龙虎人丹在防治药物性肝损伤上的应用的制作方法

本发明涉及一种龙虎人丹新用途，具体地说，涉及一种龙虎人丹在防治药物性肝损伤上的应用。

背景技术：

药物性肝损伤（drug-inducedliverinjury,dili）是指由化学药物、生物制剂、抗生素、中药及中成药、膳食补充剂及其代谢产物等所诱发的肝损伤。对乙酰氨基酚（apap）作为常用的otc类解热镇痛药，它在推荐剂量下安全有效，然而过量可能导致肝毒性和急性肝衰竭，其肝毒性是美国和英国药物性肝衰竭最常见的原因。按照推荐剂量服用时，大多数apap与葡萄糖醛酸或硫酸盐结合后随尿液排出体外，约5%~9%的apap被细胞色素p450系统（主要是cyp2e1）转化成有毒的活性代谢产物n-乙酰对苯醌亚胺(napqi)，napqi再被谷胱甘肽(gsh)迅速转化为无毒代谢物。然而，当apap过量时，会导致gsh耗竭，napqi的持续生成造成肝损伤。有研究结果表明，apap诱导的肝损伤模型中，gsh耗尽的线粒体产生的活性氧（ros）增加，导致线粒体通透性发生改变，从而抑制线粒体的生物功能，核酸内切酶g（endog）和凋亡诱导因子（apoptosis-inducingfactor，aif）移位至细胞核，导致细胞核dna断裂，最终导致肝细胞坏死。

n-乙酰半胱氨酸（nac）作为apap中毒唯一有效的解毒剂，它必须在apap消耗后尽早使用才能获得最大药效，这对大多数apap过量患者，尤其是那些无意过量服用apap的患者来说，几乎不太可能实现。若治疗不及时导致病情发展至肝衰竭，肝衰竭唯一根治的手段是肝移植，但是由于时间紧急、供体稀缺、价格昂贵等多种因素，限制了其大范围应用。因此，需要寻找其他有效的防治药物。

龙虎人丹，非处方中成药，主治开窍醒神，祛暑化浊，和中止呕，用于中暑头晕，恶心呕吐，腹泄及晕车、晕船。其主要成分有薄荷脑、冰片、丁香、砂仁、八角茴香、肉桂、胡椒、木香、干姜、儿茶、甘草、糯米粉、苯甲酸钠、红氧化铁、糊精、滑石粉、甲基硅油、石墨粉剂、乙醇。

经申请人研究发现，龙虎人丹干预后肝细胞损伤情况得到较好改善，为此，申请人进一步实验研究，并申请专利保护。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是，利用龙虎人丹来防治长期或过量服用对乙酰氨基酚（apap）所致的急性肝损伤。

本发明的方案是：

龙虎人丹在防治药物性肝损伤上的应用。所述药物性肝损伤是由长期或过量服用对乙酰胺基酚所致的急性肝损伤。用于包括人在内的哺乳动物。

附图说明

图1为各实验组血清alt活性比较图，其中与空白组比较：^**p<0.01；与模型组比较：龙虎人丹低剂量^##p<0.01,龙虎人丹高剂量^#p<0.05。

图2为各实验组小鼠肝脏组织h&e染色结果比较图，其中a为空白组；b为模型组；c为nac组；d为龙虎人丹低剂量组；e为龙虎人丹高剂量组。

图3为各实验组小鼠肝脏gsh水平比较图，与空白组比较：^**p<0.05；与模型组比较：龙虎人丹低剂量^##p<0.01,龙虎人丹高剂量^#p<0.05。

图4为各实验组小鼠肝脏ros表达情况比较图，a为空白组；b为模型组；c为nac组；d为龙虎人丹低剂量组；e为龙虎人丹高剂量组。

图5为各实验组小鼠肝脏gclc和endog蛋白表达比较图，与空白组比较：^****p<0.01；与模型组比较：龙虎人丹低剂量^####p<0.01,龙虎人丹高剂量^####p<0.01（endog）；与空白组比较：^*p<0.05；与模型组比较：低剂量^####p<0.01,高剂量^####p<0.01（gclc）。

