樟树提取物在抑制胆碱酯酶活性中的应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，具体涉及樟树提取物在抑制胆碱酯酶活性中的应用。

背景技术：

阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease，ad)，又称老年痴呆，是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，临床典型特征为记忆力下降、社交能力出现障碍以及日常自理能力丧失等。这种疾病所引起的一些日常表现，包括记忆力减退，常常忘记包括子女等亲朋好友的名字，不能分辨时间、季节，在熟悉的地方也发生迷路；产生幻觉，被害妄想，易激怒和攻击倾向；无法参与公众活动，吃饭穿衣举止失常，甚至生活不能自理。老年痴呆是心脏病、肿瘤、糖尿病之后严重影响老年人生活质量和身体健康的疾病。因此，对于抗老年性痴呆药物的研究不仅具有巨大的社会效益，而且可以明显减轻国家和家庭的经济负担，是十分必要的。

目前，从不同的角度提出了十几种关于阿尔茨海默病的学说，如胆碱能学说、β-淀粉样蛋白沉积学说、自由基学说、神经纤维缠结学说、基因学说、离子通道学说等。到目前为止，胆碱能系统一直被认为是正常认知功能中最重要的神经递质系统，胆碱能损伤是被较早公认的老年痴呆发病机制。胆碱能学说认为，在老年痴呆病理过程中，基底前脑区的胆碱能神经元丢失，胆碱乙酞转移酶活性下降，乙酰胆碱的合成、释放和摄取减少，学习和记忆力衰退。因此，改善胆碱能系统、增加脑内乙酰胆碱的水平是治疗老年痴呆的重要途径。胆碱酯酶抑制剂能延缓乙酰胆碱的水解，因此胆碱酯酶抑制剂能够提高ad患者乙酰胆碱在突触间隙的含量而产生疗效，是目前唯一被普遍认可的药物治疗手段。

目前，临床应用的大部分胆碱醋酶抑制剂都是选择性的乙酰胆碱酯酶(ache)抑制剂，如他克林、加兰他敏、多奈呱齐、利伐司替明等。乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶(bche)是两种紧密同源的蛋白，两者均存在于所有脊椎动物中，并且均能水解神经递质乙酰胆碱。mesulam等研究发现，尽管脑内ache较bche浓度高许多，但当ad患者脑中ache活性下降时，bche的活性却逐渐增加，这充分表明当ache被ache抑制剂所抑制时，bche起到一定补偿作用。此外bche在晚期ad病人大脑中的含量很高，其在晚期ad患者脑中乙酰胆碱的水解过程中起到更为突出的作用。因此，开发ache-bche双重抑制剂或选择性bche抑制剂具有重要的意义。然而临床上可供选择的抗ad药物还十分有限，寻找新型有效的抗ad药物仍是药物研究工作者面临的艰巨任务。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供樟树提取物在抑制胆碱酯酶活性中的应用，所述樟树提取物作为胆碱酯酶抑制剂对乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶均有抑制作用。

本发明提供了樟树提取物在抑制胆碱酯酶活性的应用。

优选的，所述胆碱酯酶包括乙酰胆碱酯酶和/或丁酰胆碱酯酶。

优选的，所述樟树提取物的提取方法，包括以下步骤：

1)去除樟树原料破碎物中的油脂，得到脱脂樟树原料粕；

2)将所述脱脂樟树原料粕用体积浓度70～80％乙醇水溶液提取，固液分离，收集液相，去除溶剂，得到樟树提取物。

优选的，所述樟树原料包括化学型樟树原料；所述化学型樟树原料包括来源于化学型樟树的籽仁、枝、叶、茎和根。

优选的，以加兰他敏为参比，所述樟树提取物抑制乙酰胆碱酯酶活力为9.63～11.61μmol加兰他敏/g提取物；所述樟树提取物抑制丁酰胆碱酯酶活力为0.66～0.84mmol加兰他敏/g提取物。

优选的，所述樟树提取物还包括经碱消化处理后的樟树提取物；

以加兰他敏为参比，所述经碱消化处理后的樟树提取物抑制乙酰胆碱酶活力为9.31～10.70μmol加兰他敏/g提取物，抑制乙酰胆碱酯酶生物活力保存>94％；所述经碱消化处理后的樟树提取物抑制丁酰胆碱酯酶活力为0.46～0.58mmol加兰他敏/g提取物，抑制丁酰胆碱酯酶生物活力保存>69％。

