NSC228155在制备防治慢性肾纤维化药物中的用途的制作方法

本发明属于医药领域，具体涉及化合物nsc228155在制备防治慢性肾纤维化药物中的用途。

背景技术：

慢性肾脏病(chronickidneydisease，ckd)是世界性的公共健康问题，根据不同地区的流行病学调查结果，发病率在8％-16％之间。在我国，约有1.2亿人患有ckd。几十年来，虽然人们对ckd发病机制及干预策略进行了广泛的探索，但到目前为止，对慢性肾脏病的防治仍缺乏有效手段，相当一部分ckd患者最终进展为终末期肾脏病，需要昂贵的肾脏替代治疗，给家庭和社会带来极大负担。慢性肾脏病虽然病因复杂，但是最终的共同病理发展方向是肾小管间质纤维化，纤维化程度也是影响ckd预后的重要指标。寻找阻断肾小管间质纤维化发生和进展的有效药物是目前肾脏病领域亟待解决的问题。

肾间质纤维化是一个复杂的动态过程，主要涉及肾间质成纤维细胞的活化和肾小管上皮细胞损伤与纤维化。肾间质成纤维细胞在活化后可产生大量的细胞外基质，直接导致了肾间质纤维化。肾小管上皮细胞(renaltubularepithelialcell,rtec)作为具有旺盛的代谢活性和潜在的增殖能力的肾脏固有细胞，在疾病状态下极易发生功能和结构损伤。目前认为，非致死性受损的rtec可经历适应不良的修复过程(maladaptiverepair)，在修复过程中活化增殖，异常合成细胞外基质蛋白，并分泌多种趋化因子和生长因子。因此异常活化的肾小管上皮细胞是介导肾间质纤维化的关键环节，也是肾功能受损的主要原因。

nsc228155的化学结构为：

化合物nsc228155在无细胞试验体系中被发现可抑制泛素化e3连接酶wwp2泛素化活性。由于无细胞试验体系的复杂程度相比于细胞实验和动物实验较低，nsc228155在肾脏疾病中的药理活性和作用机制需要通过动物实验和系统的细胞实验结果进行验证。本研究从体内和体外实验证明nsc228155可通过抑制wwp2抑制肾间质成纤维细胞活化和减轻肾小管上皮细胞纤维化来防治慢性肾纤维化。目前尚无nsc228155用于慢性肾纤维化治疗的任何报道。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供了nsc228155在制备防治慢性肾纤维化药物中的用途，所述的这种用途解决了现有技术中尚未发现nsc228155在肾脏疾病中的药理活性及缺乏足够合适的药物用于抑制肾间质成纤维细胞活化、逆转肾小管上皮细胞纤维化、治疗慢性肾纤维化的技术问题。

特别是，nsc228155在制备针对慢性肾纤维化患者的抑制肾间质纤维化和肾小管保护作用的药物中的应用，从而为慢性肾纤维化治疗提供一种新的候选化合物。

上述所说的应用，具体的可以是nsc228155显著降低慢性肾纤维化患者的肾纤维化病理、抑制成纤维细胞活化、保护肾小管、逆转肾小管纤维化、减轻炎症。

而且，可以是将nsc228155制成防治慢性肾纤维化药物的组合物。

我们采用单侧输尿管结扎(uuo)模型诱导的肾纤维化小鼠模型上使用nsc228155，来探讨其对肾间质纤维化的保护作用及其机制。结果发现，对uuo模型中出现的慢性肾纤维化使用nsc228155进行干预治疗，可显著减轻小鼠肾间质纤维化和炎性反应。nsc228155可抑制肾间质成纤维细胞的活化，减少肾小管上皮细胞在组织生长因子(tgf-β1)刺激下的纤维化过程，并降低促炎细胞因子的释放，从而起到减少肾间质纤维化，改善肾脏病理损伤的作用。我们的发现将极有可能为防治慢性肾纤维化提供新的有效治疗药物。因此，nsc228155应用于抑制肾间质成纤维细胞活化及肾小管上皮细胞保护，特别是减轻慢性肾纤维化患者的肾间质纤维化程度具有显著效果。

