安石榴苷在制备防治绝经后骨质疏松药物中的应用的制作方法

本发明属于化学药物新用途技术领域，具体涉及安石榴苷在制备防治绝经后骨质疏松药物中的应用。

背景技术：

绝经后骨质疏松(postmenopausalosteoporosis,pmo)是一种常见的代谢性骨病，是由于绝经后女性雌激素缺乏引起破骨细胞功能亢进，骨代谢失衡，导致骨量降低、骨组织显微结构发生改变的骨疾病，表现为骨脆性增加、易骨折。骨质疏松已成为当今全球仅次于心血管疾病、最具危害性且尚未能治愈的慢性疾病。据统计，绝经后骨质疏松症影响全世界2亿多女性，50岁以上的女性中有三分之一会经历骨质疏松性骨折，这给病人带来了巨大病痛和沉重的经济损失。尽管国内外学者专家对此病的防治十分重视，但该病尚缺乏有效的治疗药物。

目前临床上常用的防治骨质疏松的药物包括雌激素替代药物，双磷酸盐类，选择性雌激素受体调节剂，维生素d等。不幸的是，双磷酸盐类抗骨质疏松药物虽然是有效的，但也有并发颌骨坏死和肾功能衰竭的风险。激素替代疗法，虽然有效地减少骨质疏松性骨折，但导致乳腺癌，心肌缺血和血栓栓塞性疾病的风险增加。其他药物要么远期效果不明显，要么价格昂贵。由于骨质疏松是一种慢性疾病，需要长期服药，因此探寻一种价格便宜，毒副作用小的天然化合物已成为研究治疗骨质疏松的热点之一。

安石榴苷（punicalagin，pun），其分子式为c48h28o30，相对分子质量是1084.72，casno.是65995-63-3，结构如式（ⅰ）所示：

式（ⅰ）

安石榴苷（pun）是石榴皮多酚中的最主要的活性成分（约占60-70%），呈棕黄色不定型粉末状，极性强，易溶于水，可溶于乙醇等有机溶剂形成胶状溶液，能跟多种化学试剂发生显色反应，是逆没食子酸鞣质的一种，是石榴所特有的一种相对分子质量较大的可水解的多酚类化合物。pun有许多重要的药理作用，如抗炎，抗肿瘤，抗菌和抗氧化性能。近年来由于其生物活性的广泛的受到关注，并越来越多地应用到心血管疾病、糖尿病和脂肪肝等疾病的预防与治疗中。

既往有文献报道单独用pun在体外对raw264.7细胞向破骨细胞分化有抑制作用，但是有文献也表明即便某一药物在体外对破骨细胞分化有抑制作用，但是在应用到体内后对骨质疏松的防治效果却并不理想。

目前对于绝经后骨质疏松（pmo）还缺乏有效的药物治疗，也尚无pun对pmo进行防治的报道，本发明也由此而来。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供安石榴苷（pun）的一种新用途，特别是治疗pmo的用途，为防治绝经后骨质疏松提供了一种新途径。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

安石榴苷在制备防治绝经后骨质疏松药物中的应用，所述的绝经后骨质疏松主要指绝经后雌激素缺乏引起的骨质疏松症。所述安石榴苷的结构式如式（ⅰ）所示，

式（ⅰ）。

一种防治绝经后骨质疏松的药物制剂，包括治疗有效量的安石榴苷和药学上可接受的辅料。

进一步的，所述安石榴苷的含量质量计为1～99%。

进一步的，所述的药物制剂适用于胃肠道或非胃肠道给药的药物制剂。

进一步的，所述的药物制剂为冻干剂、针剂、片剂、颗粒剂或胶囊剂。

本发明技术方案通过灌胃给药法来研究pun能否对卵巢切除后雌激素缺乏引起的小鼠骨质疏松有治疗作用，同时测定核因子κb受体活化因子配体（rankl）、组织蛋白酶k（ctsk）等指标来研究这种作用与破骨细胞活化的关系，探讨pun治疗绝经后骨质疏松的机制及理论依据。

