含表柔比星的药物、其制备方法、药物组合物及其应用与流程

本申请涉及医药领域，具体而言，涉及一种含表柔比星的药物、其制备方法、药物组合物及应用。
背景技术：
：表柔比星(epirubicin,csa:56420-45-2,分子式：c27h29no11.hci，分子量：580.0)是一种抗肿瘤抗生素，是阿霉素的同分异构体，作用机制是直接嵌入dna核酸碱基对之间，干扰转录过程，阻止mrna的形成，从而抑制dna、rna及蛋白质的合成。是一种细胞周期非特异性药物，对多种移植性肿瘤均有效，包括急性白血病和恶性淋巴瘤、乳腺癌、支气管肺癌、卵巢癌、肾母细胞瘤、软组织肉瘤、肝癌(包括原发性肝细胞癌和转移性癌)以及甲状腺髓样癌等多种实体瘤。目前，包括表柔比星在内的抗肿瘤抗生素为了在肿瘤部位达到有效的治疗水平，必须应用大剂量的化疗药物，但是大剂量的全身给药可能会损害健康的正常细胞，在一系列组织和器官中造成不良反应。这些不良反应包括免疫系统抑制(骨髓抑制)，消化道粘膜的炎症和淸疡(粘膜炎)，掉发(脱发)和器官特异性毒性，例如心脏毒性和神经毒性。为了避免这些不良反应的发生，就需要通过一种肿瘤局部给药的方式来取代传统的全身给药，以达到提高肿瘤局部的药物浓度，降低全身药物浓度的效果。因此，如何实现这种局部药物输送和体外控释，已经成为癌症化疗研究重点。为减轻药物活性成分靶向性差所产生的副作用，药物递送载体应运而生，其作用主要是承载药物活性成分，将活性成分输送至血液或组织细胞内以治疗疾病。目前已经有多种多样的方法来实现不同药物的靶向运输。有用仪器或器械实现的，比如基因枪、电穿孔仪等。这些方法无需使用基因载体，但是转染效率普遍很低、操作复杂，对组织的损伤也比较大。也有用病毒载体介导的，如腺病毒、慢病毒等，病毒载体虽然有较高的体外转染活性，然而，其免疫原性与易导致突变的缺点为体内输送带来了巨大的安全隐患。还有非病毒载体，尤其是生物可降解的高分子材料来实现药物的靶向运输。非病毒载体的优势主要在于，在保证预期的转染活性的条件下，可以大大降低病毒载体所带来的免疫原性与诸多炎症反应。上述多种靶向运输方式中，目前更多的研究集中在非病毒载体领域，且一般为以下几种载体设计：(a)阳离子脂质体；(b)聚阳离子基因载体。而目前研究更多的主要集中于聚阳离子基因载体与阳离子脂质体的修饰，使之适用于基因物质的靶向输送。阳离子脂质体具有较高的体内外转染活性，然而，由于表面的正电荷影响其体内的正常分布，同时，阳离子脂质会在动物试验中引起免疫原性与炎症反应。聚阳离子基因载体目前发展已经较为成熟，然而在结构设计中难以保证靶向基团在结构的表面，而且存在一个毒性与转染活性的自身设计矛盾，同时,其连接难以在体内实现无毒化降解。因此，如何改进现有小分子药物表柔比星的递送可靠性是解决目前表柔比星药物临床应用受限的难点之一。技术实现要素：本申请的主要目的在于提供一种含表柔比星的药物、其制备方法、药物组合物及应用，以提高表柔比星药物的递送可靠性。为了实现上述目的，根据本申请的一个方面，提供了一种含表柔比星的药物，其包括核酸纳米颗粒和表柔比星，且表柔比星挂载在核酸纳米颗粒上；核酸纳米颗粒包括核酸结构域，核酸结构域包含a序列、b序列和c序列，a序列包含a1序列或者a1序列发生至少一个碱基插入、缺失或替换的序列，b序列包含b1序列或者b1序列发生至少一个碱基插入、缺失或替换的序列，c序列包含c1序列或者c1序列发生至少一个碱基插入、缺失或替换的序列；其中，a1序列为seqidno:1：5’-ccagcguucc-3’或者seqidno:2：5’-ccagcgttcc-3’；b1序列为seqidno:3：5’-gguucgccg-3’或者seqidno:4：5’-ggttcgccg-3’；c1序列为seqidno:5：5’-cggccauagcgg-3’或者seqidno:6：5’-cggccatagcgg-3’。进一步地，a1序列为seqidno:1，b1序列为seqidno:3，c1序列为seqidno:5时，a序列、b序列、c序列中的至少一个序列包含至少一个碱基插入、缺失或替换的序列。进一步地，碱基插入、缺失或替换发生在：(1)seqidno:1或seqidno:2所示的序列的5’端起始的第1、2、4或5位碱基上；和/或(2)seqidno:1或seqidno:2所示的序列的5’端起始的第8～10位碱基之间；和/或(3)seqidno:3或seqidno:4所示的序列的5’端起始的第1～3位碱基之间；和/或(4)seqidno:3或seqidno:4所示的序列的5’端起始的第6～9位碱基之间；和/或(5)seqidno:5或seqidno:6所示的序列的5’端起始的第1～4位碱基之间；和/或(6)seqidno:5或seqidno:6所示的序列的5’端起始的第9～12位碱基之间。进一步地，a序列、b序列和c序列自组装成式(1)所示结构：其中，w-c表示watson-crick配对，n和n’表示非watson-crick配对，任一位置的w-c各自独立地选自c-g或g-c；在a序列中，从5’端起的第一个n为a，第二个n为g，第三个n为u或t，第四个n为u、t、a、c或g中的任意一个；在b序列中，从5’端起的第一个n’为u、t、a、c或g中的任意一个；第二个n’为u或t，第三个n’为c；在c序列中，沿5’端至3’端方向上的nnnn序列为caua或cata。进一步地，a序列、b序列和c序列为如下任意一组：(1)a序列：5'-ggagcguugg-3'，b序列：5'-ccuucgccg-3'，c序列：5'-cggccauagccc-3'；(2)a序列：5'-gcagcguucg-3'，b序列：5'-cguucgccg-3'，c序列：5'-cggccauagcgc-3'；(3)a序列：5'-cgagcguugc-3'，b序列：5'-gcuucgccg-3'，c序列：5'-cggccauagccg-3'；(4)a序列：5'-ggagcguugg-3'，b序列：5'-ccuucgggg-3'，c序列：5'-cccccauagccc-3'；(5)a序列：5'-gcagcguucg-3'，b序列：5'-cguucggcg-3'，c序列：5'-cgcccauagcgc-3'；(6)a序列：5'-gcagcguucg-3'，b序列：5'-cguucggcc-3'，c序列：5'-ggcccauagcgc-3'；(7)a序列：5'-cgagcguugc-3'，b序列：5'-gcuucggcg-3'，c序列：5'-cgcccauagccg-3'；(8)a序列：5'-ggagcgttgg-3'，b序列：5'-ccttcgccg-3'，c序列：5'-cggccatagccc-3'；(9)a序列：5'-gcagcgttcg-3'，b序列：5'-cgttcgccg-3'，c序列：5'-cggccatagcgc-3'；(10)a序列：5'-cgagcgttgc-3'，b序列：5'-gcttcgccg-3'，c序列：5'-cggccatagccg-3'；(11)a序列：5'-ggagcgttgg-3'，b序列：5'-ccttcgggg-3'，c序列：5'-cccccatagccc-3'；(12)a序列：5'-gcagcgttcg-3'，b序列：5'-cgttcggcg-3'，c序列：5'-cgcccatagcgc-3'；(13)a序列：5'-gcagcgttcg-3'，b序列：5'-cgttcggcc-3'，c序列：5'-ggcccatagcgc-3'；(14)a序列：5'-cgagcgttgc-3'，b序列：5'-gcttcggcg-3'，c序列：5'-cgcccatagccg-3'。进一步地，核酸结构域中，还包括第一延长段，第一延长段为watson-crick配对的延长段，第一延长段位于a序列、b序列和c序列中任一序列的5'端和/或3'端；优选地，第一延长段选自如下任意一组：(1)：a链5'端：5'-ccca-3'，c链3'端：5'-uggg-3'；(2)：a链3'端：5'-ggg-3'，b链5'端：5'-ccc-3'；(3)：b链3'端：5'-cca-3'，c链5'端：5'-ugg-3'；(4)：a链5'端：5'-cccg-3'，c链3'端：5'-cggg-3'；(5)：a链5'端：5'-cccc-3'，c链3'端：5'-gggg-3'；(6)：b链3'端：5'-ccc-3'，c链5'端：5'-ggg-3'；(7)：b链3'端：5'-ccg-3'，c链5'端：5'-cgg-3'；(8)：a链5'端：5'-ccca-3'，c链3'端：5'-tggg-3'；(9)：b链3'端：5'-cca-3'，c链5'端：5'-tgg-3'。进一步地，核酸结构域还包括第二延长段，第二延长段位于a序列、b序列和c序列中任一序列的5’端和/或3’端，第二延长段为watson-crick配对的延长段；优选地，第二延长段为cg碱基对的延长序列；更优选，第二延长段为1～10个cg碱基对的延长序列。进一步地，核酸结构域还包括如下至少一组第二延长段：第一组：a链5’端：5’-cgcgcg-3’，c链3’端：5’-cgcgcg-3’；第二组：a链3’端：5’-cgccgc-3’，b链5’端：5’-gcggcg-3’；第三组：b链3’端：5’-ggcggc-3’，c链5’端：5’-gccgcc-3’。进一步地，第二延长段为同时含有cg碱基对和at/au碱基对的延长序列，优选第二延长段为2～50个碱基对的延长序列。进一步地，第二延长段为连续2～8个cg碱基对的序列与连续2～8个at/au碱基对序列交替设置的延长序列；或者，第二延长段为1个cg碱基对的序列与1个at/au碱基对序列交替设置的延长序列。进一步地，a序列、b序列和c序列中碱基、核糖和磷酸酯具有至少一个可修饰位点，任一可修饰位点通过以下任意一种修饰接头进行修饰：-f、甲基、氨基、二硫化物、羰基、羧基、巯基及醛基；优选地，a序列、b序列和c序列中的c或u碱基上具有2’-f修饰。进一步地，表柔比星通过物理连接和/或共价连接的形式挂载在核酸纳米颗粒上，且表柔比星与核酸纳米颗粒之间的摩尔比为2～300:1，优选为10～50:1，更优选为15～25:1。进一步地，核酸纳米颗粒还包括生物活性物质，生物活性物质与核酸结构域相连，生物活性物质为靶头、荧光素、干扰核酸sirna、mirna、核酶、核糖开关、适体、rna抗体、蛋白、多肽、类黄酮、葡萄糖、天然水杨酸、单抗、维生素、酚类卵磷脂以及除表柔比星以外的小分子药物中的一种或多种。进一步地，将核酸结构域的相对分子量记为n1，将表柔比星与生物活性物质的总相对分子量记为n2，n1/n2≥1:1。进一步地，生物活性物质为靶头、荧光素以及mirna中的一种或多种，其中，靶头位于a、b、c序列中任一序列上，优选a、b、c任一序列的5’端或3’端，或嵌插于核酸结构域的gc键之间，mirna为抗mirna，荧光素修饰于抗mirna的5’端或3’端，mirna位于a序列的3’端、c序列的5’端和3’端中的任意一个或多个位置；优选地，靶头为叶酸或生物素，荧光素为fam、cy5及cy3中的任意一种或多种，抗mirna为抗mir-21。进一步地，除表柔比星以外的小分子药物为含有如下任意一种或多种基团的药物：氨基基团、羟基基团、羧基基团、巯基基团、苯环基团以及乙酰氨基基团。进一步地，蛋白为sod、生存素、htert及egfr、psma中的一种或多种；维生素为左旋c和/或酯化c；酚类为茶多酚和/或葡萄多酚。进一步地，核酸纳米颗粒的粒径为1～100nm，优选为5～50nm；更优选10～30nm；进一步优选10～15nm。根据本申请的另一方面，还提供了一种含表柔比星的药物的制备方法，其包括以下步骤：提供上述的核酸纳米颗粒；通过物理连接和/或共价连接的方式将表柔比星挂载在核酸纳米颗粒上，得到含表柔比星的药物。进一步地，通过物理连接的方式挂载表柔比星的步骤包括：将表柔比星、核酸纳米颗粒及第一溶剂混合并搅拌，得到预混体系；对预混体系进行沉淀析出，得到含表柔比星的药物；优选地，第一溶剂选自dcm、dcc、dmap、py、dmso、pbs及冰醋酸中的一种或多种；优选地，对预混体系进行沉淀析出，得到含表柔比星的药物的步骤包括：对预混体系进行沉淀析出，得到析出物；对析出物进行洗涤去除杂质,得到含表柔比星的药物；更优选地，将预混体系与无水乙醇混合后在低于10℃的温度条件下沉淀析出，得到析出物；含表柔比星的药物；更优选在0～5℃温度条件下沉淀析出，得到析出物。更优选地，采用6～12倍体积的无水乙醇对析出物进行洗涤去除杂质，得到含表柔比星的药物。进一步地，通过共价连接的方式挂载表柔比星的步骤包括：配置表柔比星溶液；使表柔比星溶液在甲醛的介导作用下与核酸纳米颗粒的g环外氨基进行反应，得到反应体系；提纯反应体系，得到含表柔比星的药物；优选地，反应的步骤包括：将表柔比星溶液与多聚甲醛溶液、核酸纳米颗粒混合，在避光条件下进行反应，得到反应体系；其中优选多聚甲醛溶液的浓度优选为3.7～4wt％，优选多聚甲醛溶液为多聚甲醛和第二溶剂混合形成的溶液，且第二溶剂为dcm、dcc、dmap、py、dmso、pbs及冰醋酸中的一种或多种。进一步地，制备方法还包括制备核酸纳米颗粒的步骤，其包括：通过将上述的核酸结构域对应的单链进行自组装，得到核酸结构域；优选地，在得到核酸结构域之后，制备方法还包括：将上述的生物活性物质通过物理连接和/或共价连接的方式挂载在核酸结构域上，进而得到核酸纳米颗粒。进一步地，通过共价连接的方式挂载生物活性物质的过程中，通过溶剂共价连接、linker共价连接或点击链接进行挂载；优选地，溶剂共价连接中采用的第三溶剂作为连接介质，且第三溶剂选自多聚甲醛、dcm、dcc、dmap、py、dmso、pbs及冰醋酸中的一种或多种；优选地，linker选自二硫键、对苯叠氮基、溴丙炔或peg；优选地，点击链接是在对生物活性物质前体和核酸结构域同时进行炔基或叠氮修饰，然后通过点击链接。进一步地，生物活性物质与核酸结构域以点击链接的方式相连时，生物活性物质前体进行炔基或叠氮修饰的位点选自2’羟基、羧基或氨基，核酸结构域进行炔基或叠氮修饰的位点选自g环外氨基、2’-羟基、a氨基或2’-羟基。根据本申请的第三个方面，还提供了一种药物组合物，该药物组合物包括上述任一种含表柔比星的药物。根据本申请的第四个方面，还提供了上述任一种含表柔比星的药物在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。进一步地，肿瘤为急性白血病、恶性淋巴瘤、乳腺癌、支气管肺癌、卵巢癌、肾母细胞瘤、软组织肉瘤、原发性肝细胞癌、转移性肝癌以及甲状腺髓样癌中的任意一种或多种。根据本申请的第五个方面，还提供了一种预防和/或治疗肿瘤的方法，该方法包括：提供上述任一种含表柔比星的药物或药物组合物；给予肿瘤患者有效量的上述含表柔比星的药物或药物组合物。