由此，我们提供了nsc228155在制备防治慢性肾纤维化的药物中的用途；nsc228155在制备抑制肾间质成纤维细胞活化的药物中的用途；nsc228155在制备肾小管上皮细胞保护的药物中的用途；nsc228155在制备抑制泛素化e3连接酶wwp2的药物中的用途。

附图说明

图1显示治疗剂量的nsc228155对小鼠和人肾小管上皮细胞hk-2无毒副作用。

图1a显示nsc228155在体内治疗剂量2.5mg/kg下不影响正常小鼠肾功能标志物血清尿素氮的浓度；

图1b显示nsc228155在体内治疗剂量2.5mg/kg下不影响正常小鼠肾功能标志物血清肌酐的浓度；

图1c显示nsc228155在体内治疗剂量2.5mg/kg下不影响正常小鼠肝功能标志物血清谷丙转氨酶的浓度；

图1d显示nsc228155在体内治疗剂量2.5mg/kg下不影响正常小鼠肝、心功能标志物血清谷草转氨酶的浓度；

图1e显示nsc228155在体内治疗剂量2.5mg/kg下不影响正常小鼠心功能标志物血清乳酸脱氢酶的浓度；

图1f显示nsc228155在体内治疗剂量2.5mg/kg下不影响正常小鼠心功能标志物血清肌酸激酶的浓度；

图1g显示nsc228155在体内治疗剂量2.5mg/kg下不影响对正常小鼠肾病理；

图1h显示nsc228155在体外治疗剂量0.625μm不影响肾小管上皮细胞hk-2的增殖。

图2显示了nsc228155可改善小鼠uuo模型中的病理，显示马松染色表明nsc228155减轻了uuo模型中的肾间质纤维化；

图3显示了在小鼠uuo模型中，nsc228155降低了肾脏组织中纤维化指标的表达水平。

图3a显示了nsc228155显著降低了uuo模型中上升的纤维化指标fibronectin的mrna表达水平；

图3b显示了nsc228155显著降低了uuo模型中上升的纤维化指标α-sma的mrna表达水平；

图3c显示了nsc228155显著降低了uuo模型中上升的纤维化指标collageni的mrna表达水平；

图3d显示了nsc228155显著降低了uuo模型中上升的纤维化指标collageniii的mrna表达水平；

图3e显示了nsc228155显著降低了uuo模型中上升的纤维化指标α-sma的蛋白水平。

图4显示了在小鼠uuo模型中，nsc228155降低了肾脏组织中炎性因子的表达和巨噬细胞的浸润。

图4a显示了通过巨噬细胞标记物f4/80进行免疫组化学检查，发现nsc228155显著降低了uuo模型中巨噬细胞的浸润；

图4b显示了nsc228155显著降低了uuo模型中上升的炎性因子il-6的mrna表达水平；

图4c显示了nsc228155显著降低了uuo模型中上升的炎性因子il-1β的mrna表达水平；

图4d显示了nsc228155显著降低了uuo模型中上升的炎性因子tnf-α的mrna表达水平；

图4e显示了nsc228155显著降低了uuo模型中上升的巨噬细胞标记物cd206的mrna表达水平。

图5显示了在体外培养nrk-49f肾间质成纤维细胞系中，nsc228155降低了tgf-β诱导的成纤维细胞的激活和细胞外基质fibronectin的表达。

图5a显示nsc228155显著降低了tgf-β诱导的成纤维细胞表达细胞外基质fibronectin的蛋白水平；

图5b显示nsc228155显著降低了tgf-β诱导的成纤维细胞表达纤维化指标α-sma的mrna水平；

图5c显示nsc228155显著降低了tgf-β诱导的成纤维细胞表达纤维化指标collageni的mrna水平；

图5d显示nsc228155显著降低了tgf-β诱导的成纤维细胞表达纤维化指标collageniii的mrna水平。

图5e显示过表达wwp2可进一步加重tgf-β1诱导的fibronectin蛋白水平上升，nsc228155处理可抑制wwp2对纤维化的促进作用。

图6显示nsc228155在小鼠肾脏组织和肾间质成纤维细胞中均显著抑制了wwp2的活性