优选的，所述樟树提取物包括胃肠道消化后的樟树提取物；

以加兰他敏为参比，所述胃肠道消化后的樟树提取物抑制乙酰胆碱酯酶活力为6.52～7.02μmol加兰他敏/g提取物，抑制乙酰胆碱酯酶生物活力保存>63％；所述胃肠道消化后的樟树提取物抑制丁酰胆碱酯酶活力为0.26～0.36mmol加兰他敏/g提取物，抑制丁酰胆碱酯酶生物活力保存>40％。

本发明提供了樟树提取物在制备预防和/或治疗老年痴呆、血管性抑郁症、失眠、注意力障碍的药物中的应用；所述樟树提取物为所述应用中的樟树提取物。

本发明提供了樟树提取物在改善老年痴呆、血管性抑郁症、失眠、注意力障碍的食品或保健品中的应用；所述樟树提取物为所述应用中的樟树提取物。

本发明还提供了一种乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的双重抑制剂，包括所述应用中的樟树提取物；所述樟树提取物包括以下质量百分含量的活性成分：多酚≥12.2％、黄酮≥20％和皂苷≥12.7％。

本发明提供了樟树提取物在抑制胆碱酯酶活性中的应用。以樟树籽仁提取物为例验证在抑制胆碱酯酶酶活测试中应用，实验表明，樟树籽仁提取物具有较强的乙酰胆碱酯酶抑制活性，以加兰他敏为参比，所述樟树提取物抑制乙酰胆碱酯酶活力为9.63～11.61μmol加兰他敏/g提取物，说明樟树籽仁提取物作为乙酰胆碱酯酶抑制剂在抑制乙酰胆碱酯酶酶活性方面具有较好的应用前景。同时樟树籽仁提取物具有较强的丁酰胆碱酯酶抑制活性，以加兰他敏为参比，所述樟树提取物抑制丁酰胆碱酯酶活力为0.66～0.84mmol加兰他敏/g提取物，说明樟树籽仁提取物作为丁酰胆碱酯酶抑制剂在抑制丁酰胆碱酯酶酶活性方面具有较好的应用前景。

进一步的，本发明提供的应用，进一步限定了樟树提取物包括经碱液或胃肠消化液消化后的樟树提取物。以樟树籽仁提取物为例验证在抑制胆碱酯酶酶活测试中应用，实验表明，樟树籽仁提取物经碱液和胃肠消化液消化后乙酰胆碱酯酶抑制活力分别保留94.3％和63.7％，经碱液和胃肠消化液消化后丁酰胆碱酯酶抑制活力分别保留69.3％和41％，表明樟树籽仁提取物对碱和胃肠消化液具有较强的耐受性。

附图说明

图1为樟树籽提取物紫外扫描图谱；

图2为樟树籽提取物hplc图谱；

图3为黄酮标准曲线；

图4为多酚标准曲线；

图5为皂苷标准曲线；

图6为troloxdpph自由基清除曲线。

具体实施方式

本发明提供了樟树提取物在抑制胆碱酯酶活性中的应用。所述胆碱酯酶优选包括乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶。

在本发明中，所述樟树提取物的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的樟树提取物即可。在本发明实施例中，所述樟树提取物的提取方法，优选包括以下步骤：

1)去除樟树原料破碎物中的油脂，得到脱脂樟树原料粕；

2)将所述脱脂樟树原料粕用体积浓度70～80％乙醇水溶液提取，固液分离，收集液相，去除溶剂，得到樟树提取物。

本发明去除樟树原料破碎物中的油脂，得到脱脂樟树原料粕。

在本发明中，所述樟树原料优选包括化学型樟树原料；所述化学型樟树原料优选包括来源于化学型樟树的籽仁、枝、叶、茎和根。本发明以化学型樟树的籽仁、枝、叶、茎和根为原料进行提取，均能够得到具有抑制胆碱酯酶活性的提取物。本发明实施例中，以化学型樟树籽仁为例加以说明樟树提取物的性能。

在本发明中，所述去除樟树原料破碎物中的油脂的方法优选包括以下步骤：以正己烷或石油醚为溶剂室温条件下搅拌提取樟树原料破碎物中油脂，提取后悬浊液经抽滤，得到的滤饼用所述溶剂淋洗3～5次，滤饼自然风干至无溶剂气味，干燥粉过40目筛，得到脱脂樟树原料粕。

