草药组方提取物在制备治疗白血病药物中的应用
【专利摘要】本发明公开了一种草药组方提取物在制备治疗白血病药物中的应用，它包括金银花1?10份、蒲公英1?10份及紫花地丁1?10份；将以上组分中的两种或三种进行混合后，向混合物中加入15?25倍量的水浸泡20?40分钟，再加热煎煮提取三次，并将三次滤液混合，减压浓缩至浓度为5g/mL，紫外灭菌，保存于?20℃，获得草药组方提取物。本发明将金银花、蒲公英及紫花地丁单独或复配，发现通过水提的方式获得的提取物具有良好的抑菌效果，更发现了这三种药物组合所产生的协同效应，这三味中药在形成组合后对癌细胞的生长具有选择性抑制作用，特别是对白血病细胞K562的生长抑制极其显著地强于其它癌细胞。
【专利说明】
草药组方提取物在制备治疗白血病药物中的应用
技术领域
[0001]本发明涉及药学领域，尤其是一种草药组方提取物在制备治疗白血病药物中的应用。
【背景技术】
[0002]金银花(Lonicera japonica Thunb)系忍冬科忍冬属多年生半常绿藤本植物，又名忍冬，为常用大宗中药材，是国务院确定的名贵中药材之一。金银花药用历史悠久，其性甘寒气芳香，甘寒清热而不伤胃，具有宣散风热、清热解毒、消痈散肿、凉血止痢、杀虫止痒之功效，自古被誉为清热解毒的良药。金银花化学成分研究表明，花蕾中含有木犀草素(Luteolin)、肌醇(InositoI)和阜式。分离出绿原酸(Chlorogenie acid)和异绿原酸(Isochlorogenic acid)，它们是金银花抗菌作用的主要有效成分。金银花的挥发油中含有30多种成分，包括挥发油(棕榈酸、香树烯、香叶醇、α-松油醇、芳樟醇)、有机酸类、(绿原酸、异绿原酸、棕榈酸和肉豆蔻酸)、黄酮类(木樨草素)、肌醇、三萜皂苷等多种成分。临床广泛用于治疗身热、发疹、发斑、热毒疮痈、咽喉肿、瘟疫臃肿毒症、菌痢、麻疹、腮腺炎、痢疾、胃肠炎、腹泻、风湿关节痛、跌打肿痛、功能性子宫出血、治毒蛇咬伤、皮肤湿疹等疾病。
[0003]蒲公英(Herba Taraxaci)，属菊科多年生草本植物，又名布谷英、黄花地丁、婆婆丁、华花郎等，是温带至亚热带常见的一种一年或二年生植物。蒲公英含萜类、黄酮、多糖、挥发油、生物碱、有机酸、菊糖等，具有杀菌、抗病毒、抗癌、抗氧化、抗炎、利尿、利胆、抗过敏、抗血栓形成、降血糖的作用。多种三萜类化合物均具有抗肿瘤活性。蒲公英同时富含蛋白质、脂肪、碳水化合物、微量元素及维生素等，有丰富的营养价值，是药食兼用的植物。
[0004]紫花地丁(V1laphilippica Car)，为堇菜科植物紫花地丁的干燥全草，又名堇菜地丁，为植物紫花地丁或犁头草的带根全草。全草含甙类、黄酮类、蜡、蜡酸、软脂酸、对羟基苯甲酸、反式对羟基桂皮酸、丁二酸、二十酰对羟基苯乙胺、阿福豆甙(afzelin)和山柰酚-3-0-鼠李糖甙等。紫花地丁具有清热解毒、凉血消肿之功效，主要用于治疗疔疮肿毒、痈疽发背、丹毒、毒蛇咬伤等病症，临床应用广泛。《肿瘤方剂大辞典》中记录了上述三味草药各10 g混合在一起组成一剂药方，水煎服，可治疗恶性淋巴瘤。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是:发现了一种草药组方提取物在制备治疗白血病药物中的应用。
[0006]本发明是这样实现的:草药组方提取物在制备治疗白血病药物中的应用，按质量份数计算，它包括金银花1-10份、蒲公英1-10份及紫花地丁 1-10份;将以上组分中的两种或三种进行混合后，向混合物中加入15-25倍量的水浸泡20-40分钟，再加热煎煮提取三次，并将三次滤液混合，减压浓缩至浓度为5g/mL，紫外灭菌，保存于-20°C，获得草药组方提取物；用该草药组方提取物作为抑制白血病细胞K562生长的药物的有效成分。
[0007]将所述的草药组方提取物作为有效成分制备成片剂、注射剂、胶囊剂、口服液或滴丸剂。
