一种热炎宁联合抗生素在干预抗病原菌的抗菌作用中的应用的制作方法

技术领域：

本发明涉及一种中药制剂联合抗生素的应用方法，尤其是涉及一种热炎宁联合抗生素在干预抗病原菌的抗菌作用中的应用。

背景技术：
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耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)是造成社区获得性感染和医院内感染的主要致病菌。mrsa感染发病率和死亡率高，已成为一个主要的公共卫生问题。万古霉素(vancomycin,van)是治疗mrsa感染的首选药，其疗效正在下降。头孢西丁(cefoxitin,fox)曾经是治疗mrsa的一线药物，由于长期大量使用，其对mrsa的敏感性下降，虽然目前临床上已不用于mrsa的治疗，但因其安全性高、价格便宜等特点，临床上仍广泛应用于感染性疾病的治疗。利奈唑胺(lnz)是一种用于治疗mrsa的临床一线抗生素，最近已出现抗药性报道。联合用药是当前治疗疾病的主流趋势，中药与抗生素联用具有有效应对mrsa感染的潜力。中药具有多成分、多靶点、整体性的特征，用于治疗感染性疾病已有几千年的历史。研究表明中药与某些抗生素联用治疗mrsa感染发挥协同增效的作用，能够提高抗生素的敏感性、增强疗效。热炎宁(reyanning,ryn)是临床上治疗上呼吸道感染的一线药物，由蒲公英、虎杖、北败酱、半枝莲组成，具有清热解毒、活血祛瘀、消痈散结、消肿止痛等功效。

技术实现要素：
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本发明的目的在于提供一种热炎宁联合抗生素在干预抗病原菌的抗菌作用中的应用，其克服了现有技术中中药制剂、抗生素单独使用产生抗药性、效果不佳的问题，热炎宁与抗生素头孢西丁、利奈唑胺联用发挥协同作用，为临床上采用中药制剂和抗生素联合治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染提供指导。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种热炎宁联合抗生素在干预抗病原菌的抗菌作用中的应用。

一种用于抗病原菌的热炎宁联合抗生素。

一种热炎宁联合抗生素在制备抗病原菌的联合用药物中的用途。

所述病原菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

所述抗生素为头孢西丁或利奈唑胺。

热炎宁采用蒲公英、虎杖、北败酱和半枝莲的水提取物制得，蒲公英、虎杖、北败酱和半枝莲的重量比为1～3:1～3:1～3:1。

热炎宁为热炎宁合剂、热炎宁颗粒或热炎宁片剂，抗生素为口服剂或注射剂。

热炎宁合剂稀释倍数为1:8，头孢西丁浓度为4mg/ml时为两药联用的最低抑菌浓度；1/8mic热炎宁合剂与1/2mic利奈唑胺的组合较每种单一药物具有更强的抑菌效果

与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：

1、本发明通过网络药理学预测和体外细菌实验确认，在药物干预mrsa中，ryn与van联用出现拮抗作用与gαisignaling相关；ryn与fox联用出现协同作用，其机制与mrsa致病因子sara和atl，及glucocorticoidreceptorsignaling相关。本发明为临床上ryn联合fox治疗mrsa感染提供指导，也开辟了中西药联用治疗感染性疾病的新思路和新方法。

2、本发明为ryn和lnz对游离mrsa和mrsa生物膜的协同作用提供了体外证据，并揭示了它们的最佳联用剂量，从而为mrsa联合治疗奠定了基础。多组分，多靶点的中药复方联合抗生素的使用将成为对抗mrsa感染的有前途的策略。

附图说明：

图1为ryn、fox和van网络映射mrsa网络的作用点图；

图2为ryn网络和van网络分子对gαisignaling的调控图(箭头实线代表van、虚线代表ryn；箭头向上代表促进、向下代表抑制)；

图3生物膜形成中单用和联用对mrsa的lnz和ryn的抑制率图；

图4为mrsa生物膜的clsm分析图。

具体实施方式：

本发明为一种热炎宁联合抗生素在干预抗病原菌的抗菌作用中的应用，病原菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，抗生素为头孢西丁或利奈唑胺。热炎宁采用蒲公英、虎杖、北败酱和半枝莲的水提取物制得，蒲公英、虎杖、北败酱和半枝莲的重量比为1～3:1～3:1～3:1。热炎宁为热炎宁合剂、热炎宁颗粒或热炎宁片剂，优选热炎宁合剂。抗生素为口服剂或注射剂。热炎宁合剂稀释倍数为1:8，头孢西丁浓度为4mg/ml时为两药联用的最低抑菌浓度；1/8mic热炎宁合剂与1/2mic利奈唑胺的组合较每种单一药物具有更强的抑菌效果

