胞制备干细胞活性因子的方法，尤其是涉及使用脐带间充质干细胞源活性因子制备的面膜贴敷料，还涉及该类面膜贴敷料的制备方法。本发明方法制备的面膜贴敷料呈现优良的性能。
背景技术：
：近年来，随着对间充质干细胞研究的不断深入，其分泌因子已成为研究者们的热点。间充质干细胞可以分泌多种具有生物活性的细胞因子，这些细胞因子可有效地调控机体细胞信号传导、活化人体干细胞，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞。干细胞在美容中的应用，最早是干细胞在整形外科中的运用，它是目前研究较多的一种干细胞美容技术。而在整形外科中应用得较多的干细胞种类主要亦是人脐带间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞等。传统上所谓的干细胞美容术，一般都是直接注射干细胞针剂。而这种注射用干细胞的来源主要是从流产的胚胎中提取的，所以难免会引起免疫排斥反应，而且存在一定的论理问题。即使是采用自体干细胞，如人脂肪间充质干细胞，但是在干细胞的培养扩增过程中亦难免会引入外源性的蛋白(例如胎牛血清)，容易引起免疫排斥反应。所以，科学家们最近提出一种新的干细胞应用方法，即细胞培养上清活性因子及细胞裂解液的应用。将细胞活性因子添加到美容化妆品，不仅具有一般化妆品的保湿美白功效，还能够修复受损皮肤，消除皮肤皱纹，收缩毛孔，改善面色等，越来越受到人们的关注。含细胞活性因子的化妆品现已在多个国家上市，尤其是在以美容整形行业最为发达的韩国，细胞因子化妆品尤为甚行。我国亦有多家规模较大的干细胞公司开发出了细胞因子化妆品。但市面上的细胞因子化妆品一般采用干细胞培养上清液直接掺入或经冻干后掺入化妆品基质的方式制造，细胞因子含量较低，且含有大量糖分等其它杂质，使用这些化妆品后反而会造成皮肤干燥等不适感。研究表明细胞培养上清液含有各种具有生物活性的细胞因子，它的应用可以避免干细胞美容时的产生的免疫排斥反应。但是，液态的培养上清在常温保存时间短，这就阻碍了它的推广和应用。另外，针对目前的干细胞分选技术，比较常见是的磁珠分选，但常规的分选中，磁珠会随同干细胞一同进行后续的培养，即磁珠并没有从干细胞上脱离下来，这样对于干细胞的后期生产，必定会产生一定的影响，虽然有一些方法，如加入一些细菌或者其他物质进行降解，但这样也相当于加入了其他的外源蛋白质等成分，造成对干细胞的二次污染，所以实际上并没有解决上述问题。间充质干细胞在培养过程中会分泌大量的细胞因子，这些细胞因子能够深入肌肤基底，促进肌肤细胞组织的分化；促进受损肌肤组织的结构重建以及再生修复，促进老化细胞的脱落以及细胞的新生等；修复皮肤纤维组织，促进皮下胶原蛋白的分泌与合成，还可以促进皮下血管新生成，分泌蛋白质，促进受损肌肤深层细胞组织愈合，淡化疤痕和痘印等。在现有皮肤修复产品中，大多数产品都是以液体的形式存在，需要添加防腐剂来防止产品变质，但防腐剂往往具有一定的刺激性，长期使用含有防腐剂的护肤品，可能使皮肤容易老化、抗氧化能力降低等，甚至可能导致过敏。液体产品制作过程繁杂时长久，以液体状态保存，会导致活性成分会逐渐流失。将面膜贴敷料以生物休眠冻干技术“瞬时锁活”，有效锁住活性因子，让贴敷料中的有效活性物以最佳最天然的状态滋养肌肤，真正做到无防腐剂。面膜贴敷料以冷冻干燥的状态保存，使用时加水即能瞬间溶解，赋活休眠中的活性因子，恢复活性物中的有效活性。因此，以面膜贴敷料的形式制备包含细胞活性因子产品，用于皮肤护理具有诸多益处。cn108969466a(申请号：201811186341.7，西凯生物)公开了一种基于脐带间充质干细胞分泌活性因子的驻颜面膜及其制备方法，其制备步骤包括，1)选取产房中剥离新生胎儿后的脐带组织放入脐带运输液，且经4℃环境下36小时内冷藏后提取脐带组织间充质干细胞进行培养；2)选取截留量为3500d的透析袋在透析袋置内对培养的脐带间充质干细胞进行透析处理，后利用透析脱水剂进行脱水处理；3)经过透析处理的脐带间充质干细胞预冻后通过冻干机制备成冻干粉；4)用适量的透明质酸和面膜液溶解冻干粉形成驻颜面膜。据信该发明利用新生胎儿脐带组织进行干细胞培养，提取高能度复合细胞生长因子，采用先进的冷冻干燥技术制备成冻干粉，结合保湿锁水的透明质酸和甘油作用于皮肤，优化肌肤质量，抵抗肌肤衰老，达到美容养颜的作用。cn107137340a(申请号：201710351296.5，普瑞赛尔)公开了一种含高浓度人间充质干细胞分泌活性因子的修复面膜及其制备方法，人间充质干细胞在培养过程中会分泌多种大量的细胞因子，这些细胞因子能够深入皮肤基底层促进皮肤组织分化、血管新生以及肉芽组织的生长，促进损伤皮肤组织的结构重建与再生修复，促进老化细胞的清除以及细胞的新生，防止皮肤水分的流失，从而保持和恢复肌肤的年轻态。相比于传统的面膜，据信基于间充质干细胞分泌的活性因子的修复面膜能够从根本上解决肌肤的老化问题，并且不含有任何化学修复成分，无毒副作用。据信该发明中人间充质干细胞分泌物为重复饥饿培养后提取，含有复方电解质注射液等成份。可用于各种原因引起的皮肤干燥、老化问题的缓解和修复。cn108743448a(申请号：201811000791.2，星空生物)公开了一种生物修复面膜及其制备方法，该生物修复面膜，按照重量份数计，包括如下组分：干细胞活性因子10-15份，鸡胚活性肽10-15份，寡肽-1为1-1.5份，卵磷脂0.6-0.8份，乙基己基甘油0.3-0.6份，生育酚0.5-3份，霍霍巴蜡2-3份，角鲨烷2-5份，水解蚕丝蛋白5-10份，黑桑根提取物3-8份，人参提取物3-6份，熊果苷0.6-0.8份，透明质酸钠交联聚合物0.1-3份，透明质酸钠0.1-3份，乙酰化透明质酸钠0.1-3份，水解透明质酸钠0.1-3份，1,2-戊二醇0.1-0.5份，甘油10-15份，水50-60份。据信该发明的面膜具有舒敏修复功效。本领域仍然期待有新的方法来向皮肤施用干细胞活性因子以期实现修复皮肤的目的。技术实现要素：本发明目的在于提供一种新的方法来向皮肤施用干细胞活性因子以期实现修复皮肤的目的。已经出人意料的发现，使用本发明方法可以实现本发明一个或多个方面的有益效果，尤其是通过使用干细胞活性因子制备用于皮肤修复的干细胞活性因子面膜贴敷料。本发明基于此发现而得以完成。需要说明的是，本发明的干细胞活性因子面膜贴敷料亦可简称为面膜。为此，本发明第一方面提供了一种用于皮肤修复的干细胞活性因子面膜贴敷料，其是通过将水性的面膜液浸渍于医药可接受的无纺布上，再进行冷冻干燥制得的。根据本发明第一方面的用于皮肤修复的干细胞活性因子面膜贴敷料，其中所述面膜液中包含细胞因子以及海藻糖和普鲁兰多糖。以活性因子作为面膜的生物学活性物质，在面膜中添加海藻糖是有益的，原因在于海藻糖具有优异的保持细胞活力和生物大分子活性的特性。另外，由于普鲁兰多糖具有优异的成膜性、阻气性、可塑性、粘性，并且具有易溶于水、无毒无害、无色无味等优良特性，这些性质将赋予用于皮肤修复的面膜贴敷料的优异性能。根据本发明第一方面的用于皮肤修复的干细胞活性因子面膜贴敷料，其中所述面膜液包含如下组分：根据本发明第一方面的用于皮肤修复的干细胞活性因子面膜贴敷料，其中所述面膜液包含如下组分：低级醇3-7重量份，精氨酸/赖氨酸多肽2-4重量份，细胞因子液10-30重量份，海藻糖2-5重量份，海藻酸钠0.25-1重量份，peg-75牛油树脂甘油酯类1-5重量份，玫瑰花水1-5重量份，普鲁兰多糖0.25-1重量份，透明质酸钠0.25-1重量份，水适量至100重量份。