山竹果壳提取物的药物新用途
【专利摘要】本发明公开了一种山竹果壳提取物的药物新用途。该药物用途是其在制备下述产品中的应用：1）预防和/或治疗帕金森病的产品；2）预防和/或治疗帕金森病人多巴胺神经元树突的退行性病变的产品；3）抗氧化应激产品；4）预防和/或治疗帕金森病氧化应激的产品。药效学实验表明，山竹果壳提取物能够使A30P帕金森病线虫模型多巴胺神经元树突（部分）恢复；同时还可抑制鱼藤酮诱导的帕金森病线虫模型体内的活性氧水平。进而证明，山竹果壳提取物具有较好的抗帕金森病作用及抗氧化应激的作用。
【专利说明】山竹果壳提取物的药物新用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种山竹果壳提取物的药物新用途。
【背景技术】
[0002] 帕金森病（Parkinson，s disease, PD)是仅次于阿尔茨海默病（Alzheimer' s disease, AD)的第二大神经退行性疾病，它是一种黑质纹状体系统多巴胺（dopamine, DA) 神经功能受损所致多巴胺与乙酰胆碱平衡失调的一种慢性疾病，以运动迟缓、静止性震颤 和强直为主要特征。ro病因至今未明，可能与年老、环境因素及遗传因素有关，其发病机制 也涉及自由基、氧化应激、谷氨酸兴奋性毒性、线粒体复合物I缺失、炎症、神经营养因子缺 乏和凋亡等，在级联生化反应中这些机制相互作用最终导致神经元死亡。
[0003] 近年来，鱼藤酮模型由于能够同时再现ro的行为学改变和所有病理学特征而备 受国内外学者关注，鱼藤酮诱导的模型更接近人类ro症状。鱼藤酮来源于植物中的天然产 物，鱼藤酮具有极强的亲脂性，在不依赖DA转运体的情况下自由通过血脑屏障和细胞膜并 聚集在细胞器如线粒体内，是线粒体氧化磷酸化的解偶联剂，特异性抑制呼吸链中的复合 物I。可选择性抑制线粒体复合物I的活性产生活性氧和释放凋亡诱导因子，引起氧化应激 和细胞凋亡。实验证实低剂量慢性给予鱼藤酮可引起动物的ro症状。
[0004] a -synuclein被认为在帕金森病发病过程中发挥核心作用，表现在： I) a -synuclein突变体A53T、A30P、E46K在不同帕金森病家系中被鉴定出来；2) a -synuclein蛋白是帕金森病人Lewy小体的主要成分。a -synuclein基因突变可能与家 族帕金森病人黑质纹状体多巴胺神经元的退行性病变有关，所以，人们利用转基因技术，是 野生型或突变型a -synuclein在小鼠或模式生物如果蝇、秀丽隐杆线虫中过度表达制备 出动物模型来研究帕金森病发病机制或药物作用机制。转人a-synuclein突变基因(突变 位点A30P)的线虫F 1D模型(简称A30P)由日本Tomoki Kuwahara等人制备而成的线虫帕金 森病模型（Kuwahara T.，Koyama A.，Gengyo-Ando K. , et al. (2006). Familial Parkinson mutant alpha-synuclein causes dopamine neuron dysfunction in transgenic Caenorhabditis elegans[J]· J Biol Chem281(I):334_340)〇
[0005] 线虫具有精确的解剖结构，快速的复制周期，简短的生活史以及半透明的胞体 (http://www. wormbook. org/)。线虫虽小，却能感受各种环境刺激（接触、温度、化学物质、 离子、外激素等），并通过肌肉协调运动作出种种反应，以完成趋利避害、进食、排粪、交配等 行为。还有证据表明线虫的关联记忆可保持一天以上。通过基因沉默或敲除等手段很容易 对其基因表达进行调节。可直接对特定的神经元亚型，如多巴胺能神经元进行转基因干预。 通过荧光指示剂容易实现在活体线虫中观察神经元的完整性，并且可从幼虫阶段一直观察 直到其衰老。这些特点使得线虫成为研究衰老相关疾病强大的模式生物。线虫的多巴胺神 经元在细胞及分子水平上重点体现哺乳类多巴胺神经元的特点。但不同于脊椎动物含有上 万个多巴胺神经元，雌雄同体的线虫仅有8个多巴胺神经元，易于观察。其中6个位于大前 端，由两对CEP (cephalic)和一对ADE (anterior deirid)神经元组成。尾部还有两个F1DE (posterior deirid)神经元。它们表现出所有哺乳类动物与多巴胺生物合成、储存、转运及 传递信号的酶活性。
