黄芪多糖壳聚糖纳米粒的制备方法及其用途与流程

本发明属于制药领域，涉及黄芪多糖壳聚糖纳米粒的制备方法，本发明还涉及黄芪多糖壳聚糖在预防和治疗黄颡鱼鲶爱德华氏菌病中的新用途。
背景技术：
：黄颡鱼(pelteobagrusfulvidraco)隶属于鲇形目(siluriformes)、鲿科(bagridae)、黄颡鱼属(pelteobagrus)，分布于我国各大水系，尤其是长江中下游的湖泊、池塘、溪流中广泛分布。作为我国重要的淡水经济鱼类，黄颡鱼肉质鲜美细嫩，风味、口感俱佳，深受消费者青睐，市场需求量也逐年增大，近些年来在国内被广泛养殖。然而随着黄颡鱼人工养殖面积不断扩大，随之而来的疾病问题也日益严重。其中细菌性疾病是黄颡鱼养殖中危害最为严重的一类疾病，已成为制约黄颡鱼养殖业健康发展的瓶颈问题。其中，对黄颡鱼影响最为严重的细菌性疾病为鲶爱德华氏菌(e.ictaluri)病。鲶爱德华氏菌做为一种胞内菌，因众多抗菌药物很难进入胞内而达不到治疗效果。鲶爱德华氏菌病的爆发具有明显的季节性，春末、秋初水温在22-28℃是该病爆发的高峰期，高于或低于这个时期则表现为隐性感染，死亡率较小。对于已感染的鱼体来说，其发病的表现形式主要有急性型和慢性型两种。急性型发病急、死亡率高，主要症状为败血症与肠炎。慢性型是e.ictaluri经鼻腔或头盖骨皮肤黏膜进入嗅球，再由嗅觉神经侵入大脑，e.ictaluri在嗅囊内增值并在大脑内形成肉芽肿性炎症，最终于头部形成溃疡性症状。黄颡鱼因慢性感染e.ictaluri引起头部特殊的症状，俗称“开天窗”或“一点红”。病原菌的致病过程是病原和宿主相互作用的过程，对病原来说要经历黏附、侵入、生长繁殖、抵抗宿主免疫反应、产生毒素等阶段。鲶爱德华氏菌致病过程的各种作用机制还没完全明晰，目前认为鲶爱德华氏菌的主要毒力因子为溶血素、脂多糖、荚膜多糖、透明质酸酶等。研究表明，e.ictaluri可产生β-溶血素，且在正常生长条件下，e.ictaluri强毒株产溶血素比比弱毒株多(stanleyetal1994)，而williams(2003)的研究发现，溶血素的产生对鲶鱼的毒性不强，因此，溶血素在该菌的致病机制中的作用有待进一步研究；此外，作为e.ictaluri保护屏障的脂多糖，且具有单一o血清型的抗原可抵抗补体等的溶解与吞噬细胞的吞噬(lawrenceetal2001)，而荚膜多糖是以覆盖在细菌表面的形式来逃逸宿主的免疫应答反应；透明质酸酶作为一种蛋白质水解酶，能特异性的分解透明质酸，并协助细菌在宿主体内扩散，释放毒素，破坏机体的细胞与组织(黄源春等2008)。也有研究认为e.ictaluri可分泌软骨素酶，降解软骨素与细胞基质，可能黄颡鱼的“红头病”与此有关(cooperetal1996)。对于已经感e.ictaluri并已出现疾病症状的鱼体来说，必须马上进行药物治疗以控制死亡率。有研究表明，e.ictaluri对多种抗生素敏感，如氨基糖苷类、头孢类及喹诺酮类等(张彬等2010)。黄芪多糖是黄芪(astragalusmembranaceus)的主要活性成分之一，对人体具有免疫调节、抗氧化、抗应激、保肝护肾、抗菌、抗病毒等多种的药理作用，目前黄芪多糖已广泛应用于畜禽生产，并在一些水产动物的疾病防治上也取得了不错的效果，但还没有抗鲶爱德华氏菌的相关报导。