图6a显示nsc228155处理显著升高了小鼠肾脏皮质组织中经由wwp2介导降解的下游底物pten的蛋白水平；

图6b显示nsc228155处理显著升高了肾间质成纤维细胞中经由wwp2介导降解的下游底物pten的蛋白水平。

图7显示了在体外培养人肾小管上皮细胞hk-2中，nsc228155降低了tgf-β诱导的纤维化指标fibronectin的表达，且其机制是通过抑制wwp2的hect催化结构域的催化活性。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明实施例中所使用的生物材料和试剂，如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1治疗剂量的nsc228155对小鼠和细胞无毒副作用

1实验材料与方法

1)小鼠的给药、饲养与取材

本发明使用的c57bl/6种属雄性小鼠(购买时7周龄，体重20-24g)购自南京医科大学实验动物中心，饲养于南京医科大学实验动物中心spf级屏障环境中，动物自由进食，维持12小时光照和12小时黑暗的昼夜节律。实验室温度：20-25℃，湿度50±5％。小鼠在适应性饲养1周后随机分为对照组(n＝10)和nsc228155组(n＝10)。

本发明使用nsc228155(纯度≥99％)购自selleck公司。给药前采用溶媒(5％dmso，35％peg-300，65％无菌生理盐水)稀释至0.25mg/ml。给药组小鼠剂量为2.5mg/kg，通过腹腔注射进行给药，给药体积为每10g体重给0.1ml；对照组小鼠腹腔注射给予同样体积的上述溶媒，每天给药一次，共给药7天。末次给药24h后采集小鼠血清，进行血清生化分析血清中肾功能、肝功能和心功能等标志物的浓度。将小鼠安乐死后取双侧肾脏，去除肾包膜后取肾皮质保存于-80℃以供提取rna和蛋白，或将组织采用多聚甲醛固定后进行病理检验。

血清生化分析：

末次给药24h后取小鼠下腔静脉血，分离血清后采用血清生化分析仪对血清样本中尿素氮、肌酐、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶和肌酸激酶的浓度进行检测，以评估nsc228155对正常小鼠的肾、肝、心功能的影响。

病理检测：

肾脏组织经多聚甲醛固定、石蜡包理，组织切片后进行组织学检验。采用马松三色法染色，观察肾脏皮质的病理改变。

2)细胞的给药与增殖检测

铺板：将人肾小管上皮细胞系hk-2采用含10％胎牛血清的dmem/f12培养基培养于96孔板，培养条件为37℃，5％二氧化碳和95％空气。给药：为研究nsc228155对细胞增殖的影响，我们在铺板18h后将培养基换成含0.625μmnsc228155的无血清培养基，将细胞在上述培养条件下继续培养24h后进行cck8细胞增殖检测。增殖检测：细胞增殖检测采用cck8细胞增殖试剂盒(购自凯基生物)进行检测，即向每孔加入10μlcck8检测试剂后继续培养1h，在450nm波长下检测吸光度，od值越高表示细胞越多。

3)实验结果

为研究nsc228155重复给药的安全性，在小鼠连续7天重复给药2.5mg/kgnsc228155后，分析其血清中各脏器生化指标的变化情况，以评估nsc228155对肾、肝、心功能的影响。从结果可知，在此情况下nsc228155对肾功能标志物血清尿素氮(图1a)和血清肌酐(图1b)浓度无影响，对肝功能标志物谷丙转氨酶(图1c)、谷草转氨酶(图1d)无影响，对心功能标志物谷草转氨酶(图1d)、乳酸脱氢酶(图1e)和肌酸激酶(图1f)无影响，这些结果说明nsc228155在2.5mg/kg这一治疗剂量下对肾、肝、心无明显毒性。此外，对小鼠肾脏进行病理染色结果可知，nsc228155在2.5mg/kg剂量下对小鼠肾脏病理无明显改变(图1g)。在细胞实验中，nsc228155在0.625μm剂量下对hk-2细胞增殖无显著影响(图1h)。这些结果说明nsc228155在治疗剂量下对小鼠和细胞安全无毒。

