本发明涉及黄酮类药物，尤其是涉及淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞增生与降糖中的应用。
背景技术：
淫羊藿(herbaepimedii)系小檗科淫羊藿属(epimedium)植物，淫羊藿含有特殊的化学成分和显著的生物活性，是一种具有广泛药理活性的中药材。淫羊藿素(icaritin)是淫羊藿中主要有效成分淫羊藿苷的苷元，既为淫羊藿苷的体内代谢产物，也均少量存在于淫羊藿药材中，属黄酮醇类化合物。
糖尿病以1型和2型为主，1型糖尿病是自体免疫性疾病，由自体免疫系统破坏产生胰岛素的β-细胞引起的；2型糖尿病主要由胰岛素抵抗及胰岛素相对缺乏引起的。这两种糖尿病的最终发病都会引起胰岛β-细胞数量减少或者功能损伤，从而降低胰岛素的分泌。而寻找促进胰岛β-细胞增生的药物，以期用在糖尿病治疗上一直是科学领域的研究热点。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞增生与降糖中的应用。
所述淫羊藿素的结构式为：
所述淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞增生中的应用。
所述淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞增生中应用的方法，包括以下步骤：
1)tg(-1.2ins:h2bmcherry，即胰岛β细胞带红色荧光标记)斑马鱼的药物处理
将发育至4～6天的斑马鱼转移至24孔板中，在24孔板中依次加入斑马鱼胚胎培养液、斑马鱼以及淫羊藿素溶液，待全部加入完毕，将其转移至光照培养箱中培养24h；
在步骤1)中，所述在24孔板中可依次加入斑马鱼胚胎培养液2ml，斑马鱼8～10尾，10mmol/l的淫羊藿素溶液2μl；所述光照培养箱的条件可为光照︰黑暗的时间比为14︰10，培养箱中的温度可为28.5℃。
2)斑马鱼的固定
药物处理过的斑马鱼胚胎转移至干净的1.5～2ml的离心管中，并利用4％的多聚甲醛进行固定；
在步骤2)中，所述固定的温度可为4℃，固定的时间可为8h。
3)斑马鱼胰岛β细胞的计数
斑马鱼胚胎转移至载玻片上，并使右侧朝上，在其上面滴加10～20μl的封片剂进行封片，封片完毕后，利用斑马鱼自身的胰岛β细胞所带有的红色荧光蛋白在荧光显微镜下进行细胞数量统计。
在步骤3)中，为避免荧光蛋白淬灭，固定后的斑马鱼玻片应放置于4℃并尽快进行细胞数量的统计。
所述淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞复制中的应用。
所述淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞复制中应用的方法，包括以下步骤：
1)tg(ins:mag-zgeminin1/100，即新生的胰岛β细胞带绿色荧光标记)斑马鱼的药物处理
将发育至4～6天的斑马鱼转移至24孔板中，在24孔板中依次加入斑马鱼胚胎培养液、斑马鱼以及淫羊藿素溶液，待全部加入完毕，将其转移至光照培养箱中培养24h；
在步骤1)中，所述在24孔板中可依次加入斑马鱼胚胎培养液2ml，斑马鱼8～10尾，10mmol/l的淫羊藿素溶液2μl；所述光照培养箱的条件可为光照︰黑暗的时间比为14︰10，培养箱中的温度可为28.5℃。
2)斑马鱼的固定
药物处理过的斑马鱼胚胎转移至干净的1.5～2ml的离心管中，并利用4％的多聚甲醛进行固定；
在步骤2)中，所述固定的温度可为4℃，固定的时间可为8h。
3)斑马鱼胰岛β细胞的计数
斑马鱼胚胎转移至载玻片上，并使右侧朝上，在其上面滴加10～20μl的封片剂进行封片，封片完毕后，利用斑马鱼新生的胰岛β细胞所带有的绿色荧光蛋白在荧光显微镜下进行细胞数量统计。
