亚硫酸氢钠穿心莲内酯在制备用于治疗高血脂病症的药物中的应用的制作方法

本发明涉及医药领域，涉及一种治疗高血脂的药物或保健食品，特别涉及一种中药穿心莲提取成分在制备治疗高血脂症药物或保健食品中的应用。

背景技术：

心血管疾病(cvd)，包括不稳定性心绞痛，中风，st段抬高或无st段抬高的急性心肌梗死，以及冠状动脉猝死，是全球范围内导致心血管疾病发病和死亡的主要原因。大部分的心脏病死亡病例是由于冠状动脉粥样硬化性心脏病引发。在我国北京地区，1984-1993年急性冠心病事件发病率的年平均增长率为2.3％。在全国，1984-1997年急性冠心病事件发病率的年平均增长率为1.7％。

冠心病又称冠状动脉粥样硬化性心脏病，是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化性病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病。大多数急性冠状动脉综合征(acss)被认为是由动脉粥样硬化斑块破裂引发的。

在冠心病的发病机制中，血中增高的脂质以低密度脂蛋白胆固醇(ldl)、极低密度脂蛋白胆固醇(vldl)或其残粒的形式侵入动脉壁，堆积在平滑肌细胞、胶原和弹性纤维之间，引起平滑肌细胞增生。后者与来自血液的单核细胞一样吞噬大量脂质成为泡沫化细胞。脂蛋白降解释出胆固醇、胆固醇酯、甘油三酯和其他脂质，ldl还和动脉壁的蛋白多糖结合产生不溶性沉淀，这些都能刺激纤维组织增生。上述因素共同促进纤维斑块的发展。高胆固醇水平是导致动脉粥样硬化和心血管疾病的最重要因素，由于ldl-c代谢的基因缺陷，导致患者长期处于高血浆胆固醇水平，极大提高罹患冠心病的风险。这些发现均表明，调节血脂，降低血清胆固醇、甘油三酯、ldl和oxldl水平，促进抗氧化能力以及抑制泡沫细胞形成，是预防动脉粥样硬化病变进展的有效方法。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有的心血管疾病血脂、胆固醇在细胞内堆积，导致高血脂病变的技术问题，提供一种亚硫酸氢钠穿心莲内酯的新用途用，即亚硫酸氢钠穿心莲内酯在制备用于治疗高血脂病症的药物或保健品中的新应用，亚硫酸氢钠穿心莲内酯具有调节血脂，降低血清中胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇，同时具有升高高密度脂蛋白胆固醇作用，用于降低细胞内胆固醇含量，抑制胆固醇在平滑肌细胞胶原和弹性纤维之间堆积，避免平滑肌细胞增生，抗动脉粥样硬化。

亚硫酸氢钠穿心莲内酯的化学名为14-脱羟-13-脱氢穿心莲内酯-12-磺酸钠盐；分子式为：c20h29o4so3na；分子量为：436.23；结构式如下：

亚硫酸氢钠穿心莲内酯为白色结晶粉末，味苦，具有祛热解毒，消炎止痛之功效，对细菌性与病毒性上呼吸道感染及痢疾有特殊疗效，被誉为天然抗生素药物，其药理学研究表明，小鼠静脉推注亚硫酸氢钠穿心莲内酯后，小鼠的自发活动明显减少；小鼠静脉推注亚硫酸氢钠穿心莲内酯后腹腔注射戊巴比妥钠可缩短戊巴比妥钠入睡时间和延长睡眠持续时间；麻醉家犬静脉滴注亚硫酸氢钠穿心莲内酯后，对血压、心率、心律及心电图各波形未见有临床意义的改变；亚硫酸氢钠穿心莲内酯对小鼠中枢神经系统有明显的镇静作用；对小鼠的协调运动无明显影响；与戊巴比妥钠催眠作用有协同作用；麻醉家犬静脉滴注亚硫酸氢钠穿心莲内酯对心血管系统无影响。

为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种亚硫酸氢钠穿心莲内酯在制备用于治疗高血脂病症的药物或保健品中的应用。