实施例2nsc228155改善uuo模型中的肾纤维化

1实验材料

本发明使用的c57bl/6种属小鼠和nsc228155(纯度≥99％)与实施例1中的来源相同。

2实验方法

2.1动物给药、造模与取材

雄性c57bl/6小鼠20只(购买时7周龄，体重20-24g)饲养于南京医科大学实验动物中心spf级屏障环境中，动物自由进食，维持12小时光照和12小时黑暗的昼夜节律。实验室温度：20-25℃，湿度50±5％。小鼠在适应性饲养1周后随机分为对照组(n＝10)和nsc228155组(n＝10)。分组后，对照组小鼠和nsc228155组小鼠分别每天进行一次腹腔注射溶媒或nsc228155，共进行8次注射。注射剂量与实施例1中相同。第一次给药后24h进行单侧输尿管结扎手术(unilateralureteralobstruction，uuo)，术后7天对小鼠进行安乐死后取双侧肾脏，去除肾包膜后取肾皮质保存于-80℃以供提取rna和蛋白，或将组织采用多聚甲醛固定后进行病理检验。

1)肾皮质病理检验

肾脏组织经多聚甲醛固定、石蜡包理，组织切片后进行组织学检验。采用马松三色法染色，观察肾间质纤维化程度。其中蓝色面积指示纤维化区域。

2)蛋白质免疫印迹

肾脏组织提取蛋白，按照文献方法操作。蛋白质免疫印迹(westernblot)结果用imagej软件进行灰度分析。

3)rt-pcr

采用takara公司rnaiso试剂按照说明书提取样本中的rna后，利用vazyme公司逆转录试剂盒将rna逆转录为cdna，并采用sybrgreenpcrmix结合相应引物进行rt-pcr检测。

4)统计分析

使用均值±sem表示数据。多组间比较用方差分析(anova)，两组间数据比较用t检验。以p<0.05为具有统计学意义。

3实验结果

为了评估检测nsc228155对肾纤维化的作用，我们采用马松三色法染色检测了小鼠肾皮质病理和间质纤维化程度。uuo造模7天后，肾皮质出现明显的间质纤维化和肾小管扩张坏死等肾脏病理损伤，而nsc228155治疗后，其相应肾脏病理损伤都显者下降(图2)。因此，nsc228155可以显著减轻肾脏纤维化病理和肾小管损伤。这些结果表明nsc228155可以减轻肾小管间质纤维化的病理改变。

实施例3nsc228155降低了肾脏组织中纤维化指标的表达水平

1.实验材料与方法

小鼠和nsc228155的来源和使用同实施例2中所述。小鼠uuo模型的建立方法、组织取材同实施例2。

1)rt-pcr

采用takara公司rnaiso试剂按照说明书提取样本中的rna后，利用vazyme公司逆转录试剂盒将rna逆转录为cdna，并采用sybrgreenpcrmix结合相应引物进行rt-pcr检测。

2)统计分析

柱状图使用均值±sem表示数据。多组间比较用方差分析(anova)，两组间数据比较用t检验。以p<0.05为具有统计学意义。

2.实验结果

为了进一步确证nsc228155对uuo模型中肾纤维化具有治疗作用，我们检测了肾皮质中肾纤维化特异性分子指标fibronectin、α-sma、collageni、collageniii等的表达情况。如图3的rt-pcr检测显示，这些肾纤维化指标在空白对照组小鼠uuo模型肾皮质中高表达，在nsc228155治疗后，其表达水平显著下降(图3a-d)；与这些mrna水平的检测结果相一致的，nsc228155同样显著降低了uuo模型中的纤维化指标α-sma的蛋白水平。因此，这些纤维化指标在mrna水平和蛋白水平的变化结果进一步说明nsc228155可减轻uuo模型中的肾间质纤维化。