[0008]由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明将金银花、蒲公英及紫花地丁单独或复配，发现通过水提的方式获得的提取物具有良好的抑菌效果，更发现了这三种药物组合所产生的协同效应，这三味中药在形成组合后对癌细胞的生长具有选择性抑制作用，特别是对白血病细胞K562的生长抑制极其显著地强于其它癌细胞，为开发新的抗癌药物提供了思路。本发明材料来源广泛，成本低廉，使用效果理想。
【附图说明】
[0009]
[0010]附图1为终浓度为100yg/mL的不同提取液对三株菌株生长的抑制作用；
附图2为不同浓度的三味中草药等质量混合的水提取液对三株菌株生长的抑制作用。
【具体实施方式】
[0011 ]本发明的实施例1:草药组方提取物在制备治疗白血病药物中的应用:
金银花为贵州省遵义市产全草，蒲公英为贵州省都匀市产全草，紫花地丁为贵州省贵阳市产全草。三种中药均为夏季所采样本，除杂质后自然阴干。
[0012]分别将三种中药进行组合，总共有7个组，分别为:I组金银花10g，2组蒲公英10g，3组紫花地丁 10 g，4组金银花、蒲公英各10 g，5组金银花及紫花地丁各10 g，6组蒲公英及紫花地丁各10 g，7组金银花、蒲公英及紫花地丁各10 go
[0013]取各组分，并按上述分组分好，向各组药物中加入20倍量加水浸泡30分钟后，电炉加热煎煮提取三次，并将三次滤液混合，用旋转蒸发仪浓缩至浓度为5 g/mL，紫外灭菌，保存于-20°C冰箱备用。
[0014]本发明的实施例2:提取物抗癌效果检测:
细胞及其它试剂
白血病细胞K562、前列腺癌细胞PC3、乳腺癌细胞MDA均为贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室保存。DMEM培养基购于Hycone公司，胎牛血清(FBS)购于浙江天杭生物科技有限公司，四甲基偶氮哩盐(MTT)购于GENVIEW公司，二甲基亚飒(DMSO)购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
[0015]体外抗肿瘤活性检测
分别取对数生长期的白血病细胞K562、前列腺癌细胞PC3、乳腺癌细胞MDA，以2 X 14个/mL密度接种96孔培养板中。首先检测50yg/mL的提取液对三种癌细胞生长的抑制作用，运用37°C、5% CO2培养箱中培养48h的细胞，将10 yL提取液加入90 yL的细胞中，继续培养24h后进行MTT检测。
[0016]其次检测不同浓度(终浓度为100、80、60、40、20、1、5 yg/mL)的提取液，对照组加入DMSO(使DMSO终浓度为0.03%)，每孔加5 mg/mL MTT溶液10 uL，37°C继续培养4h。终止培养后，进行离心(1000 rpm，10 min)，吸取并弃掉培养液，每孔加DMSO 100 yL，震动10 min，使结晶物充分溶解，在酶标仪上测定570 nm长下各孔的吸光度(0D值)，将OD值作为反映细胞活性及代谢状况的参数，结果以均数土标准差(X 土 s )表示。组间比较的t检验法进行统计学分析。各实验组和对照组均设复孔，每一实验至少重复3次。生长抑制率用上述计算细菌抑菌率的公式进行计算。
[0017]研究结果表明这三味中草药单味(第1、2、3组)、两两组合(第4、5、6组)及三味中草药等质量混合(第7组)的水提取液对三种癌细胞的生长均有不同程度的抑制作用(图1);但两两组合及三味中草药等质量混合的水提取液对白血病细胞K562的生长抑制极其显著地强于其它细胞(P < 0.01)，这表明这三味中药在形成组合后对癌细胞的生长具有选择性抑制作用，且三味中草药等质量混合的水提取液的抑制效果最好(P < 0.01)，明显强于两两组合的提取液。
