木犀草素的应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及木犀草素的应用。

背景技术：

ndds(neurodegenerativediseases，神经退行性疾病)是一类神经元疾病，由异常的蛋白质积累和脑组织特定区域神经元结构和功能的进行性缺陷导致的神经元死亡引起，包括老年痴呆(alzheimer’sdisease，ad)、帕金森(parkinson’sdisease，pd)、多发性硬化症(multiplesclerosis，ms)等。目前，ndds多发于中老年人群中，随着我国社会老龄化程度加剧，该类病严重影响中老年人日常的工作、学习与生活，更是对病患者本人、家庭以及社会造成了沉重的心理和经济负担。由于nd发病机制复杂、部位特殊，至今仍缺乏有效的治疗药物，因此研发一种毒副作用小，治疗nd的药物迫在眉睫。

近年来，越来越多的临床研究表明，神经炎症广泛的参与到各种ndds，与之密切相关。当脑受到刺激时，变性蛋白形成的寡聚体产生神经毒性，引起氧化损伤，释放过量金属离子，三者之间密切相关。当机体受到体内外的刺激时，异常的蛋白堆积形成毒性物质，产生神经毒性，进而激活小胶质细胞，释放tnf-α、il-1β等炎症因子，诱导氧化应激反应，造成神经元损伤；同时，低聚毒性物质aβ等与金属离子结合，加重氧化应激反应、诱导星形胶质细胞的活化，扩大氧化应激和神经炎症反应。可以看出，ndd的常见病理特征错综复杂，不可分割，形成恶性循环，对脑组织造成无法逆转的损伤。因此，寻找和研究脑内神经炎症抑制剂，对于开发具有治疗多种神经退行性疾病的新型药物具有重要的意义。

木犀草素(luteolin)是一种天然黄酮类化合物，分子式为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，存在于多种植物中，具有多种药理活性，如消炎、抗过敏、降尿酸、抗肿瘤、抗菌、抗病毒等，临床主要用于止咳、祛痰、消炎、降尿酸、治疗心血管疾病、治疗“肌萎缩性脊髓侧索硬化症”，sars，肝炎等。但目前未见木犀草素用于防治神经炎症相关疾病的报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种木犀草素的应用，该木犀草素可以显著抑制神经炎症的活性。

神经炎症主要表现为小胶质细胞激活，小胶质细胞内炎症因子大量释放，tlr4信号通路的激活，同时伴随记忆损伤和认知功能障碍。

本发明提供了木犀草素在制备抑制小胶质细胞激活药物中的应用。

优选地，所述药物用于抑制所述小胶质细胞中炎症因子il-1β、il-6和tnf-α的表达。

优选地，所述药物用于抑制所述小胶质细胞中no信号分子的产生。

本发明采用no试剂盒检测木犀草素对lps诱导的小鼠小胶质细胞no的释放的影响。结果表明木犀草素可显著抑制小胶质细胞的激活和小胶质细胞中no的释放。

本发明还提供了木犀草素在制备阻断tlr4信号通路药物中的应用。

本发明中，优选阻断tlr4信号通路下游的myd88蛋白、nf-kb蛋白和/或mapk蛋白的表达，因而木犀草素可以阻断toll样受体4(tlr4)信号通路。

本发明还提供了木犀草素在制备抑制神经炎症药物中的应用。

优选地，所述神经炎症为脂多糖诱导的神经小胶质细胞炎症。

本发明还提供了木犀草素在制备预防或治疗神经退行性疾病药物中的应用。

优选地，所述神经退行性疾病选自：老年痴呆、帕金森或多发性硬化症。

优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

优选地，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂或注射剂。

从以上技术方案可以看出，本发明具有以下优点：

本发明提供了木犀草素的应用，由实验结果可知，木犀草素可以抑制lps诱导的小胶质细胞的激活，显著抑制小胶质细胞内no信号分子的产生，小胶质细胞和tlr4信号通路下游炎症因子il-1β、il-6和tnf-α的表达。因此，木犀草素可以显著抑制神经炎症活性，可用于制备预防或治疗神经退行性疾病药物，具有临床应用价值和开发前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明实施例1不同浓度的木犀草素对细胞活力的影响图；