[0006] 山竹（Garcinia mangostana)又名山竹子、莽吉柿、凤果，是藤黄科藤黄属常绿乔 木山竹的果实，产于南洋热带地区，有"热带果后"之称。外果皮中含有大量的粗纤维、果胶、 植物多酚类物质，可以入药。山竹外果皮在国内的临床应用非常少，而作为泰国、缅甸、印度 等东南亚国家的传统医药，山竹外果皮已经被广泛用于治疗腹痛、腹泻、痢疾、感染性创伤、 化脓、慢性溃疡等疾病治疗和抗溃疡、抗炎、抗白血病和败血病等。20世纪70年代，国外业 内人士在山竹外果皮中相继发现了一系列新的化学成分及非常有价值的生物活性成分。研 究发现山竹具有抗氧化活性、增强机体免疫力作用、抗炎及抗过敏作用、增强机体免疫力作 用等作用。目前尚未有将山竹果壳提取物用于治疗帕金森病的相关报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种山竹果壳提取物的药物新用途。
[0008] 本发明所提供的山竹果壳提取物的药物新用途是其在制备预防和/或治疗帕金 森病的产品中的应用。所述帕金森病包括原发性帕金森病药物和继发性帕金森病。
[0009] 更进一步的，本发明还提供了山竹果壳提取物在制备预防和/或治疗帕金森病人 多巴胺神经元树突的退行性病变的产品中的应用；山竹果壳提取物在制备抗氧化应激产品 中的应用；以及山竹果壳提取物在制备预防和/或治疗帕金森病氧化应激的产品中的应 用。
[0010] 上述广品均包括药物和保健品。
[0011] 本发明中所述山竹果壳提取物是从山竹干燥果壳中提取的有效成分。其提取方法 可采用本领域现有技术对山竹果壳进行提取的常规操作，也可以采用体积分数为的80? 95%乙醇水溶液对山竹果壳进行回流提取处理，收集回流液，经浓缩和干燥后得到山竹果壳 提取物。
[0012] 上述提取方法中，山竹果壳在提取前可先进行预处理：将山竹果壳清洗干净后， 60°C干燥至恒重，将干燥的山竹果壳掰碎或粉碎后用于后期的提取。
[0013] 具体提取方法如下：将山竹果壳用体积分数为的80?95%乙醇水溶液进行回流提 取，收集回流液并浓缩，将得到的浓缩液真空干燥，得到山竹果壳提取物；所述回流、浓缩和 干燥均为本领域的常规操作。
[0014] 所述回流提取至少进行一次，优选提取2次，每次提取的时间可为1-2小时；每次 提取时，提取溶剂与所述山竹果壳的配比为8-10L: lkg。
[0015] 以山竹果壳提取物为有效成分制备的预防和/或治疗帕金森病的药物和/或保健 品，也属于本发明的保护范围。
[0016] 所述预防和/或治疗帕金森病的药物可通过口服、注射、喷射、渗透、吸收、物理或 化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹 后导入机体。
[0017] 以山竹果壳提取物为有效成分的药物，需要的时候，在上述药物中还可以加入一 种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘 合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。所述药物的给药方式 可以是但不局限于口服、静注、肌注等方式，其剂型可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶 囊、口服液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
[0018] 药效学实验表明，山竹果壳提取物能够使A30P帕金森病线虫模型多巴胺神经元 树突(部分）恢复；同时还可抑制鱼藤酮诱导的帕金森病线虫模型体内的活性氧水平。进而 证明，所述山竹果壳提取物具有较好的抗帕金森病作用及抗氧化应激的作用，其单次服用 剂量范围为1?200mg/kg。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1为山竹果壳提取物对A30P线虫帕金森病模型的干预作用，与对照组相比， P〈0.001。
