青蒿素衍生物在制备抗焦虑症的药物或缓解焦虑症的食品中的应用的制作方法

本发明涉及青蒿素衍生物的新用途，尤其涉及青蒿素衍生物在制备抗焦虑症的药物或缓解焦虑症的食品中的应用。

背景技术：

焦虑症以及精神疾病伴发的焦虑症状是一类发作性或持续性焦虑和紧张情绪为主要特征的神经精神疾病。近年来焦虑症的发病率逐年上升，严重影响患者的生存质量。目前，焦虑症的治疗主要采用药物及心理治疗。而焦虑症的发作与中枢神经系统相关神经环路的功能异常密切相关。

脑内兴奋性/抑制性突触传递平衡(e/i平衡)是指中枢神经环路中兴奋性神经元或兴奋性神经递质的活动与抑制性神经元或抑制性神经递质活动间的动态平衡，是大脑正常功能和可塑性形成和维持的重要基础。e/i平衡的异常会诱发焦虑症、抑郁症、癫痫、帕金森、睡眠障碍等多种神经疾病。现代神经科学研究多用其评价局部神经环路中兴奋性与抑制性突触传递功能之间的动态改变，进一步提示局部环路中兴奋性和抑制性神经元数量、形态或功能等变化，这些变化与特定的行为、情感或认知活动密切相关。

青蒿，别名草蒿，属菊科类一年生或二年生草本植物，青蒿素(artemisinin)是我国药学人员于20世纪70年代从菊科植物黄花蒿叶中提取的一种含过氧化基团结构的倍半萜内酯化合物。其衍生物主要包括青蒿琥酯、二氢青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚等，是一类被广泛运用的抗疟疾药物。蒿甲醚(artemether，art)是青蒿素的甲基醚衍生物。蒿甲醚抗疟疾的效果是其先导化合物青蒿素的6倍，目前被广泛用于制备抗疟疾药物，具有安全性高，毒副作用小等优点。此外，蒿甲醚还有抗炎和抗肿瘤等功效，并且可通过血脑屏障分布到中枢神经系统内。经临床试验证明，蒿甲醚同时具有水溶性和脂溶性的特点，化学性能比其它衍生物更为稳定，临床上常用肌肉注射作为其治疗疟疾的方法。双氢青蒿素(dihydroartemisinin,dha)作为第一种被开发的青蒿素衍生物，具有高效抗疟、低毒和起效迅速等优点。目前在抗肿瘤活性，抗免疫抑制如红斑狼疮，抗寄生虫等方面有较良好的效果。青蒿琥酯(artesunate,as)是在双氢青蒿素的基础上进行酯化形成的青蒿水溶性衍生物，其生物利用度高，在抗炎、抗肿瘤等领域也有着良好疗效。

可见，青蒿素衍生物的安全性较高，毒副作用小，在拓展其它疾病方向的研究有很好的应用前景。目前，尚未见报道青蒿素衍生物通过作用于中枢兴奋性/抑制性突触传递平衡来达到抗焦虑效果或缓解焦虑效果的相关机制研究。

虽然，中国专利申请cn107149601a中公开了青蒿素类化合物具有治疗神经病理性疼痛及痛诱发焦虑症状的作用。但该专利申请是以青蒿素类药物的镇痛效果为首要观察，而疼痛导致的焦虑症状会因为疼痛的减轻而得到有效缓解。因此，该专利申请所涉及的焦虑表型仅限于神经病理性疼痛伴发的痛情绪症状，与本发明所涉及的焦虑症状的病因不同，本领域技术人员难以基于青蒿素类药物对神经病理性疼痛的效果联想到其抗焦虑作用。其次，该专利申请应用单一的旷场实验观察青蒿素类药物对神经病理性疼痛模型小鼠在中央区停留时间有增加作用，然而旷场实验不是检验焦虑行为的经典指标，并不能由此判断青蒿素类药物具有抗焦虑作用。而本发明是在发现青蒿素衍生物对中枢e/i平衡的调节作用的基础上，运用了两个经典的动物焦虑行为评价指标，包括高架十字迷宫和明暗箱实验，首次明确了青蒿素衍生物的抗焦虑作用，并首次明确了青蒿素衍生物对中枢e/i平衡的调节作用。