其中，所述高血脂病症为高胆固醇血症、高甘油三酯血症，动脉粥样硬化症或冠心病中的一种或多种，优选为高甘油三酯血症。

亚硫酸氢钠穿心莲内酯在制备用于治疗高甘油三酯血症的药物或保健品中的应用。

亚硫酸氢钠穿心莲内酯在制备预防或/和治疗由甘油三酯在血管内皮沉淀导致的动脉粥样硬化、甘油三酯水平高肥胖症的药物或保健品中的应用。

特别是，所述药物由亚硫酸氢钠穿心莲内酯和药学上可接受的载体组成。

尤其是，所述药物以片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、乳剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、凝胶型、霜剂、酊剂、巴布剂、橡胶贴膏剂或贴膏剂形式存在。

药学上可接受的载体通常被保健专家认可用于这一目的且作为药剂的非活性成分。有关药学上可接受的载体的汇编可以在《药物赋形剂手册》(handbookofpharmaceuticalexcipients，第2版，由a.wade和p.j.weller编辑；americanpharmaceuticalassociation出版，washingtonandthepharmaceuticalpress,london,1994)等工具书中找到。

尤其是，所述的载体包括赋形剂，如淀粉、水等；润滑剂，如硬脂酸镁等；崩解剂，如微晶纤维素等；填充剂，如乳糖等；粘结剂，如预胶化淀粉、糊精等；甜味剂；抗氧化剂；防腐剂、矫味剂、香料等；

其中，所述药物是通过经胃肠道给药和非经胃肠道给药途径给药。

特别是，所述的非经胃肠道给药途径选择注射给药、呼吸道给药、皮肤给药、粘膜给药或腔道给药。

其中，非经胃肠道给药药剂选择注射剂、喷雾剂、气雾剂、贴剂等。

特别是，所述的经胃肠道给药制剂选择片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、溶液剂或糖浆剂等。

本发明另一方面提供一种亚硫酸氢钠穿心莲内酯在制备用于调节甘油三酯代谢、调节胆固醇代谢或预防或/和治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。

其中，所述药物用于治疗或/和预防以动脉粥样硬化为病理基础的病症或/和用于治疗高脂血症为病理基础的病症、高血脂继发的肥胖症。

特别是，所述以动脉粥样硬化为病理基础的病症为脑动脉、冠状动脉、肾动脉、肠系膜动脉、颈动脉粥样硬化的相关病变，以及相关继发疾病中的一种或多种。

尤其是，所述以动脉粥样硬化为病理基础的病症为高甘油三酯导致的脑动脉粥样硬化、冠状动脉粥样硬化、脑梗、心梗。

本发明又一方面提供一种亚硫酸氢钠穿心莲内酯在制备用于治疗心血管疾病的药物中的应用。

其中，所述心血管疾病为动脉粥样硬化性心血管疾病，优选为冠状动脉粥样硬化性心脏病。

亚硫酸氢钠穿心莲内酯在制备用于预防或治疗肥胖症的药物中的应用。

所述肥胖症为血脂异常引起的肥胖。亚硫酸氢钠穿心莲内酯抑制甘油三酯在细胞内堆积沉淀。

本发明再一方面提供一种用于治疗高血脂病症、肥胖症的药物或保健品，所述药物或保健品含有亚硫酸氢钠穿心莲内酯。

其中，所述亚硫酸氢钠穿心莲内酯与所述药物或保健品的总重量之比为0.01-10：100。

本发明另一方面一种用于治疗高血脂病症的药物的制备方法，包括如下顺序进行的步骤：

a)将穿心莲内酯溶于95％乙醇中，加热、搅拌、溶解后加入亚硫酸氢钠水溶液,加热回流，搅拌，进行加成反应1-2h；

b)对加成反应混合物进行浓缩处理，回收乙醇至无醇味；然后加入活性炭，脱色处理30-60min后过滤；

c)对滤液进行浓缩，然后于温度≤4℃的条件下，进行结晶处理，结晶混合物进行离心处理，即得亚硫酸氢钠穿心莲内酯。

其中，步骤a)中所述穿心莲内酯与亚硫酸氢钠的摩尔配比为1：1-2，优选为1：1.5。所述亚硫酸氢钠水溶液的浓度为10-20mol/l；所述加成反应的温度为60-80℃。