根据本发明第一方面的用于皮肤修复的干细胞活性因子面膜贴敷料，其中所述面膜液包含如下组分：根据本发明第一方面的用于皮肤修复的干细胞活性因子面膜贴敷料，其中所述面膜液包含如下组分：低级醇5重量份，精氨酸/赖氨酸多肽2.5重量份，细胞因子液15重量份，海藻糖4重量份，海藻酸钠0.75重量份，peg-75牛油树脂甘油酯类2重量份，玫瑰花水2重量份，普鲁兰多糖0.75重量份，透明质酸钠0.75重量份，水适量至100重量份。根据本发明第一方面的用于皮肤修复的干细胞活性因子面膜贴敷料，其中所述低级醇选自甘油、丙二醇、丁二醇。优选的，所述低级醇选自甘油、丙二醇。在本发明中，医药可接受的无纺布可以容易的从市场上购得，是一种无纺布类纤维织物。根据本发明第一方面的用于皮肤修复的干细胞活性因子面膜贴敷料，其是通过包括如下步骤的方法制备得到的：(a)将透明质酸钠、海藻酸钠和低级醇混合均匀，加入约为透明质酸钠10倍重量的70～80℃热水，搅拌使溶解，降温至30～35℃；(b)向上一步骤所得液体中添加海藻糖、玫瑰花水、精氨酸/赖氨酸多肽、peg-75牛油树脂甘油酯类、细胞因子液、普鲁兰多糖，搅拌使溶解，得面膜液；(c)使面膜液浸润于无纺布上，再将浸润面膜液的无纺布置冷冻干燥机中，进行冷冻干燥以除去水分(例如，至水分含量小于8％，优选小于5％)；(d)使冷冻干燥的面膜折叠，并密封包装(例如包装于密封袋、密封玻璃瓶、密封塑料瓶中)，即得。根据本发明第一方面的用于皮肤修复的干细胞活性因子面膜贴敷料，其中步骤(3)使面膜液浸润于无纺布上时，每500平方厘米面积的无纺布上浸润所述面膜液2～20g，例如是2～15g，例如是3～10g。根据本发明第一方面的用于皮肤修复的干细胞活性因子面膜贴敷料，其中步骤(c)照如下程序进行冷冻干燥：(i)预冷冻：在-30℃至-40℃下将面膜冷冻，维持3～5小时；(ii)主干燥：预抽真空至18pa，搁板升温至-15℃至-20℃保持10～20小时；(iii)主干燥：继续升温至-2℃至4℃保持2～4小时进一步干燥；(iv)解析干燥：缓慢升温至30℃至35℃，再保持2～5小时使水分达到要求。根据本发明第一方面的用于皮肤修复的干细胞活性因子面膜贴敷料，其中所述细胞因子液中包含20～200pg/ml的egf，例如包含30～150pg/ml的egf，例如包含40～100pg/ml的egf。根据本发明第一方面的用于皮肤修复的干细胞活性因子面膜贴敷料，其中所述细胞因子液中还任选的包含fgf、vegf、il-6之一或者多种。根据本发明第一方面的用于皮肤修复的干细胞活性因子面膜贴敷料，其中所述细胞因子液是从脐带源间充质干细胞制备获得的。根据本发明第一方面的用于皮肤修复的干细胞活性因子面膜贴敷料，其中所述细胞因子液是照包括如下步骤的方法制备得到的：(1)脐带源间充质干细胞获取：取健康足月剖宫产孕妇脐带，通过分离华通氏胶(wharton'sjelly)法，使用华通氏胶悬浮法制备；将华通氏胶放于t75培养瓶，加入适量间充质干细胞(msc)无血清培养基，置于37℃，5％的co2培养箱内培养，培养7天以后出现细胞集落；约10-13天细胞达到饱和，可进行传代；细胞呈长梭形，是典型的成纤维细胞样形态；(2)细胞扩增：当细胞融合度达70-80％时，用生理盐水轻轻冲洗培养瓶细胞1-2次，添加3-5ml消化液，室温放置1-2分钟，镜下观察细胞接近球形，轻轻拍打瓶壁，中止消化，转移至离心管混匀，取样计数，按照8000个细胞/cm2进行传代，2-3天细胞密度达70-80％时，反复以上操作，以获得足够量的msc，一般采用p3-p5代细胞制备；(3)细胞鉴定检测：细胞活率达90％以上时，流式检测标志物合格；(4)干细胞活性因子的制备：4i)细胞培养至最旺盛时，收集上清至离心管，0.22μm滤膜过滤上清除菌；4ii)用生理盐水清洗2-3次培养瓶，弃去，然后采用细胞饥饿法加入10ml生理盐水/t225培养瓶继续培养12-24小时，待细胞变圆，吹打混匀后移至离心管，采用超声破碎仪破碎细胞后离心1400rpm，离心5min，收集的上清，经0.22μm滤膜过滤除菌；4iii)将步骤4i)和4ii)的上清混合，采用截留分子量为10kd的纯化超滤系统浓缩，即得干细胞活性因子浓缩液(其在本发明中亦可称为浓缩的干细胞活性因子液、细胞因子液、活性因子液等)。根据本发明第一方面的用于皮肤修复的干细胞活性因子面膜贴敷料，其中制备细胞因子液时，步骤(2)中所述消化液是0.25％胰酶。根据本发明第一方面的用于皮肤修复的干细胞活性因子面膜贴敷料，其中制备细胞因子液时，步骤(3)中所述流式检测标志物为：cd73、cd90、cd105表达阳性，hla-dr、cd11b、cd19、cd34、cd45表达阴性。根据本发明第一方面的用于皮肤修复的干细胞活性因子面膜贴敷料，其中制备细胞因子液时，步骤(3)中所述流式检测标志物结果中显示细胞具有成脂、成骨、成软骨分化潜能。根据本发明第一方面的用于皮肤修复的干细胞活性因子面膜贴敷料，其中制备细胞因子液时，步骤(4)之4i)中细胞培养至最旺盛时是指细胞融合度约70-80％。根据本发明第一方面的用于皮肤修复的干细胞活性因子面膜贴敷料，其中制备细胞因子液时，步骤(4)之4ii)中采用超声破碎仪破碎细胞时，其程序为：4℃，500w，超声2秒，间隔8秒，86个循环。根据本发明第一方面的用于皮肤修复的干细胞活性因子面膜贴敷料，其中制备细胞因子液时，还进一步包括步骤(5)，即对步骤(4)所得干细胞活性因子浓缩液进行干细胞活性因子检测的操作，具体如下：取干细胞活性因子浓缩液3ml，采用重组人源抗体包被的酶联免疫试剂盒(例如，本发明亦采用，r&d公司提供的商品化试剂盒)测定干细胞活性因子的含量。根据本发明第一方面的用于皮肤修复的干细胞活性因子面膜贴敷料，其中制备细胞因子液时，在步骤4ii)中，还向所述生理盐水中添加0.1～0.2mmol/l浓度的枸橼酸钠。如前文所述的，海藻糖和普鲁兰多糖能够在本发明的面膜贴敷料中发挥相辅相成的效果，然而，令人遗憾的是，同时包含海藻糖和普鲁兰多糖的面膜液浸润于无纺布上进行冷冻干燥后，无纺布表面的膜层会出现诸多破裂泡点，通过观察浸润面膜液的无纺布在冻干机内的冻干过程，发现这些破裂泡点出现的原因是，在冻干过程中(预抽真空至18pa且搁板升温至-15℃至-20℃期间)浸润面膜液的无纺布表面会鼓泡，随着冻干过程的继续，这些鼓泡通常会在-2℃至4℃干燥阶段破裂，从而形成破裂泡点。另外还发现，当面膜液中仅添加海藻糖和普鲁兰多糖之一或者二者均不添加时，并不会出现此类破裂泡点，这表明海藻糖和普鲁兰多糖二者同时用于本发明面膜时会出现禁忌。已经出人意料地发现，当在步骤(b)配制面膜液过程中随其它物料一起还添加规定量的丝氨酸(在本发明中提及的丝氨酸均是l-丝氨酸)和氯化钠时(丝氨酸在面膜液中的浓度为0.2～0.5％，氯化钠在面膜液中的浓度为0.01～0.02％)，可以避免出现破裂泡点。这表明，向面膜中同时添加丝氨酸和氯化钠可以克服海藻糖和普鲁兰多糖二者共用时出现的禁忌。因此，在本发明的一个实施方案中，所述面膜液中还包含0.2～0.5％丝氨酸和0.01～0.02％氯化钠。在本发明的一个实施方案中，所述面膜液中还包含0.4％丝氨酸和0.015％氯化钠。在本发明的另一个实施方案中，所述丝氨酸和氯化钠是随海藻糖一起添加到面膜液中的。需要说明的是，本发明细胞因子液可以参照cn106381284a(中国专利申请号2016108190874)中记载的方法来制备，当然，细胞因子液还可以采用其它方法尤其是本领域已知的方法来制备。