具体实施方式

具体实验过程：

1.动物

健康spf级c57bl/6雄性小鼠30只，6-8周龄，由广东省实验动物中心提供，动物生产许可证号：scxk（粤）2018-0034，实验单位使用许可证编号：syxk（粤）2017-0125。6只/笼，群养，自由饮水进食。

2.药物

龙虎人丹（上海中华药业有限公司生产），对乙酰氨基苯酚、nac（上海麦克林生化科技有限公司生产），羧甲基纤维素钠（cmc-na，生工生物工程（上海）股份有限公司），pbs粉末（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）。

3.主要试剂及仪器

anti-gclc（proteintechgroup），anti-endog（affinitybiosciences），anti-β-actin（北京全式金生物技术有限公司），alt检测试剂盒、gsh检测试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司），苏木素、伊红（上海宏兹实业有限公司）。

电子天平（德国mettlertoledo仪器有限公司），高速冷冻离心机（美国赛默飞公司），微型蛋白电泳转印系统（美国伯乐公司），化学发光仪（上海勤翔科学仪器有限公司），脱水机、包埋机（湖北亚光医用电子有限公司），切片机（德国徕卡公司），显微镜（日本奥林巴斯公司），酶标仪（美国赛默飞公司）。

4.造模及干预方法

将30只雄性c57bl/6小鼠随机均分成5组：正常对照组（cmc-na）、apap模型组（250mg/kg）、nac阳性对照组（50mg/kg）、龙虎人丹低剂量组（80mg/kg）、龙虎人丹高剂量组（160mg/kg）。采取预防性给药，即连续灌胃给药6天后造模。除正常对照组，其余组别小鼠参照参考文献（furutak,yoshiday,oguras,etal.gab1adaptorproteinactsasagatekeepertobalancehepatocytedeathandproliferationduringacetaminophen-inducedliverinjuryinmice[j].hepatology,2016,63(4):1340-1355.）建立过量对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤模型：晚上19:00开始禁食，22h后，于次日下午17:00点造模，即腹腔注射250mg/kgapap，正常对照组则腹腔注射pbs，给药体积均为20μl/g。

5.检测指标及方法

5.1血清alt测定血清alt测定采用微板法，按照试剂盒说明书操作：处理后的血清样本置于室温环境稳定后，用酶标仪于510nm波长处测定各个孔的od值，根据标准曲线计算得出血清alt值。

5.2肝脏组织h&e染色将小鼠肝脏组织用10%的中性缓冲甲醛液固定，脱水，石蜡包埋、切片、脱蜡，使用苏木素和伊红对组织进行染色，脱水，中性树胶封片，镜下观察其肝脏组织形态学变化。

5.3肝脏gsh水平检测准确称取组织重量，按重量（g）:体积（ml）=1:9的比例，加入9倍的生理盐水制成组织匀浆，2500转/分，离心10分钟，取上清液按照说明书检测gsh含量。

5.4westernblot检测肝脏组织gclc和endog蛋白表达各组小鼠肝脏组织经匀浆、离心后收集上清液，采用bca法测定蛋白浓度，按照说明书配制分离胶及浓缩胶，进行蛋白电泳后采用半干转印法将蛋白转至pvdf膜，经5%脱脂牛奶封闭，gclc（1:1000）及endog（1:1000）一抗4℃孵育过夜，二抗（1:5000）室温孵育1h，tbst漂洗后显影及曝光。采用imagej软件进行灰度统计，与β-actin对比得到目的蛋白的相对表达量。

5.5荧光探针dcfh-da法检测组织细胞内的活性氧表达各组小鼠肝脏组织石蜡切片充分脱蜡后，经荧光探针dcfh-da孵育、pbs漂洗、封片后于荧光显微镜下观察ros的表达情况。