图2为本发明实施例2不同浓度的木犀草素抑制lps诱导小胶质细胞内no的抑制率。

具体实施方式

为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例bv-2细胞购买于国家实验细胞资源共享平台，木犀草素购买于四川省维克奇生物科技有限公司，no试剂盒购于碧云天试剂公司，lps购于sigma-aldrich。

实施例1

本实施例采用mtt法考察不同浓度的木犀草素对小鼠小胶质细胞的活力的影响。

(1)小鼠小胶质细胞系bv-2的培养

细胞培养液以dmem为基础，加入10％fbs、1％双抗(青霉素和链霉素)配置。小鼠小胶质细胞系bv-2培养在5％co2，37℃的细胞培养箱中，定期在显微镜下观察细胞生长情况，当细胞贴壁面积约占培养瓶的70％-80％时，用胰酶消化细胞并传代，之后继续培养。

(2)细胞活力测定

实验原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性mtt还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(dmso)能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在540或720nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

检测方法：取对数生长期的bv2细胞，将细胞接种于96孔板内，细胞密度为5000/well，接种量为100ul/well，置于培养箱内。24小时后，取出96孔板，弃去上清液，按实验组分组，分别换成无血清的dmem培养液配置的不同浓度木犀草素(25μm、50μm、100μm、200μm)来孵育细胞，同时设置对照孔(对照组未加入木犀草素)和调零孔(tl)，每组设置6个复孔，置于培养箱中孵育24h。24小时后取出96孔板，弃去上清液，避光加mtt溶液(浓度0.5mg/ml)，每孔100ul，然后在放入培养箱培养4小时。4h后，终止培养，小心吸走孔内培养液，每孔加入150uldmso，把板子前后左右摇晃数次，用酶标仪测试在570nm的波长处光吸收值，并计算细胞活力。

如图1所示，木犀草素(mxc)在浓度为100μm及以下时，对细胞活力无影响，因此可选择100μm及以下药物浓度，进行药效验证。

实施例2

本实施例采用criess比色法考察木犀草素对lps诱导的小胶质细胞no释放的抑制作用；

细胞株：小鼠小胶质细胞株bv-2；

药物：木犀草素、lps、no试剂盒

亚硝酸盐含量测定：

实验原理:当lps刺激机体产生神经炎症时，bv2细胞被大量激活，nos的表达量迅速增加，催生大量的no；no可诱导ros反应形成过氧亚硝酸阴离子(onoo-)，产生神经毒性物质oh·、oh-，导致蛋白变性、神经元损伤。no在生物体内、水溶液中极易被氧化生成no^2-和no^3-，而no^3-可以通过镉被还原为no^2-；no^2-在碱性环境下与磺胺作用可生成重氮化合物，再与n-1-萘基乙二胺盐进行偶联反应，生成的偶氮化合物显紫红色，该产物在540-550nm处存在较大吸收峰，使用酶标仪测量产物溶液在540nm处的吸光强度。

检测方法：取对数生长期的bv2细胞，将细胞接种于96孔板内，细胞密度为1*10^⁵/ml，接种量100μl/well，置于培养箱中培养。24小时后，取出96孔板，弃去上清液，按实验组分组，分别换成lps+无血清的dmem培养液配置的不同浓度木犀草素(3.125μm、6.25μm、12.5μm、25μm、50μm、100μm)来孵育细胞、lps组(添加含100ng/mllps的基础培养基100μl)和对照组(添加100μl的基础培养基)，每组设置6个复孔，置于培养箱中孵育24h。24小时后取出96孔板，取50μl的细胞培养上清液加入96孔板中，避光依次各加入50μl的试剂盒中的a、b试剂，10min后用酶标仪540nm测吸光度，然后根据吸光值通过公式计算抑制率＝(od-lps组平均值)/(对照组平均值-lps平均值)计算出no的抑制率。

如图2所示，木犀草素可显著抑制lps诱导的小胶质细胞no的释放。

以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。