特别是，为了获得高纯度亚硫酸氢钠穿心莲内酯，还包括对制备的亚硫酸氢钠穿心莲内酯进行重结晶。

其中，所述穿心莲内酯按照如下步骤制备而成：

1)将穿心莲药材浸泡于乙醇溶液中，加热回流提取2-3次，合并回流提取液并进行浓缩处理，回收乙醇，制得提取-浓缩液；

2)向提取-浓缩液中加入活性炭，进行脱色处理30-60min；然后过滤并对脱色滤液进行浓缩处理，制得脱色-浓缩液；

3)脱色-浓缩液于温度≤10℃(优选为0-4℃)的条件下，进行冷藏、静置、沉淀处理，静置至少12h后，弃去上清液，沉淀加无水乙醇溶解，制得粗品复溶液；

4)将粗品复溶液于温度≤4℃(优选为0-4℃)的条件下，进行结晶处理，结晶混合物进行离心处理，制得穿心莲内酯结晶粗品；

5)穿心莲内酯结晶粗品溶于热的无水乙醇中，接着加入活性炭进行脱色；然后进行过滤，滤液浓缩，回收乙醇，制得结晶—脱色-浓缩液；

6)结晶—脱色-浓缩液于温度≤4℃(优选为0-4℃)的条件下，进行结晶处理，结晶混合物进行离心处理，制得穿心莲内酯粗品。

其中，步骤1)中所述乙醇溶液的质量百分比浓度为50-95％，优选为75％。

特别是，步骤1)中所述乙醇溶液的体积与穿心莲药材的重量之比为5-20：1，优选为5-15:1，即当穿心莲药材重量(干重)为1kg时，提取溶液乙醇溶液的体积为5-20l，当穿心莲药材重量(干重)为1g时，提取溶液乙醇溶液的体积为5-20ml。

其中，步骤1)中所述提取-浓缩液的重量与原料药穿心莲药材的重量之比为1：1-5：1。

其中，步骤2)中活性炭的用量为原药材量的5％-20％，优选为10％，脱色处理时间30-60min；脱色处理至澄清可以进行后续过滤。

特别是，所述脱色-浓缩液的重量与原料药穿心莲药材的重量之比为0.5:1～2:1，优选为0.5：1。

特别是，还包括步骤6a)：对穿心莲内酯粗品进行纯化处理，包括将穿心莲内酯粗品用适量热水溶解，过大孔吸附树脂柱，分别用纯水，30％，50％，70％和95％乙醇为洗脱剂进行洗脱；收集各洗脱流出液，流出液分别浓缩至适量后，冷藏重结晶，离心，结晶真空干燥，得纯化的穿心莲内酯。

其中，大孔树脂柱内所述的大孔吸附树脂的体积与步骤6)制备的穿心莲内酯粗品的重量之比为0.5-2：1，优选为1-2：1，进一步优选为1：1即当穿心莲内酯粗品的重量(干重)为1kg时，大孔吸附树脂的体积为0.5-2l，当穿心莲内酯粗品的重量(干重)为1g时，大孔吸附树脂的体积为0.5-2ml。

特别是，洗脱过程中各洗脱剂的体积与大孔树脂柱的柱体积之比为3-5：1。

尤其是，所述打孔吸附树脂为ab-8型大孔吸附树脂、d101型大孔树脂或hp20型大孔树脂，优选为ab-8型大孔吸附树脂。

本发明提供一种治疗高血脂症的方法，包括向受试者给予治疗有效量的亚硫酸氢钠穿心莲内酯，其治疗有效量为1～100mg/kg·d，优选为10～90mg/kg·d，进一步优选为60～90mg/kg·d。

除非另外说明，本文所用的术语“治疗有效量”为需要产生有效作用的药物的用量；“治疗有效量”是可以调整和变化的，最终由医务人员确定，其所考虑的因素包括给药途径和制剂的性质、接受者的体重、年龄等一般情况以及所治疗疾病的性质和严重程度。

与现有技术相比，本发明具有如下的明显优点：

1、本发明对已知化合物亚硫酸氢钠穿心莲内酯发掘了新的药用价值，将其用于治疗高血脂病症，抗动脉粥样硬化，并可制备成预防、调理和/或治疗高血脂病症的药物或保健食品，制备成治疗、调理心血管疾病的药物或保健品，从而为亚硫酸氢钠穿心莲内酯的应用开拓了一个新的领域。

2、本发明的系列细胞试验研究证明穿亚硫酸氢钠心莲内酯具有显著的预防和治疗动脉粥样硬化的作用，亚硫酸氢钠穿心莲内酯将吞噬到细胞内的胆固醇逆转运出细胞，降低细胞内胆固醇含量，平滑肌细胞增生的危险，抑制泡沫细胞形成，显著抑制动脉粥样硬化病变的发展。