进一步地，肿瘤为急性白血病、恶性淋巴瘤、乳腺癌、支气管肺癌、卵巢癌、肾母细胞瘤、软组织肉瘤、原发性肝细胞癌、转移性肝癌以及甲状腺髓样癌中的任意一种或多种。本申请提供的含表柔比星的药物中包括核酸纳米颗粒和表柔比星，且表柔比星通过物理连接和/或共价连接的形式挂载在核酸纳米颗粒上。该核酸纳米颗粒中，通过包含本申请所提供的三条序列或其变异序列，不仅能够自组装形成核酸结构域，而且可以作为载体在三条链的任意5'端和/或3'末端连接表柔比星，或者能够使表柔比星稳定地嵌插在核酸结构域的链间。本申请通过将小分子药物表柔比星挂载于核酸纳米颗粒上，利用核酸纳米颗粒的内部疏水性、外部的亲水性以及碱基的堆砌效应，对表柔比星起到了“包被作用”，而且包被作用或共价连接使表柔比星在一定的时间内不会被溶解，提高了递送的稳定性。此外，当核酸结构域经过靶头修饰后，可具有较好的靶向性，能够稳定地递送表柔比星，可靠性很高；同时能减少表柔比星与非目标细胞或组织的接触的机会，降低毒副作用。附图说明构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：图1示出了本申请实施例1中自组装形成的rna纳米颗粒的电泳检测结果；图2示出了本申请实施例1中自组装形成的dna纳米颗粒的电泳检测结果；图3示出了本申请实施例2中自组装形成的7组短序列rna纳米颗粒的2％琼脂糖凝胶电泳检测结果；图4示出了本申请实施例2中自组装形成的7组短序列rna纳米颗粒的4％琼脂糖凝胶电泳检测结果；图5示出了本申请实施例3中自组装形成的7组常规序列rna纳米颗粒的2％琼脂糖凝胶电泳检测结果；图6示出了本申请实施例3中自组装形成的7组常规序列rna纳米颗粒的4％琼脂糖凝胶电泳检测结果；图7示出了本申请实施例4中自组装形成的7组常规序列dna纳米颗粒的2％琼脂糖凝胶电泳检测结果；图8示出了本申请实施例4中自组装形成的7组常规序列dna纳米颗粒的4％琼脂糖凝胶电泳检测结果；图9示出了本申请实施例4中自组装形成的常规序列dna纳米颗粒d-7的透射电镜照片；图10a示出了本申请实施例5中rna纳米颗粒挂载率检测过程中表柔比星吸光度的标准曲线；图10b示出了本申请实施例5中dna纳米颗粒挂载率检测过程中表柔比星吸光度的标准曲线；图11示出了本申请实施例6中rnah-biotin-quasar670纳米颗粒及rnah-biotin-quasar670-epb纳米颗粒与hl60细胞的结合和内化的显微镜观察结果；图12示出了本申请实施例8中rnah-biotin-quasar670-epb纳米颗粒在coomassieblue程序下，在血清中孵育不同时间后的电泳检测结果；图13示出了本申请实施例8中rnah-biotin-quasar670-epb纳米颗粒在stainfreegel程序下，在血清中孵育不同时间后的电泳检测结果；图14示出了本申请实施例9中dnah-bio-egfrapt-cy5-epb纳米颗粒在血清中孵育不同时间后的电泳检测结果；图15示出了本申请实施例10中小分子药物表柔比星及rnah-biotin-quasar670-epb纳米颗粒抑制hl60细胞增殖情况检测结果；图16示出了本申请实施例10中荧光靶向载体rnah-bio-fam抑制hl60细胞增殖情况的检测结果；图17a至图17d示出了实施例11中dnah-bio-egfrapt-cy5-epb纳米颗粒抑制mcf-7细胞增殖的检测结果，其中，图17a是小分子药物表柔比星对mcf-7细胞的增殖抑制情况，图17b是dnah-bio-egfrapt-cy5-epb(靶向药)对mcf-7细胞的增殖抑制情况，图17c是dnah-bio-egfrapt-cy5(靶向荧光载体)对mcf-7细胞的增殖抑制情况，而图17d是dmso的空白对照对mcf-7细胞的增殖抑制情况；图18a至图18d示出了实施例11中dnah-bio-egfrapt-cy5-epb纳米颗粒抑制nci-h1975细胞增殖的检测结果，其中，图18a是小分子药物表柔比星对nci-h1975细胞的增殖抑制情况，图18b是dnah-bio-egfrapt-cy5-epb(靶向药)对nci-h1975细胞的增殖抑制情况，图18c是dnah-bio-egfrapt-cy5(靶向荧光载体)对nci-h1975细胞的增殖抑制情况，而图18d是dmso的空白对照对nci-h1975细胞的增殖抑制情况；图19示出了本发明实施例12中7组延长段变形+核心短序列rna自组装产物的非变性page胶电泳检测结果；图20示出了本发明实施例12中rna纳米颗粒r-15的溶解曲线；图21示出了本发明实施例12中rna纳米颗粒r-16的溶解曲线；图22示出了本发明实施例12中rna纳米颗粒r-17的溶解曲线；图23示出了本发明实施例12中rna纳米颗粒r-18的溶解曲线；图24示出了本发明实施例12中rna纳米颗粒r-19的溶解曲线；图25示出了本发明实施例12中rna纳米颗粒r-20的溶解曲线；图26示出了本发明实施例12中rna纳米颗粒r-21的溶解曲线；图27示出了本发明实施例13中7组延长段变形+核心短序列dna自组装产物的非变性page胶电泳检测结果；图28示出了本发明实施例13中dna纳米颗粒d-8的溶解曲线；图29示出了本发明实施例13中dna纳米颗粒d-9的溶解曲线；图30示出了本发明实施例13中dna纳米颗粒d-10的溶解曲线；图31示出了本发明实施例13中dna纳米颗粒d-11的溶解曲线；图32示出了本发明实施例13中dna纳米颗粒d-12的溶解曲线；图33示出了本发明实施例13中dna纳米颗粒d-13的溶解曲线；图34示出了本发明实施例13中dna纳米颗粒d-14的溶解曲线；图35示出了本发明实施例14中rna纳米颗粒r-15在血清中孵育不同时间后的电泳检测结果；图36示出了本发明实施例14中rna纳米颗粒r-16在血清中孵育不同时间后的电泳检测结果；图37示出了本发明实施例14中rna纳米颗粒r-17在血清中孵育不同时间后的电泳检测结果；图38示出了本发明实施例14中rna纳米颗粒r-18在血清中孵育不同时间后的电泳检测结果；图39示出了本发明实施例14中rna纳米颗粒r-19在血清中孵育不同时间后的电泳检测结果；图40示出了本发明实施例14中rna纳米颗粒r-20在血清中孵育不同时间后的电泳检测结果；图41示出了本发明实施例14中rna纳米颗粒r-21在血清中孵育不同时间后的电泳检测结果；图42示出了本发明实施例15中dna纳米颗粒d-8在血清中孵育不同时间后的电泳检测结果；图43示出了本发明实施例15中dna纳米颗粒d-9在血清中孵育不同时间后的电泳检测结果；图44示出了本发明实施例15中dna纳米颗粒d-10在血清中孵育不同时间后的电泳检测结果；图45示出了本发明实施例15中dna纳米颗粒d-11在血清中孵育不同时间后的电泳检测结果；图46示出了本发明实施例15中dna纳米颗粒d-12在血清中孵育不同时间后的电泳检测结果；图47示出了本发明实施例15中dna纳米颗粒d-13在血清中孵育不同时间后的电泳检测结果；图48示出了本发明实施例15中dna纳米颗粒d-14在血清中孵育不同时间后的电泳检测结果；图49a、图49b、图49c、图49d、图49e、图49f、图49g、图49h分别示出了本发明实施例18中dmso和原药阿霉素、d-8和d-8-阿霉素、d-9和d-9-阿霉素、d-10和d-10-阿霉素、d-11和d-11-阿霉素、d-12和d-12-阿霉素、d-13和d-13-阿霉素、d-14和d-14-阿霉素所对应的细胞存活率曲线；图50示出了实施例19的挂载率检测过程中采用的柔红霉素吸光度的标准曲线。具体实施方式需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本申请。术语解释：rnah、dnah或空白载体：指不含任何生物活性物质的空白核酸纳米颗粒载体，如rnah或dnah。靶向载体：指含有靶头但不含有荧光物质的核酸纳米颗粒载体，如biotin-rnah或biotin-dnah。荧光载体：指含有荧光物质但不含有靶头的核酸纳米颗粒载体，如cy3-rnah或cy3-dnah。靶向荧光载体：指含有靶头和荧光物质的核酸纳米颗粒载体，如rnah-biotin-fam或dnah-biotin-fam。靶向药：指含有靶头、荧光物质和化药的核酸纳米颗粒载体，如rnah-biotin-quasar670-epb或dnah-biotin-quasar670-epb。需要说明的是，本申请中的各载体或生物活性物质的命名规则并无特殊格式，其在表述中的前后位置并不代表其在rnah或dnah的5’端或3’端，仅表示含有该生物活性物质。如
背景技术：
所提到的，现有技术中尽管已有多种提高药物递送效率的药物载体，但仍难以解决药物在临床上应用受限的问题。为了改善这一状况，本申请的发明人对现有所有可用作药物载体的材料进行了研究，并从载体的细胞/组织靶向性、运输过程中的稳定性、进入靶细胞的活性和效率、到达靶细胞后的药物释放能力以及对细胞的毒性等方面对各种载体进行了深入考察和分析，发现采用新兴的dna和/或rna分子自组装形成的纳米结构，比如，dna树枝状大分子的自组装体系中dna对核酸酶的降解有显著的阻碍作用，在基因治疗和生物医学领域有非常重要的应用价值。通过对现有报道的dna和rna自组装形成的纳米颗粒进行分析发现，相对于比较刚性的dna纳米颗粒而言，rna纳米颗粒由于分子内或分子间存在大量的茎-环结构，其具有更大柔性和更强的张力，因而在作为候选药物载体方面更具优势。然而，自然状态的rna纳米颗粒稳定性相对较差，而目前基于rna纳米载体应用方面的改进，大多都是围绕提高其稳定性和可靠性而展开的。目前的研究结果尽管在一定程度上提供了挂载药物的可能性，但更侧重于对核酸药物，尤其是sirna药物或mirna药物等挂载的可能性和有效性进行研究。而对于非核酸类的药物是否同样有效，目前报道很少。此外，现有的自组装纳米颗粒，尤其是作为载体应用的自组装纳米颗粒，目前都是采用rna链进行自组装成的，极少数采用了rna链和dna链组合的形式进行自组装的，但却并没有采用纯粹的dna链来实现自组装的。为了提供一种新的可靠好且能够自主装的rna纳米颗粒载体，申请人对现有的rna纳米颗粒进行了比较和改进，开发出了一系列新的rna纳米颗粒，而且，从提高适用性及降低成本角度考虑，进一步尝试了采用纯粹的dna链来进行自组装，意外发现改为这些dna单链不仅能够实现自组装成dna纳米颗粒，而且性能与rna纳米颗粒同样优异。且，dna纳米颗粒的自组装还具有价格廉价和易操作的优势。并经过实验验证，发明人所改进的rna纳米颗粒和dna纳米颗粒均能够挂载各种药物，并能在血清中稳定存在；进一步的实验验证，其能携带药物进入细胞，且单独的载体对细胞无毒性。而携带药物的载体能够对相应疾病起到缓解和治疗作用。在上述研究结果的基础上，申请人提出了本申请的技术方案。本申请提供了一种含表柔比星的药物，该药物包括核酸纳米颗粒和表柔比星，且表柔比星挂载在核酸纳米颗粒上；该核酸纳米颗粒包括核酸结构域，核酸结构域包含a序列、b序列和c序列，a序列包含a1序列或者a1序列发生至少一个碱基插入、缺失或替换的序列，b序列包含b1序列或者b1序列发生至少一个碱基插入、缺失或替换的序列，c序列包含c1序列或者c1序列发生至少一个碱基插入、缺失或替换的序列；其中，a1序列为seqidno:1：5’-ccagcguucc-3’或者seqidno:2：5’-ccagcgttcc-3’；b1序列为seqidno:3：5’-gguucgccg-3’或者seqidno:4：5’-ggttcgccg-3’；c1序列为seqidno:5：5’-cggccauagcgg-3’或者seqidno:6：5’-cggccatagcgg-3’。本申请提供的含表柔比星的药物中包括核酸纳米颗粒和表柔比星，且表柔比星挂载在所述核酸纳米颗粒上。该核酸纳米颗粒中，通过包含上述三条序列或其变异序列，不仅能够自组装形成核酸结构域，而且可以作为载体，在三条链的任意5'端和/或3'末端连接表柔比星，或者能够使表柔比星稳定地嵌插在核酸结构域的链间。本申请提供的含表柔比星的药物，通过将小分子药物表柔比星挂载于核酸纳米颗粒上，因核酸纳米颗粒的内部具有疏水性、外部具有亲水性以及碱基具有堆砌效应，相当于对表柔比星起到了“包被作用”，而包被或共价连接使表柔比星在一定的时间内不会被溶解，提高了递送的稳定性。此外，当核酸结构域经过靶头修饰后，可具有较好的靶向性，能够稳定地递送表柔比星，可靠性很高；同时能减少表柔比星与非目标细胞或组织的接触的机会，降低毒副作用。上述自组装是指基本结构单元自发形成有序结构的一种技术。在自组装的过程中，基本结构单元在基于非共价键的相互作用下自发地组织或聚集为一个稳定、具有一定规则几何外观的结构。自组装过程并不是大量原子、离子或分子之间弱相互作用力(其中“弱相互作用力”指氢键、范德华力、静电力、疏水作用力等)的简单叠加，而是若干个体之间同时自发的发生并联并集合在一起形成一个紧密而又有序的整体，是一种整体的复杂的协同作用。自组装的产生需要两方面的条件：自主装的动力和导向作用。自组装的动力指分子间的弱相互作用力的协同作用，它为分子自组装提供能量。自组装的导向作用指的是分子在空间的互补性，也就是说自组装发生需要在空间的尺寸和方向上满足分子重排的要求。dna纳米技术是一种自下而上的分子自组装模式，由分子构造为起点基于核酸分子的物理和化学性质自发地形成稳定结构，遵循严格的核酸碱基配对原则。多个dna片段在体外以正确顺序连接在一起，通过碱基互补配对原则，建立亚组装结构，最终形成复杂的多级结构。与dna不同，rna的结构可以超出双螺旋的限制。rna可以形成一系列不同的碱基对，碱基对之间至少形成两个氢键。不同的碱基可以分为两种个类型，包括标准的waston-crick碱基对型和非waston-crick碱基对型，可以使得rna形成大量和多种类型的循环结构模块，这些模块就是构成折叠rna三级结构的基本单元。rna纳米技术可以利用这些天然存在的3d模块及其可以预知的相互作用，其中，很多具有生物学活性的rna结构都可以具有原子级别的分辨率，比如核糖体、各类核酶以及存在于核糖开关内的天然rna适配体。rna纳米技术的一个优越特性在于，可以设计出在大小和复杂性上都能够与天然rna物质相媲美的结构。还可以对天然rna复合体内的rna的独特组装性质加以利用。本申请的上述核酸纳米颗粒中，包含序列seqidno:1、seqidno:3和seqidno:5所示的三条序列或其变异后的序列，或者包含序列seqidno:2、seqidno:4和seqidno:6所示的三条序列或其变异后的序列，均以能够通过自组装形成核酸纳米颗粒为准，具体变异后的序列可以在seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6序列基础上合理选择变异位点及其变异类型得到，或者通过延长合适片段得到。