本发明将60只10周c57bl/j6雌性小鼠被随机分为假手术组（sham组）、骨质疏松模型组（ovx组）、低剂量pun治疗组（20mg/kg/d）和高剂量pun治疗组（50mg/kg/d），每组15只。各组动物均在全麻下行常规手术操作，sham组仅切除卵巢周围部分脂肪组织，其余三组行双侧卵巢切除术。pun治疗组从术后第3周起，每天通过灌胃给药法注射200µl含有pun的无菌pbs溶液（其中低剂量组和高剂量治疗组给药剂量分别为20mg/kg/d和50mg/kg/d），sham组和ovx组每天通过灌胃给200µl无菌pbs溶液。持续给药四周（每周5次）后处死动物取股骨行micro-ct及组织学检测，测定股骨骨密度、骨体积分数、骨小梁数、骨小梁分离度以及成熟破骨细胞数量等分析股骨骨质疏松程度；同时应用免疫组化方法检测rankl、ctsk等在骨组织中表达量。采用单因素方差分析对各组数据进行统计学分析。

有益效果：本发明提供了一种安石榴苷在制备防治绝经后骨质疏松药物中的应用。本发明通过应用去卵巢小鼠骨质疏松模型，观察安石榴苷（pun）对去卵巢小鼠骨质疏松的治疗作用，并评估破骨活化主要指标rankl、ctsk的改变，分析骨质疏松的各项指标，从而阐明pun对雌激素缺乏骨质疏松的治疗作用机制。绝经后由于雌激素缺乏，骨吸收因子可上调rankl的表达，活化rankl通路，引起破骨细胞活化，目前被认为是引起绝经后骨质疏松的重要机制，而pun通过抑制此通路，抑制破骨细胞活化，从而使得pun对绝经后骨质疏松的防治提供一种新途径。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述

图1为micro-ct扫描各实验组小鼠股骨的三维模型图。a为sham组，b为ovx组，c为pun低剂量治疗组，d为pun高剂量治疗组。

图2为各实验组小鼠股骨骨密度（bmd）的检测值图。

图3为各实验组小鼠股骨骨体积分数（bv/tv）的检测值图。

图4为各实验组小鼠股骨松质骨骨小梁数量（tb.n）的检测值图。

图5为各实验组小鼠股骨松质骨平均骨小梁分离度（tb.sp）结果图。

图6为各实验组小鼠股骨he染色的结果图。a为sham组，b为ovx组，c为pun低剂量治疗组，d为pun高剂量治疗组。

图7为各实验组小鼠股骨he染色骨体积分数（bv/tv）的检测值图。

图8为各实验组小鼠股骨trap染色结果图。a为sham组，b为ovx组，c为pun低剂量治疗组，d为pun高剂量治疗组。

图9为各实验组小鼠股骨trap染色阳性细胞计数结果图。

图10为各实验组小鼠股骨rankl免疫组化染色结果图。a为sham组，b为ovx组，c为pun低剂量治疗组，d为pun高剂量治疗组。

图11为各实验组小鼠股骨免疫组化表达rankl阳性细胞计数结果图。

图12为各实验组小鼠股骨ctsk免疫组化染色结果图。a为sham组，b为ovx组，c为pun低剂量治疗组，d为pun高剂量治疗组。

图13为各实验组小鼠股骨免疫组化表达ctsk阳性细胞计数结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

一、材料与方法

1、材料

1.1试剂及实验设备

1.1.1主要药品及试剂

安石榴苷（pun），购自sigma-aldrich公司，美国；trap染色试剂盒，购自sigma-aldrich公司，美国；多聚甲醛、无菌pbs、dab显色剂、苏木素、伊红、无水乙醇、蒸馏水、10%水合氯醛。rankl、ctsk抗体购自abcam公司，英国。