3、本发明使用亚硫酸氢钠穿心莲内酯，通过口服给药途径进行了大量的动物试验，试验结果表明：亚硫酸氢钠穿心莲内酯能显著降低动脉中动脉粥样硬化斑块，主动脉中斑块面积显著降低，明显抑制动脉中动脉粥样硬化斑块的形成和面积，表明亚硫酸氢钠穿心莲内酯能明显降低细胞内胆固醇含量的作用，显著促进细胞内胆固醇逆转运的功效。

本发明的亚硫酸氢钠穿心莲内酯具有调节血脂，降低血中胆固醇、甘油三酯等作用，调节脂蛋白，抑制血管动脉粥样硬化，抗动脉粥样硬化性心脏病作用；

4、本发明的亚硫酸氢钠穿心莲内酯药理作用强，用于抗动脉粥样硬化；预防、调理和治疗心血管疾病的功效显著，见效快、毒副作用小、安全性好，能够长期服用，且可用现代药理学分析其抗动脉粥样硬化的作用机理，具有良好的药用前景。

本发明的细胞和动物实验研究证明，亚硫酸氢钠穿心莲内酯具有调节血脂，降低血清中胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇，同时具有一定升高高密度脂蛋白胆固醇的作用，并具有预防动脉粥样硬化病变进展的作用。

5、本发明的产品原料来源丰富、价廉、临床使用安全，制备工艺简单，可制成各种剂型，且服量小，使用方便，因此易于推广。

附图说明

图1为β-3t3脂肪细胞及其脂质油红0染色变化结果图，其中：model为模型组细胞；ator为阿托伐他汀处理细胞；alow为亚硫酸氢钠穿心莲内酯低剂量(10μmol/l)处理细胞；ahigh为亚硫酸氢钠穿心莲内酯高剂量(50μmol/l)处理细胞；blow为穿心莲内酯低剂量(10μmol/l)处理细胞，bhigh为穿心莲内酯高剂量(50μmol/l)处理细胞。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

以下通过试验例来进一步阐述本发明所述药物的有益效果，这些试验例包括了本发明药物的药效学试验。

本发明具体实施方式中使用的仪器和材料

1、试验仪器

仪器名称仪器型号生产厂家

hplc色谱仪1200seriesagilenttechnologies

2、试验试剂

3、试验药品

实施例1制备亚硫酸氢钠穿心莲内酯

1、制备穿心莲内酯

将药材穿心莲(1kg)粉碎成粗粉后，加入乙醇溶液(质量浓度为75％，通常为50-75％)，加热回流提取，提取次数为2次(通常为2-3次)，每次提取时乙醇溶液的体积为5l(通常为5-20l)，即每次提取时乙醇溶液的体积与穿心莲药材的体积比为5-20:1。

提取液进行减压浓缩处理，浓缩至无醇味，制得提取-浓缩液，其中减压浓缩的温度为70℃，相对真空度为-0.09～-0.075mpa，提取-浓缩液的重量与原料药穿心莲的重量之比为1：1(通常为1-5：1)。

向提取-浓缩液中加入活性炭，搅拌，脱色处理30min(通常为30-60min)后过滤，对滤液进行浓缩处理，制得脱色-浓缩液；其中，活性炭的用量为原药材量的10％(通常为5-20％)；脱色处理至澄清可以进行后续过滤；脱色-浓缩液的重量与原料药穿心莲药材的重量之比为0.5：1(通常为0.5:1～2:1)。

将脱色-浓缩液于温度≤10℃(优选为4-10℃)的条件下，进行静置、沉淀处理，静置至少12h后，弃去上清液，沉淀加入少量无水乙醇，搅拌至沉淀刚好完全溶解，制得粗品复溶液；