seqidno:1、seqidno:3和seqidno:5自组装形成的纳米颗粒为rna纳米颗粒，seqidno:2、seqidno:4和seqidno:6自组装形成的纳米颗粒为dna纳米颗粒。在一种优选的实施例中，上述核酸纳米颗粒为rna纳米颗粒时，且a序列、b序列、c序列中的至少一个序列包含至少一个碱基插入、缺失或替换的序列。该rna纳米颗粒中变异序列的具体位置和碱基类型可以在能够实现自组装的前提下，根据需要改进为提高药物挂载量或提高稳定性的纳米颗粒。为了使核酸纳米颗粒具有相对更高的稳定性，进而使经过表柔比星挂载得到的药物更稳定，在对上述seqidno:1/2、seqidno:3/4和/或seqidno:5/6所示的序列进行碱基插入、缺失或替换时，可以在上述序列的某些特定位置的碱基上进行，一方面使得变异后的序列与原序列一样，能够自组装成纳米颗粒，另一方面变异保留与原序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的同源性，使得其与上述序列自组装形成的纳米颗粒具有同样的载药特性和类似的稳定性，能够很好地挂载和递送表柔比星。在一种优选的实施例中，上述碱基插入、缺失或替换发生在：(1)seqidno:1或2所示的a序列的5’端起始的第1、2、4和5位碱基之间；和/或(2)seqidno:1或2所示的a序列的5’端起始的第8～10位碱基之间；和/或(3)seqidno:3或4所示的b序列的5’端起始的第1～3位碱基之间；和/或(4)seqidno:3或4所示的b序列的5’端起始的第6～9位碱基之间；和/或(5)seqidno:5或6所示的c序列的5’端起始的第1～4位碱基之间；和/或(6)seqidno:5或6所示的c序列的5’端起始的第9～12位碱基之间。上述优选的实施例中，所限定的发生变异的碱基位置，是在seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6所示的序列形成的纳米结构中的非经典watson-crick配对碱基位置或凸出的未配对碱基位置，因而不影响这些凸出或loop结构的形成，从而保持了上述序列形成的纳米结构的柔性和张力，有助于维持其作为载体的稳定性。为了进一步提高上述核酸纳米颗粒的稳定性，进而提高表柔比星挂载后形成的药物的稳定性，在一种优选的实施例中，a序列、b序列和c序列自组装成式(1)所示结构：其中，w-c表示watson-crick配对，n和n’表示非watson-crick配对，任一位置的w-c各自独立地选自c-g或g-c，且a序列、b序列和c序列中至少两条序列各自的5’端和3’端的两个碱基不互补；在a序列中，从5’端起的第一个n为a，第二个n为g，第三个n为u或t，第四个n为u、t、a、c或g中的任意一个；在b序列中，从5’端起的第一个n’为u、t、a、c或g中的任意一个；第二个n’为u或t，第三个n’为c；在c序列中，沿5’端至3’端方向上的nnnn序列为caua或cata。上述优选的实施例中，a、b、c序列通过自组装形成具有式(1)所示的核酸结构域，其中，除了n和n’限定的非watson-crick配对碱基外，其余位置的碱基均形成的经典的watson-crick配对，并且上述watson-crick配对的碱基均选择g-c或c-g碱基对。由于g-c或c-g碱基对间的氢键的作用力大于a-u/t或u/t-a碱基对间的氢键的作用力，因而使得该核酸纳米结构更稳定。而非watson-crick配对碱基所形成的凸起或loop结构，为核酸纳米载体带来更大的张力，使得其对微环境变化的适应性更强，因而该核酸纳米颗粒的稳定性更高。上述式(1)结构的纳米颗粒中，a序列、b序列和c序列的具体序列组成并无特殊限定，只要能够形成上述结构即可。从核酸序列自组装的角度考虑，为了进一步提高上述三条序列自组装成上述式(1)结构的纳米颗粒的效率，在选择watson-crick配对的碱基时，不同位置的碱基选择最好遵循如下原则：(1)a序列、b序列和c序列，单独一条序列时并不自我互补配对形成二级结构；(2)a序列、b序列和c序列，任意两条序列之间一端互补配对形成双链，另一端不互补配对，形成y型或t型结构。上述碱基选择的原则是最大效率地使任意一条链的两端分别与其他两条链的两端分别互补配对，从而提高自组装效率。当然，除了y型或t型结构，也可以是三叉以外的四边形等替他变形形式，只要满足任意两条序列之间一端互补配对形成双链，另一端不互补配对的原则即可。上述式(1)结构的纳米颗粒中，非watson-crick配对碱基中，a序列中从5’端起的第四个n及b序列中与其配对的从5’端起的第一个n’，可以是非watson-crick配对的u-u，也可以是改进后的遵循watson-crick配对原则的t、a、c或g。watson-crick配对相对提高链间的结合力，提高稳定性，而非watson-crick配对赋予了纳米颗粒更大的柔性和灵活性，在面对微环境变化的时候，同样有助于提高纳米颗粒的稳定性。在一种优选的实施例中，a序列、b序列和c序列为如下任意一组：(1)a序列(seqidno：7)：5'-ggagcguugg-3'，b序列(seqidno：8)：5'-ccuucgccg-3'，c序列(seqidno：9)：5'-cggccauagccc-3'；(2)a序列(seqidno：10)：5'-gcagcguucg-3'，b序列(seqidno：11)：5'-cguucgccg-3'，c序列(seqidno：12)：5'-cggccauagcgc-3'；(3)a序列(seqidno：13)：5'-cgagcguugc-3'，b序列(seqidno：14)：5'-gcuucgccg-3'，c序列(seqidno：15)：5'-cggccauagccg-3'；(4)a序列(seqidno：16)：5'-ggagcguugg-3'，b序列(seqidno：17)：5'-ccuucgggg-3'，c序列(seqidno：18)：5'-cccccauagccc-3'；(5)a序列(seqidno：19)：5'-gcagcguucg-3'，b序列(seqidno：20)：5'-cguucggcg-3'，c序列(seqidno：21)：5'-cgcccauagcgc-3'；(6)a序列(seqidno：22)：5'-gcagcguucg-3'，b序列(seqidno：23)：5'-cguucggcc-3'，c序列(seqidno：24)：5'-ggcccauagcgc-3'；(7)a序列(seqidno：25)：5'-cgagcguugc-3'，b序列(seqidno：26)：5'-gcuucggcg-3'，c序列(seqidno：27)：5'-cgcccauagccg-3'；(8)a序列(seqidno：28)：5'-ggagcgttgg-3'，b序列(seqidno：29)：5'-ccttcgccg-3'，c序列(seqidno：30)：5'-cggccatagccc-3'；(9)a序列(seqidno：31)：5'-gcagcgttcg-3'，b序列(seqidno：32)：5'-cgttcgccg-3'，c序列(seqidno：33)：5'-cggccatagcgc-3'；(10)a序列(seqidno：34)：5'-cgagcgttgc-3'，b序列(seqidno：35)：5'-gcttcgccg-3'，c序列(seqidno：36)：5'-cggccatagccg-3'；(11)a序列(seqidno：37)：5'-ggagcgttgg-3'，b序列(seqidno：38)：5'-ccttcgggg-3'，c序列(seqidno：39)：5'-cccccatagccc-3'；(12)a序列(seqidno：40)：5'-gcagcgttcg-3'，b序列(seqidno：41)：5'-cgttcggcg-3'，c序列(seqidno：42)：5'-cgcccatagcgc-3'；(13)a序列(seqidno：43)：5'-gcagcgttcg-3'，b序列(seqidno：44)：5'-cgttcggcc-3'，c序列(seqidno：45)：5'-ggcccatagcgc-3'；(14)a序列(seqidno：46)：5'-cgagcgttgc-3'，b序列(seqidno：47)：5'-gcttcggcg-3'，c序列(seqidno：48)：5'-cgcccatagccg-3'。上述十四组序列所自组装形成的核酸纳米颗粒，不仅具有更高的稳定性，而且自组装效率更高。上述所提到的核酸纳米颗粒不仅能够自我组装成型，而且也具备携带或挂载表柔比星药物的能力。根据上述核酸纳米颗粒中g-c或c-g碱基对的位置的不同，所挂载的表柔比星的量也有所差异。为了使上述核酸结构域能够挂载更多的表柔比星以及生物活性物质(生物活性物质的介绍见下文)，在一种优选的实施例中，上述核酸结构域中还包括第一延长段，第一延长段为watson-crick配对的延长段，第一延长段位于a序列、b序列和c序列中任一序列的5'端和/或3'端。载体与所挂载的物质之间需要一定的匹配关系，当载体的分子量过小而所挂载的物质分子量过大时，从力学角度考虑，载体对挂载物质的携带或运输能力相对降低。因而，通过在前述核酸纳米结构基础上，通过在a序列、b序列和c序列中任一序列的5'端和/或3'端增加第一延长段，能够获得与挂载物质大小相匹配的载体。上述第一延长段的具体长度，可以根据所欲挂载的物质的大小而定。在一种优选的实施例中，第一延长段选自如下任意一组：(1)：a链5'端：5'-ccca-3'，c链3'端：5'-uggg-3'；(2)：a链3'端：5'-ggg-3'，b链5'端：5'-ccc-3'；(3)：b链3'端：5'-cca-3'，c链5'端：5'-ugg-3'；(4)：a链5'端：5'-cccg-3'，c链3'端：5'-cggg-3'；(5)：a链5'端：5'-cccc-3'，c链3'端：5'-gggg-3'；(6)：b链3'端：5'-ccc-3'，c链5'端：5'-ggg-3'。(7)：b链3'端：5'-ccg-3'，c链5'端：5'-cgg-3'；(8)：a链5'端：5'-ccca-3'，c链3'端：5'-tggg-3'；(9)：b链3'端：5'-cca-3'，c链5'端：5'-tgg-3'；(10)：a链5'端：5'-gcggcgagcggcga-3'(seqidno:162)，c链3'端：5'-ucgccgcucgccgc-3'(seqidno:163)；(11)：a链3'端：5'-ggccggaggccgg-3'(seqidno:164)，b链5'端：5'-ccggccuccggcc-3'(seqidno:165)；(12)b链3'端：5'-ccagccgcc-3'(seqidno:166)，c链5'端：5'-ggcggcagg-3'(seqidno:167)；(13)：a链5'端：5'-gcggcgagcggcga-3'(seqidno:168)，c链3'端：5'-tcgccgctcgccgc-3'(seqidno:169)；(14)：a链3'端：5'-ggccggaggccgg-3'(seqidno:170)，b链5'端：5'-ccggcctccggcc-3'(seqidno:171)。上述第一延长段不仅增加了形成核酸纳米结构的三条序列中任意一条或多条的长度，而且，gc碱基组成的第一延长段进一步提高了所形成的纳米颗粒的稳定性。而且，上述序列组成的第一延长段同样使a序列、b序列和c序列保持了较高的自组装活性和效率。从所形成的核酸纳米颗粒的大小及其作为药物递送载体在体内运输时的稳定性考虑，需要能够在运输药物的同时，尽量在达到靶细胞之前不被肾脏过滤出去。在一种优选的实施例中，核酸结构域还包括第二延长段，第二延长段位于a序列、b序列和c序列中任一序列的5’端和/或3’端，第二延长段为watson-crick配对的延长段；更优选地，第二延长段为cg碱基对的延长序列；进一步优选地，第二延长段为1～10个cg碱基对的延长序列。第二延长段是在第一延长段的基础上进一步添加的延长段。在一种优选的实施例中，上述核酸结构域还包括如下至少一组第二延长段：第一组：a链5’端：5’-cgcgcg-3’，c链3’端：5’-cgcgcg-3’；第二组：a链3’端：5’-cgccgc-3’，b链5’端：5’-gcggcg-3’；第三组：b链3’端：5’-ggcggc-3’，c链5’端：5’-gccgcc-3’。这种第二延长段，使得纳米颗粒不存在免疫原性，而且不存在每条链自身折叠结合的二级结构的情况。需说明的是，上述第一延长段和/或第二延长段中也可以间隔有非配对的碱基对。为了使上述核酸纳米颗粒能够挂载更大分子量的生物活性物质(生物活性物质的介绍见下文)、增加载药量以及维持必要的稳定性，在一种优选的实施例中，第二延长段为同时含有cg碱基对和at/au碱基对的延长序列，优选第二延长段为2～50个碱基对的延长序列。此处“at/au碱基”中的“/”是或的关系，具体地，第二延长段为同时含有cg碱基对和at碱基对的延长序列，或者第二延长段为同时含有cg碱基对和au碱基对的延长序列。更具体地，添加上述第二延长段之后的a、b和c序列可以分别是如下序列：a序列为(seqidno:49)：b序列为(seqidno:50)：c序列为(seqidno:51)：上述a序列、b序列和c序列中的m为u或t，当m为t时，上述序列的合成成本大大降低。在实际应用中，可以根据实际需要合理调整上述cg碱基对以及at/au碱基对的延长序列的具体设置位置。在一种更优选的实施例中，第二延长段为连续2～8个cg碱基对的序列与连续2～8个at/au碱基对序列交替设置的延长序列；或者第二延长段为1个cg碱基对的序列与1个at/au碱基对序列交替设置的延长序列。具体地，如将上述seqidno:49所示的a序列中的cgcgcg延长段和cgccgc延长段与aaaaaa延长段的位置互换，将上述seqidno:50所示的b序列中的gcggcg延长段和ggcggc延长段与tttttt延长段的位置互换，将上述seqidno:51所示的c序列中的gccgcc延长段与aaaaaa延长段互换，同时将cgccgc延长段与tttttt延长段互换。上述序列自组装形成的核酸纳米颗粒适用于吲哚类分子结构的生物活性物质的挂载之用(吲哚类分子优选与a结合)。过去多年里，rna作为广泛应用的构建材料所存在的三大挑战包括：1)rna酶降解的敏感性；2)全身注射后对解离的敏感性；3)毒性和不良免疫应答。