在步骤3)中，为避免荧光蛋白淬灭，固定后的斑马鱼玻片应放置于4℃并尽快进行细胞数量的统计。
所述淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞分化中的应用。
所述淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞分化中应用的方法包括以下步骤：
1)tgbac(neurod:egfp，即由前体细胞分化而来的胰岛β细胞带绿色荧光标记)斑马鱼的药物处理
将发育至4～6天的斑马鱼转移至24孔板中，在24孔板中依次加入斑马鱼胚胎培养液、斑马鱼以及淫羊藿素溶液，待全部加入完毕，将其转移至光照培养箱中培养24h；
在步骤1)中，所述在24孔板中可依次加入斑马鱼胚胎培养液2ml，斑马鱼8～10尾，10mmol/l的淫羊藿素溶液2μl；所述光照培养箱的条件可为光照︰黑暗的时间比为14︰10，培养箱中的温度可为28.5℃。
2)斑马鱼的固定
药物处理过的斑马鱼胚胎转移至干净的1.5～2ml的离心管中，并利用4％的多聚甲醛进行固定；
在步骤2)中，所述固定的温度可为4℃，固定的时间可为8h。
3)斑马鱼胰岛β细胞的计数
斑马鱼胚胎转移至载玻片上，并使右侧朝上，在其上面滴加10～20μl的封片剂进行封片，封片完毕后，利用斑马鱼由前体细胞分化而来的胰岛β细胞所带有的绿色荧光蛋白在荧光显微镜下进行细胞数量统计。
在步骤3)中，为避免荧光蛋白淬灭，固定后的斑马鱼玻片应放置于4℃并尽快进行细胞数量的统计。
所述淫羊藿素在降糖中应用。
为了克服基于分子靶点和细胞表型分析进行的药物筛选的不足，本发明提供了以斑马鱼为模型进行淫羊藿素降糖功能的探究，所述淫羊藿素在降糖中应用的方法包括以下步骤：
1)斑马鱼的药物处理
将发育至4～6天的斑马鱼转移至24孔板中，在24孔板中依次加入斑马鱼胚胎培养液、斑马鱼以及淫羊藿素溶液，待全部加入完毕，将其转移至光照培养箱中培养24h；
在步骤1)中，所述在24孔板中可依次加入斑马鱼胚胎培养液2ml，斑马鱼8～10尾，10mmol/l的淫羊藿素溶液2μl；所述光照培养箱的条件可为：光照︰黑暗的时间比为14︰10，培养箱中的温度为27～29℃。
2)斑马鱼上清的获得
利用dgs手持式电动组织研磨器对斑马鱼进行匀浆，待离心机的温度降低至0～4℃时，将匀浆后的组织进行离心，即获得斑马鱼上清；
在步骤2)中，所述离心的速度可为10000～12000rpm/min，离心的时间可为10～15min。
3)斑马鱼血糖含量的测定
利用amplexredglucose/glucoseoxidaseassaykit测定斑马鱼幼鱼的葡萄糖含量，具体操作步骤如下：
所需试剂：
1、amplexredreagent：154μg/管，加60μldmso溶解
2、5×reactionbuffer：按照1︰4的比例稀释成1×reactionbuffer使用
3、horseradishperoxidase(hrp)：10u,加1ml1×reactionbuffer溶解
4、glucoseoxidase(葡萄糖氧化酶)：100u,加1ml1×reactionbuffer溶解
5、d-glucose(葡萄糖标准溶液)：0.1mol/l
按照每100个反应分别需要加50μlamplexredreagent、100μlhrp、100μlglucoseoxidaseand4.75ml1×reactionbuffer配制反应所需mix，在干净的96孔板中依次加入40μl1×reactionbuffer，10μl测定样品，50μlmix；标准曲线按照1×reactionbuffer分别加：50、48、46、44、42、40；0.1mol/l的d-glucose分别加0、2、4、6、8、10。每个孔测定2～3个复孔，放入37℃培养箱孵育30min后，通过酶标仪(激发光：520nm；发射光：580～640nm)测量其荧光值，然后根据标准曲线将荧光值代入计算测定样品的葡萄糖浓度。