6.统计学方法

采用graphpadprism7软件进行分析，实验结果以表示，成组设计的资料采用t检验分析各组间差异的统计学意义。p<0.05为差异有统计学意义。

实验结果：

各组小鼠血清alt值比较见图1。与正常对照组比较，apap模型组血清alt水平显著升高，差异具有统计学意义（p<0.01）；与apap模型组比较，龙虎人丹低（p<0.01）、高剂量组及nac阳性对照组血清alt水平均显著降低且具有统计学意义（p<0.05）。

各组小鼠肝脏组织h&e染色结果比较见图2。光镜观察可见正常对照组肝小叶结构清晰，肝索围绕在中央静脉周围呈放射状排列，肝细胞核规则，肝细胞无变性或坏死，无明显炎性细胞浸润。模型组肝小叶结构模糊，出现大面积的肝细胞变性和坏死，损伤严重。nac及龙虎人丹低、高剂量组较模型组均有不同程度的改善，表现为肝细胞变性和坏死面积减少。

各组小鼠肝脏gsh水平比较见图3。与正常对照组比较，apap模型组肝脏gsh水平显著降低，差异具有统计学意义（p<0.05）；与模型组比较，龙虎人丹低（p<0.01）、高剂量组及nac阳性对照组肝脏gsh水平显著升高（p<0.05）。

各组小鼠肝脏的ros表达情况比较见图4。与正常对照组相比，apap模型组ros含量显著上调；与apap模型组比较，龙虎人丹低、高剂量组及nac阳性对照组的ros均有显著性下调。

各组小鼠肝脏组织gclc和endog蛋白表达比较见图5。与正常对照组比较，apap模型组肝脏gclc蛋白表达显著下调（p<0.05），endog蛋白表达显著上调（p<0.01）；与apap模型组比较，龙虎人丹低、高剂量组及nac阳性对照组肝脏gclc蛋白表达显著增加（p<0.01），endog蛋白表达显著下调（p<0.01）。

实验分析：

alt作为肝脏主要的功能酶之一，会从坏死或变性的肝细胞释放到血液中，因此血清alt活性增高是急性肝细胞损伤的敏感标志。本实验中apap模型组的血清alt活性较正常对照组显著增高，h&e染色结果及ros含量辅助证明造模成功，而龙虎人丹干预后肝细胞损伤情况得到较好改善，说明龙虎人丹具有一定的保护作用。

gsh是由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸组成的三肽，是体内的一种低分子清除剂，可清除h2o2等，gsh量的多少是衡量机体抗氧化能力的重要指标。本实验中apap模型组的gsh显著降低，龙虎人丹干预后则显著上调，证明龙虎人丹可通过上调gsh含量来改善肝损伤。

ros是引起氧化应激的主要活性分子，主要由线粒体产生。ros可直接破坏线粒体膜，使线粒体膜通透性增加，出现水肿，直接导致endog易位至细胞核从而发生dna断裂，最终导致细胞坏死。本实验中apap造模后，肝脏ros含量及endog蛋白表达量均显著增加，而龙虎人丹干预后，出现明显下调，证明龙虎人丹是通过抑制ros的产生及endog的表达来改善apap诱导的肝损伤。

在真核细胞中，核因子e2相关因子2(nuclear-factor-e2-relatedfactor2,nrf2)信号通路是主要的抗氧化机制。一旦被激活（如通过nrf2转录后修饰），nrf2就会转位到细胞核中，并与抗氧化反应元件(antioxidantresponsiveelement,are)结合，促进多种抗氧化基因和解毒酶的转录，包括血红素加氧酶-1（hemeoxygenase-1,ho-1）、gclc等。药物干预的小鼠肝脏gsh含量和gclc蛋白表达量显著升高，则表明小鼠肝脏抗氧化应激能力增强，证实了龙虎人丹的调节作用。

综上所述，apap造模小鼠存在肝功能的受损，龙虎人丹可减轻小鼠的病理损伤，同时改善其肝脏功能，提升肝脏抗氧化能力。本试验证明了龙虎人丹对急性肝损伤的防治作用，为其临床应用提供了理论参考。