将粗品复溶液于温度≤10℃(优选为0-4℃)的条件下，进行结晶处理(即冷藏结晶)，结晶混合物进行离心处理，制得穿心莲内酯结晶粗品；

穿心莲内酯结晶粗品溶于适量的无水乙醇，加热搅拌至结晶粗品刚好完全溶解，接着加入活性炭进行脱色；然后进行过滤，滤液浓缩，回收乙醇，制得结晶-脱色-浓缩液；

结晶—脱色-浓缩液于温度≤4℃(优选为0-4℃)的条件下，进行结晶处理，结晶混合物进行离心处理，制得穿心莲内酯粗品；

将穿心莲内酯结晶在减压条件下，进行真空干燥，制得脱水穿心莲内酯粗品，备用。

2、穿心莲内酯纯化

将穿心莲内酯粗品用适量热水溶解，过大孔吸附树脂柱，分别用纯水，30％，50％，70％和95％乙醇为洗脱剂进行洗脱；收集各洗脱流出液，流出液分别浓缩至适量后，冷藏重结晶，离心，结晶真空干燥，得纯化的穿心莲内酯。其中，大孔树脂柱内所述的大孔吸附树脂的体积与步骤1)制备的穿心莲内酯粗品的重量之比为1:1(通常为0.5-2：1)，即当穿心莲内酯粗品的重量(干重)为1kg时，大孔吸附树脂的体积为0.5-2l，当穿心莲内酯粗品的重量(干重)为1g时，大孔吸附树脂的体积为0.5-2ml，优选为1-2:1。洗脱过程中各洗脱剂与大孔树脂柱的柱体积之比为4:1(通常为3-5：1)，大孔吸附树脂选择ab-8型大孔吸附树脂(还可以是d101、hp20)。

制备的穿心莲内酯的含量测定：

色谱条件：以乙腈-磷酸盐缓冲液(5mmol·l^-1磷酸氢二钾-5mmol·l^-1磷酸二氢钾1:2，磷酸调节ph＝6.80)为流动相梯度洗脱，检测波长230nm，柱温为30℃；流速为1.0ml·min^-1，进样体积为10μl。经穿心莲内酯对照品比较，本发明制备的穿心莲内酯含量大于98.5％。

3、加成反应

将制备的纯化的穿心莲内酯溶于95％乙醇中，加热、搅拌、溶解后加入浓度为16mol/l(通常为10-20mol/l)的亚硫酸氢钠水溶液,加热回流，搅拌，加成反应1-2h(至澄清)；穿心莲内酯与亚硫酸氢钠的摩尔配比为1:1.5(通常为1：1-1:2)；接着对加成反应混合物进行浓缩处理，回收乙醇至无醇味；然后加入活性炭，脱色处理30min后过滤；再接着对滤液浓缩后于温度≤4℃的条件下，进行结晶处理，结晶混合物进行离心处理，即得亚硫酸氢钠穿心莲内酯。

为了获得高纯度亚硫酸氢钠穿心莲内酯，还包括对制备的亚硫酸氢钠穿心莲内酯进行重结晶。

制备的亚硫酸氢钠加成物的含量测定：

色谱条件：以乙腈-磷酸盐缓冲液(10mmol·l^-1磷酸氢二钾-10mmol·l^-1磷酸二氢钾1:2，磷酸调节ph＝6.80)为流动相梯度洗脱，uv全波长检测，柱温为30℃；流速为1.0ml·min^-1，进样体积为10μl。经亚硫酸氢钠穿心莲内酯的对照品比较为亚硫酸氢钠穿心莲内酯，纯度大于98.5％。

试验例1亚硫酸氢钠穿心莲内酯对β-3t3前脂肪细胞脂质合成的影响

1、实验材料

1.1、细胞

3t3-l1前脂肪细胞系于2014年9月15日从北京协和医学院细胞资源中心(其为细胞系资源的国家基础设施，nsti的总部)购得。通过pcr和培养检查细胞系没有支原体污染用pcr鉴定其种源，用str谱(fbi，codis)鉴定细胞系的鉴定结果，所有结果均可在网站(http://cellresource.cn)上查看。

1.2、药品

亚硫酸氢钠穿心莲内酯：白色结晶粉末(乙醇)，含量99.7％，中国食品药品检定研究院；

穿心莲内酯：白色结晶粉末(乙醇)，含量99.7％，中国食品药品检定研究院；

阿托伐他汀钙，购自大连美仑生物科技公司(货号：134523-03-8)。

3t3-l1细胞诱导液a(分化诱导液组成为：0.5mmol/libmx(sigma:i7018)、1μg/ml胰岛素(sigma:i9278)、0.25μmol/l地塞米松(sigma:d1756)，底液为完全培养基)

3t3-l1细胞诱导液b，(1μg/ml胰岛素，底液为完全培养基)