目前，这三大挑战已经在很大程度上得到了克服：1)核糖-oh基团的2’-氟(2’-f)或者2’-o-甲基(2’-ome)修饰可以使rna在血清中化学稳定；2)某些天然存在的连接基序是热力学稳定的，并且可以保持整个rna纳米颗粒在超低浓度下完整；3)rna纳米颗粒的免疫原性是序列和形状依赖性的，并且可以调节，以使rna纳米颗粒刺激炎性细胞因子的产生，或使得rna纳米颗粒在30mg/kg的重复静脉注射施用时具有非免疫原性和无毒性。因此，为了进一步降低上述核酸纳米颗粒对rna酶降解的敏感性，同时提高在运输过程中的稳定性，在一种优选的实施例中，a序列、b序列和c序列中碱基、核糖和磷酸酯具有至少一个可修饰位点，任一可修饰位点通过以下任意一种修饰接头进行修饰：-f、甲基、氨基、二硫化物、羰基、羧基、巯基及醛基；优选地，a序列、b序列和c序列中的c或u碱基上具有2’-f修饰。当修饰接头为巯基时，属于硫代修饰，修饰强度较弱，成本低。上述表柔比星可以通过物理连接和/或共价连接的形式进行挂载。当表柔比星采用物理嵌插与共价连接两种方式同时与核酸结构域进行连接时，物理嵌插通常是嵌插在gc碱基对之间，优选的嵌插位点数目根据核酸结构域上gc碱基对的数目的不同，按照1～100：1的比例进行嵌插。而采用共价连接方式进行连接时，表柔比星通常会与g环外氨基发生化学反应形成共价连接。更优选地，表柔比星与核酸纳米颗粒之间的摩尔比为2～300:1，优选为2～290:1，更优选为2～29:1，进一步优选为10～50:1，最优选为15～25:1。本申请所提供的含表柔比星的药物中，核酸纳米颗粒是作为表柔比星的递送载体，除此以外，根据不同的药物目的，在一种优选的实施例中，上述核酸纳米颗粒还包括生物活性物质，生物活性物质与核酸结构域相连。生物活性物质为靶头、荧光素、干扰核酸sirna、mirna、核酶、核糖开关、适体、rna抗体、蛋白、多肽、类黄酮、葡萄糖、天然水杨酸、单抗、维生素、酚类、卵磷脂以及除表柔比星以外的小分子药物中的一种或多种。为了提高核酸纳米颗粒对所挂载的生物活性物质的挂载效率和运载效率，核酸结构域的相对分子量与表柔比星及生物活性物质的相对分子量最好存在一定的匹配关系。在一种优选的实施例中，将核酸结构域的相对分子量记为n1，将表柔比星与生物活性物质的总相对分子量记为n2，n1/n2≥1:1。根据具体挂载的生物活性物质的种类的不同，本申请中含表柔比星的药物具有不同性能方面的优化。比如，当生物活性物质为生物素或叶酸时，其所起到的作用是使该含表柔比星的药物具有靶向性，如，特异靶向癌细胞。当生物活性物质为荧光素时，其所起到的作用是使核酸纳米颗粒具有发光示踪效果，如可以是fam、cy3、cy5或quasar670等中的一种或多种。而生物活性物质为某些sirna、mirna、蛋白、多肽、rna抗体、除表柔比星以外的小分子药物时，根据不同生物学功能的不同，可能使得该含表柔比星的药物成为具有特定治疗效果的新产品，比如性能更优异的药物。此外，根据具体挂载的生物活性物质的种类的不同，其具体优选使用的是dna纳米颗粒和rna纳米颗粒，可以根据实际需要进行合理选择。比如，当生物活性物质为药物时，优选dna纳米颗粒或rna纳米颗粒进行挂载，且对组装形成纳米颗粒的单链长度无特殊要求。在一种优选的实施例中，生物活性物质为靶头、荧光素以及mirna，其中，靶头位于a、b、c序列中任一序列上，优选a、b、c任一序列的5’端或3’端，或嵌插于核酸结构域的gc键之间，mirna为抗mirna，荧光素修饰于抗mirna的5’端或3’端，mirna位于a序列的3’端、c序列的5’端和3’端中的任意一个或多个位置；优选地，靶头为叶酸或生物素，荧光素为fam、cy5及cy3中的任意一种或多种，抗mirna为抗mir-21。上述靶头可以通过linker共价连接的方式连接于a、b、c序列中的任一序列上，可用的linker选自二硫键、对苯叠氮基、溴丙炔或peg。此处所说的“任一序列上”是a、b、c序列任一序列的任一位置的碱基上，而连在5’端或3’端更方便，应用更广泛。叶酸修饰可以是物理嵌插模式连接或者是物理嵌插+共价连接。上述荧光素可以现有常用的荧光素，优选为fam、cy5及cy3中的任意一种或多种。上述mirna可以是具有抑癌效果的mirna，也可以是能够抑制对应病症的抗mirna，实际应用中根据医疗需要合理选择。上述抗mirna可以合成于上述a序列的3’端、c序列的5’端和3’端中的任意一个或多个位置。当在上述三个位置上均合成有抗mirna时，抗mirna对相应mirna的抑制作用相对更强。优选为抗mir-21，mir-21参与多种癌症的起始和进展，是侵袭和转移的主要致癌基因。抗mir-21能够有效地同时调节广泛的靶基因，有利于解决癌症的异质性问题。因而，上述优选的核酸纳米颗粒中，靶头，比如叶酸或生物素，能够特异地靶向癌细胞，与癌细胞结合内化后，抗mir-21以非常高的亲和力和特异性与mir-21碱基互补，从而有效降低致癌mir-21的表达。因此，根据实际需要，上述抗mir-21可以合成于上述a序列的3’端、c序列的5’端和3’端中的任意一个或多个位置。当在上述三个位置上均合成有抗mir-21时，抗mir-21对mir-21的抑制作用相对更强。上述所能够挂载的生物活性物质为除了表柔比星以外的其他小分子药物时，根据不同药物所能治疗的疾病类型，药物包括但不仅限于治疗肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、头颈癌、子宫癌、卵巢癌、黑色素瘤、白血病、老年痴呆、强直性脊柱炎、恶性淋巴瘤、支气管癌、类风湿关节炎、hbv乙肝、多发性骨髓瘤、胰腺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、鼻咽癌，食道癌，口腔癌，红斑狼疮疾病的药物；优选地，头颈癌为脑癌、神经母细胞瘤或胶质母细胞瘤。上述所能够挂载的生物活性物质为除了表柔比星以外的小分子药物时，根据药物的分子结构的不同或者所具有的特征性基团的不同，其包括但不仅限于含有如下任意一种或多种基团的药物：氨基基团、羟基基团、羧基基团、巯基基团、苯环基团以及乙酰氨基基团。在一种优选的实施例中，上述蛋白为sod(超氧化物歧化酶)、生存素(survivin)、htert(人端粒酶逆转录酶)及egfr(表皮生长因子受体，epidermalgrowthfactorreceptor)、psma(前列腺特异性膜抗原)的抗体或适配体中的一种或多种；上述维生素为左旋c和/或酯化c；上述酚类为茶多酚和/或葡萄多酚。在一种优选的实施例中，核酸纳米颗粒的粒径为1～100nm，优选为5～50nm，更优选为10～30nm，进一步优选为10～15nm。在该范围内大小合适，既能通过细胞表面受体介导的细胞吞噬现象而进入细胞膜，又避免非特异性的细胞渗透而被肾脏过滤除去，因而，有利的粒径尺寸有助于改进药代动力学、药效学、生物学分布和毒理学的分布。根据本申请的第二方面，还提供了一种上述含表柔比星的药物的制备方法，其包括以下步骤：提供上述任一种核酸纳米颗粒；通过物理连接和/或共价连接的方式将表柔比星挂载在核酸纳米颗粒上，得到含表柔比星的药物。当采用物理连接方式时，表柔比星通常会以物理嵌插形成嵌插在gc碱基对之间。而采用共价连接方式进行连接时，表柔比星通常会与g环外氨基发生化学反应形成共价连接。利用上述方法制备的含表柔比星的药物，其经过靶头修饰后，可具有较好的靶向性，能够稳定地递送表柔比星，可靠性很高。在一种优选的实施例中，通过物理连接的方式挂载表柔比星的步骤包括：将表柔比星、核酸纳米颗粒及第一溶剂混合并搅拌，得到预混体系；对预混体系进行沉淀析出，得到含表柔比星的药物。具体的表柔比星、核酸纳米颗粒的用量可以根据挂载量的变化进行调整，这是本领域技术人员都能够理解的，在此不再赘述。为了提高物理连接的效率和稳定性，优选每升第一溶剂中添加的表柔比星量为0.1～1g。优选地，第一溶剂选自dcm、dcc、dmap、py、dmso、pbs及冰醋酸中的一种或多种。优选地，对预混体系进行沉淀析出，得到含表柔比星的药物的步骤包括：对预混体系进行沉淀析出，得到析出物；对析出物进行洗涤去除杂质，得到含表柔比星的药物。更优选地，将预混体系与无水乙醇混合后在低于10℃的温度条件下进行沉淀析出，得到析出物，进一步优选在0～5℃温度条件下沉淀析出，得到析出物。更优选地，采用6～12倍体积的无水乙醇对析出物进行洗涤去除杂质，得到含表柔比星的药物。在一种优选的实施例中，通过共价连接的方式挂载表柔比星的步骤包括：配置表柔比星溶液；使表柔比星溶液在甲醛的介导作用下与核酸纳米颗粒的g环外氨基进行反应，得到反应体系；提纯反应体系，得到含表柔比星的药物。通过甲醛介导的形式，可以发生如下反应：优选地，上述反应的步骤包括：将表柔比星溶液与多聚甲醛溶液、核酸纳米颗粒混合，在避光条件下进行反应，得到反应体系。多聚甲醛溶液能够释放甲醛小分子，从而参与上述化学反应。为了提高反应效率，优选多聚甲醛溶液的浓度为3.7～4wt％，优选多聚甲醛溶液为多聚甲醛和第二溶剂混合形成的溶液，且第二溶剂为dcm、dcc、dmap、py、dmso、pbs及冰醋酸中的一种或多种。上述制备方法中，核酸纳米颗粒可以通过自组装的形式进行制备，比如：(1)将rna或dna单链a，b，c同时混合溶于depc水或tms缓冲液中；(2)加热混合溶液至80℃/95℃(其中rna组装温度为80℃，dna组装温度为95℃)，保持5min后以2℃/min的速率缓慢降温到室温；(3)将产物上样到8％(m/v)非变性page凝胶上并在tbm缓冲液中4℃条件下，以100v电泳纯化复合体；(4)切下目的条带并在rna/dna洗脱缓冲液中37℃洗脱，之后乙醇沉淀过夜，减压低温挥干，得到自组装产物，即可得到核酸结构域，进而得到核酸纳米颗粒。根据实际应用需要，为了使上述含表柔比星的药物具有其他功能，在一种优选的实施例中，在得到核酸结构域之后，制备方法还包括：将前文所提到的生物活性物质通过物理连接和/或共价连接的方式挂载在所述核酸结构域上，进而得到核酸纳米颗粒。生物活性物质的挂载方式同样可以是物理连接和/或共价连接。共价连接的形式包括但不限于通过溶剂共价连接、linker共价连接或点击链接进行挂载；优选地，溶剂共价连接中采用的第三溶剂作为连接介质，且第三溶剂选自多聚甲醛、dcm、dcc、dmap、py、dmso、pbs及冰醋酸中的一种或多种；优选地，linker选自二硫键、对苯叠氮基、溴丙炔或peg；优选地，点击链接是在对生物活性物质前体和核酸结构域同时进行炔基或叠氮修饰，然后通过点击链接。需要说明的是，上述分类并不意味着某种生物活性物质与核酸结构域的连接方式仅有一种。而是，有的生物活性物质，既可以通过物理嵌插的方式与核酸结构域连接，也可以通过物理嵌插与共价连接的方式与核酸结构域连接，同时还可能利用点击链接的方式实现连接。但对某种特定的生物活性物质而言，可能仅有其中一种连接方式，也可能有多种连接方式，但可能其中某种连接效率具有优势的实用价值。上述连接方式中，不同药物在与核酸结构域通过物理嵌插的方式进行连接时，嵌插的结合位点及数目也略有不同。比如，蒽环类、吖啶类药物在嵌插时，通常嵌插在gc碱基对之间，优选的嵌插位点数目根据核酸结构域上gc碱基对的数目的不同，按照1～100：1的比例进行嵌插。而萘酰胺药物在嵌插时，通常嵌插在aa碱基对之间，优选的嵌插位点数目根据核酸结构域上aa碱基对的数目的不同，吡啶并咔唑类根据aa碱基对的数目的不同按照1～200：1的比例进行嵌插。具体地，根据生物活性物质种类的不同、核酸纳米颗粒中形成核酸结构域的a、b和c序列的长度以及其中gc互补碱基对的数目的多少，可以合理选择生物活性物质与核酸结构域的摩尔比进行物理嵌插。在一种优选的实施例中，生物活性物质与核酸结构域以物理嵌插方式与共价连接方式相连时，物理嵌插方式连接的生物活性物质与共价连接方式连接的药物的摩尔比为1～200：1。该连接方式适用于蒽环类、吖啶类的药物。上述不同连接方式连接的药物比例并不局限于上述范围，只要能够满足高效挂载，对细胞无毒性作用，且在达到靶标后实现药物的有效释放即可。当采用对生物活性物质前体和核酸结构域同时进行炔基或叠氮修饰，通过点击链接的方式连接时，随药物不同结构的变化选择不同的点击连接。且随着活性物质结构的不同，连接位置也有可能会发生相应改变，这是本领域技术人员能够理解的。在一种优选的实施例中，生物活性物质与核酸结构域以点击链接的方式相连时，生物活性物质前体进行炔基或叠氮修饰的位点选自羟基、羧基、巯基或氨基，核酸结构域进行炔基或叠氮修饰的位点选自氨基、亚氨基或羟基。需要说明的是，上述核酸结构域与药物结合时，核酸结构域为水溶性的，多数药物的水溶性较差，将其与核酸结构域结合后，水溶性提高。当上述药物为蒽环类时，这些药物通过核苷酸鸟苷上的-nh键(在合适的ph值条件下，该-nh基团的活性比其他可能与药物发生共价结合的基团的活性高上百倍)与核酸结构域发生共价结合，从而形成挂载药物的核酸结构域。因而，根据具体药物分子的大小及具体所设计的核酸结构域上的a序列，b序列和c序列上的gc碱基对的数量，在结合时，按照理论上1.1～1.3倍的过饱和结合量进行结合反应，一个核酸结构域上最多可结合35～45个药物。当上述药物为其他结构时，挂载量与具体药物的占位情况有关(包括但不仅限于分子结构、形态、形状及分子量大小)，因此，药物的活性位点与核酸结构域的核苷酸鸟苷上的-nh键的结合条件相对严苛，同样能挂载但比较难以出现过量结合的情况。根据本申请的第三个方面，还提供了一种药物组合物，该药物组合物包括上述任一种含表柔比星的药物。具体可以根据实际需要，选择合适的联用药或辅料来形成具有联合药效或能使药物某方面性能(比如稳定性)得以提升的药物组合。根据本申请的第四个方面，还提供了上述任一种含表柔比星的药物在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。进一步地，肿瘤为急性白血病、恶性淋巴瘤、乳腺癌、支气管肺癌、卵巢癌、肾母细胞瘤、软组织肉瘤、原发性肝细胞癌、转移性肝癌以及甲状腺髓样癌中的任意一种或多种。具体应用可以在本申请的药物基础上对药物本身进行改进而获得新的药物，或者将本申请的药物作为主要活性成分将其制备成适合剂型的制剂等。根据本申请的第五个方面，还提供了一种预防和/或治疗肿瘤的方法，该方法包括：提供上述任一种含表柔比星的药物或药物组合物；给予肿瘤患者有效量的上述含表柔比星的药物或药物组合物。进一步地，肿瘤为急性白血病、恶性淋巴瘤、乳腺癌、支气管肺癌、卵巢癌、肾母细胞瘤、软组织肉瘤、原发性肝细胞癌、转移性肝癌以及甲状腺髓样癌中的任意一种或多种。此处的有效量包括预防有效量和/或治疗有效量，治疗有效量指在必要的剂量和时间期限内，有效实现所希望的治疗结果，如急性白血病、乳腺癌和/或卵巢癌减轻的量。在一个具体的实施方案中，可以通过调节剂量以提供最佳治疗应答剂量，治疗有效量可以根据如下因素而变：个体的疾病状态、年龄、性别、体重以及制剂在个体中引起所希望的应答的能力。