在本发明中，所述樟树原料破碎物和所述溶剂的料液比为1:3(w/v)。所述搅拌的速度优选为60～100rpm，更优选为80rpm。所述提取的时间优选为8h，所述提取的次数优选为3次。所述樟树原料破碎物的粒径优选为50～100目，更优选为70～90目，更优选为80目。

得到所述脱脂樟树原料粕后，本发明将所述脱脂樟树原料粕用体积浓度70～80％乙醇水溶液提取，固液分离，收集液相，去除溶剂，得到樟树提取物。

在本发明中，所述脱脂樟树原料粕和体积浓度70～80％乙醇水溶液的料液比1:20(w/v)。所述提取优选伴随搅拌。所述搅拌的转速优选为60-100rpm，更优选为80rpm。所述提取的次数优选3次，每次提取的时间优选为8h。所述固液分离优选为离心。所述离心的转速优选为5000rpm。所述离心的时间优选为10min。所述去除溶剂的方法优选于45～55℃减压浓缩去除溶剂。去除溶剂后得到的残留物优选用超纯水复溶，复溶液以5000rpm离心10分钟，离心上清液经低温冷冻干燥得到樟树籽仁提取物phi，收集冻干物储存于-20℃。樟树提取物用超纯水配制成2mg/ml浓度，用全波长紫外分光光度计在190～900nm波长范围内扫描，以超纯水校零。樟树籽仁提取物的uv光谱在210～250nm和260～300nm处显示最大吸收。

在本发明中，所述樟树提取物还包括经碱消化处理后的樟树提取物和胃肠道消化后的樟树提取物。

所述经碱消化处理后的樟树提取物的制备方法优选为将上述方法提取得到的樟树提取物和4mnaoh溶液混合，在37℃150rpm震荡消化30min得到。所述樟树提取物和naoh溶液的料液比优选为1:20(w/v)。

所述胃肠道消化后的樟树提取物的制备方法优选为将上述方法提取得到的樟树提取物与ph2.0的人工模拟胃液在37℃150rpm震荡下消化2h；得到的胃液消化液调节ph至6.8，37℃150rpm震荡消化15min；得到的混悬液中加入胰蛋白酶，用1mnahco3溶液调节ph至6.8，37℃150rpm震荡消化2小时；90℃10min灭活酶，12000g离心10min取上清得到胃肠道消化后的樟树提取物。

在本发明中，人工模拟胃液为包含以下含量的水溶液：35mmnacl，250units/mg胃蛋白酶和4mhcl。所述樟树提取物和人工模拟胃液的料液比为1:10(w/v)。所述樟树提取物和胰蛋白酶的料液比为1:10(w/v)。所述调节胃液消化液的ph用溶液为包含以下组分的水溶液：1mnahco3，1mcacl2和9mg/ml胆汁盐。

测定上述方法制备得到的樟树提取物、经碱消化处理后的樟树提取物和胃肠道消化后的樟树提取物中总黄酮含量，分别为196.92±1.42mgre/g提取物、131.65±0.50mgre/g提取物和173.67±0.66mgre/g提取物。测定上述方法制备得到的樟树提取物、经碱消化处理后的樟树提取物和胃肠道消化后的樟树提取物中自由基清除率，2.40±0.042mmolte/g提取物、1.92±0.010mmolte/g提取物和2.41±0.025mmolte/g提取物。测定上述方法制备得到的樟树提取物、经碱消化处理后的樟树提取物和胃肠道消化后的樟树提取物中多酚含量，分别为122.30±0.87mggae/g提取物、84.82±0.48mggae/g提取物和120.98±1.28mggae/g提取物。测定上述方法制备得到的樟树提取物、经碱消化处理后的樟树提取物和胃肠道消化后的樟树提取物中皂苷含量，分别为127.14±1.62mgrb1/g提取物、105.42±1.10mgrb1/g提取物和188.33±1.95mgrb1/g提取物。

抑制胆碱酯酶酶活测试结果，以加兰他敏为参比，所述樟树提取物抑制乙酰胆碱酯酶活力为9.63～11.61μmol加兰他敏/g提取物；所述樟树提取物抑制丁酰胆碱酯酶活力为0.66～0.84mmol加兰他敏/g提取物。