另外，目前黄芪多糖的常规剂型存在降解、释放速度快，药物在达到作用部位之前，大部分已被降解代谢，因此需要加大给药剂量和次数，这在水产养殖鱼类上造成非常不便。技术实现要素：本发明的一个目的是提供一种黄芪多糖壳聚糖纳米粒的制备方法，本发明的另一个目的是提供黄芪多糖壳聚糖在预防和治疗黄颡鱼鲶爱德华氏菌病中的新用途。一种黄芪多糖壳聚糖纳米粒的制备方法，包括以下步骤：1)将壳聚糖溶于醋酸溶液中，搅拌溶胀后制成浓度为0.5-5mg/ml的壳聚糖醋酸溶液；2)向壳聚糖醋酸溶液中加入黄芪多糖，搅拌溶解，然后将混合溶液的ph调节至3-6，所述混合溶液中壳聚糖与黄芪多糖的质量比为3-10：1；3)将三聚磷酸钠用去离子水溶解，制成质量浓度为1-3mg/ml的三聚磷酸钠溶液，然后边搅拌边逐滴加入到步骤2)的混合溶液中，待溶液产生淡蓝色乳光时停止滴加，继续搅拌0.5-2h，即得黄芪多糖壳聚糖纳米粒混悬液；4)将黄芪多糖壳聚糖纳米粒混悬液分装于冷冻瓶中，先-70～-60℃预冷冻1-3h，然后-50～-30℃抽真空冷冻干燥，得到的冻干粉即为黄芪多糖壳聚糖纳米粒。优选地，所述混合溶液中壳聚糖与黄芪多糖的质量比为6：1。优选地，所述混合溶液的ph为5。体外试验结果表明：黄芪多糖壳聚糖纳米粒对鲶爱德华氏菌具有显著的抑制效果，其mic值为0.52mg/ml，能显著减少黄颡鱼头肾巨噬细胞感染鲶爱德华氏菌后的胞内菌数量。体内试验结果表明：黄芪多糖壳聚糖纳米粒能显著降低黄颡鱼感染鲶爱德华氏菌后的死亡率并改善疾病症状，对鲶爱德华氏菌具有很好的预防和治疗作用。本发明采用现代制剂技术，首次应用离子交联法制备黄芪多糖壳聚糖纳米粒，减少了药物在达到作用部位之前的降解，降低了药物释放速度并延长了释放时间，改善了黄芪多糖的稳定性和在体内的利用度，从而提高了疗效，减少了给药次数和剂量，更便于应用于养殖鱼类。附图说明图1、黄芪多糖壳聚糖纳米粒体外药效评价。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明进行详细地说明。实施例11)将壳聚糖溶于1％(v/v)醋酸溶液中，搅拌溶胀后制成浓度为1.5mg/ml的壳聚糖醋酸溶液；2)向壳聚糖醋酸溶液中加入黄芪多糖，搅拌溶解，然后将混合溶液的ph调节至5，所述混合溶液中壳聚糖与黄芪多糖的质量比为6：1；3)将三聚磷酸钠用去离子水溶解，制成质量浓度为1.5mg/ml的三聚磷酸钠溶液，然后边搅拌边逐滴加入到步骤2)的混合溶液中，待溶液产生淡蓝色乳光时停止滴加，继续搅拌1h，即得黄芪多糖壳聚糖纳米粒混悬液；4)将黄芪多糖壳聚糖纳米粒混悬液分装于冷冻瓶中，先-70℃预冷冻2h，然后-50℃抽真空冷冻干燥，得到的冻干粉即为黄芪多糖壳聚糖纳米粒。实施例21)将壳聚糖溶于1％(v/v)醋酸溶液中，搅拌溶胀后制成浓度为3mg/ml的壳聚糖醋酸溶液；2)向壳聚糖醋酸溶液中加入黄芪多糖，搅拌溶解，然后将混合溶液的ph调节至3，所述混合溶液中壳聚糖与黄芪多糖的质量比为9：1；3)将三聚磷酸钠用去离子水溶解，制成质量浓度为1mg/ml的三聚磷酸钠溶液，然后边搅拌边逐滴加入到步骤2)的混合溶液中，待溶液产生淡蓝色乳光时停止滴加，继续搅拌2h，即得黄芪多糖壳聚糖纳米粒混悬液；4)将黄芪多糖壳聚糖纳米粒混悬液分装于冷冻瓶中，先-60℃预冷冻3h，然后-40℃抽真空冷冻干燥，得到的冻干粉即为黄芪多糖壳聚糖纳米粒。