治疗有效量的涵义还包括治疗的有益效果超过其毒性或者有害效果的量。预防有效量指在必要的剂量和时间期限内，有效实现所希望的预防结果，如预防或抑制急性白血病、乳腺癌和/或卵巢癌发生的量。可以根据上述对治疗有效量的描述确定预防有效量。对于任何具体受试者，可以根据个体需要和施用人的职业判断随时间调节特定剂量。需要说明的是，本申请所提供的序列或序列的变形通过自组装形成的核酸纳米颗粒也可以作为基本结构单元，根据实际应用需要可以进一步聚合形成多聚体，比如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体或七聚体等。下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。核酸纳米颗粒的组装实施例1一、rna和dna纳米颗粒载体：(1)组成rna纳米颗粒的三条多核苷酸碱基序列见表1：表1：(2)dna纳米颗粒的三条多核苷酸碱基序列dna采用与上述rna同样的序列，仅是t替代u。其中，a链的分子量为8802.66，b链的分子量为8280.33，c链的分子量为9605.2。上述rna纳米颗粒和dna纳米颗粒的a、b和c链，均是委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。二、自组装实验步骤：(1)按1:1:1的摩尔比将rna或dna单链a，b，c同时混合溶于depc水或tms缓冲液中；(2)加热混合溶液至80℃/95℃(其中rna组装温度为80℃，dna组装温度为95℃)，保持5min后以2℃/min的速率缓慢降温到室温；(3)将产物上样到8％(m/v)非变性page凝胶上并在tbm缓冲液中4℃条件下，以100v电泳纯化复合体；(4)切下目的条带并在rna/dna洗脱缓冲液中37℃洗脱，之后乙醇沉淀过夜，减压低温挥干，得到自组装产物；(5)电泳分析检测。三、自组装实验结果电泳检测结果rna自组装产物的电泳检测结果见图1。图1中，泳道1至3从左到右依次为：a链、b链、rna自组装产物。由图中可知，rna自组装产物随稍有弥散，但明显可以看出是单一条带。且由于分子量为组装后的分子量，较单链分子量大，因此条带位置落后于a链和b链，实际情况与理论相符，证明了上述rna单链之间经自组装形成了稳定的复合结构，形成了rna纳米颗粒。dna自组装产物的电泳检测结果见图2。图2中，泳道1至3从左到右依次为：a链、b链、dna自组装产物。由图中可知，dna自组装产物的条带明亮清晰，为单一条带，证明了上述dna单链之间经自组装形成了稳定的复合结构，形成了dna纳米颗粒。该实施例中，通过凝胶电泳验证了：包括rna核心序列seqidno:1,seqidno:3和seqidno:5在内的a、b、c序列，能够成功自组装成rna纳米颗粒。包括dna核心序列seqidno:2,seqidno:4和seqidno:6在内的a、b、c序列，也能够成功自组装成dna纳米颗粒。上述rna纳米颗粒和dna纳米颗粒的a、b、c序列中除了具有形成核酸结构域的核心序列外，还具有各种促进核酸结构域挂载功能的延长序列(包括药物挂载结合序列)以及与核酸结构域连接的靶头或荧光素。可见，这些核心序列以外的物质存在并不影响核酸结构域的形成和核酸纳米颗粒的成功自组装。而所自组装而成的核酸纳米颗粒在靶头的引导下，能够具有靶向型，荧光素能使该核酸纳米颗粒具有可视性和可追踪性。实施例2一、7组短序列rna纳米颗粒载体：(1)7组组成rna纳米颗粒的三条多核苷酸碱基序列分别见表2至表8：表2：r-1表3：r-2表4：r-3表5：r-4表6：r-5表7：r-6表8：r-7上述7组短序列rna纳米颗粒载体的单链均是委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。二、自组装实验步骤：(1)按1:1:1的摩尔比将rna单链a，b，c同时混合溶于depc水或tms缓冲液中；(2)加热混合溶液至80℃，保持5min后以2℃/min的速率缓慢降温到室温；(3)将产物上样到8％(m/v)非变性page凝胶上并在tbm缓冲液中4℃条件下，以100v电泳纯化复合体；(4)切下目的条带并在rna洗脱缓冲液中37℃洗脱，之后乙醇沉淀过夜，减压低温挥干，得到短序列rna自组装产物；(5)电泳分析检测与激光扫描观察；(6)电位检测。三、自组装实验结果(1)电泳检测结果7组短序列rna自组装产物的2％琼脂糖凝胶电泳图见图3。图3中泳道1至7从左到右依次为：短序列r-1、r-2、r-3、r-4、r-5、r-6、r-7。7组短序列rna自组装产物的4％琼脂糖凝胶电泳图见图4。图4中泳道1至7从左到右依次为：短序列r-1、r-2、r-3、r-4、r-5、r-6、r-7。由图3和图4结果可以看出，可以清楚地看出7组短序列自组装产物中r-2、r-3、r-5、r-7的条带明亮清晰，r-1、r-4、r-6虽然较为弥散，但仍然可以看出为单一条带，表明7组短序列均能较好地自组装成rna纳米颗粒结构。(2)电位测定测定方法：准备好电位样品(自组装产物溶于超纯水中)放入样品池中，打开仪器的样品池盖，放入仪器；打开软件，点击菜单measure€manual，出现手动测量参数设置对话框；设置软件检测参数；然后点击确定完毕设置，出现测量对话框，点击start开始；测定结果：7组短序列rna纳米颗粒的电位检测结果如下表9至表15：表9：表10：表11：表12：表13：表14：表15：由上述电位检测数据可知：7组短序列rna自组装产物均具有良好的稳定性，进一步表明各短序列rna自组装而成的纳米颗粒具有较稳定的自组装结构。该实施例表明：不同的a、b、c核心序列组合能够通过自组装形成具有核酸结构域的rna纳米颗粒，且结构稳定。在实施例1的基础上可知，在这些不同的核心序列组合基础上增加各种功能延长片段或者连接靶头、荧光素等，同样能成功组装成rna纳米颗粒，并具有挂载药物、细胞靶向性及可视可追踪等性能。为了进一步验证这些性能，在实施例2基础上增加延长片段，具体见实施例3。并在与实施例2的rna核心序列相对应的dna核心序列基础上，增加延长片段，同时连接靶头或不连接靶头，具体见实施例4。实施例3一、7组常规序列rna纳米颗粒载体：(1)7组组成rna纳米颗粒的三条多核苷酸碱基序列分别见表16至表22：表16：r-8表17：r-9表18：r-10表19：r-11表20：r-12表21：r-13表22：r-14(下述a链中的ugacagauaaggaaccugcudtdt为survivinsirna)上述7组常规序列rna纳米颗粒载体的单链均是委托苏州吉玛公司进行合成，其中r-8至r-14中的a序列、b序列、c序列分别是在r-1至r-7的a序列、b序列、c序列基础上增加延长段后形成的延展rna寡核苷酸序列，没有延展靶向模块片段，并进行了c/u碱基2’f修饰(增强了抗酶切性和稳定性)。另外，上述rna纳米颗粒r-14中修饰了一段生存素(survivin)的sirna核酸干扰治疗片段，具体是在a链3’端延展了survivinsirna的正义链(见a链下划线部分)，在b链的5’端延展连接了反义链(见b链下划线部分)，形成碱基对互补。二、自组装实验步骤：(1)按1:1:1的摩尔比将rna单链a，b，c同时混合溶于depc水或tms缓冲液中；(2)加热混合溶液至80℃，保持5min后以2℃/min的速率缓慢降温到室温；(3)将产物上样到8％(m/v)非变性page凝胶上并在tbm缓冲液中4℃条件下，以100v电泳纯化复合体；(4)切下目的条带并在rna洗脱缓冲液中37℃洗脱，之后乙醇沉淀过夜，减压低温挥干；(5)电泳分析检测与激光扫描观察；(6)电位测定。三、自组装实验结果(1)电泳检测结果7组常规序列rna自组装产物的2％琼脂糖凝胶电泳图见图5。图5中泳道1至7从左到右依次为：常规序列rna自组装产物r-8、r-9、r-10、r-11、r-12、r13、r-14。7组常规序列rna自组装产物的4％琼脂糖凝胶电泳图见图6。图6中泳道1至7从左到右依次为：常规序列rna自组装产物r-8、r-9、r-10、r-11、r-12、r13、r-14。由图5和图6结果可以看出，可以清楚地看出7组常规序列rna自组装产物的条带均为明亮清晰的单一条带，表明7组常规序列均能自组装成纳米结构。其中常规序列rna自组装产物r-14中修饰了一段survivinsirna核酸干扰治疗片段后，仍旧具有稳定的自组装结构，也说明了本申请中核酸纳米颗粒能够挂载核酸药，具有核酸药的递送载体功能。(2)电位测定测定方法：准备好电位样品放入样品池中，打开仪器的样品池盖，放入仪器；打开软件，点击菜单measure€manual，出现手动测量参数设置对话框；设置软件检测参数；然后点击确定完毕设置，出现测量对话框，点击start开始；测定结果：7组常规序列rna纳米颗粒的电位检测结果如下表23至表29：表23：表24：表25：表26：表27：表28：表29：由上述电位检测数据可知：7组常规序列rna自组装产物均具有良好的稳定性，进一步表明各常规序列rna自组装而成的纳米颗粒具有较稳定的自组装结构。该实施例表明：在不同组合的rna核心序列基础上，添加延长片段同样能够成功自组装成结构稳定的rna纳米颗粒。同时，添加的延长片段使得rna纳米颗粒具有优越的药物挂载性能(具体见实施例5)。实施例4一、7组常规序列dna纳米颗粒载体：(1)7组组成dna纳米颗粒的三条多核苷酸碱基序列分别见表30至表36：表中部分a链中延展了egfrapt靶头或psmaapt(a9l)靶头：egfrapt(seqidno：97)：gccttagtaacgtgctttgatgtcgattcgacaggaggc；psmaapt(a9l，seqidno：98)：gggccgaaaaagacctgacttctatactaagtctacgtccc。表30：d-1表31：d-2表32：d-3表33：d-4表34：d-5表35：d-6表36：d-7上述7组常规序列dna纳米颗粒的单链均是委托苏州泓迅进行合成，其中：d-1是在前文所述核心序列(8)(a序列：5'-ggagcgttgg-3'，b序列：5'-ccttcgccg-3'，c序列：5'-cggccatagccc-3')的基础上，增加包含egfrapt靶头(见下划线部分)的延展序列后形成的常规序列dna纳米颗粒；d-2是在前文所述核心序列(9)(a序列：5'-gcagcgttcg-3'，b序列：5'-cgttcgccg-3'，c序列：5'-cggccatagcgc-3')的基础上，增加包含egfrapt靶头(见下划线部分)的延展序列后形成的常规序列dna纳米颗粒；d-3是在前文所述核心序列(10)(a序列：5'-cgagcgttgc-3'，b序列：5'-gcttcgccg-3'，c序列：5'-cggccatagccg-3')的基础上，增加包含egfrapt靶头(见下划线部分)的延展序列后形成的常规序列dna纳米颗粒；d-4是在前文所述核心序列(11)(a序列：5'-ggagcgttgg-3'，b序列：5'-ccttcgggg-3'，c序列：5'-cccccatagccc-3')的基础上，增加包含psmaapt靶头(见下划线部分)的延展序列后形成的常规序列dna纳米颗粒；d-5是在前文所述核心序列(12)(a序列：5'-gcagcgttcg-3'，b序列：5'-cgttcggcg-3'，c序列：5'-cgcccatagcgc-3')的基础上，增加包含psmaapt靶头(见下划线部分)的延展序列后形成的常规序列dna纳米颗粒；d-6是在前文所述核心序列(13)(a序列：5'-gcagcgttcg-3'，b序列：5'-cgttcggcc-3'，c序列：5'-ggcccatagcgc-3')的基础上，增加了不包含靶头结构的延展序列后；形成的常规序列dna纳米颗粒；d-7是在前文所述核心序列(14)(a序列：5'-cgagcgttgc-3'，b序列：5'-gcttcggcg-3'，c序列：5'-cgcccatagccg-3')的基础上，增加了不包含靶头结构的延展序列后；形成的常规序列dna纳米颗粒。二、自组装实验步骤：(1)按1:1:1的摩尔比将dna单链a，b，c同时混合溶于depc水或tms缓冲液中；(2)加热混合溶液至95℃，保持5min后以2℃/min的速率缓慢降温到室温；(3)将产物上样到8％(m/v)非变性page凝胶上并在tbm缓冲液中4℃条件下，以100v电泳纯化复合体；(4)切下目的条带并在dna洗脱缓冲液中37℃洗脱，之后乙醇沉淀过夜，减压低温挥干，得到常规序列dna自组装产物；(5)电泳分析检测与激光扫描观察；(6)电位测定；(7)粒径测量；(8)透射电镜观察。三、自组装实验结果(1)电泳检测结果7组常规序列dna自组装产物的2％琼脂糖凝胶电泳图见图7。图7中泳道1至7从左到右依次为：常规序列dna自组装产物d-1、d-2、d-3、d-4、d-5、d-6、d-7。7组常规序列dna自组装产物的4％琼脂糖凝胶电泳图见图8。图8中泳道1至7从左到右依次为：常规序列dna自组装产物d-1、d-2、d-3、d-4、d-5、d-6、d-7。由图7和图8结果可以看出，可以清楚地看出7组常规序列dna自组装产物的条带均明亮清晰，表明7组常规序列dna链均完成了自组装，形成了稳定的纳米颗粒结构。其中d-6、d-7两组自组装结构因为携带egfrapt或psmaapt靶头，分子量略低，其条带位置明显比其他条带靠前，实际与理论情况完全符合，进一步证明了自组装结构的稳定性。该实施例表明：在这些不同的dna核心序列组合基础上增加各种功能延长片段或者同时连接靶头时，同样能成功组装成dna纳米颗粒，并同样具有挂载药物、细胞靶向性及可视可追踪等性能。(2)电位测定测定方法：准备好电位样品放入样品池中，打开仪器的样品池盖，放入仪器；打开软件，点击菜单measure€manual，出现手动测量参数设置对话框；设置软件检测参数；然后点击确定完毕设置，出现测量对话框，点击start开始；测定结果：3组常规序列dna纳米颗粒的电位检测结果如下表37至表39：表37：表38：表39：由上述电位检测数据可知：3组常规序列rna自组装产物均具有良好的稳定性，进一步表明各常规序列rna自组装而成的纳米颗粒具有较稳定的自组装结构。(3)粒径测量1.准备好电位样品(常规序列dna自组装产物d-7)放入样品池中，打开仪器的样品池盖，放入仪器；2.打开软件，点击菜单，出现手动测量参数设置对话框；3.设置软件检测参数；4.然后点击确定完毕设置，出现测量对话框，点击start开始，自组装产物d-7的流体动力学尺寸的dls测量值结果如下表40：表40：(4)透射电镜观察结果对上述常规序列dna自组装产物d-7进行透射电镜照射，步骤如下：1、取一滴样本悬浮在400目覆碳膜铜网上，室温1分钟；2、滤纸吸去液体；3、2％醋酸铀染色1分钟；4、滤纸吸干，室温干燥；5、jem-1400透射电子显微镜120kv观察、拍照。