油红o粉末，购自美国sigma公司(货号：o0625)。

2、实验方法

2.1、分组及给药

实验分别设空白对照组，模型组，阿托伐他汀钙组；亚硫酸氢钠穿心莲内酯低剂量组；亚硫酸氢钠穿心莲内酯高剂量组；穿心莲内酯低剂量组；穿心莲内酯高剂量组。

将复苏培养的3t3-l1前脂肪细胞以1×10⁶接种于24孔细胞培养板内，于完全培养基(dmem培养基，10％fbs(胎牛血清))内培养，当细胞生长覆盖面积达90％以上时，空白对照组细胞予完全培养基(dmem培养基，10％fbs(胎牛血清))，其他各组细胞先加入3t3-l1细胞诱导液a诱导分化48h，然后换3t3-l1细胞诱导液b继续诱导分化，分化48h后，吸出处理液后，加入完全培养基、相应的处理药物，对各组细胞进行如下处理：

空白对照组：dmem培养基(10％fbs(胎牛血清))；模型组：dmem培养基(10％fbs)；阿托伐他汀钙组：dmem培养基(10％fbs)10um阿托伐他汀钙；亚硫酸氢钠穿心莲内酯低剂量组：dmem培养基(10％fbs)+10μm亚硫酸氢钠穿心莲内酯；亚硫酸氢钠穿心莲内酯高剂量组：dmem培养基(10％fbs)+50μm亚硫酸氢钠穿心莲内酯；穿心莲内酯低剂量组：dmem培养基(10％fbs)+10μm穿心莲内酯；穿心莲内酯高剂量组：dmem培养基(10％fbs)+50μm穿心莲内酯。

2.2染色

培养10天后，向各组细胞中加入细胞油红o进行染色：

1.储备液配制：称取油红o0.5g，溶于异丙醇100ml，60℃水浴加热溶解

2.用pbs洗板两次，吸弃。

3.用4％的多聚甲醛固定30分钟。

4.油红储备液与去离子水3:2混合，然后染色细胞15分钟，pbs洗两次。

2.3统计

显微镜下观察并拍照，照片如图1所示，其中：model为模型组细胞；ator为阿托伐他汀处理细胞；alow为亚硫酸氢钠穿心莲内酯低剂量(10μmol/l)处理细胞；ahigh为亚硫酸氢钠穿心莲内酯高剂量(50μmol/l)处理细胞；blow为穿心莲内酯低剂量(10μmol/l)处理细胞，bhigh为穿心莲内酯高剂量(50μmol/l)处理细胞；采用image-proplus6.0图像识别软件计算红色面积。spss22.0进行单因素方差分析。结果如表1所示。

表1对脂肪细胞脂质生成的影响(％，n＝3)

与模型组比较，★p＜0.05，★★p＜0.01，★★★p＜0.001

由上述细胞试验结果可见，本实施例中亚硫酸氢钠穿心莲内酯对3t3-l1脂肪细胞的脂质合成有明显影响。随着剂量提高，干预脂质合成的效果增加。与穿心莲内酯的效果相比，两者之间未发现明显差异(p>0.01)。说明亚硫酸氢钠穿心莲内酯在3t3-l1脂肪细胞中干预脂质合成存在与穿心莲内酯近似的效果。

