桑白皮提取物及其制备方法与流程

本发明涉及化妆品领域，具体地，本发明涉及桑白皮提取物及其制备方法。
背景技术：
：酪氨酸酶，又称多酚氧化酶，广泛存在于微生物，植物和人体中，是人体内合成黑色素的关键酶，其结构是一种含铜金属离子的氧化还原酶。酪氨酸在酪氨酸酶的催化作用下，依次生成多巴，多巴醌，多巴色素，最终产物为黑色素。人类的皮肤颜色取决于体内的黑色素含量及分布范围，当黑色素水平发生异常时，常伴有黄褐斑，雀斑甚至色素瘤等病变产生。国内外学者通过采用有效的酪氨酸酶抑制剂，控制酪氨酸酶的活性水平，从而影响黑色素的生成，导致合成量减少，达到美白效果。目前酪氨酸酶抑制剂来源于发酵，人工合成，天然植物等，广泛应用于美白化妆品领域的产品，常用抑制剂包括曲酸，熊果苷，维生素c，氢醌等，但以上抑制剂多存在一定的副作用或稳定性问题，在产品应用中不尽人意，如曲酸稳定低，且长期使用有致癌风险，而氢醌已被多国列为禁用添加剂。因此寻找开发安全、有效的酪氨酸酶抑制剂是化妆品应用领域的热门研究课题，也是市场的迫切需求。大量研究结果和临床实验证明，中药及其提取物具有性质平和，耐受性好，毒副作用小，作用持久等独特优点，植物来源的酪氨酸酶抑制剂迎合消费者的安全需求，适合作为新的安全有效的美白添加剂。桑白皮为桑科植物桑(morusalbal.)的干燥根皮，其中主要含有多种黄酮，生物碱和多糖类等有效成分，有泻肺平喘，利水消肿功效。现代药理研究表明它具有降压，利尿，镇静镇痛，抗炎，抗菌抑制血小板聚集，降糖等作用。有文献报道桑白皮水提溶液具有一定酪氨酸酶抑制活性，但是未对桑白皮水提物进行进一步分离并研究其美白效果。如文献《桑白皮水提物美白机制研究》(2010,40(6):444-447)报道，通过回流提取得到质量浓度为120mg/ml的桑白皮水提物，其质量浓度为12mg/ml时抑制酪氨酸酶的抑制率约为75％，其中阳性对照为1.42mg/ml的vc，其抑制率为90％，同时桑白皮水提物抑制蘑菇酪氨酸酶的ic50值为1.52mg/ml。然而，对于桑白皮在化妆品中的美白效果更深入的应用还未见报道。技术实现要素：本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：发明人在前期实验中对桑白皮水提取物进行了系列的纯化研究实验，结果显示，与阳性对照熊果苷(ic50值为1.013mg/ml)相比，通过利用回流提取串联d101型大孔树脂分离纯化制备的桑白皮提取物具有良好的抑制活性(ic50值为0.014mg/ml)(
专利名称：：桑白皮制品及其制备方法，申请号201811512778.5)。在此研究基础上，发明人对该提取物进行了进一步的提纯制备，惊喜地发现，使用本发明方法制备的桑白皮提取物，其酪氨酸酶抑制活性ic50值为0.0006mg/ml，显著低于前期实验所制备纯化的提取物(ic50值0.014mg/ml)，也远低于阳性对照熊果苷的ic50值(1.013mg/ml)，具有非常好的酪氨酸酶抑制活性，在美白化妆品的生产应用方面具有广阔的应用前景。为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种桑白皮提取物。根据本发明的实施例，所述桑白皮提取物包括：氧化白藜芦醇，所述氧化白藜芦醇的重量份为20～40，如为22、24、26、28、30、32、34、35、36、37、38或40；和桑辛素m，所述桑辛素m的重量份为10～35，如为10、12、14、15、16、18、20、22、24、26、28、30、32或35。发明人发现，根据本发明实施例的桑白皮提取物的酪氨酸酶抑制活性ic50值为0.0006mg/ml，具有非常好的酪氨酸酶抑制活性，在美白化妆品的生产应用方面具有广阔的应用前景。根据本发明的实施例，上述桑白皮提取物还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本发明的实施例，所述氧化白藜芦醇的重量份为25～38，所述桑辛素m的重量份为15～30。在一些实施例中，所述氧化白藜芦醇的重量份为30～38，所述桑辛素m的重量份为20～30。