以加兰他敏为参比，所述经碱消化处理后的樟树提取物抑制乙酰胆碱酶活力为9.31～10.70μmol加兰他敏/g提取物，抑制乙酰胆碱酯酶生物活力保存>94％；所述经碱消化处理后的樟树提取物抑制丁酰胆碱酯酶活力为0.46～0.58mmol加兰他敏/g提取物，抑制丁酰胆碱酯酶生物活力保存>69％。

以加兰他敏为参比，所述胃肠道消化后的樟树提取物抑制乙酰胆碱酯酶活力为6.52～7.02μmol加兰他敏/g提取物，抑制乙酰胆碱酯酶生物活力保存>63％；所述胃肠道消化后的樟树提取物抑制丁酰胆碱酯酶活力为0.26～0.36mmol加兰他敏/g提取物，抑制丁酰胆碱酯酶生物活力保存>40％。

基于上述方法制备得到的樟树提取物、经碱消化处理后的樟树提取物和胃肠道消化后的樟树提取物均具有较好的胆碱酯酶抑制活性，本发明提供了樟树提取物在制备预防和/或治疗与胆碱酯酶活性引起的疾病中的应用，所述疾病包括老年痴呆、血管性抑郁症、失眠、注意力障碍的药物中的应用。同时本发明提供了樟树提取物在改善老年痴呆、血管性抑郁症、失眠、注意力障碍的食品或保健品中的应用。

在本发明中，所述药物优选为片剂。所述药物的服用方法为口服，每次1～2g提取物，一日2次，早餐及晚餐同服。

本发明还提供了一种乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的双重抑制剂，包括所述应用中的樟树提取物；所述樟树提取物包括以下质量百分含量的活性成分：多酚≥12.2％、黄酮≥20％和皂苷≥12.7％。所述抑制剂还包括可以接受的辅料。所述双重抑制剂的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的抑制剂的制备方法即可。所述双重抑制剂用于抑制乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的酶活力。

下面结合实施例对本发明提供的樟树提取物在抑制胆碱酯酶活性的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

樟树籽仁提取物的制备方法

(1)樟树籽去皮肉脱壳获得樟树籽仁，樟树籽仁用高速多功能粉碎机破碎成50目，破碎物以正己烷为溶剂室温搅拌提取樟树籽仁中油脂，料液比1:3(w/v，单位g/ml)，搅拌速度60rpm，提取时间8h，提取3次。第3次提取后悬浊液经真空泵抽滤，滤饼用正己烷淋洗3次，滤饼平铺于洁净托盘中置于阴凉通风处自然风干至无溶剂气味，干燥粉过40目筛，得脱脂樟树籽仁粕。

(2)室温下脱脂樟树籽仁粕分散于80％乙醇溶液中，料液比1:20(w/v)，搅拌速度60rpm，提取时间8h，提取次数3次。每次提取后的悬浊液以5000rpm离心10分钟。合并3次离心上清液，用旋转蒸发器于45℃减压浓缩去除溶剂，残留物用适量超纯水复溶，复溶液以5000rpm离心10分钟，离心上清液经低温冷冻干燥得到樟树籽仁提取物phi，收集冻干物储存于-20℃。

实施例2

樟树籽仁提取物的制备方法

(1)樟树籽去皮肉脱壳获得樟树籽仁，樟树籽仁用高速多功能粉碎机破碎成100目，破碎物以石油醚为溶剂室温搅拌提取樟树籽仁中油脂，料液比1:3(w/v)，搅拌速度100rpm，提取时间8h，提取3次。第3次提取后悬浊液经真空泵抽滤，滤饼用正己烷淋洗5次，滤饼平铺于洁净托盘中置于阴凉通风处自然风干至无溶剂气味，干燥粉过40目筛，得脱脂樟树籽仁粕。

(2)室温下脱脂樟树籽仁粕分散于70％乙醇溶液中，料液比1:20(w/v)，搅拌速度100rpm，提取时间8h，提取次数3次。每次提取后的悬浊液以5000rpm离心10分钟。合并3次离心上清液，用旋转蒸发器于55℃减压浓缩去除溶剂，残留物用适量超纯水复溶，复溶液以5000rpm离心10分钟，离心上清液经低温冷冻干燥得到樟树籽仁提取物phi，收集冻干物储存于-20℃。

