本发明属于生物医药领域，特别是涉及一种黄酮类单体化合物的医药用途。
背景技术：
：：止痛药在临床上的需求量巨大。目前使用最广泛的是非甾体抗炎药(nsaids)。然而，随着这些药物剂量的增加，会发生严重的消化系统和心血管系统不良反应[1-2]，这限制了这些药物在慢性疼痛中的应用。随着中药现代化的发展，人们试图从这些药物中分离出有效的单体以发挥镇痛作用[3-4]。然而，到目前为止，由于疗效或安全性，这些单体均未用于临床。近年来，一种被称为木犀草苷的黄酮单体引起了人们的关注。木犀草苷常见于忍冬忍冬以及其他植物[5]。根据最近的研究，木犀草苷具有多种生理生化作用，如抗氧化，抗炎，抗菌，抗病毒，抗癌等功能[6-9]。宋方明等。已经报道了木犀草苷对脂多糖(lps)诱导的炎症模型表现出抗炎作用。在这项研究中，木犀草苷减少了炎症细胞因子的分泌，包括由lps介导的巨噬细胞衍生的白介素1β(il-1β)[10]。一些报道表明，木犀草苷可以减轻mcao大鼠的神经系统损伤和脑水肿，并改善脑梗死和组织病理学变化。木犀草苷可显着抑制脑缺血再灌注(i/r)诱导的神经炎症，如大脑中动脉闭塞(mcao)大鼠脑组织中il-1β水平降低所证明的[11]。当子宫被金黄色葡萄球菌浸润时，木犀草苷可以降低体内和体外促炎细胞因子il-1β的表达[8]。1.scarpignatoc,lanasa,blandizzic,lemswf,hermannm,huntrh.safeprescribingofnon-steroidalanti-inflammatorydrugsinpatientswithosteoarthritis:anexpertconsensusaddressingbenefitsaswellasgastrointestinalandcardiovascularrisks.bmcmed.2015；13:55.2.gargallocj,lanasa.isnsaids-relatedgastrointestinaldamagepreventable？jdigdis.2013；14:55-61.3.lij,zhangs,zhour,zhangj,lizf.perspectivesoftraditionalchinesemedicineinpancreasprotectionforacutepancreatitis.worldjgastroenterol.2017；23:3615–3623.4.daisx,zouy,fengyl,liuhb,zhengxb.baicalindown-regulatestheexpressionofmacrophagemigrationinhibitoryfactor(mif)effectivelyforratswithulcerativecolitis.phytotherres.2012；26:498-504.5.linjl,chenjx,zhangzj,xutz,shaozx,wangxb.luteolosideinhibitsil-1β-inducedapoptosisandcatabolisminnucleuspulposuscellsandamelioratesintervertebraldiskdegeneration.frontiersinpharmacology.2019；doi:10.3389/fphar.2019.00868.6.songys,parkcm.luteolinandluteolin-7-o-glucosidestrengthenantioxidativepotentialthroughthemodulationofnrf2/mapkmediatedho-1signalingcascadeinraw264.7cells.foodchem.toxicol.2014；65:70–75.7.qiuf,liz,hel,wangd.hplc-esi-ms/msanalysisandpharmacokineticsofluteoloside,apotentialanticarcinogeniccomponentisolatedfromlonicerajaponicainbeagledogs.biomed.chromatogr.2013；27:311–317.8.wangxy,yuant,yinnn,maxf,zhangzb,zhuz,etal.luteolosideprotectstheuterusfromstaphylococcusaureus-inducedinflammation,apoptosis,andinjury.inflammation.2018；doi:10.1007/s10753-018-0814-7.9.xiongj,lis,wangw,hongy