实验例一：

1材料

1.1药物靶蛋白和mrsa相关基因

从《中药大辞典(第二版)》查找ryn中蒲公英、虎杖、北败酱、半枝莲的化学成分；在中药系统药理学分析平台(tcmsp)中，根据各个成分的adme(absorption,distribution,metabolism,excretion)性质确定具有成药性的活性成分；从pubchem数据库中检索这些活性成分对应的人类靶蛋白。查找到蒲公英、虎杖、北败酱、半枝莲的靶蛋白各103，256，45，97个。在chembl、etcm和pubchem数据库检索van和fox的靶蛋白，剔除非实证获得和重复者，入选van靶蛋白134个，fox靶蛋白65个；在ensemblbacteria、uniprot和pubmed数据库中检索mrsa致病相关基因，剔除重复者，共入选80个基因。

1.2细菌实验材料

热炎宁(reyanning,ryn国药准字z20050493)由清华德人西安幸福制药有限公司提供；头孢西丁(cefoxitin,fox)购于中国食品药品检定研究所；注射用盐酸万古霉素(vancomycin,van批号no.657)，日本elilillyjapank.k,seishinlaboratories公司产品；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(atcc43300)购自美国atcc公司。

胰蛋白胨(lp0024)和酵母提取物(lp0021)为英国oxoid公司产品；ttc(17779-10x10ml-f)为美国sigma公司产品；baclight^tmbacterialviabilitykit(l-7012)为美国invitrogen公司产品；恒温恒湿培养箱由上海森信实验仪器有限公司生产；高压灭菌锅由日本三洋企业生产；分光光度计为上海美谱达仪器厂生产。

2方法

2.1ryn、van和fox干预mrsa的作用和机制预测

参考以往的类似研究，把ryn、van、fox的靶蛋白及mrsa相关基因进行格式归一化处理，然后导入ipa网络分析平台，采用networkanalysis功能模块构建药物靶蛋白网络和mrsa基因网络，通过网络的映射分析，发现ryn、van和fox干预mrsa的相关靶点和通路。

2.2药物最低抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration,mic)测定

从mrsa平板中挑取单菌落置于3mllb培养基，并于37℃,280r/min震摇过夜。次日取出菌液，用lb培养基将上述菌液稀释至a600＝0.02，采用96孔板微量肉汤稀释法分别测定ryn、van和fox单用对mrsa的最低抑菌浓度(mic)。取无菌96孔板，采用倍比稀释的方法将药液稀释成一定成浓度，其中ryn的浓度梯度范围为1/2-1/1024药物原液，van的浓度梯度范围为128-0.25mg/l，fox的浓度梯度128-0.25mg/l，每孔加入100ul稀释好的药液，每个浓度设置三个复孔，另外每孔再加入100ula600＝0.02的菌液，总体积200ul。同时设置阴性对照孔和阳性对照孔，其中阴性对照孔加入200ullb培养基，阳性对照孔加入200ula600＝0.02的菌液。于37℃恒温恒湿培养箱培养24小时候后加入0.25％的ttc溶液30ul，于上述条件继续培养30min，通过肉眼观察培养孔内的颜色，当呈现红色时，表示孔内有细菌生长，孔内出现无色时的最小浓度即为细菌生长的最低抑制浓度(mic)。另外，基于ryn本身颜色过深，采用细菌划板的方法判读，分别挑取热炎宁不同浓度的孔进行划板，37℃恒温恒湿箱培养24h后，肉眼观察小于5个单菌落的最低浓度则被判定为最低抑菌浓度(mic)，上述实验均重复三次。