本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。本发明所得干细胞活性因子可直接用于美容护肤方面，包括美容、祛斑、修复疤痕等，特别地，可以采用本发明所述干细胞活性因子面膜贴敷料的形式使用。海藻糖是一种安全、可靠的天然糖类。海藻糖是由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，有3种异构体即海藻糖(α，α)、异海藻糖(β，β)和新海藻糖(α，β)，并对多种生物活性物质具有非特异性保护作用。海藻糖在自然界中许多可食用动植物及微生物体内都广泛存在，如人们日常生活中食用的蘑菇类、海藻类、豆类、虾、面包、啤酒及酵母发酵食品中都有含量较高的海藻糖。海藻糖对生物体具有神奇的保护作用，是因为海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。许多对外界恶劣环境表现出非凡抗逆耐受力的物种，都与它们体内存在大量的海藻糖有直接的关系。而自然界中如蔗糖、葡萄糖等其它糖类，均不具备这一功能。这一独特的功能特性，使得海藻糖除了可以作为蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品的优良活性保护剂以外，还是保持细胞活性、保湿类化妆品的重要成分，更可作为防止食品劣化、保持食品新鲜风味、提升食品品质的独特食品配料，大大拓展了海藻糖作为天然食用甜味糖的功能。目前使用的商品海藻糖，有含有二分子结晶水的结晶海藻糖和不含结晶水的无水海藻糖。其具有的理化性质如下：(1)密度：结晶海藻糖1,512g/cm。(2)熔点：结晶海藻糖于130℃失水；无水海藻糖210.5℃。(3)溶解热：结晶海藻糖57.8kj/mol，无水海藻糖53.4kj/mol。(4)甜度：相当于蔗糖的45％，是一种甜味柔和的优质糖质。其温和的甜味比砂糖更为持久，可改善高砂糖含量食品的甜腻感，与其他的甜味料配合，能将食品素材特有的味感提升出来。(5)溶解性、晶体析出性：海藻糖易溶于水、热乙醇、冰醋酸，不溶于乙醚、丙酮。海藻糖在水中的溶解度随温度变化较为明显。低温时在水中的溶解度比砂糖低，与麦芽糖相同。此外，海藻糖易于结晶，结晶性能良好。(6)高玻璃化转变温度：海藻糖具有双糖中最高的玻璃化转变温度，高达115℃，因而把海藻糖加入到其他的食品中时，能有效地提高其玻璃化转变温度，更容易形成玻璃化状态，可以发挥保持玻璃化，保持新鲜度的作用。(7)低吸湿性和保水性：二水结晶海藻糖在相对湿度92％以下无吸湿性，而无水海藻糖在相对湿度30％以上有吸湿性。这一性质使其既具有低吸湿性。又具有高保湿性功能。(8)耐热、耐酸性：于100℃加热24h海藻糖仍可保存99％以上。这种特殊的分子结构赋予了海藻糖分子极强的稳定性，是天然二糖中最稳定的分子。(9)着色性：海藻糖不会引起美拉德反应。和甘氨酸于100℃反应90min不呈色，和聚蛋白胨120℃反应90min不呈色，有利于保持食品色泽，适合于须加热处理或高温保存的食品、饮料等。与其它糖类一样，海藻糖可广泛应用于食品业，包括饮料、巧克力及糖果、烘烤制品和速冻食品。海藻糖的功能特性及在食品中的应用：(1)防止淀粉老化(2)防止蛋白质变性(3)抑制脂质氧化变质(4)矫味作用(5)保持蔬菜(6)肉类的组织稳定和保鲜作用(7)持久稳定的能量来源。海藻糖在医药工业中的应用：(1)在医学上已经成功地应用海藻糖替代血浆蛋白作为血液制品、疫苗、淋巴细胞、细胞组织等生物活性物质的稳定剂。不仅可以常温条件下干燥存放，更重要的是可以防止因血源污染而引起乙肝、艾滋病等致命疾病的传播，世界卫生组织对此十分重视。(2)英国剑桥的quadrant研究基金会将小儿麻痹症疫苗与海藻糖混合冻干后，发现在干燥状态下45℃时其稳定性和液态4℃保存条件时相当。这项目研究成功，将大大减化疫苗处理工序，降低疫苗的贮存及运输成本，且保证了长距离运输疫苗仍可保持相当高的活性，这将会大大有助于世界卫生组织实现在最大范围内消灭小儿麻痹症的目标。(3)美国加利福尼亚大学的约翰·克劳及其同事将海藻糖与制造血小板的细胞混合，经干燥脱水使细胞变干后，将其冻干在室温下可长时间保存。实践证明，加入海藻糖并经长时间保存的血小板在水化后仍有85％存活，存活率比大多数血库短期保存的血小板还高。(4)海藻糖可应用于研究用生物试剂的保存，例如各种工具酶、细胞膜、细胞器、抗体、抗原及病毒等等，使得生命科学研究更为方便快捷有效，英国大学camilo.c等详细的研究了海藻糖对dna限制性内切酶dna连接酶和dna聚合酶的保护作用，结果表明，所有加入海藻糖干燥的酶样，在70℃保存35天或在37℃保存9个月后，其活力并无损失，仍能精确的将dna截断。我国中科院微生物研究所应用海藻糖干燥制备、用于人血清胆固醇测定的三种诊断工具酶，在室温下长期保存后，活性保持率都在90％以上，现已成功的进入于临床应用。这是其它种类的保护剂都不可能达到的效果，利用海藻糖作为诊断工具酶等生物试剂的稳定剂和保护剂，可置于常温条件下干燥并保存，不仅简化了生物试剂的制备过程，也给我国幅员广大的农村地区患者的疾病诊治带来便利。(5)双歧杆菌是肠道中用于改善人体微生态平衡的细菌，双歧杆菌活菌制剂作为防病治病的有力武器，在欧美日本等发达国家备受欢迎。在我国，双歧杆菌活菌制剂已逐步成为制药行业的一支生力军。由于双歧杆菌是一种对生存条件要求极为苛刻的厌氧菌，外界环境稍有变化就易引起该菌的死亡，因此，如何提高双歧杆菌的存活率，保证产品的货架寿命，一直是困扰活菌制剂行业的技术难题。2012年来普遍是采用脱脂牛奶作冻干保护剂，但效果不甚理想，在储存过程中，细菌的存活率下降很快。2012的研究结果表明，采用海藻糖作保护剂，双歧杆菌的存活率比脱脂牛奶提高一倍以上，特别令人振奋的是，海藻糖能够使冻干双歧杆菌在常温下长期保持活性，大幅度延长活菌制剂的保质期。从而可以解决活菌制剂行业所面临的产品储存性能差，货架寿命短的问题。海藻糖在化妆品中的应用主要有如下方面，海藻糖在化妆品上的应用是基于其具有优异的保持细胞活力和生物大分子活性的特性。皮肤细胞，尤其是表皮细胞在高温、高寒、干燥、强紫外线辐射等环境下，极易失去水分发生角质化，甚至死亡脱落使皮肤受损。海藻糖在这种情况下能够在细胞表层形成一层特殊的保护膜，从膜上析出的粘液不仅滋润着皮肤细胞，还具有将外来的热量辐射出去的功能。从而保护皮肤不致受损。随着人们对海藻糖功能和作用的认识，海藻糖作为新一代的超级保湿因子将成为化妆品市场消费的一个热点。海藻糖是一种超级防晒保湿因子。海藻糖是一种天然的糖类，存在于许多沙漠植物中，在植物干枯时形成一层玻璃状的基质，保护其内部结构，直至雨水来到，植物可奇迹般地起“死”而复生。大量的研究与实践表明，海藻糖能有效地保护表皮细胞膜结构，活化细胞，调理肌肤，令肌肤健康自然、有弹性。表皮细胞在高温、高寒、干燥、强紫外线辐射等环境下，极易失去水分而使皮肤受损，海藻糖在这种情况下能够在细胞表层形成一层特殊的保护膜，保持皮肤原有营养和水分，避免皮肤晒伤及黑色素沉淀，有效抵抗皮肤老化现象；从膜上析出的粘液可温和滋润肌肤，使肌肤莹亮、光泽、柔嫩。另外，特别是来自深海海藻因为其独特的生长环境，提取的海藻糖，保湿效果显著。海藻糖是生物酶制剂反应中的激活剂与稳定剂。温度是影响酶反应效率的重点因素之一，高温能提高酶的催化活力，但易使酶失活。