[0020] 图2为山竹果壳提取物对鱼藤酮所致N2线虫活性氧升高的抑制作用（RFU表示相 对荧光单位）;$$$鱼藤酮vs.对照组，p〈0. 001 ;***山竹果壳提取物vs.鱼藤酮，p〈0. 001。
【具体实施方式】
[0021] 下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中 所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从 商业途径获得。
[0022] 下述实施例中所用的实验材料如下
[0023] 1、线虫品系：菌株E. coli 0P50、野生型秀丽隐杆线虫Bristol (N2)(参考文献： Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans [J]. Genetics, 1974, 77:71 - 94)； 转人α-synuclein突变基因（突变位点A30P)的线虫H)模型（简称A30P)(参考文献： Kuwahara T. , Koyama A. , Gengyo-Ando K. , et al. (2006). Familial Parkinson mutant alpha-synuclein causes dopamine neuron dysfunction in transgenic Caenorhabditis elegans[J], J Biol Chem281(I):334-340)
[0024] 2、药物和试剂：琼脂粉（日本协和株式会社），peptone、tryptone (OXOID)，鱼藤酮 和DHR123 (sigma)，其余试剂均为国产。
[0025] 统计学分析：采用ANOVA方差检验分析药物干预实验结果，定量资料以JT±S表示； 采用两样本t检验方法比较分析组间差异。
[0026] 下述实施例中所使用的山竹果壳提取物是按照如下方法制备得到的：将山竹果壳 清洗干净后，60°C干燥至恒重，称重得到3kg ;将干燥的山竹果壳掰碎，加入体积分数为95% 的乙醇溶液分别以1:1〇，1:8的比例（kg/L)回流提取2次，每次提取时间为1.5小时，收集 回流液并浓缩，将得到的浓缩液真空干燥24小时，得到真空干燥的提取物；所述回流、浓缩 和干燥均为本领域的常规操作。
[0027] 实施例1、山竹果壳提取物对A30P帕金森病线虫模型多巴胺神经元树突的影响线 虫常规培养：
[0028] 模型组A30P线虫，接种于涂布E. Coli 0P50的标准线虫培养基（nematode growth medium，NGM)于 20°C恒温培养。
[0029] 药物干预实验：
[0030] 同步化：用M9缓冲溶液将年轻成虫洗至无菌EP管中，加适量裂解液（0. 5%次氯酸 钠，0. 5N氢氧化钠）裂解线虫，置低速离心机上离心（3000rpm，lmin)，弃上清，再用M9缓冲 溶液冲洗线虫2次，离心弃上清后用移液器吸取EP管底部线虫滴于NGM的无菌区，约48小 时后裂解的线虫体内的受精卵基本发育成L4期幼虫，完成同步化用于下一步实验。
[0031] 同步化的线虫接种到各组培养基中，20°C恒温培养3天，加入不同浓度的山竹果 壳提取物（lmg/ml和0. lmg/ml)干预，20°C恒温培养4天，挑取年轻成虫置荧光显微镜下观 察，统计多巴胺神经元树突(部分)恢复线虫比例，结果见图1。以上实验独立重复一次。由 图1可知，lmg/ml山竹果壳提取物干预线虫A30P 模型后，与对照组相比，多巴胺树突缺 失表型线虫存在比例明显高于对照组（P < 0. 001)。
[0032] 实施例2、山竹果壳提取物对鱼藤酮诱导帕金森病线虫模型体内活性氧水平的影 响线虫常规培养：
[0033] 野生型秀丽隐杆线虫N2，接种于涂布E. Coli 0P50的标准线虫培养基（nematode growth medium，NGM)于 20°C恒温培养。