1.1.2主要仪器

micro-ct（skyscan1176，比利时）、石蜡切片机（leica2135，德国）、烤片机（leica1120，德国）、石蜡包埋机（leica1150，德国）、axiovert40c光学显微镜（zeiss，德国）、手术器械一套等。

1.2实验动物

健康c57bl/j6小鼠60只，雌性，体重21～24g，10周龄，spf级，由苏州大学动物实验中心提供。饲养条件如下：五只一笼，室温18～20℃，湿度50～60%，通风良好，自由摄食进水。

2、实验方法

2.1实验动物分组

c57bl/j6小鼠60只，随机分为以下4组：

（1）sham组：15只，为去势假手术组，操作与ovx组相同，但仅限于切除卵巢周围部分脂肪组织，而不切除卵巢，从术后第3周起，通过灌胃给药法注射200µl无菌pbs溶液术，每周给pbs溶液5天，连续灌胃4周后处死；

（2）ovx组：15只，为骨质疏松模型组，取小鼠腰椎后正中切口，暴露两侧的卵巢。在两侧卵巢和子宫交界处分别用丝线结扎，并将卵巢切除，从术后第3周起，通过灌胃给药法注射200µl无菌pbs溶液术，每周给pbs溶液5天，连续灌胃4周后处死；

（3）low-pun组：15只，为pun低剂量治疗组，取小鼠腰椎后正中切口，暴露两侧的卵巢。在两侧卵巢和子宫交界处分别用丝线结扎，并将卵巢切除，从术后第3周起，通过灌胃给药法注射200µl含20mg/kg的pun的无菌pbs溶液，每周给药5天，连续灌胃4周后处死；

（4）high-pun组：15只，为pun高剂量治疗组，取小鼠腰椎后正中切口，暴露两侧的卵巢。在两侧卵巢和子宫交界处分别用丝线结扎，并将卵巢切除从术后第3周起，通过灌胃给药法注射200µl含50mg/kg的pun的无菌pbs溶液，每周给药5天，连续灌胃4周后处死。

2.2小鼠去卵巢骨质疏松模型的制备

本发明采用卵巢切除去势骨质疏松模型来模拟绝经后骨质疏松发生的病理过程（kinoshitam,etal.changesinmicro-ct3dboneparametersreflecteffectsofapotentcathepsinkinhibitor(sb-553484)onboneresorptionandcorticalboneformationinovariectomizedmice.bone2007;40(5):1231-7.）。将实验小鼠经4%水合氯醛0.1ml/10g腹腔内注射麻醉。在动物手术操作台将小鼠仰卧位固定，小鼠下腹部皮肤去毛，安尔碘消毒三遍，铺无菌洞巾，取小鼠腰椎后正中切口，暴露分离出两侧的卵巢，用手术缝线，将卵巢与子宫连接的根部行结扎，行双侧卵巢切除。成功切除卵巢后，皮肤以4-0缝线缝合。为了预防术后感染，手术后肌肉注射青霉素一次。所有手术均在在同一天完成。

2.3标本采集

取出被处死的小鼠的双侧股骨，剥离周围骨膜、肌肉等软组织；右侧股骨用4%多聚甲醛溶液固定24h后，以10%edta脱钙3周，石蜡包埋用于he染色、trap染色评估以及免疫组织化学检测；在10%冷的pbs中保存左侧股骨标本，用于micro-ct检测松质骨骨密度及相关骨形态学参数。

2.4micro-ct检测

小鼠股骨固定24h后，行micro-ct扫描。扫描参数：分辨率9μm，电压80kv；电流100µa；每次曝光时间为100ms；0.9°/8images。采用wedemeyerc方法（wedemeyerc,etal.particle-inducedosteolysisinthree-dimensionalmicro-computedtomography.calciftissueint.2007;81(5):394-402.），选定一圆柱形感兴趣区域（roi；直径3mm，高度1mm），应用micro-ct图像分析软件对图像进行3d分析，记录roi股骨的骨密度（bmd,mg/mm²），骨体积与组织体积比值（bv/tv），平均骨小梁数量（tb.n），松质骨平均骨小梁分离度（tb.sp）等。