本发明以胰岛β-细胞特异性表达mcherry的转基因斑马鱼tg(-1.2ins:h2bmcherry)为模型，进行淫羊藿素促β-细胞增生的活性筛选，并通过指示β-细胞复制的模型tg(ins:mag-zgeminin1/100)，以及指示β-细胞分化的模型tgbac(neurod:egfp)进行进一步分析。并打破传统意义上细胞或分子水平的筛选，以斑马鱼为模型，利用斑马鱼进行淫羊藿素的药物处理后，对其进行血糖水平的测定。整个筛选操作简单，方法便捷高效，可为淫羊藿素在糖尿病领域的进一步开发提供理论基础。
本发明以斑马鱼为模型进行淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞增生以及血糖水平测定方面的应用。促β-细胞增生的活性筛选的方法：(1)以胰岛β-细胞特异性表达mcherry的转基因斑马鱼tg(-1.2ins:h2bmcherry)为模型，进行淫羊藿素的药物处理，探究淫羊藿素对β细胞增生作用的分析；(2)以指示β-细胞复制的转基因斑马鱼tg(ins:mag-zgeminin(1/100)为模型，进行淫羊藿素的药物处理，探究淫羊藿素对β细胞复制作用的分析；(3)以指示β-细胞分化的转基因斑马鱼tgbac(neurod:egfp)为模型，进行淫羊藿素的药物处理，探究淫羊藿素对β细胞分化作用的分析；血糖水平的测定方法：(1)以斑马鱼为模型进行淫羊藿素的药物处理；(2)斑马鱼上清的获取；(3)斑马鱼血糖含量的测定。反应过程简单，容易操作。
本发明从淫羊藿素对胰岛β细胞的数量影响入手，并结合其对血糖水平的影响，探究胰岛β细胞的数量变化与血糖水平之间的关系。不同于传统意义上的分子或细胞水平的药物筛选，这种方法能够更加直接、全面地反应出药物对生物体的反应。
具体实施方式
以下实施例将对本发明作进一步的说明。
所述淫羊藿素的结构式为：
所述淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞增生中的应用。
所述淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞增生中应用的方法，包括以下步骤：
1)tg(-1.2ins:h2bmcherry，即胰岛β细胞带红色荧光标记)斑马鱼的药物处理
将发育至4～6天的斑马鱼转移至24孔板中，在24孔板中依次加入斑马鱼胚胎培养液、斑马鱼以及淫羊藿素溶液，待全部加入完毕，将其转移至光照培养箱中培养24h；
所述在24孔板中依次加入斑马鱼胚胎培养液2ml，斑马鱼8～10尾，10mmol/l的淫羊藿素溶液2μl；所述光照培养箱的条件可为光照︰黑暗的时间比为14︰10，培养箱中的温度可为28.5℃。
2)斑马鱼的固定
药物处理过的斑马鱼胚胎转移至干净的1.5～2ml的离心管中，并利用4％的多聚甲醛进行固定；所述固定的温度可为4℃，固定的时间可为8h。
3)斑马鱼胰岛β细胞的计数
斑马鱼胚胎转移至载玻片上，并使右侧朝上，在其上面滴加10～20μl的封片剂进行封片，封片完毕后，利用斑马鱼自身的胰岛β细胞所带有的红色荧光蛋白在荧光显微镜下进行细胞数量统计。为避免荧光蛋白淬灭，固定后的斑马鱼玻片应放置于4℃并尽快进行细胞数量的统计。
所述淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞复制中的应用。
所述淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞复制中应用的方法，包括以下步骤：