实施例4在uuo模型中，nsc228155降低了肾脏组织中的炎症

1.实验材料与方法

小鼠和nsc228155的来源和使用同实施例2中所述。小鼠uuo模型的建立方法、组织取材、rt-pcr法及统计学检验同实施例3。

1)免疫组化

对小鼠肾皮质组织进行免疫组化，以检验巨噬细胞浸润情况。对组织切片进行脱蜡、水化后，采用枸橼酸钠进行抗原修复，随后采用10％山羊血清对组织进行封闭，并用巨噬细胞标记物f4/80检测抗体4℃封闭过夜，在阻断内源性酶后，采用免疫组化试剂盒(购自中杉金桥)对一抗进行识别、显色。脱水、封片后对肾皮质组织中巨噬细胞浸润情况进行显微成像。

3.实验结果

过度的炎性反应是肾纤维化的诱因之一。在uuo模型中，浸润的巨噬细胞是炎症的主要参与者。我们通过免疫组化的方法检测了肾皮质中的巨噬细胞浸润情况。从图4a可见，在正常肾脏皮质及nsc228155给药的肾脏皮质组织中，仅偶见f4/80阳性染色细胞出现在神小管间质，在uuo肾小管间质可见大量f4/80细胞，即uuo肾脏有明显的巨噬细胞浸润。nsc228155给药可明显降低uuo模型中的f4/80染色结果，降低uuo模型中肾间质巨噬细胞浸润。

此外，通过rt-pcr检测了nsc228155治疗之后肾皮质组织炎症相关指标的mrna水平，包括促炎细胞因子il-6(图4b)、il-1β(图4c)和tnf-α(图4d)以及巨噬细胞表面物cd206(图4e)。rt-pcr结果显示，在正常小鼠肾脏中，促炎细胞因子表达很低或者不表达，uuo模型可显著升高促炎细胞因子的表达，加剧巨噬细胞浸润，而使用nsc228155治疗可显著降低促炎细胞因子的表达水平。这些结果与免疫组化所示结果一致，说明在uuo模型中，nsc228155能够抑制肾皮质中的炎性反应。

实施例5nsc228155显著抑制tgf-β诱导的肾间质成纤维细胞活化。

1.实验材料与方法

大鼠肾间质成纤维细胞nrk-49f采用含10％胎牛血清的dmem培养基培养，培养条件为37℃，5％二氧化碳和95％空气。为研究nsc228155对肾间质成纤维细胞活化的影响，我们采用tgf-β1处理来在体外诱导nrk-49f细胞活化，我们将nrk-49f在低血清培养基中加入0.625μm的nsc228155预处理2h，之后加入终浓度为5ng/ml的tgf-β1模拟慢性肾纤维化过程中的成纤维细胞活化，24h后收集细胞总蛋白进行westernblot检测，或收集细胞，提取rna后采用rt-pcr检测纤维化基因，α-sma、collageni和collageniii的表达情况。为研究nsc228155是否通过抑制wwp2起到抑制纤维化的作用，我们在nrk-49f细胞中过表达wwp2后，以上述方法进行nsc228155处理和tgf-β1刺激，并在tgf-β1处理24h后收集细胞总蛋白进行westernblot检测。纤维化指标分子fibronectin抗体购于abcam公司。内参蛋白gapdh及二抗购于南京巴傲得公司。数据的统计与分析同实施例3所述。

2.实验结果

肾间质成纤维细胞的活化是导致肾间质纤维化的直接细胞机制，活化的成纤维细胞可产生大量细胞外基质，如fibronectin，collageni和collageniii等，直接导致肾间质纤维化。在tgf-β1的刺激下，肾间质成纤维细胞活化可由fibronectin等细胞外基质的表达水平来进行检测。实验结果表明，在蛋白水平上，nsc228155显著抑制了tgf-β1诱导的fibronectin的表达(图5a)。与此一致的是，nsc228155在mrna水平上同样显著抑制了tgf-β1诱导的纤维化基因，α-sma、collageni和collageniii的表达上调情况(图5b-d)。这些结果说明，nsc228155显著抑制了tgf-β1诱导的肾间质成纤维细胞活化。如图e所示，过表达wwp2可进一步加重tgf-β1诱导的fibronectin蛋白水平上升，nsc228155处理可抑制wwp2对纤维化的促进作用。这些结果说明nsc228155通过抑制wwp2抑制了肾间质成纤维细胞的活化。