实施例3

樟树籽仁提取物的制备方法

(1)樟树籽去皮肉脱壳获得樟树籽仁，樟树籽仁用高速多功能粉碎机破碎成80目，破碎物以正己烷为溶剂室温搅拌提取樟树籽仁中油脂，料液比1:3(w/v)，搅拌速度80rpm，提取时间8h，提取3次。第3次提取后悬浊液经真空泵抽滤，滤饼用正己烷淋洗4次，滤饼平铺于洁净托盘中置于阴凉通风处自然风干至无溶剂气味，干燥粉过40目筛，得脱脂樟树籽仁粕。

(2)室温下脱脂樟树籽仁粕分散于75％乙醇溶液中，料液比1:20(w/v)，搅拌速度80rpm，提取时间8h，提取次数3次。每次提取后的悬浊液以5000rpm离心10分钟。合并3次离心上清液，用旋转蒸发器于50℃减压浓缩去除溶剂，残留物用适量超纯水复溶，复溶液以5000rpm离心10分钟，离心上清液经低温冷冻干燥得到樟树籽仁提取物phi，收集冻干物储存于-20℃。

将实施例1～3制备的樟树籽仁提取物phi用超纯水配制成2mg/ml浓度，用全波长紫外分光光度计在190～900nm波长范围内扫描，以超纯水校零。樟树籽仁提取物的uv光谱在210～250nm和260～300nm处显示最大吸收，见图1。

将樟树籽仁提取物phi用超纯水配制成2mg/ml浓度，用agilenttechnologies6120hplc色谱仪进行色谱分离：

色谱柱：amethystc18-h(4.6ⅹ250mm,5μm)；

柱温：25℃；

流动相：0.1％甲酸-水溶液(a)，甲醇(b)；

流速：1ml/min；

进样量：10μl；

紫外检测波长：280nm；

梯度洗脱程序见表1。

表1梯度洗脱程序

色谱分离结果见图2。

根据色谱分离结果进一步质谱分析，用电喷雾离子源(esi)在负离子模式下进行质谱扫描。主要参数如下：离子源电压，-4500v；离子源温度，550℃；气帘气，35psi；辅助气1，60psi；辅助气2，60psi；碰撞能量，-30ev；离子扫描范围，100～1500ida。初步鉴定樟树籽仁提取物中的化合物见表2。

表2初步鉴定樟树籽仁提取物中的化合物信息

实施例4

碱消化樟树籽仁提取物的制备方法

将实施例1～3制备的樟树籽仁提取物phi与4mnaoh溶液1:20(w/v)在37℃150rpm震荡消化30min，得到碱消化樟树籽仁提取物phh。

实施例5

将实施例1～3制备的樟树籽仁提取物phi与ph2.0的人工模拟胃液(35mmnacl，250units/mg胃蛋白酶，4mhcl)按照1:10(w/v)的比例混合，在37℃150rpm震荡下消化2h；用溶液(1mnahco3，1mcacl2，9mg/ml胆汁盐)调节ph至6.8，37℃150rpm震荡消化15min；混悬液中加入胰蛋白酶1:10(w/v)，用1mnahco3溶液调节ph至6.8，37℃150rpm震荡消化2小时；90℃10min灭活酶，12000g离心10min取上清，得到胃肠液消化樟树籽仁提取物dphi。

实施例6

樟树籽仁提取物phi、碱消化樟树籽仁提取物phh、胃肠液消化樟树籽仁提取物dphi中总黄酮含量测定。

①芦丁(re,rutin)标准溶液配制：精确称取经105℃干燥恒重的芦丁标准品10mg，用30％乙醇溶解，用30％乙醇定容至100ml，得0.1mg/ml的对照品标准溶液。

②黄酮标准曲线绘制：准确吸取0.lmg/ml的芦丁对照品溶液0.0、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml分别置于10ml具塞刻度试管中，用30％乙醇补充至5ml，先加5％nano2溶液0.3ml，摇匀，放置6min；再加10％al(no3)3溶液0.3ml，摇匀，放置6min；加1mol/lnaoh溶液4ml，用30％乙醇定容至10ml，摇匀，静置15min。依次编号为0、1、2、3、4、5，以0为空白对照。在510nm波长处测定吸光度，以吸光度值为纵坐标，芦丁标准品溶液浓度为横坐标，用最小二乘法进行线性回归，得到黄酮标准曲线。