实施例31)将壳聚糖溶于1％(v/v)醋酸溶液中，搅拌溶胀后制成浓度为0.5mg/ml的壳聚糖醋酸溶液；2)向壳聚糖醋酸溶液中加入黄芪多糖，搅拌溶解，然后将混合溶液的ph调节至6，所述混合溶液中壳聚糖与黄芪多糖的质量比为3：1；3)将三聚磷酸钠用去离子水溶解，制成质量浓度为3mg/ml的三聚磷酸钠溶液，然后边搅拌边逐滴加入到步骤2)的混合溶液中，待溶液产生淡蓝色乳光时停止滴加，继续搅拌0.5h，即得黄芪多糖壳聚糖纳米粒混悬液；4)将黄芪多糖壳聚糖纳米粒混悬液分装于冷冻瓶中，先-70℃预冷冻3h，然后-30℃抽真空冷冻干燥，得到的冻干粉即为黄芪多糖壳聚糖纳米粒。试验例实验用“黄优”黄颡鱼来自湖北“黄优”源渔业发展有限公司，鲶爱德华氏菌由中国水产科学研究院长江水产研究所曾令兵研究员提供。1.形态表征取实施例1－3制备的黄芪多糖壳聚糖纳米粒冻干粉适量，用双蒸水稀释成适宜的浓度后，吸取一滴，滴加在覆盖碳膜的铜网上，再滴加一滴2.0磷钨酸钠溶液负染，在室温条件下自然晾干后，用透射电镜观察粒子的形态。黄芪多糖壳聚糖纳米粒冻干粉呈白色且表面蓬松，负染后经透射电镜(tem)观察，纳米粒形态规则、外形圆整、分散性好，无明显黏连现象，粒径达到纳米级。2.包封率和载药量测定精密称取适量黄芪多糖壳聚糖纳米粒冻干粉置于量瓶中，加入无水乙醇溶液10ml，在4℃避光条件下，超声10min，轻轻振摇，使黄芪多糖完全释放溶解后，在12000r/min条件下高速离心后，收集上清液，于288nm处测定溶液中黄芪多糖的吸光度值并采用外标一点法计算黄芪多糖的浓度，最后根据下式计算黄芪多糖壳聚糖纳米粒的包封率和载药量：包封率(％)＝(投药总量－上清液中药物含量)/投药总量×100％；载药量(％)＝壳聚糖纳米粒中所包载黄芪多糖的含量/壳聚糖纳米粒的质量×100％。结果见表1。表1黄芪多糖壳聚糖纳米粒的包封率和载药量包封率(％)载药量(％)实施例156.915.5实施例252.715.1实施例353.314.63.mic测定取一个96孔板(共8行，每行12个孔)，标记为96孔板，在96孔板每个孔中加入100μlbhi液体培养基，然后在第1行的各孔中加入100μl药液(此处指的是指将实施例1制得的黄芪多糖壳聚糖纳米粒分散于pbs缓冲液中配制而成的12.5μg/ml的药液)，从第1行各孔中吸取100μl混合液分别加入第2行的各孔中，依次类推至第6行，并从第六行中吸取100μl混合液弃去，得到2、4、8、16、32、64倍稀释的药物，即为实验组。第7行的各孔加入10μl双抗(将青霉素与链霉素混合溶液(100×双抗)进行稀释100倍)作为阳性对照组，第8行的各孔不加药液与双抗作为阴性对照组。在上述实验组、阴性对照与阳性对照液体加入完毕后，并在96孔板各孔加入10μl1×106cfu/ml鲶爱德华氏菌菌液，37℃培养24h后取出观察96孔板中个孔中的浑浊度(即鲶爱德华氏菌在各孔中的生长情况)，从而得到mic值。