2.3棋盘法联合药敏实验测定

采用倍比稀释的方法分别将ryn、van和fox稀释成一定浓度梯度。取无菌96孔板，从左到右依次将ryn的浓度从1:1倍比稀释至1/64原液，每孔加入50ul稀释液；从上到下依次将van从1:1倍比稀释成浓度梯度为16—0.25mg/l，每孔加入50ul；最后每孔再加入100ula600＝0.02的菌液，使总体积保持在200ul。同时分别设置ryn、van各个浓度单用孔和只加200ul培养基的质控孔。同理，按照上述方法制备ryn与fox联用的96孔板，上述实验均重复三次。

2.4分数抑制指数(fic)计算

∑fic＝fica+ficb，其中fica＝mica药联用/mica药单用，ficb＝micb药联用/micb药单用[13]。根据欧洲抗菌药物敏感性试验委员会(eucast，2010)评估标准[14]如下:当fic指数≤0.5，表示两药联用为协同作用；当fic指数＞0.5且≤1，表示两药联用为相加作用；当1＜fic指数≤2，表示两药联用为无关作用；当fic指数＞2，则表示为拮抗作用。

3结果

3.1ryn、van和fox干预mrsa的作用和机制

ryn网络和fox网络映射mrsa网络的共同作用点是sara(staphylococcalaccessoryregulatora)和atl(autolysins)，ryn网络通过26sproteasome与fox网络相连(图1)；最显著相关的生物通路是glucocorticoidreceptorsignaling，两药对其调节方向一致(表1)，提示两药可能存在协同作用。ryn网络和van网络针对mrsa网络没有共同作用点，最显著相关的生物通路是gαisignaling(图1和表2)。在gαisignaling中，ryn网络分子等上调，而van网络分子等下调，提示两药可能存在拮抗作用(图2)。

表1fox网络和ryn网络相关信号通路及其被激活的状态

表2van网络和ryn网络相关信号通路及其被激活的状态

3.2药物最低抑菌浓度(mic)测定结果

mic测定结果，当ryn浓度为1/2原液时，孔内的细菌被完全抑制生长，即表示其mic为1/2；当van的浓度为4mg.l^-1时，孔内的细菌被完全抑制生长，即表示其mic为4mg.l^-1；当fox的浓度为32mg.l^-1时，孔内的细菌被完全抑制生长，即表示其mic为32mg.l^-1。

3.3棋盘法药敏实验测定结果

如表3、表4所示，ryn与van联用时，fic＝3，表现为拮抗作用；ryn1/8原液浓度与fox4mg.l^-1为两药联用的mic值，fic＝0.375，表示两药联用为协同作用。

注：孔内无细菌生长记为阴性，即“-”；孔内有细菌生长记为阳性，即“+”

表3热炎宁联合万古霉素对mrsa的mic

注：孔内无细菌生长记为阴性，即“-”；孔内有细菌生长记为阳性，即“+”

表4热炎宁联合注射用头孢西丁对mrsa的mic

实验例二：

目的：探讨ryn和lnz联合作用对mrsa的协同效应。

方法：采用微量肉汤稀释法测定ryn和lnz对游离mrsa菌株的最低抑菌浓度(mics)。采用棋盘法研究了ryn与lnz的抗菌作用。通过2,3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2h-四唑-5-甲酰苯胺(xtt)还原方法检测生物膜中的mrsa。在生物膜的发育和形成中观察两种药物的抗生物膜效应。使用激光共聚焦扫描显微镜观察给药后生物膜中用syto9染色的活细胞。

结果：mrsa菌株对ryn敏感，mic值为1/2，而lnz的mic值为4μg/ml。ryn通过降低其mic来显着增强测试抗生素的活性。lnz的抑菌效果在0h时比ryn更显著，而ryn在6h时的抑菌效果比lnz更显著。1/8micryn和1/2miclnz的组合比每种单一药物具有更强的抑菌效果(图3)，图3为生物膜形成中单用和联用对mrsa的lnz和ryn的抑制率。与对照组相比，单用和联用的ryn和lnz的作用在统计学上是具有显著性差异(**p<0.01)。0h时2μg/mllnz组优于1/16ryn组，6h后1/16ryn组抑制率均大于2μg/mllnz组。2μg/mllnz+1/16ryn组在各时间点的抑制率均高于两种药物单用。