耐热酶的发现为分子生物学带来巨大的进步，如pcr和连接酶链式反应的产生，目前局限于从一些耐热菌中分离得到耐热酶，而且酶催化反应类型也受到限制。研究发现海藻糖在高温下能保持酶的正常活性，甚至起热激活作用，还能用于提高干燥保存的酶的活性。在反应体系中加入海藻糖，使热敏感的酶在高温下稳定性和活性增加，可当作耐热酶使用，海藻糖的这一作用在生物药学和工业生产领域具有广泛的应用价值。未加海藻糖的限制性内切酶nocl在温度由45℃升到50℃时失活，加了海藻糖时酶不但不失活而且活力继续升高，说明海藻糖能抑制高温下酶的失活；37℃时海藻糖能够激活dnasel，加了海藻糖，温度升到50℃时酶活力仍显著升高；猪的胰脂肪酶在无水海藻糖介质中可以耐受100℃高温，有水时则会失活。有实验表明海藻糖通过影响蛋白水合作用来稳定和激活蛋白，它可以降低溶液中蛋白质的水化作用，干燥时则能取代水或作为玻璃样稳定剂。海藻糖能阻止酶发生不可逆的热凝聚-热变性，与分子伴侣的功能相类似，实验中将一些分子伴侣与海藻糖共同使用，能进一步扩大对酶具有热稳定和热激活作用的温度范围。另外海藻糖并不是对检测的所有酶都有热稳定和热激活的作用，说明只有一些蛋白可能具有海藻糖识别和作用的位点。获得全长cdna文库，有利于分子克隆和全长cdna测序，反转录反应是构建cdna文库的重要反应，mrna的二级结构能够终止反转录反应，释放mrna/非互补cdna杂合体，导致合成全长cdna效率很低，这是构建高质量的cdna文库最主要的问题。以前解决这一问题主要是在反应前使样品变性，如热变性、加氢氧化甲基汞处理mrna等或者反应中提高反应温度。前一类方法对破坏mrna二级结构效果不佳，特别是从长转录产物获得全长的cdna，而后者虽然对破坏mrna二级结构比较有用，但除了tchdna聚合酶外，其它反转录酶者不耐热，而tchdna聚合酶催化反应需mn2+，这容易造成mrna在反应前就降解了。实验证明海藻糖能使鼠白血病病毒逆转录酶具有热稳定和热激活特性，酶在60℃仍具有全部活性，足以在mrna二级结构诱导终止反应之前合成全长的cdna，反应效率大大提高。另外推测海藻糖可能具有改变核酸构型的作用，例如减少反转录反应中mrna的二级结构。生产中利用海藻糖热稳定和热激活的双重功能，可以减少酶的用量和提高反应速率，提高消耗/产出和时间/产出比值，在一系列酶反应中都有很大潜力，如生化反应、诊断或工业生产领域，更重要的是热激活能用于提高反应程度和总效率，获得标准反应条件下不可能的产量。另外，利用热稳定和热激活的作用，可开发以前在常规反应条件下不可能进行的反应，例如专一性要求特别高的核酸杂交实验，反应体系加入海藻糖，就可在适宜的温度下同时使用几种限制/修饰酶，提高杂交反应特异性，减少假阳性结果。海藻酸钠是从褐藻类的海带或马尾藻中提取碘和甘露醇之后的副产物，其分子由β-d-甘露糖醛酸(β-d-mannuronic，m)和α-l-古洛糖醛酸(α-l-guluronic，g)按(1→4)键连接而成。海藻酸钠的水溶液具有较高的黏度，已被用作食品的增稠剂、稳定剂、乳化剂等。海藻酸钠是无毒食品，早在1938年就已被收入美国药典。海藻酸钠含有大量的—coo－，在水溶液中可表现出聚阴离子行为，具有一定的黏附性，可用作治疗黏膜组织的药物载体。在酸性条件下，—coo－转变成—cooh，电离度降低，海藻酸钠的亲水性降低，分子链收缩，ph值增加时，—cooh基团不断地解离，海藻酸钠的亲水性增加，分子链伸展。因此，海藻酸钠具有明显的ph敏感性。海藻酸钠可以在极其温和的条件下快速形成凝胶，当有ca2+、sr2+等阳离子存在时，g单元上的na+与二价阳离子发生离子交换反应，g单元堆积形成交联网络结构，从而形成水凝胶。海藻酸钠形成凝胶的条件温和，这可以避免敏感性药物、蛋白质、细胞和酶等活性物质的失活。由于这些优良的特性，海藻酸钠已经在食品工业和医药领域得到了广泛应用。海藻酸钠为白色或淡黄色粉末，几乎无臭无味。海藻酸钠溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。溶于水成粘稠状液体，1％水溶液ph值为6-8。当ph＝6-9时粘性稳定，加热至80℃以上时则粘性降低。海藻酸钠无毒，ld50>5000mg/kg。螯合剂对海藻酸钠溶液性质的影响螯合剂可以络合体系中的二价离子，使得海藻酸钠能稳定于体系中。海藻酸钠微溶于水，不溶于大部分有机溶剂。它溶于碱性溶液，使溶液具有粘性。海藻酸钠粉末遇水变湿，微粒的水合作用使其表面具有粘性。然后微粒迅速粘合在一起形成团块，团块很缓慢的完全水化并溶解。如果水中含有其它与海藻酸盐竞争水合的化合物，则海藻酸钠更难溶解于水中。水中的糖、淀粉或蛋白质会降低海藻酸钠的水合速率，混合时间有必要延长。单价阳离子的盐(如nacl)在浓度高于0.5％时也会有类似的作用。海藻酸钠在1％的蒸馏水溶液中的ph值约为7.2。海藻酸钠具有吸湿性，平衡时所含水分的多少取决于相对湿度。干燥的海藻酸钠在密封良好的容器内于25℃及以下温度储存相当稳定。海藻酸钠溶液在ph5～9时稳定。聚合度和分子量与海藻酸钠溶液的粘性直接相关，储藏时粘性的降低可用来估量海藻酸钠去聚合的程度。高聚合度的海藻酸钠稳定性不及低聚合度的海藻酸钠。据报道海藻酸钠可经质子催化水解，该水解取决于时间、ph和温度。藻酸丙二醇酯溶液在室温下、ph3～4时稳定；ph小于2或大于6时，即使在室温下粘性也会很快降低。海藻酸钠作为饮料和乳品的增稠剂，在增稠方面有独特的优势：海藻酸钠良好的流动性，使得添加后的饮品口感柔滑；并且可以防止产品消毒过程中的黏度下降现象。在利用海藻酸钠作为增稠剂时，应尽量使用分子量较大的产品，适量添加ca。可以大大提高海藻酸钠的黏度。海藻酸钠是冰激凌等冷饮的高档稳定剂，它可使冰淇淋等冷饮食品产生平滑的外观、柔滑的口感。由于海藻酸钙可形成稳定热不可逆凝胶，因而在运输、储藏过程中不会变粗糙(冰晶生长)，不会发生由于温度波动而引起的冰淇淋变形现象；同时这种冰淇淋食用时无异味，既提高了膨胀率又提高了融点，使得产品的质量和效益都有显著提高。海藻酸钠作为乳制品及饮料的稳定剂，稳定的冰冻牛乳具有良好的口感，无粘感和僵硬感，在搅拌时有粘性，并有迟滞感。1、在食品上的应用，海藻酸钠用以代替淀粉、明胶作冰淇淋的稳定剂，可控制冰晶的形成，改善冰淇淋口感，也可稳定糖水冰糕、冰果子露、冰冻牛奶等混合饮料。许多乳制品，如精制奶酪、掼奶油、干乳酪等利用海藻酸钠的稳定作用可防止食品与包装物的连粘性，可作为上乳制饰品覆盖物，可使其稳定不变并防止糖霜酥皮开裂。海藻酸钠用于色拉(一种凉拌菜)调味汁，布丁(一种甜点心)、果酱、番茄酱及罐装制品的增稠剂，以提高制品的稳定性质，减少液体渗出。在挂面、粉丝、米粉制作中添加海藻酸钠可改善制品组织的粘结性，使其拉力强、弯曲度大、减少断头率，特别是对面粉含量较低面筋，效果更为明显。在面包、糕点等制品中添加海藻酸钠，可改善制品内部组织的均一性和持水作用，延长贮藏时间。在冷冻甜食制品中添加可提供热聚变保护层，改进香味逸散，提高熔点的性能。海藻酸钠可做成各种凝胶食品，保持良好的胶体形态，不发生渗液或收缩，适合用于冷冻食品和人造仿型食品。还可用来覆盖水果、肉、禽类和水产品作为保护层，与空气不直接接触，延长贮藏时间。还可作为面包的糖衣、加馅填料、点心的涂盖层、罐头食品等自凝形成剂。在高温、冷冻和酸性介质中仍可维持原有的形体。还可代替琼胶制成具有弹性，不粘牙，透明的水晶软糖。2、在药物制剂上的应用，海藻酸钠早在1938就已收入美国药典。海藻酸在1963年收入英国药典。海藻酸不溶于水，但放入水中会膨胀。