[0034] 药物干预实验：
[0035] 同步化：用M9缓冲溶液将年轻成虫洗至无菌EP管中，加适量裂解液（0. 5%次氯酸 钠，0. 5N氢氧化钠）裂解线虫，置低速离心机上离心（3000rpm，lmin)，弃上清，再用M9缓冲 溶液冲洗线虫2次，离心弃上清后用移液器吸取EP管底部线虫滴于NGM的无菌区，约48小 时后裂解的线虫体内的受精卵基本发育成L4期幼虫，完成同步化用于下一步实验。
[0036] 同步化的线虫接种到各组培养基中，20°C恒温培养3天，加入25 μ M鱼藤酮诱导线 虫Η)模型，同时加入不同浓度的山竹果壳提取物（lmg/ml和0. lmg/ml)干预，24h后，用Μ9 缓冲溶液清洗线虫，加入终浓度为100 μ M DHR123(二氢罗丹明123)在30°C下避光孵育， 30min后M9清洗除去多余DHR123,上SYNERGY2多功能酶标仪检测荧光度值（λ ex=485nm， λ em=520nm)的变化，以此反映线虫体内活性氧水平的改变。结果见图2。由图2可知，与 对照组相比，25 μ M鱼藤酮可明显增高线虫体内活性氧的水平（P〈0. 001);而给予0. lmg/ml 及lmg/ml山竹果壳提取物干预24h后，线虫体内活性氧水平明显低于鱼藤酮组（P〈0. 001， P〈0.001)。
【权利要求】
1. 山竹果壳提取物在制备下述产品中的应用：1)预防和/或治疗帕金森病的产品；2) 预防和/或治疗帕金森病人多巴胺神经元树突的退行性病变的产品；3)抗氧化应激产品； 4)预防和/或治疗帕金森病氧化应激的产品。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述帕金森病包括原发性帕金森病药物 和继发性帕金森病。
3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述产品为药物和/或保健品。
4. 根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于：所述山竹果壳提取物为山竹 果壳的乙醇水溶液提取物；所述乙醇水溶液优选体积分数80?95%的乙醇水溶液。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述山竹果壳提取物是按照下述方法提 取得到的：将山竹果壳用体积分数为的80?95%乙醇水溶液进行回流提取，收集回流液并 浓缩，将得到的浓缩液真空干燥，得到山竹果壳提取物； 其中，所述回流提取至少进行一次，优选提取2次，每次提取的时间为1-2小时；每次提 取时，提取溶剂与所述山竹果壳的配比为8-10L: lkg。
6. -种产品，其活性成分为山竹果壳提取物； 所述产品选自下述任意一种：1)预防和/或治疗帕金森病的产品；2)预防和/或治疗 帕金森病人多巴胺神经元树突的退行性病变的产品；3)抗氧化应激产品；4)预防和/或治 疗帕金森病氧化应激的产品。
7. 根据权利要求6所述产品，其特征在于：所述帕金森病包括原发性帕金森病药物和 继发性帕金森病。
8. 根据权利要求6或7所述的产品，其特征在于：所述产品为药物和/或保健品。
9. 根据权利要求6-8中任一项所述的产品，其特征在于：所述山竹果壳提取物为山竹 果壳的乙醇水溶液提取物；所述乙醇水溶液优选体积分数80?95%的乙醇水溶液。
10. 根据权利要求9所述的产品，其特征在于：所述山竹果壳提取物是按照下述方法提 取得到的：将山竹果壳用体积分数为的80?95%乙醇水溶液进行回流提取，收集回流液并 浓缩，将得到的浓缩液真空干燥，得到山竹果壳提取物； 其中，所述回流提取至少进行一次，优选提取2次，每次提取的时间为1-2小时；每次提 取时，提取溶剂与所述山竹果壳的配比为8-10L: lkg。
【文档编号】A61K36/185GK104435019SQ201310447244
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年9月25日 优先权日:2013年9月25日
【发明者】李玉娟, 王丹巧, 于友华, 李连达 申请人:中国中医科学院医学实验中心