[0018]进一步分析了两两组合(第4、5、6组)及三味中草药等质量混合(第7组)的水提取液对白血病细胞生长抑制的浓度曲线，结果表明四组的提取液的抑制效果均随着浓度的增加而逐渐增加，这表明这种抑制作用具有浓度依赖关系。根据浓度抑制曲线，计算了其IC50值(抑制活性达到一半时的药物浓度)。结果表明金银花与蒲公英组合(第4组)的水提液的IC5Q值为47.77 ± 3.47yg/mL，金银花、紫花地丁组合(第5组)的水提液IC5q值为48.43 ± 3.98yg/mL，蒲公英、紫花地丁组合(第6组)的水提液IC5q值为46.68±4.23yg/mL，而三味中草药等质量混合(第7组)的水提取液IC5q值为20.05 ± 2.27yg/mL，显著强于两两组合的抑制效果(P<0.01)o
[0019]运用倒置荧光显微镜进行观察，也发现第七组水提取液对K562细胞生长具有显著作用，并观察到了部分细胞呈现出凋亡的现象，因此，运用流式细胞仪对其凋亡率进行了检测。结果表明第七组的水提取液能够显著地诱导K562细胞凋亡，其40yg/mL的粗提液的诱导癌细胞凋亡率达到了38.35 ± 3.98%，极其显著地高于对照(P〈0.01)。
[0020]流式细胞仪检测细胞凋亡
运用流式细胞术检测三种中草药组方水提取液诱导癌细胞凋亡情况。取对数生长期的白血病细胞K562，以2 X 16个/mL密度接种6孔培养板中。于37 °C、5% CO2培养箱中培养48h，实验组加入终浓度为40 yg/mL的提取液，对照组加入DMSO(使DMSO终浓度为0.03%)。收集细胞(I?5) X 16个，500?1000 r/min离心5 min，弃去培养液，3 mL PBS洗一次。离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定，4°C，lh。离心弃去固定液，3 mL PBS重悬5 min，弃去PBS。用I mL PI染液，4°C避光30 min。用流式细胞仪检测细胞的凋亡率。
[0021]三种中草药组方水提取液处理的K562细胞凋亡率达到了接近40%，明显高于control组和DMSO处理组。
[0022]将实施例1中4-7组提取草药组方提取物与药学上可接受的辅料制备成可接受的剂型，如片剂、注射剂、胶囊剂、口服液或滴丸剂。
[0023]经发明人验证，这三味中药在本发明提供的范围内，按不同比例组合均具有协同效应，但实施例中仅以最优方案作为例子进行说明。
【主权项】
1.一种草药组方提取物在制备治疗白血病药物中的应用，其特征在于:按质量份数计算，它包括金银花1-10份、蒲公英1-10份及紫花地丁 1-10份;将以上组分中的两种或三种进行混合后，向混合物中加入15-25倍量的水浸泡20-40分钟，再加热煎煮提取三次，并将三次滤液混合，减压浓缩至浓度为5g/mL，紫外灭菌，保存于-20°C，获得草药组方提取物;用该草药组方提取物作为抑制白血病细胞K562生长的药物的有效成分。2.根据权利要求1所述的草药组方提取物在制备治疗白血病药物中的应用，其特征在于:将所述的草药组方提取物作为有效成分制备成片剂、注射剂、胶囊剂、口服液或滴丸剂。
【文档编号】A61K36/86GK106038838SQ201610140334
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年3月14日 公开号201610140334.8, CN 106038838 A, CN 106038838A, CN 201610140334, CN-A-106038838, CN106038838 A, CN106038838A, CN201610140334, CN201610140334.8
【发明人】骆衡, 张小东, 朱绪辉, 潘卫东, 黄丽荣, 王星慧, 封素娟, 关天琪, 王恒
【申请人】贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室, 首都医科大学附属北京朝阳医院