1)tg(ins:mag-zgeminin1/100，即新生的胰岛β细胞带绿色荧光标记)斑马鱼的药物处理
将发育至4～6天的斑马鱼转移至24孔板中，在24孔板中依次加入斑马鱼胚胎培养液、斑马鱼以及淫羊藿素溶液，待全部加入完毕，将其转移至光照培养箱中培养24h；
所述在24孔板中依次加入斑马鱼胚胎培养液2ml，斑马鱼8～10尾，10mmol/l的淫羊藿素溶液2μl；所述光照培养箱的条件可为光照︰黑暗的时间比为14︰10，培养箱中的温度可为28.5℃。
2)斑马鱼的固定
药物处理过的斑马鱼胚胎转移至干净的1.5～2ml的离心管中，并利用4％的多聚甲醛进行固定；所述固定的温度可为4℃，固定的时间可为8h。
3)斑马鱼胰岛β细胞的计数
斑马鱼胚胎转移至载玻片上，并使右侧朝上，在其上面滴加10～20μl的封片剂进行封片，封片完毕后，利用斑马鱼新生的胰岛β细胞所带有的绿色荧光蛋白在荧光显微镜下进行细胞数量统计。为避免荧光蛋白淬灭，固定后的斑马鱼玻片应放置于4℃并尽快进行细胞数量的统计。
所述淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞分化中的应用。
所述淫羊藿素在促进斑马鱼胰岛β细胞分化中应用的方法包括以下步骤：
1)tgbac(neurod:egfp，即由前体细胞分化而来的胰岛β细胞带绿色荧光标记)斑马鱼的药物处理
将发育至4～6天的斑马鱼转移至24孔板中，在24孔板中依次加入斑马鱼胚胎培养液、斑马鱼以及淫羊藿素溶液，待全部加入完毕，将其转移至光照培养箱中培养24h；
所述在24孔板中依次加入斑马鱼胚胎培养液2ml，斑马鱼8～10尾，10mmol/l的淫羊藿素溶液2μl；所述光照培养箱的条件可为光照︰黑暗的时间比为14︰10，培养箱中的温度可为28.5℃。
2)斑马鱼的固定
药物处理过的斑马鱼胚胎转移至干净的1.5～2ml的离心管中，并利用4％的多聚甲醛进行固定；所述固定的温度可为4℃，固定的时间可为8h。
3)斑马鱼胰岛β细胞的计数
斑马鱼胚胎转移至载玻片上，并使右侧朝上，在其上面滴加10～20μl的封片剂进行封片，封片完毕后，利用斑马鱼由前体细胞分化而来的胰岛β细胞所带有的绿色荧光蛋白在荧光显微镜下进行细胞数量统计。为避免荧光蛋白淬灭，固定后的斑马鱼玻片应放置于4℃并尽快进行细胞数量的统计。
所述淫羊藿素在降糖中应用。
为了克服基于分子靶点和细胞表型分析进行的药物筛选的不足，本发明提供了以斑马鱼为模型进行淫羊藿素降糖功能的探究，所述淫羊藿素在降糖中应用的方法包括以下步骤：
1)斑马鱼的药物处理
将发育至4～6天的斑马鱼转移至24孔板中，在24孔板中依次加入斑马鱼胚胎培养液、斑马鱼以及淫羊藿素溶液，待全部加入完毕，将其转移至光照培养箱中培养24h；
所述在24孔板中依次加入斑马鱼胚胎培养液2ml，斑马鱼8～10尾，10mmol/l的淫羊藿素溶液2μl；所述光照培养箱的条件可为：光照︰黑暗的时间比为14︰10，培养箱中的温度为27～29℃。
2)斑马鱼上清的获得
利用dgs手持式电动组织研磨器对斑马鱼进行匀浆，待离心机的温度降低至0～4℃时，将匀浆后的组织进行离心，即获得斑马鱼上清；所述离心的速度可为10000～12000rpm/min，离心的时间可为10～15min。
3)斑马鱼血糖含量的测定
利用amplexredglucose/glucoseoxidaseassaykit测定斑马鱼幼鱼的葡萄糖含量，具体操作步骤如下：
所需试剂：
1、amplexredreagent：154μg/管，加60μldmso溶解
2、5×reactionbuffer：按照1︰4的比例稀释成1×reactionbuffer使用
3、horseradishperoxidase(hrp)：10u,加1ml1×reactionbuffer溶解