技术实现要素：

为解决上述现有技术中存在的缺点和不足，本发明提供了青蒿素衍生物在制备抗焦虑症的药物或缓解焦虑症的食品中的应用。所述焦虑症包括自发或由遗传、疾病、药物及不良事件等引起的广泛性焦虑。

本发明所述的青蒿素衍生物包括蒿甲醚、青蒿琥酯和双氢青蒿素中的至少一种。

本发明还提供了所述青蒿素衍生物作为一种调节中枢神经系统的兴奋性/抑制性突触传递平衡的作用剂在制备抗焦虑症的药物或缓解焦虑症的食品中的应用。

本发明还提供了所述青蒿素衍生物作为一种提高锥体神经元上的抑制性突触后电流的作用剂在制备抗焦虑症的药物或缓解焦虑症的食品中的应用。

其次，本发明还提供了一种抗焦虑症的药物，其含有有效剂量的所述青蒿素衍生物及其药用盐，和药学上可接受的载体。

在上述药物中，所述青蒿素衍生物可单独直接使用，也可与其他药物组成复方使用。

优选地，所述抗焦虑症药物的剂型为口服制剂或注射制剂。

优选地，所述口服制剂选自片剂、胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、丸剂、口服液体制剂中的至少一种。

优选地，所述片剂为普通片剂、分散片、口腔崩解片或缓释片。

优选地，所述注射制剂为注射液或粉针剂。

此外，本发明还提供了一种缓解焦虑症的食品，其含有有效量的所述青蒿素衍生物，和食品上可接受的载体和/或辅料。

本发明通过膜片钳全细胞记录海马锥体神经元上突触活动，发现青蒿素衍生物蒿甲醚能提高小鼠海马ca1区锥体神经元上的自发性抑制性突触后电流(sipscs)，而不影响自发性兴奋性突触后电流(sepscs)，从而降低了中枢神经系统兴奋性/抑制性突触传递平衡(e/i)的作用。本发明进一步在正常小鼠及焦虑模型小鼠上检验了青蒿素衍生物蒿甲醚、青蒿琥酯和双氢青蒿素的药物疗效，通过小鼠高架十字迷宫实验以及明暗箱实验发现，蒿甲醚、青蒿琥酯和双氢青蒿素能有效改善正常或间氯苯哌嗪(mcpp)所致焦虑模型小鼠的焦虑样症状。上述实验结果表明，青蒿素衍生物(蒿甲醚、青蒿琥酯和双氢青蒿素)能通过调节中枢神经系统兴奋性/抑制性突触传递平衡来达到安全、有效的抗焦虑作用，有期成为新的抗焦虑药物或缓解焦虑症的食品。可见，本发明为临床焦虑症患者提供了一种安全、高效、价格低廉的治疗药物或功能食品。

附图说明

图1为利用膜片钳全细胞记录技术发现蒿甲醚对海马脑片ca1区锥体神经元上e/i平衡的调节作用。a为两组代表性的sipscs(上两排)和sepscs(下两排)的例图；b和c分别为蒿甲醚对ca1区锥体神经元sepscs频率和幅度的影响；d为蒿甲醚对ca1区锥体神经元sepscs电荷量的影响；e和f分别为蒿甲醚对ca1区锥体神经元sipscs频率和幅度的影响；g为蒿甲醚对ca1区锥体神经元sepscs电荷量的影响；h为蒿甲醚对ca1区锥体神经元e/i平衡比值的影响。

图2为蒿甲醚对正常小鼠及mcpp诱发焦虑模型小鼠在明暗箱实验中的焦虑样行为的改善结果。a为小鼠在明暗箱中的活动轨迹图；b为各组小鼠在明箱中的停留时间；c为各组小鼠在明箱的活动路程；d为各组小鼠在明暗箱实验中明箱与暗箱的穿梭次数。

图3为蒿甲醚对正常小鼠及mcpp诱发焦虑模型小鼠在高架十字迷宫实验中的焦虑样行为的改善结果。a为小鼠在高架十字迷宫中的活动轨迹图；b为各组小鼠进入开臂的次数；c为各组小鼠在开臂停留的时间。