结果如图9所示，从图中明显看出上述常规序列dna自组装产物d-7为一个整体结构，且能够清晰地看出其具有t型结构。实施例5表柔比星挂载实验(一)化学法挂载：一、实验材料和实验方法1.实验材料及试剂：(1)核酸纳米颗粒(分子量为29550)：与实施例1中的rna纳米颗粒类似，不同之处在于c链上的荧光标记为cy5。(2)depc水：碧云天。(3)pbs缓冲液：cellgro。(4)4％多聚甲醛(5)表柔比星。(6)氯仿：北化。(7)无水乙醇：北化。2.实验方法：(1)精密称取表柔比星(0.79mg，1.354μmol)溶于depc水(1.0ml)及pbs缓冲液(1.25ml)，冰水浴冷却下加入4％多聚甲醛水溶液(0.25ml)混匀，将此混合液全部与rna纳米颗粒(1mg，33.84nmol)混匀，并在避光条件下于4℃反应72小时。(2)取反应液10μl稀释10倍，以50μm的表柔比星水溶液及310ng/μl的rna纳米颗粒为对照，按等体积进样进行hplc分析。根据各组分峰面积比可判断反应转化基本完全。(3)将反应液以氯仿萃取(10mlx3)，随后加入25ml的无水乙醇，混匀后避光置于4℃使产物充分析出(4小时)。离心(4000/min)，转移上清，固体产物再次以乙醇(50ml)洗，于低温下减压使溶剂挥发干，得到暗红色固体产物。(4)挂载率计算：1.配置已知浓度的表柔比星-pbs标准液：2μm、4μm、6μm、8μm、10μm，各100μl；2.将表柔比星-rnah颗粒溶解在100ulpbs中；3.将标准液与表柔比星-rnah颗粒置于pcr板中，于85℃加热5min，随后冷却至室温；4.利用酶标仪测量492nm处表柔比星的吸光度，绘制标准曲线(见图10a)，计算得出挂载产物中表柔比星的摩尔浓度；5.利用分光光度计测量260nm处rna的吸光度，得到每个样品中含有rnah颗粒的质量浓度；6.根据测量得到的表柔比星摩尔浓度及rnah颗粒的质量浓度，计算挂载率。计算具体过程如下：crnah-1＝21.0ug/ml，mrnah≈30000，100ul；c表柔比星-1＝7.158um，100ul；crnah-2＝33.5ug/ml，mrnah≈30000，100ul；c表柔比星-2＝9.263um，100ul；取其平均值得到表柔比星-rnah核酸纳米颗粒的挂载率约为9.3，表示每一个核酸纳米颗粒载体上能够挂载约9.3个表柔比星分子。(二)dna核酸纳米颗粒的挂载实验挂载方法及挂载率的计算方式同上述rna核酸纳米颗粒，具体所使用的核酸纳米颗粒为：dnah-bio-efgrapt-cy5，其中，dnah的三条链分别为：a链：(seqidno:172:)5’端前三个及3’的后三个碱基分别进行硫代修饰，5’端连接biotin(生物素)，黑体加粗部分为egfrapt序列；b链(seqidno:173:)：5’-gcgcccggttcgccgccagccgccgc-3’，5’端前三个及3’的后三个碱基分别进行硫代修饰；c链(seqidno:174:)：5’-gcggcggcaggcggccatagccgtgggcgcgcg-3’；5’端前三个及3’的后三个碱基分别进行硫代修饰，3’端连接cy5荧光标记。dna核酸纳米颗粒挂载表柔比星的标准曲线见图10b，具体计算过程如下：cdnah-1＝22.19ug/ml，mdnah≈39500，100ul；c表柔比星-1＝17.06um，100ul；cdnah-2＝32.57ug/ml，mdnah≈39500，100ul；c表柔比星-2＝20.40um，100ul；取其平均值得到表柔比星-dnah纳米颗粒的挂载率约为27.6，表示每一个dna米颗粒载体上能够挂载约27.6个表柔比星。此外，在上述rna纳米颗粒及dna纳米颗粒挂载表柔比星的基础上，可进一步按照与挂载表柔比星一样的方法进行第二次挂载其他小分子药物，比如，本申请还进一步挂载了叶酸，得到共同挂载了表柔比星和叶酸两种小分子药物的rna纳米颗粒及dna纳米颗粒，两种药物的挂载率可以参照上述方法进行检测得到(数值未显示)。实施例5表明，带有延长片段、靶头和荧光素的rna纳米颗粒(实施例1中的)和dna纳米颗粒均具有挂载药物的功能，小分子药物表柔比星可以通过共价连接(多聚甲醛—溶剂共价)的方式来实现挂载，而且还可以与其他小分子药物实现共同挂载。实施例6共聚焦显微镜实验检测载药rna纳米颗粒的细胞结合能力一、实验材料和实验方法：1.待测样品见表41：表41：注：表中rnah-bio-670作为对照，其指的是按照实施例1中自组装方法制备的在a链和b链的5’端进行biotin修饰，而在c链的3’端进行quasar670荧光素修饰而形成的纳米颗粒，而rnah-bio-670-epb指的是进一步挂载表柔比星后(按照实施例5中化学法挂载)形成的纳米颗粒。2.所用到的实验试剂及其来源如下：rpmi-1640培养基(gibco,c11875500bt-500ml)；胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)(excellbio,fna500-500ml)；盘尼西林/链霉素(penicillin/streptomycin，ps)(gibco,15140-122-100ml)；pbs缓冲液(gibco,c20012500bt-500ml)；trypsin-edta(stemcell,07901-500ml)；dmso(sigma,d5879-1l)；prolonggoldantifademountant防猝灭剂(thermo,p36941-2ml)；dapi(yeasen,36308es11-4ml)。3.所用到的实验仪器如下：倒置显微镜(invertedmicroscope)(olympusbx53,u-rfl-t)；bdfalcon(corning,354118)；细胞离心涂片机(cytospin)(txd3)。4.实验方法:(1)hl60细胞(急性白血病细胞系)在rpmi1640+10％fbs+1％ps培养基中，于37℃和5％co2条件下培养。(2)收集细胞，用pbs洗一遍，以每孔1x105个细胞加到48孔板中。(3)将细胞与200nm和400nm的rnah-bio-670和rnah-bio-670-epb纳米颗粒一起于37℃和5％co2中孵育2h和4h。(4)hl60细胞用pbs洗涤后，通过离心图片法将细胞加到载玻片上，防猝灭剂(prolonggoldantifademountant)处理，室温过夜。(5)再用dapi染色室温5min，然后封片。(6)用激光扫描共聚焦显微镜的dapi和fam通道评估细胞结合和内化，显微镜下拍照，保存。二、实验结果实验结果见图11。从图11中可以看出，细胞结合和内化实验结果表明，rnah-bio-670和rnah-bio-670-epb纳米颗粒因均携带靶头---生物素(biotin)，因而都能够与细胞结合与内化。可见，含表柔比星的药物rnah-bio-670-epb纳米颗粒与hl60细胞结合和内化能力较强。实施例7流式细胞实验检测载药dna纳米颗粒的细胞结合能力一、细胞信息mcf-7(来源atcc，货号htb-22)，nci-h1975(来源atcc，货号crl-5908)；培养基为mem+10％fbs，培养条件为37℃，5％co2，饱和湿度。二、待测物靶向药物：dnah-bio-egfrapt-cy5-epb(按照实施例5中的dna纳米颗粒的挂载方式进行挂载)。靶向荧光载体：dnah-bio-egfrapt-cy5。三、设备、耗材(见表42)表42四、试剂(见表43)表43：五、实验方法：1.调整细胞状态到对数生长期，更换培养基为无生物素无叶酸的培养基，置于37℃培养箱中孵育过夜；2.溶解待测物，配置待测物储液；3.消化收集单细胞悬液并计数，调整细胞密度到2x105/ml，种植1ml/孔到24孔板中；4.分别将待测物加入相应的细胞孔中，终浓度2μm，震荡混匀；5.将细胞板置于37℃培养箱中孵育2小时；6.孵育结束后，胰酶消化收集细胞悬液；7.离心收集细胞沉淀，并用pbs清洗两次；8.最后用300μlpbs重悬细胞沉淀，流式上机检测；9.荧光载体或表柔比星检测通道：激发光波长：488nm，发射光通道：560nm；10.数据分析。六、实验结果(见表44)表44：从表44可以看出，表柔比星靶向药dnah-bio-efgrapt-cy5-epb能够与mcf-7细胞和nci-h1975细胞结合，且结合率都近乎百分之百；而靶向荧光载体dnah-bio-cy5同样能够与mcf-7细胞结合和nci-h1975细胞，结合率也是百分之百。实施例8检测rnah-bio-670-epb纳米颗粒在血清中的稳定性一、实验材料和实验方法1.待测样品：溶解在pbs溶液中的实施例5中制备的rnah-bio-670-epb纳米颗粒。2.实验试剂：rpmi-1640培养基(gibco,c11875500bt-500ml)；胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)(excellbio,fna500-500ml)；盘尼西林/链霉素(penicillin/streptomycin，ps)(gibco,15140-122-100ml)；pbs缓冲液(gibco,c20012500bt-500ml)；novextmtris-glycinenativesamplebuffer(2x)(invitrogen,lc2673-20ml)；novextm8％tris-glycineminigels(invitrogen,xp00080box-1.0mm)；tris-glycinenativerunningbuffer(10x)(lifescience,lc2672-500ml)；g250染色液(beyotime,p0017-250ml)。3.实验仪器：分光光度计(spectrophotometer)(thermo,nd2000c)；minigeltank(invitrogen,ps0301)；成像系统(imagingsystem)(bio-rad,chemidocmp)。4.实验方法：(1)取10μm的rnah-bio-670-epb纳米颗粒10μl置于90μl含10％血清的rpmi1640培养基中孵育。(2)在37℃孵育10min、1h、12h、36h后分别取样。(3)采用nanodrop定量后，取200ng的rna纳米颗粒，加入相同体积的tris-glycinesds样品缓冲液(2x)，充分混匀。(4)取一块novextm8％tris-glycineminigel，按照顺序上样，设置程序200v，30min，开始电泳。(5)电泳结束，进行g250染色，置于水平摇床30min，拍照成像。二、实验结果表45：定量结果及上样体积电泳检测结果见图12和图13。其中，图12示出了8％非变性胶的电泳结果(coomassieblue程序)，图13示出了8％非变性胶的电泳结果(stainfreegel程序)。血清稳定性试验结果显示：0min、10min、1h、12h和36h，不同时间长度下，rnah-bio-670-epb纳米颗粒样品条带无明显差别，表明其在10％fbs的1640培养基中比较稳定，无明显降解。实施例9检测dnah-bio-egfrapt-cy5-epb纳米颗粒在血清中的稳定性一、实验材料、试剂及设备1.实验材料dnah-bio-egfrapt-cy5-epb，浓度1.4mg/ml。2.实验试剂6×dna上样缓冲液(tsj010，擎科生物)，100bpdna分子标记(tsj010，擎科生物)；10000*solargelred核酸染料(e1020，solarbio)；8％非变性聚丙烯酰胺凝胶(自配)；1×tbebuffer(无rna酶)(自配)；血清(fbs)(excel)；rpmi1640(gbico)。电泳仪(powerpacbasic，bio-rad)，垂直电泳槽(miniproteantetracell，bio-rad)，脱色摇床(ts-3d，orbitalshaker)，凝胶成像仪(tanon3500,tanon)。二、实验方法(1)将dnah-bio-egfrapt-cy5-epb纳米颗粒取6μl，用含10％血清的rpmi1640培养基6μl进行稀释，稀释后浓度达900μg/ml，分别稀释5管，稀释后样品37℃水浴不同时间(0、10min、1h、12h、36h)。(2)取处理后的样品与6×dnaloadingbuffer混匀，冰上操作，做好标记。(3)取8％nativepage，将不同孵育时间的纳米颗粒样品上一块胶，上样量20μl/孔/样，设置程序90-100v电泳50min。(4)电泳结束，进行染色，置于水平摇床30min，拍照成像。三、实验结果非变性page胶电泳结果见图14，其中，1代表0min，2代表10min,3代表1h，4代表12h，5代表36h。dnah-bio-egfrapt-cy5-epb纳米颗粒的目的条带在200bp左右，从图25上可以看出，表柔比星-dnah纳米颗粒在37℃孵育至36h基本稳定。实施例10研究rnah-bio-670-epb纳米颗粒在hl60细胞中的细胞毒性一、实验材料和实验方法1.实验材料：待测样品：小分子药物epb及rnah-bio-670-epb纳米颗粒；药物浓度配制：准备现配试剂到对应容积容器中，加pbs定量到10um.用培养基制备连续稀释溶剂，从10μm依次到3.33μm,1.11μm,0.370μm,0.124μm,0.041μm,0.014μm,0.0046μm,0.0015μm。将50μl溶液转移到每个孔以得到分别为5um,1.667um,0.556um,0.185um,0.062um,0.021um,0.0069um,0.0023um的终浓度。2.实验试剂:(promega)；rpmi-1640培养基(gibco,c11875500bt-500ml)；胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)(excellbio,fna500-500ml)；盘尼西林/链霉素(penicillin/streptomycin，ps)(gibco,15140-122-100ml)；pbs缓冲液(gibco,c20012500bt-500ml)；trypsin-edta(stemcell,07901-500ml)；dmso(sigma,d5879-1l)；celltiter-gloluminescentcellviabilityassaykit(ctg)(promega,g7572-100ml)。3.