在一些实施例中，所述氧化白藜芦醇的重量份为32～36，所述桑辛素m的重量份为23～26。在一些实施例中，所述氧化白藜芦醇的重量份为34.81，所述桑辛素m的重量份为25.32。由此，根据本发明实施例的桑白皮提取物对酪氨酸酶的抑制活性更优。另一方面，本发明提供了一种桑白皮提取物。根据本发明的实施例，所述桑白皮提取物包括：氧化白黎芦醇，所述氧化白黎芦醇的保留时间为14～17min、相对峰面积为30％～45％；和桑辛素m，所述桑辛素m的保留时间为20～24min、相对峰面积为50％～65％；其中：所述保留时间和所述相对峰面积是在下述液相色谱检测条件下确定的：色谱柱为aglientporoshell120ec-c18，流动相为0.1％甲酸-乙腈，洗脱梯度：流速为0.4ml/min，检测波长为320nm，柱温度为30℃。由此，根据本发明实施例的桑白皮提取物对酪氨酸酶的抑制活性进一步提高。根据本发明的实施例，所述氧化白黎芦醇的保留时间为14.5-16.5min、相对峰面积为33％-40％，所述桑辛素m的保留时间为20.5-23min、相对峰面积为54％-62％。在一些实施例中，所述氧化白黎芦醇的保留时间为15-16.5min、相对峰面积为35％-39％，所述桑辛素m的保留时间为21-22.5min、相对峰面积为56％-60％。在一些实施例中，所述氧化白黎芦醇的保留时间为15.05min、相对峰面积为37.32％，所述桑辛素m的保留时间为21.58min、相对峰面积为58.47％。由此，根据本发明实施例的桑白皮提取物对酪氨酸酶的抑制活性更好。根据本发明的实施例，所述桑白皮提取物的液相色谱检测结果如图1所示。由此，根据本发明实施例的桑白皮提取物对酪氨酸酶的抑制活性进一步提高。在本发明的第二方面，本发明提出了一种制备前面所描述的桑白皮提取物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用水对桑白皮进行提取处理，获得桑白皮提取物；利用乙醇-水体系对所述桑白皮提取物进行第一分离，以便获得第一分离部分；利用甲醇-水体系对所述第一分离部分进行第二分离，以便获得所述桑白皮提取物；其中，所述第二分离是利用葡聚糖凝胶柱进行的。发明人发现，根据本发明实施例的方法制备的桑白皮提取物的酪氨酸酶抑制活性ic50值为0.0006mg/ml，具有非常好的酪氨酸酶抑制活性，在美白化妆品的生产应用方面具有广阔的应用前景。根据本发明的实施例，上述方法还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本发明的实施例，所述第二分离是利用lh-20葡聚糖凝胶柱进行的。根据本发明的实施例，所述甲醇-水体系中，所述甲醇的浓度为20％～100％，如为20％、40％、60％、80％或100％。根据本发明的实施例，所述第二分离中，依次利用20％甲醇、30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇和100％甲醇对所述第一分离部分进行梯度洗脱，100％甲醇洗脱液中包含所述桑白皮提取物。需要说明的是，在所述梯度洗脱过程中，当洗脱液中没有检测到色谱峰时换下一个洗脱液继续洗脱。发明人发现，采用所述梯度洗脱方式时，根据本发明实施例的方法制备的桑白皮提取物的酪氨酸酶抑制活性更优。根据本发明的实施例，所述第二分离中，洗脱流速为0.1～2bv/h，如为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8或2bv/h。在一些实施例中，所述第二分离中，洗脱流速为0.1bv/h。根据本发明的实施例，所述100％甲醇洗脱液中，洗脱体积为1～5bv的部分包含所述桑白皮提取物。在一些实施例中，洗脱体积为1.2～2.2bv的部分包含所述桑白皮提取物。在一些实施例中，洗脱体积为1.28～2.16bv的部分包含所述桑白皮提取物。