2.5组织学染色

股骨标本由edta脱钙液脱钙完成后，对标本进行修剪，去除股骨近端组织，保留股骨中下1/3以便做股骨干骺端的组织学观察；最后使用组织切片机对石蜡包埋标本进行切片，最终制作成层厚是5μm石蜡切片。

2.5.1he染色步骤：

（1）石蜡切片经二甲苯（10min×3次）脱蜡后，依次经过100%、100%、95%、90%，85%的乙醇至水，每道5min；

（2）蒸馏水冲洗3min，苏木素溶液染色5min，自来水冲洗5min；

（3）1％盐酸酒精溶液分化60s，自来水冲洗1min；

（4）10％氨水溶液中反蓝60s，自来水冲洗1min；

（5）l％伊红溶液复染3min，自来水冲洗1min；

（6）常规脱水、透明、封片。

光镜下观察股骨的形态学变化。用显微镜计算机图像分析系统（image-proplus6.0），参照vonknochm法（vonknochm,etal.decreaseinparticle-inducedosteolysisinobese(ob/ob)mice.biomaterials.2004;25:4675-81），计算骨密度（bmd）、骨体积分数（bv/tv）。

2.5.2抗酒石酸酸性磷酸酶染色：

抗酒石酸酸性磷酸酶(trap)为破骨细胞所特有，分布于破骨细胞胞浆。在含酒石酸盐的酸性条件下，trap能将萘酚asbi磷酸盐水解，产生萘酚asb1，后者立即与染液中的六偶氮副品红结合，在酶活性部位形成不溶性红色染料。通过观察这种染料可间接了解酸性磷酸酶活性。trap染色被用来鉴别破骨样细胞。染色采用trap染色试剂盒(sigma387a)。

2.5.2.1试剂配制：

备2个试管，一个加0.5mlfastgarnetgbcbasesolution(副品红)，另一个加0.5mlsodiumnitritesolution(亚硝酸钠)，混合30s，静置2min；备2个100ml烧杯，标记a，b，配制trap染液(ph5.2)：

2.5.2.2染色步骤：

（1）石蜡切片脱蜡和水化后，用pbs冲洗3次，每次3min

（2）将准备好的标本切片在丙酮溶液中固定30s；

（3）蒸馏水冲洗，不让其干；

（4）trap染液37度孵育1h，避光；

（5）蒸馏水冲洗3次。

trap染色阳性结果为紫红色点、片状区域，参照nichc法（nichc,etal.roleofdirectestrogenreceptorsignalinginwearparticle-inducedosteolysis.biomaterials.2013;34(3):641-50.），20×光镜视野下计数成熟破骨细胞数量。

2.6免疫组化检测rankl、ctsk1、脱蜡和水化脱蜡前，将切片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤30分钟。

1）切片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；2）无水乙醇中浸泡5分钟；3）95%乙醇中浸泡5分钟；4）70%乙醇中浸泡5分钟；2、抗原修复

酶消化方法：常用0.1%胰蛋白酶，胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，每张切片滴加0.2ml消化液覆盖完全组织，于37℃温箱内消化约5~30分钟，避光。3、免疫组织化学染色1）pbs洗2～3次各5分钟；2）滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。3）滴加ⅰ抗100μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。4）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。5）pbs洗3次各5分钟；6）滴加ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；7）pbs洗3次各5分钟；8）dab显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；9）pbs或自来水冲洗10分钟；10）苏木精复染3分钟，盐酸酒精分化；11）自来水冲洗10～15分钟；12）脱水、透明、封片、镜检。