重复两次试验。测得黄芪多糖壳聚糖纳米粒的mic值为0.52mg/ml。4.体外药效试验实验用黄颡鱼麻醉后于尾柄处静脉抽血，体表用75％酒精消毒，再于无菌操作台下分离取出头肾组织，实验前将无菌操作台紫外照射30min。将分离出的头肾组织放入预冷的aim液中浸泡2次，每次30min。采用percoll不连续密度梯度离心法，取无菌10ml离心管，先加入3ml34％percoll液，再用注射器吸取3ml51％percoll液，将注射器针头插入34％percoll液底层，轻轻推动注射器，使51％percoll液填于底层。两种percoll液间形成明显的分层，若分界不明显则弃之重加。将浸泡除菌的头肾组织放入100目筛网，再放入无菌培养皿中，用无菌注射器推头轻轻挤压研磨组织形成单细胞悬液，边研磨便加入培养基。将磨好的单细胞悬液沿管壁慢慢加入percoll液上层，整个操作保持无菌。以400g离心力，4℃下离心30min。离心、降速要平缓，以免破坏percoll梯度。离心完毕后轻取离心管，以免破坏细胞分层界面。收集离心后两层percoll液之间的细胞悬液，在400g离心力，4℃条件下hank’s液洗2次，每次10分钟。适量培养基重悬细胞，调整至5.0×107cells/ml后接种于96孔细胞培养板，细胞贴壁采用含0.2％胎牛血清、1％青链双抗的l-15培养基，贴壁2～3h后，更换为含5％胎牛血清、1％青链双抗的l-15培养基。将分离得到的黄颡鱼头肾巨噬细胞培养2-3h换液后进行细菌感染。冻存的e.ictaluri于28℃、bhi固体培养基进行复苏，长出菌落后再转接于新的bhi固体培养基上直至长出新菌落以备用。以moi＝1:10(1细胞：10细菌)进行感染，感染半小时后，用无菌pbs洗去未感染的细菌，再加入新的培养基时，实验组中加入溶好的恩诺沙星壳聚糖纳米粒乳液，其在培养基中的浓度为2μg/ml,对照组加入正常培养基。分别继续培养0.5h、1.0h、1.5h、2h、2.5h、3h后，收取相应时间点的细胞，并用无菌水裂解细胞，释放出胞内的e.ictaluri。将收集到的菌按不同的浓度梯度稀释后涂平板，每组涂3个板，重复3次。如图1，与实验组相比，对照组的每个取样点的胞内菌数量都极显著高于实验组(p<0.001)。5.体内实验将90尾黄颡鱼随机分成三组，每组30尾，第一组注射200μl含0.6mg黄芪多糖的壳聚糖纳米粒水溶液；第二组注射200μl含0.6mg黄芪多糖的水溶液；第三组注射200μl无菌pbs溶液，饲养24h后，用1.0×107cfu/ml鲶爱德华氏菌进行攻毒，每尾鱼腹腔注射0.2ml；连续观察15d，统计各组的死亡率。注射pbs的黄颡鱼在2-3d开始出现浮头现象，尤其在傍晚时分浮头现象较为明显，5-7d时黄颡鱼出现大量死亡现象，且体表红肿，溃烂，10d后有个别存活的黄颡鱼头部出现头穿孔现象。而注射黄芪多糖壳聚糖纳米粒的黄颡鱼1d后有2尾黄颡鱼死亡，无明显病变，可能是注射时的应激死亡。表2黄芪多糖壳聚糖纳米粒对黄颡鱼攻毒死亡率的影响药物第5天死亡率第10天死亡率第15天死亡率黄芪多糖壳聚糖纳米粒13.323.333.3黄芪多糖26.743.356.7pbs43.37086.7当前第1页1 2 3