,tangk,luoq.screeningandidentificationoftheantibacterialbioactivecompoundsfromlonicerajaponicathunbleaves.foodchem.2013；138:327–333.10.songfm,weicm,zhoul,qina,yangml,jennifert,etal.luteolosidepreventslipopolysaccharide-inducedosteolysisandsuppressesrankl-inducedosteoclastogenesisthroughattenuatingranklsignalingcascades.journalofcellularphysiology.2017；doi:10.1002/jcp.26084.11.liql,tianzx,wangmh,koujj,wangcl,rongxl,etal.luteolosideattenuatesneuroinflammationinfocalcerebralischemiainratsviaregulationofthepparγ/nrf2/nf-κbsignalingpathway.internationalimmunopharmacology.2019；66:309–316.技术实现要素：本发明的目的旨在提供一种木犀草苷的新用途。具体地说，本发明的第一方面是提供了木犀草苷在制备治疗疼痛的药物中的应用。在一优选例中，所述的木犀草苷是作为唯一的活性成分应用于制备治疗疼痛的药物中。在另一优选例中，所述的疼痛为炎性疼痛。本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。附图说明图1.木犀草苷对雄性(a)和雌性(b)cfa模型小鼠的机械痛觉过敏的影响。cfa建模后，小鼠每天接受一剂木犀草苷。用弗莱毛(vonfreyhair)随时间测量50％爪子缩回阈值的变化。数据表示为平均值±sem。n＝8/组。(**p<0.01，***p<0.001,20mg/kg组v.s.cfa模型组；###p<0.001，40mg/kg组v.s.cfa模型组；$p<0.05，$$$p<0.001，80mg/kg组v.s.cfa模型组。)图2.木犀草苷对雄性(a)和雌性(b)cfa模型小鼠的热痛觉过敏的影响。cfa建模后，小鼠每天接受一剂木犀草苷。随着时间的过去，用hargreaves测试测量了爪退缩潜伏期。数据表示为平均值±sem。n＝8/组。(**p<0.01，***p<0.001,20mg/kg组v.s.cfa模型组；#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001，40mg/kg组v.s.cfa模型组；$p<0.01，$$p<001，80mg/kg组v.s.cfa模型组。)图3.木犀草苷对cfa诱导的雄性小鼠的机械性异常性疼痛持续的镇痛效果。在cfa建模后，小鼠每天接受一剂木犀草苷的治疗，共14天。用弗莱毛(vonfreyhair)随时间测量50％爪子缩回阈值的变化。数据代表平均值±sem.n＝8/组。(**p<0.01，***p<0.001v.s.cfa模型组。)图4.足底(a)，drg(b)，血清(c)和脊髓(d)中il-1β水平在不同时间点的变化。数据表示平均值±sem。n＝4/组。比例尺＝100um。(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。)图5.drg(a)和脊髓(b)中巨噬细胞/小胶质细胞的激活水平。使用imagej对不同组中的ba-1阳性细胞进行计数。数据表示平均值±sem。n＝4/组。比例尺＝100um。(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。)图6.木犀草苷对肝肾细胞细胞系的活力影响。数据表示平均值±sem。组间无统计学差异。具体实施方式本发明的问世是基于这样一个意外发现：木犀草苷在体内均具有良好的镇痛作用。因此，木犀草苷有望开发成为一种促进神经干细胞增殖的药物或保健品。进而，本发明的第一方面是提供了第一方面是提供了木犀草苷在制备治疗疼痛的药物中的应用。较优选地，所述的木犀草苷是作为唯一的活性成分应用于制备治疗疼痛的药物中。较优选地，所述的疼痛为炎性疼痛。如本发明所用，本发明的化合物木犀草苷，分子量448.38，分子式c21h20o11，cas号：5373-11-5，结构式如下：如本领域的普通技术人员所知，本发明的化合物木犀草苷可通过商业途径购买获得，亦可用本领域的常规方法从金银花中提取获得。其纯度均符合药用标准。