③phi、phh、dphi样品中黄酮测定：phi、phh、dphi样品分别用超纯水溶解成2mg/ml溶液，将phi、phh、dphi溶液5000rpm离心10min，精确移取0.5ml上清于10ml带刻度试管中，按照黄酮标准曲线绘制方法测定phi、phh、dphi样品吸光度，代入黄酮标准曲线，得到phi、phh、dphi样品溶液中总黄酮含量。

由上述方法绘制黄酮标准曲线如图3。

由上述方法测得phi、phh、dphi样品中黄酮含量如表3。

表3phi、phh、dphi中黄酮含量

实施例7

樟树籽仁提取物phi、碱消化樟树籽仁提取物phh、胃肠液消化樟树籽仁提取物dphi多酚含量测定。

①没食子酸(gallicacid,ga)标准溶液配制：精确称取经105℃干燥恒重的没食子酸标准品10mg，用双蒸水溶解并定容到100ml，得0.1mg/ml的对照品标准溶液。

②多酚标准曲线绘制：准确吸取0.lmg/ml对照样品溶液0、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml于10ml具塞刻度试管中，再加入1mlfolin-ciocalteau试剂，摇匀室温下静置6分钟；后加入3ml15％na2co3溶液，用双蒸水定容到10ml，室温下反映2h，以0为空白对照，在760nm波长处测定吸光度，以吸光度值为纵坐标，没食子酸标准品溶液浓度为横坐标，用最小二乘法进行线性回归，得到多酚标准曲线。

③phi、phh、dphi样品中多酚测定：phi、phh、dphi样品分别用超纯水溶解成2mg/ml溶液，将phi、phh、dphi溶液5000rpm离心10min，精确移取0.2ml上清于10ml带刻度试管中，按照多酚标准曲线绘制方法测定phi、phh、dphi样品吸光度，代入多酚标准曲线，得到phi、phh、dphi样品溶液中总多酚含量。

由上述方法绘制多酚标准曲线如图4。

由上述方法测得phi、phh、dphi样品中总多酚含量如表4。

表4phi、phh、dphi中总多酚含量

实施例8

樟树籽仁提取物phi、碱消化樟树籽仁提取物phh、胃肠液消化樟树籽仁提取物dphi皂苷含量测定。

①人参皂苷rb1(ginsenoside-rb1)标准溶液配制：精确称取人参皂苷rb1标准品0.010g，用甲醇溶解并定容至10.0ml，得1.0mg/ml的对照品标准溶液。

②总皂苷标准曲线绘制：准确吸取1.0mg/ml对照样品溶液0、0.1ml、0.3ml、0.5ml、0.7ml、0.9ml于10ml具塞刻度试管中，于60℃水浴挥干溶剂，加入0.2ml5％香草醛-冰醋酸溶液(新鲜)，加入0.8ml高氯酸，混匀，于60℃水浴中显色15min，水浴后立即用冰水冷却5min，加入5ml冰醋酸，充分振荡，静置10min，以0为空白对照，在560nm波长处测定吸光度，以吸光度值为纵坐标，人参皂苷rb1标准品溶液浓度为横坐标，用最小二乘法进行线性回归，得到皂苷标准曲线。

③phi、phh、dphi样品中皂苷测定：phi、phh、dphi样品分别用超纯水溶解成2mg/ml溶液，将phi、phh、dphi溶液5000rpm离心10min，精确移取0.2ml上清于10ml带刻度试管中，按照皂苷标准曲线绘制方法测定phi、phh、dphi样品吸光度，代入皂苷标准曲线，得到phi、phh、dphi样品溶液中总皂苷含量。

由上述方法绘制皂苷标准曲线如图5。

由上述方法测得phi、phh、dphi样品中总皂苷含量如表5。

表5phi、phh、dphi中总皂苷含量

实施例8

樟树籽仁提取物dphi、碱消化樟树籽仁提取物phh、胃肠液消化樟树籽仁提取物dphi抗氧化性测定。

①dpph溶液的配制：精密称取dpph试剂8.0mg，用无水甲醇溶解并定容至200ml棕色容量瓶中，得浓度为0.004％的dpph溶液，避光保存，备用。

②dpph自由基清除标准曲线绘制：用无水甲醇配制不同浓度的trolox的溶液，精确吸取0.5ml不同浓度的trolox的溶液，置10ml具塞刻度试管中，加入3.0ml的dpph溶液，室温避光反应30min，同时以无水甲醇为空白，于517nm波长处测定吸光值。以trolox为阳性对照。按下列公式计算dpph自由基清除率。