因此，传统上，海藻酸钠用作片剂的粘合剂，而海藻酸用作速释片的崩解剂。然而，海藻酸钠对片剂性质的影响取决于处方中放入的量，并且在有些情况下，海藻酸钠可促进片剂的崩解。海藻酸钠可以在制粒的过程中加入，而不是在制粒后以粉末的形式加入，这样制作过程更简单。与使用淀粉相比，所制的成片机械强度更大。海藻酸钠也用于悬浮液、凝胶和以脂肪和油类为基质的浓缩乳剂的生产中。海藻酸钠用于一些液体药物中，可增强粘性，改善固体的悬浮。藻酸丙二醇酯可改善乳剂的稳定性。3、印纺工业的应用，海藻酸钠在印染工业中用作活性染料色浆，优于粮食淀粉和其它浆料。印出的纺织品花纹鲜艳，线条清晰，给色量高，得色均匀，渗透性与可塑性均良好。海藻胶是现代印染业的最佳浆料，现已广泛应用于棉、毛、丝、尼龙等各种织品的印花，特别适用于配制拨染印花浆。中国纺织部门以海藻胶与淀粉混合或代替淀粉配制经纱浆料，不仅可以节约大量粮食，而且能使经纱的纤维不起毛，耐摩擦，断头率少，从而提高织布效率。海藻胶对棉纤维和合成纤维均有效。4、在医药行业的应用，以海藻酸硫酸酯分散剂制成的ps型胃肠双重造影硫酸钡制剂，具有粘度低，粒度细，附壁性好，性能稳定等特点。pss是以海藻酸为原料研制的一种褐藻多糖双酯钠，具有抗凝血、降血脂和降低血液粘度的作用。用海藻胶代替橡胶、石膏作牙科印模料，不仅价格便宜，操作简便，而且印出的齿形更准确。海藻胶还可制作各种剂型的止血剂，包括止血海棉、止血纱布，止血薄膜，烫伤纱布，喷雾止血剂等。peg-75牛油树脂甘油酯类(peg-75sheabutterglycerides，收载于《已使用化妆品原料名称目录(2015版)》中序号：00777)。peg-75牛油树脂甘油酯类(inci名)，一种商用产品为为美国阿胡斯卡尔斯油脂公司aak的lipex102e75100％，在室温下为固态。peg-75牛油树脂甘油酯类是hlb＝16-18的水溶性乳木果油，能加强发泡作用和减少刺激，赋予皮肤滋润感。提高发质的柔软度和调理性。peg-75牛油树脂甘油酯类也可作为精油和香精的增溶剂。peg-75牛油树脂甘油酯类可用于洁面乳，发用品，沐浴产品，护肤等个人护理产品中。玫瑰花水(rosarugosaflowerwater，收载于《已使用化妆品原料名称目录(2015版)》中序号：04634)。玫瑰花水是在蒸馏玫瑰花精油时，馏出的水溶液。该水含有0.02％-0.03％的玫瑰精油及多种玫瑰花中的蛋白质、鞣质、环肽等多种水溶性的有效成分。玫瑰花水的主要功效包括，1、护肤：室内喷洒：作为纯天然空气清新剂，在室内喷几下，可以杀菌、留香，促进皮肤血液循环，增进新陈代谢效果尤佳。补水、保湿、滋润、防皱、保持肌肤柔嫩光泽。适用于中干性、衰老性肌肤，玫瑰花水可以作为保湿爽肤水，亦可以敷脸，保持肌肤弹性与活力的很好选择；2、清新剂：具有舒缓、抚慰、静心和抗发炎的特质，是温和的杀菌剂和收敛剂；3、护发：喷在头发上，保持头发润泽柔顺，使头发飘逸清香。玫瑰花水中含有多种强效保湿因子，能迅速渗透角质层，补充皮肤每天所必须的水分，有效激活细胞活力，促进肌肤新陈代谢，综合调节肤质，使皮肤细腻水嫩有弹性。精氨酸/赖氨酸多肽(arginine/lysinepolypeptide，casno.31014-78-5，收载于《已使用化妆品原料名称目录(2015版)》中序号：03522)。在本发明中，《已使用化妆品原料名称目录(2015版)》例如出自国家食品药品监督管理总局网站http://samr.cfda.gov.cn/ws01/cl1870/140365.html。普鲁兰多糖是一种由出芽短梗霉发酵所产生的类似葡聚糖、黄原胶的胞外水溶性粘质多糖，它是1938年由r.bauer发现的一种特殊的微生物多糖。由于该多糖独特的结构和性质，在医药、食品、石油、化工等行业具有广泛的应用前景。因其在自然界可被微生物降解利用，不会引起环境污染，故被誉为无公害塑料。该多糖是由α-1,4糖苷键连接的麦芽三糖重复单位经α-1,6糖苷键聚合而成的直链状多糖，分子量2万～200万，聚合度100～5000。(一般商品分子量在20万左右，大约由480个麦芽三糖组成)。该多糖有两个重要的特性：结构上富有弹性，溶解度比较大。普鲁兰多糖的成膜性、阻气性、可塑性、粘性均较强，并且具有易溶于水、无毒无害、无色无味等优良特性，已广泛应用于医药、食品、轻工、化工和石油等领域。2006年5月19日，国家卫生部发布了第8号公告，普鲁兰多糖为新增四种食品添加剂产品之一，可在糖果、巧克力包衣、膜片、复合调味科和果蔬汁饮料中用作被膜剂和增稠剂。普鲁兰多糖是一种水溶性粘质多糖，成品为白色固体粉末。由于其具有良好的成膜、成纤维、阻气、粘接、易加工、无毒性等特性，已广泛应用于医药、食品、轻工、化工和石油等领域。普鲁兰多糖主要应用领域：(1)医药和保健品胶囊行业、化妆品的粘结成形剂；(2)食品品质的改良剂和增稠剂；(3)用于防止氧化的水溶性的包装材料；(4)主食、糕点的低热能食品原料。在农产品保鲜上的应用：由于普鲁兰多糖具有良好的成膜性，可广泛应用于水果、蔬菜、鸡蛋等农产品保鲜。在海产品保鲜上的应用：研究表明，短梗霉多糖作为一种新型海产品被膜保险剂，能充分有效地抑制海产品体内挥发性盐基氮的大量积累，对海产品体内水分蒸发也有良好地保护作用。在食品加工工业上的应用：作为主食、糕点的低热值食品原料和食品品质的改良剂和增塑剂，广泛地应用于食品工业中。在环境保护领域中的应用：将该产品应用于高浊度水净化处理、城市污水一级强化处理及味精生产中废水的处理，形成了完整的工艺与技术。在包装行业中的应用：普鲁兰多糖是一种非离子性、非还原性的稳定多糖，因而在水中容易溶解，可作粘性、中性、非离性的不胶化水溶液。制成的薄膜透明、无色、无臭、无毒，具有韧性、高抗油性，能食用，可做食品包装。其光泽、强度、耐折性能都比高链淀粉制得的薄膜好。透明质酸钠，又称为玻璃酸钠、玻尿酸钠、糖醛酸钠等，是人体内一种固有的成分,是一种葡聚糖醛酸，没有种属特异性，它广泛存在于胎盘，羊水，晶状体，关节软骨，皮肤真皮层等组织；器官中它分布在细胞质，细胞间质中，对其中所含的细胞和细胞器官本身起润滑与滋养作用，同时提供细胞代谢的微环境。它是将一种人体天然的"透明质酸"配合以其他促进细胞再生除皱药物制成一种凝胶，通过注射方法使用。传统的理论认为，皱纹的形成与胶原弹力纤维的断裂或流失有关.现代医学研究发现，皱纹形成的另一个根本原因是细胞间质的改变，即细胞之间的无形成分"透明质酸"的减少，而细胞支架和弹力纤维仍然存在。微型整容就是通过补充丢失的无形间质成分，进而改变细胞的代谢环境以及水分和离子平衡，从而增加皮肤的粘弹性，达到整容效果。透明质酸钠为关节腔滑液的主要成分，为软骨基质的成分之一，在关节起到润滑作用，减少组织间的摩擦，关节腔内注入后可明显改善滑液组织的炎症反应，增强关节液的粘稠性和润滑功能，保护关节软骨，促进关节软骨的愈合与再生，缓解疼痛，增加关节的活动度。透明质酸钠是构成人体细胞间质、眼玻璃体、关节滑液等结缔组织的主要成分，具有在体内发挥保水、维持细胞外空间、调节渗透压、润滑、促进细胞修复的特性。作为眼用药物的载体，其通过增加滴眼液的黏度延长药物在眼表面的滞留时间，提高药物的生物利用度，减轻药物对眼的刺激性。透明质酸钠可直接注射进入关节腔内，作为润滑剂，用于关节炎的治疗。保湿性透明质酸钠在皮肤组织中的保湿作用是其最重要的生理功能之一，充足的水分使肌肤光滑、细腻。ha在低相对湿度(33％)下吸湿量最高，在高相对湿度(75％)下吸湿量最低，正适合皮肤在不同季节，不同环境湿度下对化妆品的保湿需求，且无油腻感和阻塞毛孔的感觉。