实验仪器:倒置显微镜(invertedmicroscope)(olympusix71,no.112a-1)；96孔板阅读仪(96-wellplatereader)(moleculardevices,flexstation3)；perkinelmerenvision2104multilabelreader(no.01-094-0002)。4.实验方法:1)细胞培养及铺板细胞在对应的基础培养基中分别添加10％fbs及1％ps中，于37℃和5％co2条件下培养。用于实验的细胞密度在80％以上。收集细胞，1000rpm4分钟离心，培养基重悬，调整细胞浓度，以3000个细胞50μl的体积加到96孔板中，每组3个复孔。2)梯度药物浓度配制及给药在24小时后，将化合物溶液转移到每个孔中，50μl/孔。最后得到终浓度分别为:5um,1.667um,0.556um,0.185um,0.062um,0.021um,0.0069um,0.0023um的溶液；溶剂对照＝dmso培养基(未处理)对照:仅有细胞没有化合物处理空白对照:没有细胞，用于仪器校零3)细胞给药后培养将上述加药后细胞于37℃和5％co2条件下培养72小时。4)检测试剂盒处理细胞将孔板提前拿至室温静置30分钟。向孔板的每个孔中加100μl试剂，在摇床上2分钟混匀促进细胞裂解。使用perkinelmerenvision2104multilabelreader仪器读值并记录。5)获取实验数据并处理将获取的实验数据使用excel软件分析处理，使用graphpadprism5软件拟合曲线分析。二、实验结果:表46：ic50值实验结果见表46和图15，从表46和图15中可以看出，表柔比星(epb)与rnah-bio-670-epb纳米颗粒对于hl60细胞增殖均有明显抑制作用，而且让人难以预料的是：给药浓度为5μm时，两种药物对细胞的抑制率分别99.25％，99.93％，而当对细胞增殖的抑制率为50％时，ic50分别是0.06977μm和0.3015μm。可见，rnah-bio-670-epb纳米颗粒对细胞增殖的抑制活性更强，其ic50的药物浓度几乎是小分子药物epb浓度的1/5，因此可显著减少药物用量，减少毒副作用。进一步地，为了确认靶向荧光载体本身对hl60细胞无明显毒性，本申请进一步设计了rnah-bio-fam靶向荧光载体对hl60细胞的毒性实验，以小分子化药顺铂(cisplatin)对hl60细胞的毒性作为对照，具体结果见图10(其中，最高给药浓度为10μm，此时rnah-bio-fam靶向荧光载体对hl60细胞的抑制率为8.75％，而对照顺铂对细胞的抑制率为99.96％)。从图10可以看出，荧光载体本身对hl60细胞无明显毒性。实施例11dnah-bio-egfrapt-cy5-epb纳米颗粒分别在mcf-7和nci-h1975细胞中的细胞毒性一、实验材料1.细胞信息(见表47)：表47：2.待测样品(见表48)：表48：3.耗材与设备(见表49)：表49：名称品牌货号/型号96孔板corning3599离心机京立ld5-2bco2培养箱thermo3111微孔板振荡器qilinbeierqb-9001显微镜olympusix53多功能酶标仪bioteksynergyh14.试剂(见表50)：表50：二、实验方法：1)收获对数生长期的细胞，取少量用台盼蓝染色计数，保证细胞活力达到98％以上；2)用生长培养基调整细胞密度到2.22×104/ml；3)种植90μl/孔细胞悬液到96孔板中，孔板中每孔细胞数量为2000；4)将种植好的细胞板置于37℃培养箱中孵育过夜；5)对化合物做9个浓度点的3.16倍梯度稀释；6)取出细胞培养板，将10μl/孔的10x浓度药物工作液加入到细胞培养板的相应孔中，每个浓度做三个复孔，药物最终作用浓度见下表51；表51：7)将细胞培养板置于培养箱中继续孵育96小时；8)将celltiteraqueousonesolution试剂置于室温融化90分钟或37℃水浴融化后置于室温平衡30分钟；9)向细胞培养板中加入20μl/孔的celltiteraqueousonesolution试剂；10)将细胞培养板置于37℃培养箱中继续孵育3小时；11)用酶标仪读取细胞板中各孔的od490值；12)数据处理与分析。采用graphpadprism5.0软件对数据进行图形化处理。为计算ic50，对数据进行“s”形非线性回归分析，匹配相适应的剂量-效应曲线。细胞存活率的计算公式如下，ic50可在graphpadprism5.0中自动计算得出。细胞存活率(％)＝(od待测孔–od空白对照)/(od阴性对照-od空白对照)x100％。三、实验结果(见表52、图17a至17d及图18a至18d)表52：从表52及图17a，17b，17c，17d可以看出，针对mcf-7细胞系而言，相比单纯的dnah靶向荧光载体，小分子药物epb及dnah载药颗粒dnah-bio-egfrapt-cy5-epb都对mcf-7细胞有毒性，且dnah载药颗粒dnah-bio-egfrapt-cy5-epb的ic50药物浓度是小分子药物epb的ic50药物浓度的一半。类似地，从表52及图18a，18b，18c，18d可以看出，针对nci-h1975细胞系而言，相比单纯的dnah靶向荧光载体，小分子药物epb及dnah载药颗粒dnah-bio-egfrapt-cy5-epb都对nci-h1975细胞有毒性，且dnah载药颗粒dnah-bio-egfrapt-cy5-epb的ic50药物浓度是小分子药物epb的ic50药物浓度的一半。从上述毒性实验可以看出，本申请的dnah载药颗粒比小分子药物具有更强的细胞增殖抑制作用，在达到相同药效时可减少药物用量，同时减少毒副作用。实施例12一、7组延长段变形+核心短序列rna纳米颗粒载体：(1)7组组成延长段变形+核心短序列rna纳米颗粒的三条多核苷酸碱基序列：表53：r-15：表54：r-16：表55：r-17：表56：r-18：表57：r-19：表58：r-20：表59：r-21：二、自组装试验步骤：(1)按1:1:1的摩尔比将rna单链a，b，c同时混合溶于depc水或tms缓冲液中；(2)加热混合溶液至80℃，保持5min后以2℃/min的速率缓慢降温到室温；(3)将产物上样到8％(m/v)非变性page凝胶上并在tbm缓冲液中4℃条件下，以100v电泳纯化复合体；(4)切下目的条带并在rna洗脱缓冲液中37℃洗脱，之后乙醇沉淀过夜，减压低温挥干；(5)电泳分析检测与激光扫描观察。三、自组装试验结果(1)电泳检测主要试剂和仪器如下：表60：试剂名称货号厂家6×dnaloadingbuffertsj010擎科生物20bpdnaladder3420atakara10000*solargelred核酸染料e1020solarbio8％非变性page凝胶/自配1×tbebuffer(无rna酶)/自配表61：步骤：①将rna纳米颗粒按下表采用超纯水进行稀释。表62：实测浓度(μg/ml)r-15165.937r-16131.706r-17144.649r-18164.743r-19126.377r-20172.686r-21169.455②取处理后的样品10μl(500ng)与2μl6×dnaloadingbuffer混匀，冰上操作，做好标记。③取8％非变性page凝胶，将不同孵育时间的样品上一块胶，将12μl处理的样品全部上样，设置程序100v跑胶40min。④跑胶结束，进行染色，置于水平摇床30min，拍照成像。检测结果：7组延长段变形+核心短序列rna自组装产物的非变性page胶跑胶结果见图17。图17中泳道1至7从左到右依次为：7组延长段变形+核心短序列rna自组装产物r-15、r-16、r-17、r-18、r-19、r-20、r-21。由图17结果可以清楚地看出7组延长段变形+核心短序列rna自组装产物的条带均明亮清晰，表明7组延长段变形+核心短序列rna链均完成了自组装，形成了稳定的纳米颗粒结构。(2)电位测定测定方法：准备好电位样品(自组装产物溶于超纯水中)放入样品池中，打开仪器的样品池盖，放入仪器；打开软件，点击菜单measure€manual，出现手动测量参数设置对话框；设置软件检测参数；然后点击确定完毕设置，出现测量对话框，点击start开始；测定结果：7组延长段变形+核心短序列rna纳米颗粒的25℃电位检测结果如下：表63：表64：表65：表66：表67：表68：表69：由上述电位检测数据可知：7组延长段变形+核心短序列rna纳米颗粒均具有良好的稳定性，进一步表明各延长段变形+核心短序列rna自组装而成的纳米颗粒具有较稳定的自组装结构。(3)粒径测量1.准备好电位样品(7组延长段变形+核心短序列rna)放入样品池中，打开仪器的样品池盖，放入仪器；2.打开软件，点击菜单，出现手动测量参数设置对话框；3.设置软件检测参数；4.然后点击确定完毕设置，出现测量对话框，点击start开始，7组延长段变形+核心短序列rna的流体动力学尺寸的dls测量值结果分别如下：表70：平均粒径(nm)r-156.808r-166.978r-177.592r-187.520r-196.936r-207.110r-216.720(4)tm值检测采用溶解曲线法，对7组延长段变形+核心短序列rna纳米颗粒的tm值进行检测，样品与电位样品一致。试剂和仪器如下：表71：试剂名称货号厂家aebuffer/takarasybrgreeni染料/自配表72：名称型号生产厂家real-timesystemcfxconnectbio-rad超净工作台hdl北京东联哈尔仪器制造有限公司步骤：①样品采用超纯水进行稀释后，将5μg稀释所得样品与2μlsybrgreeni染料(1∶200稀释)进行混合，终体积20μl，稀释浓度如下：表73：②室温避光孵育30min；③上机检测，程序设置为20℃开始，每秒升温0.1℃至95℃，每5s读数一次。检测结果：7组延长段变形+核心短序列rna纳米颗粒的tm值如下，r-15的溶解曲线图见图18，r-16的溶解曲线图见图19，r-17的溶解曲线图见图20，r-18的溶解曲线图见图21，r-19的溶解曲线图见图22，r-20的溶解曲线图见图23，r-21的溶解曲线图见图24。因rna样本特殊性，本次检测以20～90℃范围内1/2rfumax值所对应的温度为样本tm值。表74：tm值(℃)r-1557.5℃r-1653.8℃r-1755.2℃r-1854.5℃r-1954.0℃r-2059.5℃r-2165.0℃7组延长段变形+核心短序列rna纳米颗粒的tm值均较高，表明自组装产物具有良好的结构稳定性。实施例13一、7组延长段变形+核心短序列dna纳米颗粒载体：(1)7组组成延长段变形+核心短序列dna纳米颗粒的三条多核苷酸碱基序列：表75：d-8：表76：d-9：表77：d-10：表78：d-11：表79：d-12：表80：d-13：表81：d-14：二、自组装试验步骤：(1)按1:1:1的摩尔比将dna单链a，b，c同时混合溶于depc水或tms缓冲液中；(2)加热混合溶液至95℃，保持5min后以2℃/min的速率缓慢降温到室温；(3)将产物上样到8％(m/v)非变性page凝胶上并在tbm缓冲液中4℃条件下，以100v电泳纯化复合体；(4)切下目的条带并在dna洗脱缓冲液中37℃洗脱，之后乙醇沉淀过夜，减压低温挥干，得到dna自组装产物；(5)电泳分析检测与激光扫描观察；(6)电位检测；(7)粒径检测；(8)tm值检测。三、自组装试验结果(1)电泳检测主要试剂和仪器如下：表82：表83：步骤：①将dna纳米颗粒按下表82方法采用超纯水进行稀释。表84：②取处理后的样品10μl(500ng)与2μl6×dnaloadingbuffer混匀，冰上操作，做好标记。③取8％非变性page凝胶，将不同孵育时间的样品上一块胶，将12μl处理的样品全部上样，设置程序100v跑胶40min。④跑胶结束，进行染色，置于水平摇床30min，拍照成像。检测结果：7组延长段变形+核心短序列dna自组装产物的非变性page胶跑胶结果见图25。图25中泳道1至7从左到右依次为：7组延长段变形+核心短序列dna自组装产物d-8、d-9、d-10、d-11、d-12、d-13、d-14。由图25结果可以清楚地看出7组延长段变形+核心短序列dna自组装产物的条带均明亮清晰，表明7组延长段变形+核心短序列dna链均完成了自组装，形成了稳定的纳米颗粒结构。(2)电位测定测定方法：准备好电位样品(自组装产物溶于超纯水中)放入样品池中，打开仪器的样品池盖，放入仪器；打开软件，点击菜单measure€manual，出现手动测量参数设置对话框；设置软件检测参数；然后点击确定完毕设置，出现测量对话框，点击start开始；测定结果：7组延长段变形+核心短序列dna纳米颗粒的25℃电位检测结果如下：表85：表86：表87：表88：表89：表90：表91：由上述电位检测数据可知：7组延长段变形+核心短序列dna纳米颗粒均具有良好的稳定性，进一步表明各延长段变形+核心短序列dna自组装而成的纳米颗粒具有较稳定的自组装结构。(3)粒径测量①准备好电位样品(7组延长段变形+核心短序列dna)放入样品池中，打开仪器的样品池盖，放入仪器；②打开软件，点击菜单，出现手动测量参数设置对话框；③设置软件检测参数；④然后点击确定完毕设置，出现测量对话框，点击start开始，7组延长段变形+核心短序列rna的流体动力学尺寸的dls测量值结果分别如下：表92：平均粒径(nm)d-87.460d-97.920d-107.220d-117.472d-126.968d-137.012d-146.896(4)tm值检测采用溶解曲线法，对7组延长段变形+核心短序列dna纳米颗粒的tm值进行检测，样品与电位样品一致。试剂和仪器如下：表93：试剂名称货号厂家aebuffer/takarasybrgreeni染料/自配表94：名称型号生产厂家real-timesystemcfxconnectbio-rad超净工作台hdl北京东联哈尔仪器制造有限公司步骤：②样品采用超纯水进行稀释后，将5μg稀释所得样品与2μlsybrgreeni染料(1:200稀释)进行混合，终体积20μl，稀释浓度如下：表95：②室温避光孵育30min；③上机检测，程序设置为20℃开始，每秒升温0.1℃至95℃，每5s读数一次。检测结果：7组延长段变形+核心短序列dna纳米颗粒的tm值如下，d-8的溶解曲线图见图26，d-9的溶解曲线图见图27，d-10的溶解曲线图见图28，d-11的溶解曲线图见图29，d-12的溶解曲线图见图30，d-13的溶解曲线图见图31，d-14的溶解曲线图见图32。表96：tm值(℃)d-848.5d-952.5d-1054.5～55.0d-1148.7d-1251.5d-1351.0d-1449.2由图26至图32所示的7组延长段变形+核心短序列dna纳米颗粒的溶解曲线可以看出，tm值均较高，表明样本纯度较高且自组装结构稳定。