本发明的木犀草苷可以单独使用或以药物组合物的形式使用。药物组合物包括作为活性成分的本发明的木犀草苷及可药用载体。较佳地，本发明的药物组合物含有0.1～99.9％重量百分比的作为活性成分的本发明的木犀草苷。“可药用载体”不会破坏本发明的木犀草苷的药学活性，同时其有效用量，即能发挥药物载体作用时的用量对人体无毒。所述可药用载体包括但不限于：软磷脂、硬脂酸铝、氧化铝、离子交换材料、自乳化药物传递系统、吐温或其他表面活化剂、血清蛋白、缓冲物质如磷酸盐、氨基乙酸、山梨酸、水、盐、电解质如硫酸盐精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅酸镁、饱和脂肪酸部分甘油酯混合物等。其他常用的药物辅料如粘合剂(如微晶纤维素)、填充剂(如淀粉、葡萄糖、无水乳糖和乳糖珠粒)、崩解剂(如交联pvp、交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素)、润滑剂(如硬脂酸镁)以及吸收促进剂、吸附载体、香味剂、甜味剂、赋形剂、稀释剂、润湿剂等。本发明的木犀草苷以及其药物组合物可按本领域常规方法制备并可以通过肠道或非肠道或局部途径给药。口服制剂包括胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等；非肠道给药制剂包括注射液等；局部给药制剂包括霜剂、贴剂、软膏剂、喷雾剂等。优选为口服制剂。本发明的木犀草苷以及其药物组合物的给药途径可以为口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、皮肤粘膜、静脉、尿道、阴道等。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。一、实验动物使用12-14周龄的雄性和雌性c57bl/6小鼠。小鼠被饲养在上海健康医学院(sumhs)动物房中。所有实验均按照国际准则进行，并获得上海健康医学院动物伦理委员会的批准。所有实验均以盲法进行。二、药品关节炎疼痛模型造模使用足底内注射完全弗氏佐剂(cfa，sigma-aldrich，10μl)。将木犀草苷(hplc≥98％，上海远野生物技术有限公司)溶解在1％dmso(sigma-aldrich)中，并通过腹腔注射给药，给药体积0.1ml/10g体重，不同剂量组药物终浓度分别调整为20、40和80mg/kg。所有药物均在实验前新鲜制备。三、机械和热痛觉阈值测定使用vonfrey毛测量机械痛阈值。简而言之，在实验之前，将小鼠在没有任何伤害性刺激的情况下暴露于设备中1-2h/d，持续3天。在第3天，在测试前15-20分钟将小鼠置于测试环境中。在3天后确定基线反应，并使用上下法计算50％的爪子缩回阈值。通过使用hargreaves辐射加热装置(iitclifescience)测量爪子的撤离潜伏期(pwl)来确定热痛觉过敏。选择光束的强度以在基线处引起大约10秒的散热时间。设定的截止时间为15s，以防止组织损伤。四、drg和脊髓的免疫荧光染色用过量的戊巴比妥钠对小鼠进行深度麻醉，并先后用pbs和4％多聚甲醛经心灌注，然后收集腰椎drg(l3-l5)和脊髓(扩大)。将组织在4％多聚甲醛中固定4小时，然后在4℃下在pbs中的20％蔗糖中冷冻保护，然后在pbs中30％的蔗糖中冷冻过夜。然后将组织包埋在oct化合物中并在-80℃冷冻。将drg和脊髓的冰冻切片(14μm)分别用0.01mpbs和0.03％pbstritonx-100洗涤，然后与5％牛血清白蛋白(bsa，vwrlifescience)在室温下孵育2h。然后在4℃下分别与兔抗iba-1(1：200，abcam)或兔抗il-1β(1：200，abcam)孵育过夜。用0.03％pbst洗涤后，将切片与alexafluor-488驴抗兔抗体(1：500，invitrogen)一起孵育。用dfc450c(leicamicrosystemsltd.)对切片进行切片，所有载玻片的曝光时间相同。用nihimagej分析drg和脊髓中iba-1阳性染色细胞的数量。同时，以固定的曝光时间拍摄drg和脊髓中的il-1β染色，并使用nihimagej分析il-1β的表达水平。所有组的染色均平行进行。在计算il-1β染色之前，减去对照染色切片的平均背景荧光。五、酶联免疫吸附测定(elisa)在不同的时间点获得足底组织和血清，并将其立即浸入液氮中。将样品储存在-80℃直至分析。根据试剂盒说明书，使用elisa试剂盒(il-1β，r&dsystems)对足底组织和血清样品进行il-1β水平测量。使用插值法从一系列标准il-1β浓度创建的标准曲线计算结果。