需要说明的是，例如，“洗脱体积为1.28～2.16bv的部分包含所述桑白皮提取物”的含义是，第二分离中采用100％甲醇并以前述流速进行洗脱时，从第1.28bv后(不包括1.28bv)的洗脱体积开始收集，到第2.16bv(包括2.16bv)的洗脱体积结束收集，从开始收集到结束收集的1.28bv～2.16bv的洗脱液中包含所述桑白皮提取物。发明人发现，100％甲醇洗脱液中，收集的洗脱液体积在前述范围内时，制备的桑白皮提取物对酪氨酸酶的抑制活性更优。根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：将所述洗脱体积为1.28～2.16bv的部分进行浓缩和冷冻干燥处理，以便获得桑白皮100％甲醇lh-20洗脱冻干粉。根据本发明的实施例，所述第一分离是利用大孔吸附树脂柱进行的。在一些实施例中，所述第一分离是利用d101大孔吸附树脂柱进行的。根据本发明的实施例，所述第一分离中，依次利用纯水、10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和100％乙醇对所述桑白皮提取物进行梯度洗脱，50％乙醇洗脱液中包含所述第一分离部分。需要说明的是，所述梯度洗脱中，每次洗脱至洗脱液无明显颜色时更换下一种洗脱液。由此，根据本发明实施例的方法制备的桑白皮提取物对酪氨酸酶的抑制活性更优。根据本发明的实施例，所述第二分离前，所述方法进一步包括：将所述50％乙醇洗脱液依次进行浓缩、冷冻干燥和20％甲醇复溶处理，以便获得所述第一分离部分。根据本发明的实施例，所述提取处理中，所述水的体积和所述桑白皮的质量的比为(10～30)：1ml/g，如为15:1、20:1、25:1或30:1ml/g。在一些实施例中，所述水的体积和所述桑白皮的质量的比为15：1ml/g。由此，桑白皮水提取物的纯度更高，根据本发明实施例的方法制备的桑白皮提取物对酪氨酸酶的抑制活性更优。根据本发明的实施例，所述提取处理是在温度为70～100℃，如80或90℃的条件下进行的。在一些实施例中，所述提取处理是在温度为90～100℃的条件下进行的。在一些实施例中，所述提取处理是在温度为100℃的条件下进行的。根据本发明的实施例，所述提取处理的时间为3～4h。在一些实施例中，所述提取处理的时间为4h。在本发明的第三方面，本发明提出了一种化妆品。根据本发明的实施例，所述化妆品包括：前面所描述的桑白皮提取物或根据前面所描述的方法制备的桑白皮提取物。在本发明的第四方面，本发明提出了前面所描述的桑白皮提取物或根据前面所描述的方法制备的桑白皮提取物在制备化妆品中的用途，所述化妆品用于抑制酪氨酸酶的活性，或者用于皮肤美白。附图说明图1是根据本发明实施例的桑白皮100％甲醇lh-20洗脱冻干粉目标样品色谱图。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本发明的目的是提供一种具有抑制酪氨酸酶活性效果的桑白皮组合物及其制备方法，即利用回流提取串联d101型大孔树脂以及葡聚糖凝胶lh-20柱制备桑白皮组合物。具体技术方案如下：将桑白皮药材粉碎，取2kg，采用水为提取溶剂，提取溶剂体积与桑白皮原料质量之比为10-30ml/g。提取温度为70-100℃，提取时间3-4小时。使用真空浓缩煎药机进行提取及浓缩，得桑白皮浓缩提取液，并在冷冻干燥机真空度0.1mbar，冷肼温度-70℃条件下干燥，得桑白皮提取冻干粉末。桑白皮提取冻干粉末加入纯水溶解，得70-85mg/ml浓度溶液，采用d101大孔吸附树脂湿法装柱，以3.6bv/h(1bv＝650ml)流速上样，吸附2-6小时。随后以0.5-1.5bv/h流速，依次采用纯水，10％乙醇溶液，30％乙醇溶液，50％乙醇溶液，70％乙醇溶液，100％乙醇溶液进行洗脱，分别洗脱至洗脱液无明显颜色更换洗脱梯度，合并相同溶剂比例洗脱液，将50％乙醇洗脱部位浓缩至无醇味，于冷冻干燥机真空度0.1mbar，冷肼温度-70℃条件下干燥，得桑白皮50％乙醇洗脱冻干粉末。称取2g桑白皮50％乙醇洗脱冻干粉末加入400ml20％甲醇溶解，离心取上清，过0.45μm有机滤膜。使用lh-20葡聚糖凝胶装柱，湿法上样，以0.1bv/h(1bv＝500ml)流速上样，吸附过夜。