皮肤的湿润水平与透明质酸含量密切相关，随着年龄的增长，皮肤中透明质酸含量下降，使皮肤保水功能减弱,产生皱纹。透明质酸钠水溶液具有较强的黏弹性和润滑性,涂于皮肤表面,可形成一层保湿透气膜,保持皮肤滋润亮泽。小分子透明质酸能渗透到真皮层，促进血液微循环，有利于皮肤对营养物质的吸收，起到美容抗皱的保健作用。透明质酸钠属于高分子聚合物，涂抹时润滑感明显，手感良好，大分子在皮肤表面形成一层透气的薄膜，使皮肤光滑湿润，阻隔外来细菌、粉尘等侵入，小分子透明质酸钠能渗入真皮，具有轻微扩张毛细血管，增加血液循环、改善中间代谢、促进皮肤营养吸收，达到润滑、饱满之功效。透明质酸钠在皮肤表面可消除阳光中紫外线照射所产生的活性氧自由基，保护皮肤免受紫外线的伤害，同时也可通过促进表皮细胞的增殖和分化，促进受伤部位的皮肤再生。保湿作用是透明质酸钠在化妆品中最重要的作用，与其他保湿剂相比，周围环境的相对湿度对其保湿性的影响较小。化妆品常用的保湿剂有甘油、丙二醇、山梨醇、聚乙二醇、乳酸钠、吡咯烷酮羧酸钠等。实验表明，与这些保湿剂相比，透明质酸钠在低相对湿度(33％)下的吸湿量最高，而在高相对湿度(75％)下的吸湿量最低，。这种独特的性质，正适应皮肤在不同季节，不同环境湿度下，如干燥的冬季和潮湿的夏季，对化妆品保湿作用的要求。透明质酸钠的保湿性与其质量有关，质量越高，保湿性能越好。透明质酸钠作为保湿剂较少单独使用，常与其他保湿剂配合使用。透明质酸钠是皮肤固有的生物物质，外源性的透明质酸钠是对皮肤内源性透明质酸钠的补充。质量较小的透明质酸钠可渗入皮肤表皮层，促进皮肤营养的供给和废物的排泄，从而防止皮肤老化，起到美容和养颜作用。皮肤的保养重于其他化妆，已成为现代人望养颜意识。皮肤受到阳光暴晒所引起的光灼伤或日炙，如皮肤变红、变黑、脱皮等，主要是阳光中的紫外线的作用。透明质酸钠通过促进表皮细胞的增殖和分化，以及清除氧自由基的作用，可促进受伤部位皮肤的再生，事先使用也有一定预防作用。其作用机理与防晒霜中常用的紫外线吸收剂不同，因此，在防晒护肤品中ha与紫外线吸收剂混合使用，具有协同作用，可同时减少紫外线的透过和对透过的少量紫外线所造成的皮肤损伤进行修复，起到双重保护作用。将透明质酸钠、egf和肝素配合使用，可加速表皮细胞的再生，使皮肤细嫩光滑，富有弹性。皮肤遭受轻度的烧烫伤时，表面涂抹含透明质酸钠的水剂化妆品可减轻疼痛，加速受伤部位皮肤的愈合。透明质酸钠属于高分子聚合物，具有很强的润滑感和成膜性。含透明质酸钠的护肤品涂抹时润滑感明显，手感良好。涂于皮肤后，可在皮肤表面形成一层薄膜，使皮肤产生良好的光滑感和湿润感，对皮肤起到保护作用。含有透明质酸钠的护发品，可在头发表面形成一层薄膜，起到保湿、润滑、护发、消除静电等作用，使头发易于梳理、飘逸自然。透明质酸钠在水溶液中具有很高的粘度，其1％的水溶液呈凝胶状，添加在化妆品中可起增稠和稳定作用。透明质酸钠广泛存在于动物和人体的生理活性物质，在人皮肤、关节滑膜液、脐带、房水及眼玻璃体中均有分布。分子量为500000～730000道尔顿，其溶液具有高黏弹性及仿形性，为眼科手术的辅助剂，药液注入前房后维持一定的眼前房深度，便于手术操作，并有保护角膜内皮细胞及眼内组织，减少手术并发症，促进伤口愈合的作用。透明质酸钠为第四代仿生化妆品添加剂。于1934年被karlmeyer从牛眼玻璃体中发现，它是从牛眼玻璃体中提取的一种大分子多糖。具有抗衰老和保鲜包装和采用生物技术三大特点。透明质酸钠本身是人体皮肤的构成之一，是人体内分布最广的一种酸性黏糖，存在于结缔组织的基质中，具有良好的保湿作用。本发明方法具有如下有益效果：本发明面膜具有优良的即时保湿、增强皮肤屏障、增加皮肤弹性等功能，并且具有优良的成膜性能。具体实施方式通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本发明所用的各种物料可以容易地从市场上购得或者容易地通过公知技术来制备。本发明具体实验中使用的无纺布为海月牌面膜用无纺布(50g平纹)，当然地，采用其它品牌、型号、规格的无纺布亦是可行的。实施例1：制备干细胞活性因子浓缩液(1)脐带源间充质干细胞获取：取健康足月剖宫产孕妇脐带，通过分离华通氏胶(wharton'sjelly)法，使用华通氏胶悬浮法制备；将华通氏胶放于t75培养瓶，加入适量间充质干细胞(msc)无血清培养基，置于37℃，5％的co2培养箱内培养，培养7天以后出现细胞集落；约12天细胞达到饱和，可进行传代；细胞呈长梭形，是典型的成纤维细胞样形态；(2)细胞扩增：当细胞融合度达70-80％时，用生理盐水轻轻冲洗培养瓶细胞1-2次，添加4ml消化液(0.25％胰酶)，室温放置1-2分钟，镜下观察细胞接近球形，轻轻拍打瓶壁，中止消化，转移至离心管混匀，取样计数，按照8000个细胞/cm2进行传代，2-3天细胞密度达70-80％时，反复以上操作，以获得足够量的msc，一般采用p3-p5代细胞制备(本例使用p5代细胞)；(3)细胞鉴定检测：细胞活率达90％以上时，流式检测标志物合格，标准为：cd73、cd90、cd105表达阳性，hla-dr、cd11b、cd19、cd34、cd45表达阴性，且结果中显示细胞具有成脂、成骨、成软骨分化潜能；(4)干细胞活性因子的制备：4i)细胞培养至最旺盛时(即细胞融合度约70-80％)，收集上清至离心管，0.22μm滤膜过滤上清除菌；4ii)用生理盐水清洗2-3次培养瓶，弃去，然后采用细胞饥饿法加入10ml生理盐水/t225培养瓶继续培养18小时，待细胞变圆，吹打混匀后移至离心管，采用超声破碎仪破碎细胞(其程序为：4℃，500w，超声2秒，间隔8秒，86个循环)后离心1400rpm，离心5min，收集的上清，经0.22μm滤膜过滤除菌；4iii)将步骤4i)和4ii)的上清混合，采用截留分子量为10kd的纯化超滤系统浓缩，即得干细胞活性因子浓缩液。测定活性因子：取干细胞活性因子浓缩液3ml，采用重组人源抗体包被的酶联免疫试剂盒(r&d公司供)测定干细胞活性因子(测定了四种典型活性因子egf、fgf、vegf、il-6)的含量，以上述四种典型活性因子的总量作为浓缩液的总活性因子含量。另外，同法测定步骤4iii)所得遗弃液中的总活性因子含量。另外，计算分别四种典型活性因子egf、fgf、vegf、il-6的回收率，结果显示，本实施例1方法中egf、fgf、vegf、il-6四者的回收率分别大于92.2％、大于94.1％、91.6％、92.7％，表明本发明方法具有优异的活性因子回收率。本实施例1所得干细胞活性因子浓缩液中细胞因子egf的含量为63.7pg/ml，该浓缩液中还测出了fgf、vegf和il-6。众所周知的，通过调整纯化参数可以得到具有不同浓度egf的细胞因子液，尤其是可以容易地获得包含20～200pg/ml的egf、例如包含30～150pg/ml的egf、例如包含40～100pg/ml的egf的细胞因子液。示例性的，下面制备面膜时，如未另外地说明，以本实施例1方法所得干细胞活性因子浓缩液作为细胞因子液。当然，如cn106381284a所记载，在制备干细胞活性因子浓缩液时，步骤4ii)的生理盐水中还可以添加0.1～0.2mmol/l浓度的枸橼酸钠，从而改进制备细胞活性因子方法的效率。实施例11：制备用于皮肤修复的干细胞活性因子面膜贴敷料a)面膜液配方：低级醇(甘油)5重量份，精氨酸/赖氨酸多肽2.5重量份，细胞因子液15重量份，海藻糖4重量份，海藻酸钠0.75重量份，peg-75牛油树脂甘油酯类2重量份，玫瑰花水2重量份，普鲁兰多糖0.75重量份，透明质酸钠0.75重量份，水适量至100重量份。