六、木犀草苷对肝源和肾源细胞的活力影响将肝源细胞系(hepg2和huh7)和肾源细胞系(hek293)细胞用含10％胎牛血清的dmem培养液培养于96孔板，每孔接种1x104个细胞，各三个复孔，传代接种后24小时加入指定浓度(分别为：对照组为0，40ng/μl和400ng/μl处理组)的木犀草苷溶液处理48小时。木犀草苷以1％dmso配成1000倍母液，临用前以dmem稀释，并加入细胞培养孔。培养48小时后，去细胞上清，以无菌pbs清洗3遍，加入dmem按照1：10稀释的cck8(东仁化学)，37度培养30分钟，参照说明书检测(分光光度计检测od450值)，设定对照组为100％，其余数值取与对照百分比，以平均值±sem表示。七、数据统计数据表示为平均值±sem。使用单向或双向方差分析进行统计分析，然后进行bonferroni分析。小于0.05的p值被认为具有统计学意义。八、实施例：1.木犀草苷对关节炎模型疼痛产生镇痛作用。足底内注射cfa在小鼠中引起炎症性痛觉过敏。足底皮下内注射cfa后，小鼠的50％疼痛阈值不断降低。单剂量给予木犀草苷后，雄性(图1a)和雌性(图1b)小鼠在施用木犀草苷后2小时，机械疼痛阈值的降低都显着改善并达到其峰值效果，而木犀草苷的这种镇痛作用在6小时后减弱。与机械性异常性疼痛的结果相似，在hargreaves试验中，木犀草苷可延长爪子的退缩潜伏期，显示出对热痛觉过敏的镇痛作用。一剂给药后，潜伏期显着迅速延长，并在2小时达到峰值，而木犀草苷的镇痛作用在雄性(图2a)和雌性(图2b)中均在6小时后减弱。大约连续13天给药(每天一剂)后，除了cfa疼痛模型小鼠的机械性异常性疼痛，木犀草苷还显示出持续的镇痛作用，除了其快速而短暂的作用。尽管镇痛作用在6小时后仍像以前一样减弱，但50％的疼痛阈值仍高于模型对照组，表明木犀草苷的镇痛作用得以维持(图3)。这些结果表明，在这些cfa疼痛模型小鼠中，单剂量的木犀草苷在给药后2小时内产生了快速且短暂的镇痛作用。经反复给药，木犀草苷具有更明显的镇痛作用，且持续时间更长。2.木犀草苷抑制cfa诱导的炎症后il-1β的释放il-1β是重要的炎症因子，与疼痛有关。为了检验我们的假设，即木犀草苷通过抗炎作用产生镇痛作用，在不同的时间点和不同的组织中测定了il-1β的水平。注射cfa后，足底(图4a)和背根神经节(drg，图4b)中il-1β的释放迅速增加，持续超过14天。同时，血清(图4c)和脊髓(图4d)中il-1β的水平逐渐升高，并在14天后达到峰值，表明炎症从局部组织和伤害性神经逐渐扩散到全身和中枢神经系统。木犀草苷抑制cfa模型后il-1β的释放，表明木犀草苷具有抗炎作用。木犀草苷给药后第3～7天的结果表明，在药物治疗的初始阶段抑制作用较弱。模型组和木犀草苷组之间的足底(图4a)，drg(图4b)和脊髓(图4d)之间无显着差异。随着给药时间的增加，il-1β释放的抑制作用变得更加明显。在第14天(连续一天一次)，木犀草苷处理后，足底(图4a)，血清(图4c)，尤其是drg(图4b)和脊髓(图4d)中所有il-1β的水平均降低，这表明木犀草苷抗炎作用的积累。3.木犀草苷可迅速而短暂地抑制drg中巨噬细胞/小胶质细胞的活化，从而起到镇痛作用行为实验的数据表明，木犀草苷在每次给药后2小时产生快速而短暂的镇痛作用，并在6小时后减弱。木犀草苷的累积抗炎作用无法解释这种表型，因此我们认为木犀草苷除了具有抗炎作用外还通过多种机制发挥镇痛作用，然后检查了巨噬细胞/小胶质细胞的激活作用，结果表明cfa模型后，drg中的iba-1迅速增加并持续了很长时间。令人惊讶的是，在木犀草苷治疗的初始阶段(第3天)，单剂木犀草苷治疗2小时后iba-1的表达显着降低，而6小时后又再次升高。连续给药14天后，木犀草苷可连续降低drgs中iba-1的表达达6小时(图5a)。木犀草苷在初始阶段对脊髓中iba-1的表达没有影响。直到重复给药14天后，木犀草苷才显着抑制脊髓中的iba-1水平(图5b)。4.木犀草苷不影响肝肾细胞的活力，有较高的安全性本研究利用细胞模型，检测了木犀草苷的肝肾毒性。利用不同剂量的木犀草苷处理肝源细胞系(hepg2和huh7细胞)和肾源细胞系(hek293细胞)，经cck8试剂检测，与对照组相比，均未对细胞活性产生影响，证明其对肝肾细胞的安全性。(图6)九、实验结论1.木犀草苷具有镇痛作用2.木犀草苷通过抗炎和抑制巨噬细胞/小胶质细胞的活化发挥镇痛作用。3.木犀草苷具有较低的肝肾毒性，安全性较高。鉴于慢性疼痛与炎症及免疫细胞的密切关系，木犀草苷通过抗炎和抑制巨噬细胞/小胶质细胞的激活发挥镇痛作用，从而具有潜在的临床应用前景。本发明所涉及的多个方面已做如上阐述。然而，应理解的是，在不偏离本发明精神之前提下，本领域专业人员可对其进行等同改变和修饰，所述改变和修饰同样落入本申请所附权利要求的覆盖范围。当前第1页1 2 3 当前第1页1 2 3