随后以0.1-2bv/h流速依次使用20％甲醇溶液，30％甲醇溶液，50％甲醇溶液，70％甲醇溶液，100％甲醇溶液洗脱，每11分钟用收集管收集1管洗脱液(约8ml)，每5管收集管收集的洗脱液合并成一管并转移至50ml的离心管中，并依次标上阿拉伯数字第1管、第2管……。根据离心管收集的洗脱液的液相色谱分析结果，将组分类似的洗脱液合并(即在液相分析过程中把含有的色谱峰一致的洗脱液合并，即将出峰时间和峰的种类一致的洗脱液合并)，同时在洗脱过程中，当洗脱液中没有检测到色谱峰时换下一个洗脱液洗脱。实验结果发现，当使用100％甲醇溶液洗脱时，前17管的洗脱液没有抑制酪氨酸酶的活性，第17-27管收集的洗脱液具有较好的活性，将第17管至第27管合并后的洗脱液浓缩至无醇味，于冷冻干燥机真空度0.1mbar，冷肼温度-70℃条件下干燥，得桑白皮100％甲醇lh-20洗脱冻干粉末。制备后经核磁分析，初步鉴定其中包含oxyresveratrol(氧化白藜芦醇)和moracinm(桑辛素m)。下面结合具体实施例对本发明进行进一步的解释说明。实施例一、桑白皮100％甲醇lh-20洗脱冻干粉末的制备将桑白皮药材粉碎，取2kg，采用水为提取溶剂，提取溶剂体积与桑白皮原料质量之比为15ml/g。提取温度为100℃，提取时间4小时。使用真空浓缩煎药机进行提取及浓缩，得桑白皮浓缩提取液，并在冷冻干燥机真空度0.1mbar，冷肼温度-70℃条件下干燥，得桑白皮提取冻干粉末。桑白皮提取冻干粉末加入纯水溶解，得50mg/ml浓度溶液，采用d101大孔吸附树脂湿法装柱，以3.6bv/h(1bv＝650ml)流速上样，吸附2小时。随后以0.8bv/h流速，依次采用纯水，10％乙醇溶液，30％乙醇溶液，50％乙醇溶液，70％乙醇溶液，100％乙醇溶液进行洗脱，分别洗脱至洗脱液无明显颜色更换洗脱梯度，合并相同溶剂比例洗脱液，将50％乙醇洗脱部位浓缩至无醇味，于冷冻干燥机真空度0.1mbar，冷肼温度-70℃条件下干燥，得桑白皮50％乙醇洗脱冻干粉末。称取2g桑白皮50％乙醇洗脱冻干粉末加入400ml20％甲醇溶解，离心取上清，过0.45μm有机滤膜。使用lh-20葡聚糖凝胶装柱，湿法上样，以0.1bv/h(1bv＝500ml)流速上样，吸附过夜。随后以0.1bv/h流速依次使用20％甲醇溶液，30％甲醇溶液，50％甲醇溶液，70％甲醇溶液，100％甲醇溶液洗脱，每11分钟用收集管收集1管洗脱液(约8ml)，每5管收集管收集的洗脱液合并成一管并转移至50ml的离心管中，并依次标上阿拉伯数字第1管、第2管……。根据离心管收集的洗脱液的液相色谱分析结果，将组分类似的洗脱液合并(即在液相分析过程中把含有的色谱峰一致的洗脱液合并，即将出峰时间和峰的种类一致的洗脱液合并)，同时在洗脱过程中，当洗脱液中没有检测到色谱峰时换下一个洗脱液洗脱。实验结果发现，当使用100％甲醇溶液洗脱时，前17管的洗脱液没有抑制酪氨酸酶的活性，第17-27管收集的洗脱液具有较好的活性。将第17管至第27管合并后的洗脱液浓缩至无醇味，于冷冻干燥机真空度0.1mbar，冷肼温度-70℃条件下干燥，得桑白皮100％甲醇lh-20洗脱冻干粉末。制备后经核磁分析，其中两个化合物分析结果如下：第一个化合物：1hnmr(600mhz,meod)δ:7.34(1h,d,j＝9.0hz,h-6′),7.29(1h,d,j＝16.5hz,h-8),6.83(1h,d,j＝16.5hz,h-7),6.46(2h,d,j＝2.0hz,h-2,6),6.33(1h,d,j＝2.0hz,h-3′),6.32(1h,dd,j＝9.0,2.0hz,h-5′),6.16(1h,d,j＝2.0hz,h-4)；13c-nmr(151mhz,meod)δ:142.2(c-1),105.6(c-2,6),159.5(c-3,5),102.3(c-4),126.5(c-7),124.8(c-8),117.8(c-1′),157.3(c-2′),103.5(c-3′),159.2(c-4′),108.4(c-5′),128.4(c-6′)；核磁数据与文献[1]对照一致，初步鉴定第一个化合物为oxyresveratrol(氧化白藜芦醇)。