b)面膜制备：(a)将透明质酸钠、海藻酸钠和低级醇混合均匀，加入约为透明质酸钠10倍重量的75℃热水，搅拌使溶解，降温至33℃；(b)向上一步骤所得液体中添加海藻糖、玫瑰花水、精氨酸/赖氨酸多肽、peg-75牛油树脂甘油酯类、细胞因子液、普鲁兰多糖，搅拌使溶解，得面膜液；(c)使面膜液浸润于无纺布上(每500平方厘米面积的无纺布上浸润5g)，再将浸润面膜液的无纺布置冷冻干燥机中，进行冷冻干燥以除去水分(至水分含量小于5％)；(d)使冷冻干燥的面膜折叠，并密封包装(包装于密封玻璃瓶中)，即得本发明面膜。步骤(c)照如下程序进行冷冻干燥：(i)预冷冻：在-35℃至-40℃下将面膜冷冻，维持4小时；(ii)主干燥：预抽真空至18pa，搁板升温至-15℃至-17℃保持15小时；(iii)主干燥：继续升温至-2℃至4℃保持2小时进一步干燥；(iv)解析干燥：缓慢升温至32℃至35℃，再保持4小时使水分达到要求。实施例12：制备用于皮肤修复的干细胞活性因子面膜贴敷料a)面膜液配方：b)面膜制备：(a)将透明质酸钠、海藻酸钠和低级醇混合均匀，加入约为透明质酸钠10倍重量的70℃热水，搅拌使溶解，降温至35℃；(b)向上一步骤所得液体中添加海藻糖、玫瑰花水、精氨酸/赖氨酸多肽、peg-75牛油树脂甘油酯类、细胞因子液、普鲁兰多糖，搅拌使溶解，得面膜液；(c)使面膜液浸润于无纺布上(每500平方厘米面积的无纺布上浸润3g)，再将浸润面膜液的无纺布置冷冻干燥机中，进行冷冻干燥以除去水分(至水分含量小于5％)；(d)使冷冻干燥的面膜折叠，并密封包装(包装于密封塑料瓶中)，即得本发明面膜。步骤(c)照如下程序进行冷冻干燥：(i)预冷冻：在-38℃至-40℃下将面膜冷冻，维持3小时；(ii)主干燥：预抽真空至18pa，搁板升温至-15℃至-17℃保持10小时；(iii)主干燥：继续升温至-2℃至4℃保持4小时进一步干燥；(iv)解析干燥：缓慢升温至30℃至32℃，再保持5小时使水分达到要求。实施例13：制备用于皮肤修复的干细胞活性因子面膜贴敷料a)面膜液配方：b)面膜制备：(a)将透明质酸钠、海藻酸钠和低级醇混合均匀，加入约为透明质酸钠10倍重量的80℃热水，搅拌使溶解，降温至30℃；(b)向上一步骤所得液体中添加海藻糖、玫瑰花水、精氨酸/赖氨酸多肽、peg-75牛油树脂甘油酯类、细胞因子液、普鲁兰多糖，搅拌使溶解，得面膜液；(c)使面膜液浸润于无纺布上(每500平方厘米面积的无纺布上浸润10g)，再将浸润面膜液的无纺布置冷冻干燥机中，进行冷冻干燥以除去水分(至水分含量小于5％)；(d)使冷冻干燥的面膜折叠，并包装于密封袋中，即得本发明面膜。步骤(c)照如下程序进行冷冻干燥：(i)预冷冻：在-30℃至-33℃下将面膜冷冻，维持5小时；(ii)主干燥：预抽真空至18pa，搁板升温至-18℃至-20℃保持20小时；(iii)主干燥：继续升温至-2℃至4℃保持2小时进一步干燥；(iv)解析干燥：缓慢升温至33℃至35℃，再保持2小时使水分达到要求。实施例14：制备用于皮肤修复的干细胞活性因子面膜贴敷料a)面膜液配方：低级醇(丙二醇)3重量份，精氨酸/赖氨酸多肽4重量份，细胞因子液10重量份，海藻糖5重量份，海藻酸钠0.25重量份，peg-75牛油树脂甘油酯类5重量份，玫瑰花水1重量份，普鲁兰多糖1重量份，透明质酸钠0.25重量份，水适量至100重量份。b)面膜制备：(a)将透明质酸钠、海藻酸钠和低级醇混合均匀，加入约为透明质酸钠10倍重量的72℃热水，搅拌使溶解，降温至34℃；(b)向上一步骤所得液体中添加海藻糖、玫瑰花水、精氨酸/赖氨酸多肽、peg-75牛油树脂甘油酯类、细胞因子液、普鲁兰多糖，搅拌使溶解，得面膜液；(c)使面膜液浸润于无纺布上(每500平方厘米面积的无纺布上浸润8g)，再将浸润面膜液的无纺布置冷冻干燥机中，进行冷冻干燥以除去水分(至水分含量小于5％)；(d)使冷冻干燥的面膜折叠，并包装于密封袋中，即得本发明面膜。步骤(c)照如下程序进行冷冻干燥：(i)预冷冻：在-34℃至-36℃下将面膜冷冻，维持5小时；(ii)主干燥：预抽真空至18pa，搁板升温至-15℃至-17℃保持10小时；(iii)主干燥：继续升温至-2℃至4℃保持2～4小时进一步干燥；(iv)解析干燥：缓慢升温至30℃至31℃，再保持5小时使水分达到要求。实施例15：制备用于皮肤修复的干细胞活性因子面膜贴敷料a)面膜液配方：低级醇(甘油)7重量份，精氨酸/赖氨酸多肽2重量份，细胞因子液30重量份，海藻糖2重量份，海藻酸钠1重量份，peg-75牛油树脂甘油酯类1重量份，玫瑰花水5重量份，普鲁兰多糖0.25重量份，透明质酸钠1重量份，水适量至100重量份。b)面膜制备：(a)将透明质酸钠、海藻酸钠和低级醇混合均匀，加入约为透明质酸钠10倍重量的78℃热水，搅拌使溶解，降温至31℃；(b)向上一步骤所得液体中添加海藻糖、玫瑰花水、精氨酸/赖氨酸多肽、peg-75牛油树脂甘油酯类、细胞因子液、普鲁兰多糖，搅拌使溶解，得面膜液；(c)使面膜液浸润于无纺布上(每500平方厘米面积的无纺布上浸润4g)，再将浸润面膜液的无纺布置冷冻干燥机中，进行冷冻干燥以除去水分(至水分含量小于5％)；(d)使冷冻干燥的面膜折叠，并包装于密封袋中，即得本发明面膜。步骤(c)照如下程序进行冷冻干燥：(i)预冷冻：在-36℃至-38℃下将面膜冷冻，维持3小时；(ii)主干燥：预抽真空至18pa，搁板升温至-18℃至-20℃保持20小时；(iii)主干燥：继续升温至-2℃至4℃保持2～4小时进一步干燥；(iv)解析干燥：缓慢升温至34℃至35℃，再保持2小时使水分达到要求。实施例16：制备用于皮肤修复的干细胞活性因子面膜贴敷料a)面膜液配方：低级醇(丙二醇)4重量份，精氨酸/赖氨酸多肽3重量份，细胞因子液10重量份，海藻糖5重量份，海藻酸钠0.5重量份，peg-75牛油树脂甘油酯类3重量份，玫瑰花水1重量份，普鲁兰多糖1重量份，透明质酸钠0.5重量份，水适量至100重量份。b)面膜制备：(a)将透明质酸钠、海藻酸钠和低级醇混合均匀，加入约为透明质酸钠10倍重量的73℃热水，搅拌使溶解，降温至34℃；(b)向上一步骤所得液体中添加海藻糖、玫瑰花水、精氨酸/赖氨酸多肽、peg-75牛油树脂甘油酯类、细胞因子液、普鲁兰多糖，搅拌使溶解，得面膜液；(c)使面膜液浸润于无纺布上(每500平方厘米面积的无纺布上浸润7g)，再将浸润面膜液的无纺布置冷冻干燥机中，进行冷冻干燥以除去水分(至水分含量小于5％)；(d)使冷冻干燥的面膜折叠，并包装于密封袋中，即得本发明面膜。步骤(c)照如下程序进行冷冻干燥：(i)预冷冻：在-33℃至-35℃下将面膜冷冻，维持4小时；(ii)主干燥：预抽真空至18pa，搁板升温至-18℃至-20℃保持14小时；(iii)主干燥：继续升温至-2℃至4℃保持2小时进一步干燥；(iv)解析干燥：缓慢升温至33℃至35℃，再保持2.5小时使水分达到要求。实施例17：制备用于皮肤修复的干细胞活性因子面膜贴敷料a)面膜液配方：b)面膜制备：(a)将透明质酸钠、海藻酸钠和低级醇混合均匀，加入约为透明质酸钠10倍重量的77℃热水，搅拌使溶解，降温至32℃；(b)向上一步骤所得液体中添加海藻糖、玫瑰花水、精氨酸/赖氨酸多肽、peg-75牛油树脂甘油酯类、细胞因子液、普鲁兰多糖，搅拌使溶解，得面膜液；(c)使面膜液浸润于无纺布上(每500平方厘米面积的无纺布上浸润4g)，再将浸润面膜液的无纺布置冷冻干燥机中，进行冷冻干燥以除去水分(至水分含量小于5％)；(d)使冷冻干燥的面膜折叠，并包装于密封袋中，即得本发明面膜。