dpph自由基清除率(％)＝(1-as/a0)×100％

公式中，a0—无水甲醇+3.0mldpph溶液的吸光度值

as—样品溶液+3.0mldpph溶液的吸光度值

③phi、phh、dphi样品中黄酮测定：phi、phh、dphi样品分别用超纯水溶解成2mg/ml溶液，将phi、phh、dphi溶液5000rpm离心10min，精确移取0.5ml上清于10ml带刻度试管中，按照dpph自由基清除标准曲线绘制方法测定phi、phh、dphi样品自由基清除率。

由上述方法测得troloxdpph自由基清除标准曲线如图6。

由上述方法测得phi、phh、dphi样品dpph自由基清除率如表6。

表6phi、phh、dphidpph自由基清除

实施例10

樟树籽仁提取物dphi、碱消化樟树籽仁提取物phh、胃肠液消化樟树籽仁提取物dphi抑制乙酰胆碱酯酶酶活测试。

取50μl适宜浓度的样品溶液与50μl0.1mph8.0pbs和125μl1mm5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(dtnb)和25μl0.5u/ml的乙酰胆碱酯酶(ache)于96孔酶标板上混匀，室温反应15min后加入25μl1mm碘代硫代乙酰胆碱(atci)，室温下反应15min后于405nm检测吸光值。以不加酶和样品的反应体系为空白。以加兰他敏(galanthamine)为阳性对照。乙酰胆碱酯酶抑制率(i)按式(1)计算。每克测试样品抑制乙酰胆碱酯酶活力等价于加兰他敏量按式(2)换算。

抑制率(i)＝[1-(c-d)/(a-b)]×100％(1)

a—未加样品的加酶的混合液所测的吸光度；

b—未加样品未加酶的混合液所测的吸光度；

c—加样品加酶的混合液所测的吸光度；

d—加样品未加酶的混合液所测的吸光度；

μmolgalaes/g提取物＝[x×275/(50×c×287.35)]×10⁶(2)

galaes-加兰他敏；

x—样品测得的抑制率代入加兰他敏抑制率曲线得到的加兰他敏浓度(mg/ml)；

275—酪氨酸酶抑制反应总体积(μl)；

50—样品体积；

287.35—加兰他敏分子量；

由上述方法测得phi、phh、dphi抑制乙酰胆碱酯酶活力如表7。

表7phi、phh、dphi抑制乙酰胆碱酯酶活力

由表7可知，樟树籽仁提取物具有较强的乙酰胆碱酯酶抑制活性。樟树籽仁提取物经碱液和胃肠消化液消化后乙酰胆碱酯酶抑制活力分别保留94.3％和63.7％，表明樟树籽仁提取物对碱和胃肠消化液具有较强的耐受性。樟树籽仁提取物在乙酰胆碱酯酶抑制剂中具有较好的应用前景。

实施例11

樟树籽仁提取物dphi、碱消化樟树籽仁提取物phh、胃肠液消化樟树籽仁提取物dphi抑制丁酰胆碱酯酶酶活测试。

取50μl适宜浓度的样品溶液与50μl0.1mph8.0pbs和125μl1mm5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(dtnb)和25μl0.5u/ml的丁酰胆碱酯酶(bche)于96孔酶标板上混匀，室温反应15min后加入25μl1mm碘代硫代丁酰胆碱(btci)，室温下反应15min后于405nm检测吸光值。以不加酶和样品的反应体系为空白。以加兰他敏(galanthamine)为阳性对照。按照丁酰胆碱酯酶抑制率(i)按式(1)计算。每克测试样品抑制丁酰胆碱酯酶活力等价于加兰他敏量按式(2)换算。

由上述方法测得phi、phh、dphi抑制丁酰胆碱酯酶活力如表8。

表8phi、phh、dphi抑制丁酰胆碱酯酶活力

由表8可知，樟树籽仁提取物具有较强的丁酰胆碱酯酶抑制活性。樟树籽仁提取物经碱液和胃肠消化液消化后丁酰胆碱酯酶抑制活力分别保留69.3％和41％，表明樟树籽仁提取物对碱和胃肠消化液具有较强的耐受性。樟树籽仁提取物在丁酰胆碱酯酶抑制剂中具有较好的应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。