ryn组中的活菌数明显低于lnz组(图4)，图4为mrsa生物膜的clsm分析。不同给药组作用于成熟生物膜mrsa，包括(a)对照组，(b)2μg/mllnz组，(c)1/16ryn组，和(d)2μg/mllnz+1/16ryn组。比例尺＝5μm。mrsa生物膜用syt09染色，并用clsm以10倍的放大倍数观察。(a)mrsa成熟生物膜表面粗糙，荧光值信号强，表明生物膜中的活菌活性高；(b)荧光信号与(a)大致相同，生物膜的厚度基本不变，体积没有显着变化；(c)，(d)荧光信号减弱，生物膜厚度显着减少，表面分布松散。

mrsa是临床上常见的致病菌，自1961年英国科学家首次发现后，相继在日本、澳大利亚、美国等国家出现，至今已经遍及全世界。以mrsa感染为主的医院和社区感染性疾病发病率和死亡率居高不下，已经成为全球难题。尽管万古霉素仍然是最有效的抗mrsa药物之一，但它有许多不良反应，如低血压、静脉炎、肾毒性、耳毒性、过敏反应、中性粒细胞减少症等；而且自上世纪九十年代以来，临床上已经出现了大量的耐万古霉素的mrsa菌株。头孢西丁属于头霉素类抗生素，具有高度抗β-内酰胺酶性质，临床上也被用于治疗mrsa，有研究报道，其与多种β-内酰胺结合可增强其体外抗ca-mrsa菌株的活性。热炎宁是临床治疗金黄色葡萄球菌感染的常用药，具有抑杀mrsa的潜力。联合用药是目前治疗复杂疑难疾病的主流趋势，中药与抗生素联用有望用于治疗mrsa感染。本发明采用网络药理学方法和体外细菌实验探讨热炎宁分别与万古霉素、头孢西丁联用对抗mrsa的抗菌效应及机制。发现sara和atl是ryn和fox针对mrsa的共同作用点，与glucocorticoidreceptorsignaling相关，ryn网络通过26sproteasome与fox网络相连，提示两药可能存在协同作用；ryn和van针对mrsa没有共同作用点，与gαisignaling相关，两药对其调节作用相反，提示两药可能存在拮抗作用。细菌实验发现热炎宁与万古霉素联用表现出拮抗作用，而与头孢西丁联用表现出协同作用。

sara是与毒力因子调控有关的核心元件之一，在mrsa生物被膜形成过程中起着重要的作用。atl是由atl基因编码的一种水解酶，可以导致金黄色葡萄球菌的细胞分裂和细胞自溶。糖皮质激素受体(gr)是一种转录因子，参与调节许多复杂的信号通路。研究表明，通过下丘脑-垂体-肾上腺轴合成的糖皮质激素对宿主抵抗内毒素至关重要。此外，糖皮质激素对革兰氏阳性和阴性脓毒症具有保护作用。通过作用于sara、atl及glucocorticoidreceptorsignaling可能是ryn和fox对mrsa发挥协同抗菌作用的机制。26sproteasome是位于泛素-蛋白酶体系统(ups)中心的26s蛋白酶体，几乎参与了所有真核生物的细胞过程。研究发现，结构上与26s蛋白酶体相似的clpq与其atp酶配偶clpy结合形成双组分蛋白酶clpyq，在高温条件下可以促进金黄色葡萄球菌的生长。ryn可能通过抑制26sproteasome表达而影响fox的网络功能，从而增强抗mrsa的作用。gαisignaling是调控金黄色葡萄球菌诱导的炎症细胞因子和趋化因子表达的重要信号通路。ryn和van的网络分子对其调节作用相反，提示两药拮抗作用的发生可能与gαisinaling有关。这些结果为进一步ryn分别与fox和van联用干预mrsa感染机制探索奠定了基础。此外，万古霉素分子结构中含有酰胺键、酚羟基、羧基等基团，易发生自身水解使活性下降，或者其自身的酚羟基、羧基等与热炎宁化学成分中的咖啡酸、大黄蒽醌、虎杖苷、黄酮等发生中和反应，从而改变药物自身结构也可能是两药联用活性降低从而出现拮抗作用的原因。