步骤(c)照如下程序进行冷冻干燥：(i)预冷冻：在-37℃至-40℃下将面膜冷冻，维持4小时；(ii)主干燥：预抽真空至18pa，搁板升温至-17℃至-20℃保持16小时；(iii)主干燥：继续升温至-2℃至4℃保持4小时进一步干燥；(iv)解析干燥：缓慢升温至30℃至32℃，再保持4.5小时使水分达到要求。试验例1：面膜的性能观察在上述实施例11～17中，本发明人已经发现，面膜液浸润于无纺布上进行冷冻干燥后，无纺布上表面的膜层会出现诸多破裂泡点，通过观察浸润面膜液的无纺布在冻干机内的冻干过程，发现这些破裂泡点出现的原因是，在冻干过程中(预抽真空至18pa且搁板升温至-15℃至-20℃期间)浸润面膜液的无纺布表面会鼓泡，随着冻干过程的继续，这些鼓泡通常会在-2℃至4℃干燥阶段破裂，从而形成破裂泡点。在放大镜下，以5×5厘米方格(25平方厘米)为视野，肉眼观测并计数在此视野内破裂泡点的数目，每个面膜观测6个不同区域，将结果换算成每500平方厘米中破裂泡点的数目，并取其平均结果。实施例11～17结果(每500平方厘米冻干面膜上破裂泡点的数目)分别如下：实施例11为86.2个、实施例12为83.8个、实施例13为94.3个、实施例14为90.7个、实施例15为88.6个、实施例16为85.7个、实施例17为91.6个。补充的实施例18：分别参照实施例11～17，不同的仅是其中均不添加海藻糖，得到7个冷冻干燥的面膜，同上述方法观测每500平方厘米冻干面膜上破裂泡点的数目，结果7个面膜的破裂泡点数均小于1.7个，均在0～1.7个范围内，例如实施例18中参照实施例11所得面膜的破裂泡点数为0.3个，实施例18中参照实施例12所得面膜的破裂泡点数为0个。补充的实施例19：分别参照实施例11～17，不同的仅是其中均不添加普鲁兰多糖，得到7个冷冻干燥的面膜，同上述方法观测每500平方厘米冻干面膜上破裂泡点的数目，结果7个面膜的破裂泡点数均小于2.4个，均在0～2.4个范围内，例如实施例19中参照实施例11所得面膜的破裂泡点数为0个，实施例19中参照实施例12所得面膜的破裂泡点数为0.9个。补充的实施例20：分别参照实施例11～17，不同的仅是其中海藻糖和普鲁兰多糖二者均不添加，得到7个冷冻干燥的面膜，同上述方法观测每500平方厘米冻干面膜上破裂泡点的数目，结果7个面膜的破裂泡点数均小于1.4个，均在0～1.4个范围内，例如实施例20中参照实施例11所得面膜的破裂泡点数为1.1个，实施例20中参照实施例12所得面膜的破裂泡点数为0.3个。补充的实施例21：分别参照实施例11～17，不同的仅是在添加海藻糖的步骤中还同时额外添加0.4％丝氨酸(即每100重量份面膜液中添加0.4重量份丝氨酸，下同)和0.015％氯化钠，得到7个冷冻干燥的面膜，同上述方法观测每500平方厘米冻干面膜上破裂泡点的数目，结果7个面膜的破裂泡点数均小于2.8个，均在0～2.8个范围内，例如实施例21中参照实施例11所得面膜的破裂泡点数为1.7个，实施例21中参照实施例12所得面膜的破裂泡点数为1.1个。补充的实施例22：分别参照实施例11～17，不同的仅是在添加海藻糖的步骤中还同时额外添加0.4％丝氨酸，得到7个冷冻干燥的面膜，同上述方法观测每500平方厘米冻干面膜上破裂泡点的数目，结果7个面膜的破裂泡点数均在74～86个范围内，例如实施例22中参照实施例11所得面膜的破裂泡点数为81.4个，实施例22中参照实施例12所得面膜的破裂泡点数为79.3个。补充的实施例23：分别参照实施例11～17，不同的仅是在添加海藻糖的步骤中还同时额外添加0.015％氯化钠，得到7个冷冻干燥的面膜，同上述方法观测每500平方厘米冻干面膜上破裂泡点的数目，结果7个面膜的破裂泡点数均在77～83个范围内，例如实施例23中参照实施例11所得面膜的破裂泡点数为78.7个，实施例23中参照实施例12所得面膜的破裂泡点数为80.7个。试验例2：面膜的生理功效以实施例21中参照实施例11所得面膜为测试样品，分别测定它的即时保湿功能、增强皮肤屏障功能、增加皮肤弹性功能。面膜的使用方法：取500平方厘米的本发明冷冻干燥的干细胞活性因子面膜贴敷料面膜1片，加20ml水浸润后，贴敷于面部。(1)即时保湿功能试验方法：使用delfin皮肤角质层水分测量仪(moisturemetersc)，先测量各受试者测试区域(面部)的初始值(样品使用前)，然后在设定时间后测定受试区域角质层水分含量；让12名志愿者按照正常使用方法使用面膜贴敷料(实施例21中参照实施例11所得面膜)完毕后，进行产品测试区域测量，平行测定至少3次，取平均值；测定时间为使用前、使用后1h、使用后2h、使用后4h，结果(12名志愿者的平均值)：使用前皮肤含水量33.2％、使用后1h皮肤含水量44.6％(提高率34.3％)、使用后2h皮肤含水量42.3％(提高率27.4％)、使用后4h皮肤含水量39.1％(提高率17.8％)。表明说明本发明产品具有显著即时保湿功效，4小时后还能保持皮肤水分含量提升率达15％以上。(2)增强皮肤屏障功能使用delfin经皮水分流失测量仪(vapoimeter)测定。测试方法：让20名志愿者使用面膜贴敷料(实施例21中参照实施例11所得面膜)，2天使用一次，先测量各测试区域肌肤的经皮水分流失值(tewl，g/m2·h)的初始值(样品使用前)，然后在使用14天、28天后测定tewl，统计全部试验者的平均值。tewl是通过测定皮肤表面的水蒸气压梯度表明水分散失的情况，从而反映皮肤的水通透屏障。当屏障功能受损时，tewl值增高；相反地，tewl降低，提示皮肤屏障修复。结果：使用前tewl为21.1g/m2·h、使用14天tewl为16.7g/m2·h(皮肤水分流失降低率为20.9％)、使用28天tewl为15.8g/m2·h(皮肤水分流失降低率为25.1％)。可见与使用前相比较，本发明面膜能够使皮肤水分流失显著降低，使用14天后即可显著改善肌肤屏障功效，皮肤水分流失显著降低。(3)增加皮肤弹性使用delfin皮肤测量仪(elastimeter)进行测定。测试方法：让每组20名志愿者分别使用供试品面膜贴敷料(实施例21中参照实施例11所得面膜)、对照品1(参照供试品配方和制法但是未添加细胞因子液而是用相应量的水代替)、对照品2(参照供试品配方和制法但是未添加海藻糖)，2天使用一次，先测量各测试区域即时弹性(ise)的初始值(样品使用前)，然后在15天、30天、60天时测定受试区域和对照区域肌肤的即时弹性(ise)，每个区域平行测定至少3次，取平均值。即时弹性(ise)以皮肤弹性指数r2表征，另外以使用前为参考计算使用15～60天时的皮肤弹性提高率(％)。即时弹性(ise)测试：当测试仪器参考板完全与皮肤接触时，测试仪的压头会使皮肤持续变形，皮肤抗拒这种变形，从而测得皮肤的即时弹性(ise)。结果见下表(n＝20)：从上述结果可见，本发明面膜能够有效地提高皮肤弹性，长期使用可使肌肤紧致有弹性。从上述结果可见，在面膜中添加细胞因子和海藻糖对于提高皮肤弹性是有益的。本发明实施例应理解为仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求书所限定的范围。当前第1页12