试验例2亚硫酸氢钠穿心莲内酯对apoe小鼠的调脂作用

1.实验材料

100只8周龄雄性apoe(-/-)小鼠，10只野生型(widetype，wt)c57bl/6j小鼠，体重22±2g，购于北京维通利华公司。

药品与试验例1的相同。

2.分组及干预方法

所有小鼠适应性喂养1周后按体重随机分组，分组如下：

正常(空白)对照组(c57组)：10只c57bl/6j小鼠，普通饮食+生理盐水灌胃。

模型对照组(model组)：10只apoe(-/-)小鼠，高胆固醇饮食+生理盐水灌胃。

阳性对照组(ator组，atorvastatin组)：10只apoe(-/-)小鼠，高胆固醇饮食+阿托伐他汀钙(10mg/kg/d)灌胃。

亚硫酸氢钠穿心莲内酯高剂量组(ahigh组)：10只apoe(-/-)小鼠，高胆固醇饮食+亚硫酸氢钠穿心莲内酯(100mg/kg/d)灌胃。

亚硫酸氢钠穿心莲内酯中剂量组(amiddle组)：10只apoe(-/-)小鼠，高胆固醇饮食+亚硫酸氢钠穿心莲内酯(50mg/kg/d)灌胃。

亚硫酸氢钠穿心莲内酯低剂量组(alow组)：10只apoe(-/-)小鼠，高胆固醇饮食+亚硫酸氢钠穿心莲内酯(25mg/kg/d)灌胃。

穿心莲内酯高剂量组(bhigh组)：10只apoe(-/-)小鼠，高胆固醇饮食+穿心莲内酯(100mg/kg/d)灌胃。

穿心莲内酯中剂量组(bmiddle组)：10只apoe(-/-)小鼠，高胆固醇饮食+穿心莲内酯(50mg/kg/d)灌胃。

穿心莲内酯低剂量组(blow组)：10只apoe(-/-)小鼠，高胆固醇饮食+穿心莲内酯(25mg/kg/d)灌胃。

高胆固醇饮食采用“西方饮食”配方，由华阜康公司提供(货号：h10141，配方如表2所示)，各组小鼠灌胃容积为10ml/kg，各组小鼠连续灌胃给药4周，以正式实验起为第1天，共28天。

表2高胆固醇饲料配方表

所有实验组小鼠均置于spf级实验动物中心，5只/笼，小鼠房的温度保持在18-22℃之间，湿度恒定在50％左右，12h光照，12h黑暗。试验期间动物自由摄食和饮水(高压消毒灭菌水)。每周称重一次，各组按照上述分组灌胃给药，连续给药4周。

3.试验方法

各组小鼠每周用电子天平称重，记录小鼠体重。

连续给药28d后，小鼠禁食不禁水12h后，于第29d用异氟烷气体麻醉。麻醉小鼠摘取眼球取血，置于含分离胶的生化管中，室温放置2h后，3500r/min离心15min，取出上层血清，用无菌管分装后-80℃冰箱保存，待测。

小鼠置于冰上操作。打开腹腔，暴露心脏，沿左心室插入注射器，剪开右心房，注入预冷生理盐水(4℃)20ml，进行灌注，可见肝脏变白，心脏无血水流出，表明灌注干净。灌注完毕，剥离主动脉。部分用4％多聚甲醛固定，部分放于-80℃中保存。

4.指标测定

4.1血脂四项、肝肾功检测

血清用贝克曼au5822自动生化仪检测血清总胆固醇(tc)、血清甘油三酯(tg)、高密度脂蛋白-胆固醇(hdl-c)、低密度脂蛋白-胆固醇(ldl-c)、血糖(glu)、谷草转氨酶(ast)、谷丙转氨酶(alt)、尿素氮(bun)、肌酐(crea或cr)水平。结果见表3、4。

表3对apoe小鼠模型血脂、血糖和肝肾功能的影响

与模型组比较，★p＜0.05，★★p＜0.01，★★★p＜0.001

表4对apoe小鼠模型血脂、血糖和肝肾功能的影响(续表)

与模型组比较，★p＜0.05，★★p＜0.01，★★★p＜0.001

由上表3、4的试验结果可见，与模型组比较，亚硫酸氢钠穿心莲内酯对高脂喂养的apoe小鼠血中甘油三酯(tg)有明显降低作用，其降低甘油三酯作用明显优于阳性药物(阿托伐他汀钙)(p<0.05)，较穿心莲内酯有进一步降低的趋势，表现出明显统计学意义。亚硫酸氢钠穿心莲内酯对血中胆固醇(tc)和低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)也有一定降低作用，但作用弱于阳性药物(p<0.05)。亚硫酸氢钠穿心莲内酯对血中高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)有明显升高作用。与模型组比较，穿心莲内酯、亚硫酸氢钠穿心莲内酯和阳性药物在使用剂量范围内对肝肾功能无显著毒性。

通过上述实验结果可以看出：本发明的亚硫酸氢钠穿心莲内酯对高脂血症有抑制作用：降低总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇，升高高密度脂蛋白胆固醇。较穿心莲内酯呈更明显的升高甘油三酯的趋势；可用于预防和治疗高血脂症以及控制继发心血管疾病等。在本实验使用穿心莲内酯预防和治疗的剂量范围内，对肝肾功能影响未发现显著统计学意义。动物实验剂量范围的相对安全，有助于下一步药物的临床开发与转化。

4.2动物体重变化

各组小鼠每周称重，结果见表5、6。

表5apoe小鼠体重

与模型组比较，★p＜0.05，★★p＜0.01，★★★p＜0.001

表6apoe小鼠体重(续表)