2.7统计学分析

结果数据采用spss11.0统计软件分析，数据用均数±标准差（）表示，多组比较选用单因素方差分析（one-wayanova检验），两两比较在总体方差齐的条件下，选用lsd及dunnett-t法进行分析。p<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1.实验动物一般情况

各组动物均在术后30～60min内苏醒，可在笼内自由活动，正常进食，精神状态无明显变化。无切口无红肿、渗液等炎性反应，均一期愈合。实验过程中无动物死亡。

2.micro-ct检测

运用micro-ct扫描实验小鼠股骨并进行三维图像重建及定量分析，可以较为准确的描述骨量和骨微结构，从而判定骨质疏松的程度。其中，a为sham组，b为ovx组，c为ovx+low-pun组（20mg/kgpun），d为ovx+high-pun组（50mg/kgpun）。三维图像显示，sham组骨小梁数目多，骨小梁间隙小，骨组织致密；与sham组比较，ovx组可见较少量骨小梁，骨小梁间隙大，骨组织明显稀疏；pun给药后，其骨小梁数量较ovx组有所增加、骨小梁间隙减小。（图1）。

骨密度（bmd）变化：卵巢切除后，小鼠股骨生长板附近骨密度明显降低，与sham组比较，差异有统计学意义（**p<0.01）；与ovx组比较，治疗组小鼠股骨骨密度显著增加，其中pun低浓度治疗组与ovx组比较，*p<0.05，pun高剂量治疗组与ovx组比较，**p<0.01。见图2。

骨体积分数（bv/tv）：ovx组骨体积分数明显降低，与sham组比较，**p<0.01。而pun治疗后，骨体积分数明显增加，其中，高剂量pun治疗组与ovx组比较，**p<0.01，低剂量pun治疗组与ovx组相比较，**p<0.01。见图3。

松质骨骨小梁数量（tb.n）：ovx组小鼠股骨远端骨小梁数量明显减少，与sham组比较，**p<0.01。而pun治疗后，骨松质骨骨小梁数量明显增加，其中，高剂量pun治疗组与ovx组比较，**p<0.01，低剂量pun治疗组与ovx组相比较，**p<0.01。见图4。

松质骨平均骨小梁分离度（tb.sp）：ovx组小鼠股骨远端平均骨小梁分离度明显增大，与sham组比较，**p<0.01。而pun治疗后，股骨远端平均骨小梁分离度明显减小，其中，高剂量pun治疗组与ovx组比较，*p<0.05，低剂量pun治疗组与ovx组相比较，**p<0.01。见图5。

3．组织学检测

3.1he染色结果：

光镜下，与sham组相比ovx组骨小梁数目减少，排列较为松散，大部分的骨小梁不能连接成网状，且骨小梁变细、变窄、变稀疏，分离度增大，间隙增宽，并可看到骨小梁断裂的游离末端，结构扭曲不完整，呈典型的骨质疏松样改变；pun治疗组被破坏的骨小梁结构得到了不同程度的修复，表现为骨小梁数目增加、分离度降低、间隙变窄。见图6，其中，a为sham组，b为ovx组，c为ovx+low-pun组（20mg/kgpun），d为ovx+high-pun组（50mg/kgpun）。

骨体积分数（bv/tv）：与sham（20.351±2.288）组比较，ovx组（10.835±2.626）骨体积分数明显变小，差异有统计学意义（**p<0.01）。pun治疗后，骨体积分数分别为17.042±1.969（low-pun组），20.008±2.274（high-pun组），与ovx组相比，骨体积分数显著变大。其中pun低浓度治疗组与ovx组比较，*p<0.05，pun高剂量治疗组与ovx组相比，差异有统计学意义（**p<0.01）。见图7。

3.2trap染色结果

trap染色阳性区域为紫红色，ovx组可见大片紫红色区域，这表明ovx组骨组织内有大量成熟破骨细胞存在；sham组仅见极少量紫红色阳性区域；给药后(ovx+low-pun组、ovx+highpun组)深染区域明显减少，仅可见少量紫红色阳性区域。见图8。