([1]翟晓晓,钟国跃,姚鹏程,林沁华,元文君,任刚.波罗蜜根酚性化学成分研究[j].中草药,2016,47(22):3959-3964.)。第二个化合物：1hnmr(600mhz,meod)δ7.37(1h,d,j＝8.4hz,h-4),6.93(1h,d,j＝2.3hz,h-6),6.92(1h,s,h-3),6.78(2h,d,j＝2.2hz,h-2',6'),6.76(1h,dd,j＝8.4,2.0hz,h-5),6.27(1h,t,j＝2.2hz,h-4')；13cnmr(151mhz,meod)δ160.0(c-3',5'),157.2(c-7a),156.8(c-6),156.1(c-2),133.8(c-1'),123.1(c-3a),122.0(c-4),113.2(c-5),104.0(c-2',6'),103.5(c-4'),102.2(c-3),98.5(c-7)；核磁数据与文献[2]对照一致，初步鉴定第二个化合物为moracinm(桑辛素m)。([2]何细新,巢晓娟,杨璐,张翠仙,皮荣标,曾海祥,李国西,徐玉娟,林燕燕.广东桑根心材的化学成分研究[j].天然产物研究与开发,2014,26(02):193-196.)。将桑白皮100％甲醇lh-20洗脱冻干粉末甲醇复溶后进行液相色谱分析，色谱条件如下：色谱柱为aglientporoshell120ec-c18(3mm×150mm，2.7μm)，流动相0.1％甲酸(a)-乙腈(b)，洗脱梯度：(0～27min，12％～35％b；27～28min，35％～50％b；28～35min，50％b)流速：0.4ml/min，检测波长320nm，柱温度30℃，进样量10μl。色谱图如图1所示。另外，图1中各个色谱峰的保留时间和相对峰面积如下表1所示。表1：图1中各个色谱峰的保留时间以及相对峰面积保留时间min峰面积相对峰面积％(总面积)峰1(氧化白藜芦醇)15.051428.3437.32峰2(桑辛素m)21.582237.7258.47经分离计算，100％甲醇洗脱冻干粉末组合物中目标成分含量分别为：氧化白藜芦醇34.81％、桑辛素m25.32％(计算方法为：将100％甲醇lh-20洗脱冻干粉末溶解后进液相分离，接目标成分氧化白藜芦醇、桑辛素m，溶液冻干后得到粉末，再除以总的100％甲醇lh-20洗脱冻干粉末重量，即得到氧化白藜芦醇、桑辛素m的含量，计算结果与图1峰面积比例不太一致的原因可能在于，目标成分的收集和冻干过程中有所损失)。二、桑白皮100％甲醇lh-20洗脱冻干粉末酪氨酸酶抑制活性的测定实验溶液：配制酪氨酸溶液(5.0μmol/ml)，磷酸盐缓冲液(ph＝6.50)，将桑白皮lh-20-100％甲醇洗脱冻干粉末分别配制成质量浓度为0.0078，0.0049，0.0020，0.0006mg/ml的4个梯度溶液；按表2依次加入酪氨酸溶液(5.0μmol/ml)，磷酸盐缓冲液(ph＝6.50)，桑白皮供试品溶液，酪氨酸酶溶液(200u/ml)，混合均匀，置于25℃水浴反应50分钟。移取反应溶液于475nm检测吸光值，计算抑制率，并换算为ic50值(mg/ml)，具体如下表3所示。表2：反应溶液信息表抑制率计算公式：注：a供试品——桑白皮供试品反应溶液吸光值a供试品对照空白——桑白皮供试品空白反应溶液吸光值a对照——酪氨酸对照品反应溶液吸光值a对照空白——酪氨酸对照品空白反应溶液吸光值表3：酪氨酸酶抑制活性测定结果由上表3可知，本发明的桑白皮100％甲醇lh-20洗脱冻干粉末的酪氨酸酶抑制活性ic50值为0.0006mg/ml，显著低于前期实验所制备纯化的提取物的ic50值(0.014mg/ml)，远低于阳性对照熊果苷的ic50值(1.013mg/ml)，具有非常好的酪氨酸酶抑制活性，可有效用于美白化妆品的制备。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。当前第1页1 2 3