4、glucoseoxidase(葡萄糖氧化酶)：100u,加1ml1×reactionbuffer溶解
5、d-glucose(葡萄糖标准溶液)：0.1mol/l
按照每100个反应分别需要加50μlamplexredreagent、100μlhrp、100μlglucoseoxidaseand4.75ml1×reactionbuffer配制反应所需mix，在干净的96孔板中依次加入40μl1×reactionbuffer，10μl测定样品，50μlmix；标准曲线按照1×reactionbuffer分别加：50、48、46、44、42、40；0.1mol/l的d-glucose分别加0、2、4、6、8、10。每个孔测定2～3个复孔，放入37℃培养箱孵育30min后，通过酶标仪(激发光：520nm；发射光：580～640nm)测量其荧光值，然后根据标准曲线将荧光值代入计算测定样品的葡萄糖浓度。
以下给出具体实施例。
实施例1：淫羊藿素促进胰岛β细胞的增生
在洁净的24孔板中，依次加入：2ml的tg(-1.2ins:h2bmcherry)斑马鱼胚胎培养液、10条斑马鱼和2μl的淫羊藿素溶液(浓度为10mm)，利用胶头滴管混合均匀后，放置于光照培养箱中培养24h。再于4℃条件下，利用pfa固定过夜，并利用荧光显微镜进行计数。而且在实验的过程中，应设置dmso药物处理的空白对照，以此促进胰岛β细胞增生与否的标准。
实验数据：经淫羊藿素药物处理过的幼鱼，其胰岛β细胞为42.50±4.365，这与对照组中的数值32.83±2.868相比，可知：淫羊藿素促进胰岛β细胞的增生。
实施例2：淫羊藿素促进胰岛β细胞的复制
在洁净的24孔板中，依次加入：2ml的tg(ins:mag-zgeminin(1/100)斑马鱼胚胎培养液、10条斑马鱼和2μl的淫羊藿素溶液(浓度为10mm)，利用胶头滴管混合均匀后，放置于光照培养箱中培养24h。再于4℃条件下，利用pfa固定过夜，并利用荧光显微镜进行计数。而且在实验的过程中，应设置dmso药物处理的空白对照，以此促进胰岛β细胞复制与否的标准。
实验数据：经淫羊藿素药物处理过的幼鱼，其胰岛β细胞为2.333±0.5578,这与对照组中的数值1.950±0.02887相比，可知：淫羊藿素促进胰岛β细胞的复制。
实施例3：淫羊藿素促进胰岛β细胞的分化
在洁净的24孔板中，依次加入：2ml的tgbac(neurod:egfp)斑马鱼胚胎培养液、10条斑马鱼和2μl的淫羊藿素溶液(浓度为10mm)，利用胶头滴管混合均匀后，放置于光照培养箱中培养24h。再于4℃条件下，利用pfa固定过夜，并利用荧光显微镜进行计数。而且在实验的过程中，应设置dmso药物处理的空白对照，以此作为促进胰岛β细胞分化与否的标准。
实验数据：经淫羊藿素药物处理过的幼鱼，其胰岛β细胞为2.333±0.3333,这与对照组中的数值3.000±0.5774相比，可知：淫羊藿素不能促进胰岛β细胞的分化。
实施例4：淫羊藿素的降糖功效
在洁净的24孔板中，依次加入：2ml的斑马鱼胚胎培养液、10条斑马鱼和2μl的淫羊藿素溶液(浓度为10mm)，利用胶头滴管混合均匀后，放置于光照培养箱中培养24h。再于4℃条件下，提取斑马鱼上清溶液。最后利用amplexred试剂盒测定斑马鱼幼鱼的葡萄糖含量。而且在实验的过程中，应设置dmso药物处理的空白对照，以此作为后续血糖水平降低与否的标准。
实验数据：每条经淫羊藿素药物处理过的幼鱼，其血糖值为171.6±6.978pmol，这与对照组中的葡萄糖值288.1±22.58pmol相比，*p<0.05。
本发明以斑马鱼为模型，进行斑马鱼胰岛β细胞数量的测定。即利用转基因斑马鱼进行淫羊藿素的药物处理后，探究淫羊藿素对胰岛β细胞的增生、复制以及分化作用的影响，并探究其对血糖水平的影响。