光镜下计数结果显示ovx组trap阳性细胞为96±14，与sham组（25±6）相比，**p<0.01；而pun低浓度和高浓度治疗组trap细胞数分别为58±13，36±9。pun高剂量治疗组与ovx组相比，差异有统计学意义（**p<0.01），pun低剂量治疗组与ovx组相比，差异有统计学意义（**p<0.01）。见图9。

4免疫组化检测

免疫组化结果显示，rankl的表达量在光学显微镜下观察，见图10。与sham组（9±5）比较，ovx组（52±12）rankl表达量明显增加，差异有统计学意义（**p<0.01）。pun治疗后，rankl表达量分别为32±7（low-pun组），13±6（high-pun组），pun高剂量治疗组与ovx组相比，差异有统计学意义（**p<0.01），pun低剂量治疗组与ovx组相比，差异有统计学意义（*p<0.05）。见图11。

进一步进行ctsk表达量的测定，见图12，与sham组（14±6）相比，ovx组（61±9）ctsk表达量明显增加，差异有统计学意义（**p<0.01）。pun治疗后，ctsk表达量分别为39±7（low-pun组），21±6（high-pun组），pun高剂量治疗组与ovx组相比，差异有统计学意义（**p<0.01），pun低剂量治疗组与ovx组相比，差异有统计学意义（**p<0.01）。见图13。

将以上测试结果总结如下：

本发明结果表明，ovx组与sham组相比，股骨骨密度、骨体积分数、松质骨骨小梁数量明显减少（**p<0.01）；松质骨平均骨小梁分离度明显增大（**p<0.01），成熟破骨细胞数量增多（**p<0.01）；pun治疗组中松质骨平均骨小梁分离度明显减少，骨密度、骨体积分数、松质骨骨小梁数量明显增加，骨质疏松程度明显减轻，成熟破骨细胞数量减少，与ovx组比较差异有统计学意义（*p<0.05），尤其在高剂量治疗组作用更明显（**p<0.01）。

免疫组化结果显示，在sham组rankl的浓度及ctsk的浓度较低；在ovx组，rankl的含量及ctsk的含量急剧增加，与sham组相比，**p<0.01；在pun治疗组，rankl及ctsk的含量随着pun浓度的增加显著下降。

综上所述，经以上测试结果得出以下结论：

本实验通过安石榴苷（pun）灌胃给药的方式干预小鼠去卵巢骨质疏松模型，结果表明治疗组股骨骨量丢失程度减轻，成熟破骨细胞数减少，rankl、ctsk表达量减低，尤以高剂量治疗组作用更为明显，可以明显减少成熟破骨细胞数量，抑制雌激素缺乏引起的骨质疏松并降低rankl、ctsk在骨组织的表达。证明pun对雌激素缺乏引起的骨质疏松有一定的治疗作用，且高剂量的作用较为明显。

本发明人推测pun对雌激素缺乏引起的骨质疏松的作用机制可能与其抑制rankl及破骨细胞活化有关。rankl是由成骨细胞分泌，对于破骨细胞活化起重要作用，是调控破骨细胞活化的关键因子。在本实验中，pun能够强有力的抑制rankl的表达，这与本实验中治疗组小鼠骨组织中rankl表达量降低相符合。近年来认为绝经后由于雌激素缺乏，引起rankl诱导的破骨细胞活化被认为对骨质疏松的发生发展起主要作用，本实验中治疗组小鼠骨组织rankl含量表达减少，与ovx组比较，pun治疗组中骨组织成熟破骨细胞数也明显减少，说明pun通过干预rankl通路抑制破骨细胞活化，故本发明人推测pun治疗绝经后骨质疏松的机制可能是通过抑制rankl的表达下调rankl，从而抑制破骨细胞活化，减轻骨质疏松从而起到治疗作用，从而可作为对绝经后骨质疏松进行药物干预的一种新手段。