实施例6nsc228155在小鼠肾脏和细胞中抑制了wwp2活性

1.实验材料与方法

大鼠肾间质成纤维细胞(nrk-49f)采用含10％胎牛血清的dmem/f12培养基培养，培养条件为37℃，5％二氧化碳和95％空气。为研究nsc228155对细胞内wwp2活性的影响，我们在0.625μm的nsc228155处理细胞24h后收集细胞总蛋白，对wwp2下游底物pten的蛋白水平进行westernblot检测。pten抗体购于cst公司。内参蛋白gapdh及二抗购于南京巴傲得公司。小鼠nsc228155的给药方式与剂量同实施例1所述。

2.实验结果

wwp2作为泛素化e3连接酶可以通过对底物蛋白进行泛素化，导致其降解。pten是wwp2的已知底物，在wwp2活化后，pten的蛋白水平会显著下降。在已发表文献中，体外泛素化试验证明nsc228155对wwp2的泛素化e3连接酶活性具有一定的抑制活性，但是其体内和细胞内作用尚不明确，nsc228155是否通过抑制wwp2活性对肾脏病理起到调节作用也不明确。因此，我们采用nsc228155对小鼠及肾间质成纤维细胞进行处理后，通过采用westernblot对下游底物pten的蛋白水平进行检验来研究该化合物对wwp2的活性。结果发现，在小鼠肾脏皮质组织中(图7a)，及肾间质成纤维细胞中(图7b)，pten的蛋白水平均在nsc228155的作用下明显上升，说明wwp2在肾脏和肾间质成纤维细胞中的活性受到了抑制。

实施例7nsc228155通过抑制wwp2显著抑制tgf-β1诱导的的肾小管上皮细胞纤维化

1.实验材料与方法

人肾小管上皮细胞(hk-2)采用含10％胎牛血清的dmem/f12培养基培养，培养条件为37℃，5％二氧化碳和95％空气。为研究nsc228155对肾小管上皮细胞纤维化的影响，我们采用tgf-β1处理来在体外诱导肾小管上皮细胞纤维化，我们将hk-2过表达wwp2后，在无血清培养基中加入0.625μm的nsc228155预处理2h，之后加入终浓度为5ng/ml的tgf-β1模拟慢性肾纤维化过程中的肾小管上皮细胞纤维化，24h后收集细胞总蛋白进行westernblot检测。纤维化指标分子fibronectin抗体购于abcam公司。内参蛋白gapdh及二抗购于南京巴傲得公司。数据的统计与分析同实施例3所述。

2.实验结果

tgf-β1刺激肾小管上皮细胞可在体外模拟慢性肾脏病中肾小管上皮细胞纤维化过程。从图7a可见，nsc228155显著抑制了tgf-β1诱导的肾小管上皮细胞表达α-sma，即抑制了肾小管上皮细胞纤维化过程。为了在蛋白水平研究nsc228155对于肾纤维化的作用，及研究nsc228155是否通过抑制wwp2起到对肾纤维化的作用，我们在过表达wwp2后，采用nsc228155预处理了hk-2细胞2h后加入5ng/ml的tgf-β1，24小时后收集细胞，采用westernblot法检测纤维化指标fibronectin的表达。如图6所示，tgf-β1能够显著上调fibronectin的蛋白水平，而nsc228155显著降低了tgf-β1上调的fibronectin蛋白水平，说明nsc228155能够直接抑制肾小管上皮细胞纤维化；过表达wwp2进一步加重了tgf-β1诱导的fibronectin的蛋白上调，nsc228155同样抑制了fibronectin的蛋白上调，说明nsc228155通过抑制wwp2的活性抑制肾小管上皮细胞纤维化(图7b)。

综上所述，本发明提供了一种活性和作用靶点尚未明确的化合物nsc228155在制备防治慢性肾纤维化药物中的用途，该抑制剂通过注射途径给药，通过抑制wwp2，抑制成纤维细胞的过度激活和直接抑制肾小管上皮细胞纤维化的作用机制，有效抑制了肾纤维化，从而发挥防治慢性肾纤维化的目的。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。