图4为青蒿琥酯和双氢青蒿素对正常小鼠在明暗箱实验中的自发焦虑样行为的改善结果。a为小鼠在明暗箱中的活动轨迹图；b为各组小鼠在明箱中的活动路程；c为各组小鼠在明箱的停留时间；d为各组小鼠在明暗箱实验中明箱与暗箱的穿梭次数。

图5为青蒿琥酯和双氢青蒿素对正常小鼠在高架十字迷宫实验中的自发焦虑样行为的改善结果；a为小鼠在高架十字迷宫中的活动轨迹图；b为各组小鼠在开臂停留的时间；c为各组小鼠进入开臂的次数。

图6为青蒿素衍生物(蒿甲醚、青蒿琥酯和双氢青蒿素)的化学结构图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，本发明通过下列实施例进一步说明。显然，下列实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。应理解，本发明实施例仅用于说明本发明的技术效果，而非用于限制本发明的保护范围。实施例中，所用方法如无特别说明，均为常规方法。

实施例1蒿甲醚对海马脑片ca1区锥体神经元兴奋性/抑制性突触传递比值的影响

1.实验动物饲养：spf级c57bl/6小鼠：雄性，年龄6周，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供。spf级动物中心饲养，饲养区温度一般在24-26℃之间，湿度控制在40％-70％之间，微电脑控制日光灯照明系统，12h明暗自动交替。动物中心定期打扫卫生、更换动物垫料、添加饲料，可自由摄取spf级繁殖级饲料和饮水。

2.药品及主要试剂：氯化铯、甲磺酸铯、hepes、egta、atp-mg、gtp-na、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、硫酸镁、氯化钙、碳酸氢钠、葡萄糖、蔗糖均购自sigma-aldrich公司(中国，上海)；蒿甲醚，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二甲基亚砜购自广州瑞舒生物科技有限公司。

3.蒿甲醚的配制用二甲基亚砜溶解配制浓度为10μm的蒿甲醚溶液。

4.给药方法：脑片记录液中灌流浓度为10μm的蒿甲醚溶液。

5.膜片钳记录方法：

(1)制备小鼠海马脑片：用1％戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，迅速断头取脑，把取出的脑组织放入预先配制好的4℃切片液中。将脑组织固定在切片机底座上，使用震动切片机(leicavt1200s,德国)切取海马脑片，切片的厚度为300μm。切下来的海马脑片放置于32-34℃的孵育槽中孵育30分钟，随后在室温下孵育1小时。孵育完成后即可记录脑片电活动。使用axondigidata1550a数模转换器(moleculardevices,美国)和multiclamp700b(moleculardevices,美国)放大器。

(2)兴奋性/抑制性突触传递比值(e/i平衡)：使用axondigidata1550a数模转换器(moleculardevices，美国)和multiclamp700b(moleculardevices，美国)放大器。记录海马ca1区锥体神经元的微小抑制性突触后电流，在电压钳的模式下，电压分别钳制在-60mv和10mv，记录灌流人工脑脊液中海马脑片ca1区锥体神经元的自发兴奋性突触后电流及自发抑制性突触后电流(sepscs和sipscs)。

(3)数据分析：分别统计sepscs和sipscs的频率和幅度，计算sepscs和sipscs对应的电荷量指标，兴奋/抑制突触传递比值为sepscs的总电荷量与sipscs的总电荷量的比值。

6.实验结果：蒿甲醚能提高海马ca1锥体神经元sipsc的频率以及电荷量，而不改变sepsc，从而降低了e/i的比值(见图1)。

实施例2蒿甲醚对小鼠自发和mcpp诱发焦虑模型小鼠焦虑样表现的改善作用

一.实验动物饲养(同实施例1)。

二.药品及主要试剂

蒿甲醚，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；间氯苯哌嗪，购自sigma-aldrich公司(中国，上海)；甲基纤维素(methylcellulose,mc)，购自sigma-aldrich公司(中国，上海)；nacl，购自sigma-aldrich公司(中国，上海)。

三.实验方法

1.动物分组：将动物分为4组，每组11只，分别为对照组(溶剂组)，蒿甲醚干预组，mcpp模型组以及蒿甲醚治疗组。

2.蒿甲醚(art)的配制:

(1)配制1％甲基纤维素溶液(mc)：用0.9％生理盐水，在水浴锅中加热至40℃，溶解mc粉末，搅拌均匀至完全溶解，无乳白色沉淀为止。

(2)蒿甲醚配制：用4℃冷藏的1％mc溶解配置浓度为50mg/kg的art，混匀成混悬液，现配现用。

(3)间氯苯哌嗪配制：用0.9％的nacl溶液配制1mg/ml的mcpp溶液，给药剂量为5mg/kg。

3.给药方法：蒿甲醚干预组行为学实验前2h腹腔注射蒿甲醚50mg/kg，对照组同时间注射1％mc，mcpp模型组在行为学实验前30分钟注射mcpp5mg/kg，蒿甲醚治疗组在注射mcpp溶液前2h注射蒿甲醚50mg/kg，腹腔注射完mcpp后半小时开始行为学实验。

4.行为学方法：所用实验动物在进行行为学检测之前每天给每只小鼠熟悉适应操作者的手和操作，每天3分钟。实验在安静的环境下进行，每次试验后用75％酒精擦拭行为箱，以免上一只小鼠的大小便或气味影响下次测试结果。小鼠行为采集使用高清摄像头，行为分析采用吉量动物行为分析软件(上海吉量软件科技有限公司，中国)。

(1)明暗箱实验：正式实验时把小鼠放入暗箱中央，摄像与计时同步，记录时小鼠可自由穿梭于明箱与暗箱，一共记录10分钟。统计分析小鼠在明箱停留的时间、在明箱移动的距离以及穿梭于明暗箱的次数。

(2)高架十字迷宫实验：正式实验时把小鼠放在开臂和闭臂交叉的中间区域，头朝向一侧闭臂，摄像与计时同步，一共记录10分钟。统计分析小鼠进入开臂的次数以及停留在开臂的时间。

5.实验结果：结果表明蒿甲醚能有效改善小鼠自发和mcpp诱发的焦虑样表现，能够增加正常小鼠及焦虑模型小鼠在明暗箱实验中明箱停留的时间及活动路程(见图2)，能够增加正常小鼠及焦虑模型小鼠在高架十字迷宫实验中开臂停留的时间以及进入开臂的次数(见图3)。

实施例3双氢青蒿素与青蒿琥酯对正常小鼠自发焦虑样表现的改善作用

一.实验动物饲养(同实施例1)。

二.药品及主要试剂

双氢青蒿素及青蒿琥酯，均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲基纤维素(methylcellulose,mc)，购自sigma-aldrich公司(中国，上海)；nacl，购自sigma-aldrich公司(中国，上海)。

三.实验方法

1.动物分组：将动物分为3组，每组11只，分别为对照组(溶剂组)，双氢青蒿素干预组及青蒿琥酯干预组。

2.溶液配制:

(1)配制1％甲基纤维素溶液(mc)：用0.9％生理盐水，在水浴锅中加热至40℃，溶解mc粉末，搅拌均匀至完全溶解，无乳白色沉淀为止。1％mc溶剂作为对照组注射溶液。

(2)双氢青蒿素配制：用4℃冷藏的1％mc溶解配置浓度为5mg/ml的双氢青蒿素的混悬液，现配现用，有效剂量按照50mg/kg腹腔注射给药。

(3)青蒿琥酯配制：用4℃冷藏的1％mc溶解配置浓度为5mg/ml的青蒿琥酯的混悬液，现配现用，有效剂量按照5mg/kg腹腔注射给药。

3.给药方法：对照组(溶剂组)行为学实验前1h腹腔注射1％mc，双氢青蒿素干预组及青蒿琥酯干预组相同时间注射50mg/kg对应药物。

4.行为学方法：同实施例1。

5.实验结果：结果表明双氢青蒿素和青蒿琥酯均能有效改善正常小鼠的自发焦虑样表现，能够增加小鼠在明暗箱实验中明箱停留的时间及活动路程(见图4)，能够增加小鼠在高架十字迷宫实验中开臂停留的时间以及进入开臂的次数(见图5)。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。