与模型组比较，★p＜0.05，★★p＜0.01，★★★p＜0.001

由上表5、6可见，亚硫酸氢钠穿心莲内酯组小鼠体重明显低于模型组和阳性药物组，较穿心莲内酯体重减轻也更明显(p<0.05)，显示本品可能有一定减肥作用，可用于肥胖相关药物的开发。

试验例3亚硫酸氢钠穿心莲内酯对昆明鼠高脂模型血脂的调节作用

1.实验材料

50只8周龄昆明种雄性小白鼠，体重20±2g，购于北京维通利华公司。

药品与试验例1的相同。

2.分组及干预方法

所有小鼠适应性喂养1周后按体重随机分组，分组如下：

正常对照组10只小鼠，普通饮食+生理盐水灌胃。

模型对照组：10只小鼠，高胆固醇饮食+脂肪乳灌胃+生理盐水灌胃。

阳性对照组：10只小鼠，高胆固醇饮食+脂肪乳灌胃+阿托伐他汀钙(10mg/kg/d)灌胃。

亚硫酸氢钠穿心莲内酯组：10只小鼠，高胆固醇饮食+脂肪乳灌胃+亚硫酸氢钠穿心莲内酯(50mg/kg/d)灌胃。

穿心莲内酯组：10只小鼠，高胆固醇饮食+脂肪乳灌胃+穿心莲内酯(50mg/kg/d)灌胃。

高胆固醇饮食采用“西方饮食”配方，由华阜康公司提供(货号：h10141，配方如表2所示)，各组小鼠灌胃容积为10ml/kg，各组小鼠连续灌胃给药4周，以正式实验起为第1天，共28天。

脂肪乳配方和制法：处方：猪油20g，丙基硫氧嘧啶1g，胆固醇8g，谷氨酸钠1g，蔗糖5g，果糖5g，吐温8015ml，丙二醇15ml，水35ml。

制法：猪油70℃水浴融化，保温备用；丙基硫氧嘧啶研细，加入胆固醇和丙二醇，25000rpm均质2min，无可见颗粒，保温备用；谷氨酸钠1g，蔗糖5g，果糖5g用水溶解，搅拌中加入吐温80，搅拌均匀，60℃水浴加热，3000-4000rpm搅拌下将油相缓慢加入，搅拌均匀，即得。

所有小鼠均置于spf级实验动物中心，5只/笼，小鼠房的温度保持在18-22℃之间，湿度恒定在50％左右，12h光照，12h黑暗。试验期间动物自由摄食和饮水(高压消毒灭菌水)。每周称重一次，各组按照上述分组灌胃给药，连续给药4周。

3.试验方法

连续给药28d后，小鼠禁食不禁水12h后，于第29d用异氟烷气体麻醉。麻醉小鼠摘取眼球取血，置于含分离胶的生化管中，室温放置2h后，3500r/min离心15min，取出上层血清，用无菌管分装后-80℃冰箱保存，待测。

4.指标测定

4.1血脂四项、血糖、肝肾功检测

用贝克曼au5822自动生化仪检测血清tc(cho)、tg、hdl-c、ldl-c、glu、ast、alt、crea、bun水平。结果见下表7。

表7对昆明小鼠高脂模型血脂、血糖和肝肾功能的影响

与模型组比较，★p＜0.05，★★p＜0.01，★★★p＜0.001

由上表7可见，与模型组比较，亚硫酸氢钠穿心莲内酯对高脂喂养的昆明小鼠血中甘油三酯(tg)有明显降低作用,且作用有优于阳性对照组和穿心莲内酯的趋势；对总胆固醇(tc)和血中低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)有减低作用。

在本实验中，亚硫酸氢钠穿心莲内酯对肝肾功能无显著性影响。

4.2动物体重变化

各组小鼠每周称重，结果见表8。

表8对小鼠高脂模型体重的影响

与模型组比较，★p＜0.05，★★p＜0.01，★★★p＜0.001

由上表7、8可见，亚硫酸氢钠穿心莲内酯对km小鼠的体重有明显的减轻作用。且呈优于阳性对照药物的趋势。亚硫酸氢钠穿心莲内酯抑制甘油三酯在细胞内堆积沉淀，预防、治疗肥胖症。

本发明上述实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。