检测核酸纳米颗粒在血清中的稳定性实施例14采用非变性page法对7组延长段变形+核心短序列rna纳米颗粒在血清中的稳定性进行表征。主要试剂和仪器如下：表97：试剂名称货号厂家6×dnaloadingbuffertsj010擎科生物20bpdnaladder3420atakara10000*solargelred核酸染料e1020solarbio8％非变性page凝胶/自配1×tbebuffer(无rna酶)/自配血清(fbs)/excelrpmi1640/gbico表98：步骤：①将rna纳米颗粒配制为下表浓度，然后将配制后的样品按下表中的方法进行稀释，稀释5管，稀释后样品37℃水浴不同时间(0、10min、1h、12h、36h)；表99：②取处理后的样品10μl与2μl6×dnaloadingbuffer混匀，冰上操作，做好标记；③取8％非变性page凝胶，将不同孵育时间的样品上一块胶，将12μl处理的样品全部上样，设置程序100v跑胶40min；④跑胶结束，进行染色，置于水平摇床缓慢振荡30min，拍照成像。r-15的电泳检测结果见图33，r-16的电泳检测结果见图34，r-17的电泳检测结果见图35，r-18的电泳检测结果见图36，r-19的电泳检测结果见图37，r-20的电泳检测结果见图38，r-21的电泳检测结果见图39。图33至图39中，从左到右的泳道分别为m：marker；1：36h；2：12h；3：1h；4：10min；5：0min。从血清稳定性试验结果可知：10min、1h、12h和36h的非变性胶结果显示，不同时间rna纳米颗粒样品条带无明显差别，表明rna纳米颗粒r-15至r-21在50％fbs的1640培养基中比较稳定，无明显降解。实施例15采用非变性page法对7组延长段变形+核心短序列dna纳米颗粒在血清中的稳定性进行表征。主要试剂和仪器如下：表100：试剂名称货号厂家6×dnaloadingbuffertsj010擎科生物20bpdnaladder3420atakara10000*solargelred核酸染料e1020solarbio8％非变性page凝胶/自配1×tbebuffer(无rna酶)/自配血清(fbs)/excelrpmi1640/gbico表101：步骤：②将dna纳米颗粒配制为下表浓度，然后将配制后的样品按下表中的方法进行稀释，稀释5管，稀释后样品37℃水浴不同时间(0、10min、1h、12h、36h)；表102：②取处理后的样品5μl与1μl6×dnaloadingbuffer混匀，冰上操作，做好标记；③取8％非变性page凝胶，将不同孵育时间的样品上一块胶，将6μl处理的样品全部上样，设置程序100v跑胶40min；④跑胶结束，进行染色，置于水平摇床缓慢振荡30min，拍照成像。d-8的电泳检测结果见图40，d-9的电泳检测结果见图41，d-10的电泳检测结果见图42，d-11的电泳检测结果见图43，d-12的电泳检测结果见图44，d-13的电泳检测结果见图45，d-14的电泳检测结果见图46。图40至图46中，从左到右的泳道分别为m：marker；1：36h；2：12h；3：1h；4：10min；5：0min。从血清稳定性试验结果可知：10min、1h、12h和36h的非变性胶结果显示，不同时间dna纳米颗粒样品条带无明显差别，表明dna纳米颗粒d-8至d-14在50％fbs的1640培养基中比较稳定，无明显降解。核酸纳米颗粒挂载药物试验实施例16阿霉素挂载实验：根据实施例5的化学法挂载方法(除特殊限定外，方法同实施例5相同)，分别采用前述实施例12中r-15、r-16、r-17、r-18、r-19、r-20和r-21自组装形成的rna纳米颗粒、实施例13中d-8、d-9、d-10、d-11、d-12、d-13和d-14自组装形成的dna纳米颗粒作为阿霉素挂载载体，测得阿霉素挂载率分别如下：rna纳米颗粒r-15的阿霉素挂载率为20.5；rna纳米颗粒r-16的阿霉素挂载率为29.4；rna纳米颗粒r-17的阿霉素挂载率为30.9；rna纳米颗粒r-18的阿霉素挂载率为34.1；rna纳米颗粒r-19的阿霉素挂载率为27.1；rna纳米颗粒r-20的阿霉素挂载率为30.2；rna纳米颗粒r-21的阿霉素挂载率为20.1；dna纳米颗粒d-8的阿霉素挂载率为28.0；dna纳米颗粒d-9的阿霉素挂载率为27.9；dna纳米颗粒d-10的阿霉素挂载率为18.9；dna纳米颗粒d-11的阿霉素挂载率为26.8；dna纳米颗粒d-12的阿霉素挂载率为27.6；dna纳米颗粒d-13的阿霉素挂载率为31.8；dna纳米颗粒d-14的阿霉素挂载率为32。流式细胞仪(facs)实验检测dna纳米颗粒及载体药的细胞结合能力实施例17一、细胞信息hepg2(来源协和细胞库)，培养基为dmem+10％fbs+1％双抗(gibco，15140-122)，培养条件为37℃，5％co2，饱和湿度。二、待测物空白载体：前述实施例13中d-8、d-9、d-10、d-11、d-12、d-13和d-14自组装形成的dna纳米颗粒载体。载体药：根据实施例5的化学法挂载方法(除特殊限定外，方法同实施例5相同)，采用前述实施例13中d-8、d-9、d-10、d-11、d-12、d-13和d-14自组装形成的dna纳米颗粒挂载阿霉素，分别记为d-8-阿霉素、d-9-阿霉素、d-10-阿霉素、d-11-阿霉素、d-12-阿霉素、d-13-阿霉素和d-14-阿霉素。三、主要设备、耗材表103：生产厂家型号生物安全柜北京东联哈尔仪器制造公司bsc-1360ⅱa2低速离心机中科中佳仪器有限公司sc-3612co2培养箱thermo3111倒置显微镜uopdsz2000x流式细胞仪bdbdfacscaliburtm四、主要试剂表104：试剂名称生产厂家货号备注dmem(无生物素)百药智达提供ys31601％bsa-pbs自配－五、实验方法：1.调整细胞状态到对数生长期，更换培养基为无生物素无叶酸的培养基，置于37℃培养箱中孵育过夜；2.孵育结束后，胰酶消化收集细胞悬液，1000rmp离心5min，调整浓度后，取2×105-5×105细胞/ep管，用1ml/管1％bsa-pbs洗2次，观察管底细胞，以防被吸走。3.溶解待测物，稀释待测物到使用浓度；4.将细胞上清液吸净，每管按顺序加入100μl相应样品，避光，37℃孵育2h；5.用1％bsa-pbs洗2次；1000rmp离心5min；6.最后用300μlpbs重悬细胞沉淀，流式上机检测(本实施例所用的空白载体是由quasar670标记的，而载体药中的阿霉素自带荧光，因此可以分别通过fl4-apc和fl2-pe进行检测)；7.数据分析。六、实验结果1.实验结果见下表：表105：2.结论1.hepg2细胞与d-8-阿霉素(载体药)及d-8(空白载体)孵育后，均有很高(93.1％～98.4％)的结合率。2.hepg2细胞与d-9-阿霉素(载体药)及d-9(空白载体)孵育后，均有很高(88.6％～98.1％)的结合率。3.hepg2细胞与d-10-阿霉素(载体药)及d-10(空白载体)孵育后，均有很高(89.4％～98.3％)的结合率。4.hepg2细胞与d-11-阿霉素(载体药)及d-11(空白载体)孵育后，均有很高(89.3％～97.8％)的结合率。5.hepg2细胞与d-12-阿霉素(载体药)及d-12(空白载体)孵育后，均有很高(94.6％～97.1％)的结合率。6.hepg2细胞与d-13-阿霉素(载体药)及d-13(空白载体)孵育后，均有很高(89.6％～98.2％)的结合率。7.hepg2细胞与d-14-阿霉素(载体药)及d-14(空白载体)孵育后，均有很高(90.3％～98.3％)的结合率。研究dna纳米颗粒及载体药在hepg2细胞中的细胞毒性实施例18采用cck8法检测dna纳米颗粒及载体药对hepg2的毒性。一、主要试剂表106：二、主要耗材和仪器表107：名称生产厂家型号96孔细胞培养板nest701001生物安全柜北京东联哈尔仪器制造公司bsc-1360ⅱa2低速离心机中科中佳仪器有限公司sc-3612co2培养箱thermo3111倒置显微镜uopdsz2000x酶标仪上海欧颖实验设备有限公司k3三、细胞信息hepg2(来源协和细胞库)，培养基为dmem+10％fbs+1％双抗(gibco，15140-122)，培养条件为37℃，5％co2，饱和湿度。四、实验材料1.待测样品空白载体：前述实施例13中d-8、d-9、d-10、d-11、d-12、d-13和d-14自组装形成的dna纳米颗粒载体，分别记作：d-8、d-9、d-10、d-11、d-12、d-13和d-14。载体药：根据实施例5的化学法挂载方法(除特殊限定外，方法同实施例5相同)，采用前述实施例13中d-8、d-9、d-10、d-11、d-12、d-13和d-14自组装形成的dna纳米颗粒挂载阿霉素，分别记为d-8-阿霉素、d-9-阿霉素、d-10-阿霉素、d-11-阿霉素、d-12-阿霉素、d-13-阿霉素和d-14-阿霉素。原药阿霉素。dmso。五、实验步骤1.取对数生长期的hepg2细胞，使用台盼蓝染色计数细胞活率为98.3％，以5000个cell/孔进行铺板，体积为100μl/孔，铺8个96孔板，每板57个孔，37℃孵育过夜。2.按照下表稀释待测样品并加入：去除原有培养基，加入100μl不同浓度待测样品的培养基，每组3个复孔。表108：孔号c9c8c7c6c5c4c3c2c1挂载药终浓度10μm3.16μm1μm316nm100nm31.6nm10nm3.16nm1nm空载体终浓度1μm316nm100nm31.6nm10nm3.16nm1nm0.316nm0.1nm原药阿霉素终浓度10μm3.16μm1μm316nm100nm31.6nm10nm3.16nm1nmdmso(％)0.10.03160.010.003160.0010.000360.00010.0000360.00001在本实施例中，挂载药和空白载体分别先用pbs配制成100μm的原液，再用完全培养基(无生物素dmem)进行稀释。原药阿霉素先用dmso配制成100μm的原液，再用完全培养基(无生物素dmem)进行稀释。dmso直接用完全培养基(无生物素dmem)进行稀释。3.加待测样品后将96孔板放入37℃5％co2培养箱中孵育72h。4.将试剂盒取出室温融化，每孔加入10μlcck-8溶液，也可将cck8溶液与培养基以1:9混合，然后以100μl/孔的量加入孔中。5.在细胞培养箱内继续孵育4h，时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定。6.用酶标仪在450nm处测定吸光度。7.计算：细胞活力(％)＝(od实验组-od空白组)×100％/(od对照组-od空白组)，由graphpadprism5.0计算得到ic50。六、实验结果表109：结论：从上表和图49a、图49b、图49c、图49d、图49e、图49f、图49g、图49h中可以看出，原药阿霉素及挂载药d-8-阿霉素、d-9-阿霉素、d-10-阿霉素、d-11-阿霉素、d-12-阿霉素、d-13-阿霉素和d-14-阿霉素作用于hepg2细胞的ic50分别为0.2725μm、0.05087μm、0.0386、0.03955、0.04271、0.02294、0.03017和0.03458；dmso作用于hepg2细胞的ic50为>0.1％；d-8(空白载体)、d-9(空白载体)、d-10(空白载体)、d-11(空白载体)、d-12(空白载体)、d-13(空白载体)和d-14(空白载体)作用于hepg2细胞的ic50均>1μm。说明针对hepg2细胞系而言，相比单纯的空白载体d-8、d-9、d-10、d-11、d-12、d-13和d-14，小分子药物原药阿霉素及挂载药d-8-阿霉素、d-9-阿霉素、d-10-阿霉素、d-11-阿霉素、d-12-阿霉素、d-13-阿霉素和d-14-阿霉素都对hepg2细胞有毒性，且挂载药d-8-阿霉素、d-9-阿霉素、d-10-阿霉素、d-11-阿霉素、d-12-阿霉素、d-13-阿霉素和d-14-阿霉素相对于原药阿霉素有明显的增效作用。实施例19根据实施例5的化学法挂载方法(除特殊限定外，方法同实施例5相同)，采用前述实施例13中d-10和d-14自组装形成的dna纳米颗粒作为柔红霉素挂载载体。利用酶标仪测量492nm处柔红霉素的吸光度，绘制标准曲线(如图48所示)。测得柔红霉素挂载率分别如下：dna纳米颗粒d-10的柔红霉素挂载率为24.0；dna纳米颗粒d-14的柔红霉素挂载率为25.1。从以上的描述中，可以看出，本申请上述的实施例实现了如下技术效果：本申请提供了一系列具有热力学稳定性、化学稳定性、高负载率以及可多种模块组合的核酸纳米颗粒载体。对该类载体进行独特的模块化设计的，得到既保持天然相容的亲和力，又具有高度稳定性质和多样组合特征的核心模块结构。该结构可以灵活高效的集成各种功能性模块，包括靶向模块、成像和探针模块、治疗模块和其它复合智能模块，从而能够用于体内靶向投送，实现精准诊疗。通过将小分子药物表柔比星挂载于本申请所提供的核酸纳米颗粒载体上形成含表柔比星的药物，不仅能够提高表柔比星的递送稳定性，而且能够在核酸纳米颗粒携带靶头的情况下，一方面将表柔比星靶向递送到目标细胞，提高药物的生物利用度，另一方面因靶向递送既降低了对非目标细胞或组织的毒副作用，又降低了局部用药浓度，进一步减少了因用药浓度高而带来的毒副作用。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>百药智达（北京）纳米生物技术有限公司<120>含表柔比星的药物、其制备方法、药物组合物及应用<130>pn114930byzd<141>2019-09-30<150>201811163405.1<151>2018-09-30<160>174<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>10<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>misc_feature<222>(1)..(10)<223>a1序列<400>1ccagcguucc10<210>2<211>10<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>mrna<222>(1)..(10)<223>a1序列<400>2ccagcgttcc10<210>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