本发明整体上涉及分子生物学和肿瘤学领域。更具体地，其涉及经工程改造的犬尿氨酸酶及其使用方法。
背景技术：
犬尿氨酸是通过吲哚胺2，3二氧酶(ido)或色氨酸2，3二氧酶(tdo)的作用产生的氨基酸色氨酸的代谢物。犬尿氨酸对细胞生理发挥多重效应；其中最重要的一个效应是作为t细胞反应的调节剂。许多肿瘤细胞调控ido和/或tdo酶的合成以提高犬尿氨酸的局部浓度，其伴随着色氨酸的耗竭。犬尿氨酸的高水平进而用作抑制原本会攻击肿瘤的肿瘤浸润t细胞功能的有力方式。
犬尿氨酸产生在癌症中的重要性已得到公认，且导致犬尿氨酸生成酶ido和tdo的抑制剂的开发。所述化合物中的至少一者目前正经历ii期临床评估。然而，ido或tdo抑制对于癌症疗法是有问题的，这是因为：(1)存在ido和tdo的两种同种型，目前犬尿氨酸生成的所有可能路径的抑制都需要产生多个小分子抑制剂；(2)可以产生抗抑制性。
人类犬尿氨酸酶对3′oh犬尿氨酸的降解具有强烈偏好，其降解作用的催化效率(kcat/km)是犬尿氨酸降解显示的催化效率的1,000倍。相比之下，一些细菌酶(例如来自荧光假单胞菌(p.fluorescens)的酶)相对于3′oh犬尿氨酸对犬尿氨酸具有强烈偏好。出于治疗目的，必须具有在人类中具有活体内应用所必需的药理学性质的药剂(即治疗酶)。所述性质包括：(i)犬尿氨酸的高催化活性，(ii)增强的血清中失活的稳定性，以便在单剂量注射时延长犬尿氨酸在血清和组织中的耗竭。
技术实现要素：
本发明的方面通过提供包含能够降解l-犬尿氨酸的经工程改造的多肽序列的酶克服本领域的主要缺陷，所述经工程改造的多肽序列具有与人类酶的高度序列一致性以避免引发不利免疫反应且如癌症疗法所期望的在血清中显示有利的药物动力学。在pct/us2014/053437中，发明人公开相对于野生型人类酶具有kyn的高达24倍的降解催化效率的突变人类犬尿氨酸酶(在本文中也称为h-kynase或hskyn)酶。需要发现相对于pct/us2014/053437中公开的那些酶具有更高催化活性和人类血清中的稳定性的突变h-kynase。本申请案的方面解决此需要且公开具有更高催化效率的突变酶以及具有比野生型h-kynase更高催化活性的突变酶以及具有增强的血清稳定性的酶。
在第一实施例中，本发明提供经分离、修饰的人类犬尿氨酸酶，所述经修饰的酶具有与seqidno：1、2、3的人类犬尿氨酸酶或表1中提供的多肽中的一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，且包含至少一个选自由以下组成的组的取代(相对于seqidno：1的序列)：l8p、k38e、y47l、i48f、k50q、i51m、s60n、k64n、d65g、e66k、n67d、n67p、d67s、a68f、a68t、a68v、f71l、f71m、l72n、k84e、e88n、e89k、e89s、e90q、d92e、k93n、k93t、a95h、a95q、k96n、i97h、i97l、i97v、a98g、a99g、a99i、a99r、a99s、a99t、a99v、y100n、y100s、y100t、g101a、h102w、e103f、e103h、e103n、e103q、e103r、e103v、e103w、v104d、v104e、v104f、v104h、v104k、v104l、v104r、g105a、g105h、g105s、g105t、e106d、k106d、k106e、k106h、k106n、r107p、r107s、p108r、i110a、i110f、i110l、i110m、i110t、t111d、t111h、t111n、t111r、g112a、g112c、g112d、g112k、g112l、g112m、g112q、g112r、g112s、g112t、g112y、n127k、i131v、a132v、l133v、a136t、l137t、t138s、n140d、h142q、q14r、y156h、k163t、d168e、h169r、q175l、i183f、i183l、i183p、t183s、e184a、e184d、e184r、e184t、e184v、e185t、m187l、m189i、k191a、k191g、k191h、k191m、k191n、k191r、k191s、k191t、k191w、e197a、e197d、e197f、e197k、e197m、e197q、e197s、e197t、e197v、i201c、i201e、i201f、i201h、i201l、i201s、i201t、i201v、h203k、l219m、l219w、f220l、v223i、f225y、h230f、h230l、h230y、n232s、y246f、f249w、d250e、s274a、s274c、s274g、s274n、s274t、l278m、a280g、a280s、a280t、g281s、a282m、a282p、g284n、i285l、v303l、v303s、f306w、f306y、s311n、k315e、d317e、d317k、i331c、i331l、i331n、i331s、i331t、i331v、n333t、p334n、p335t、l337t、l338a、l338q、s341i、k373e、k373n、n375a、n375h、y376c、y376f、y376l、k378g、k378p、k378q、k378r、k380g、k380s、a382g、a382r、a382t、t383s、k384g、k384n、p386k、p386s、v387l、n389e、i405l、f407y、s408d、s408n、n411r、d413s、d413v、q416t、e419a、e419l、k420e、r421n、v424i、k427m、n429e、g432a和a436t。在一些方面中，所述氨基酸序列与seqidno：1、2或3的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性；或与表1的一种酶具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。在某些方面中，酶可包含a282处的取代(例如，a282m或a282p)、f306(例如，f306w或f306y)，或f249，例如f249w。在其他方面中，酶可包含l72n取代。在其他方面中，酶可包含f306w取代。在具体方面中，酶可包含h102w和n333t取代。在另一方面中，酶可包含a99处的取代。在一些方面中，酶可包含g112处的取代。在某些具体方面中，酶包含e103处的取代。在其他方面中，酶包含v104处的取代。在其他方面中，酶可包含s408处的取代。在若干方面中，酶可包含i183p取代。在一些特定方面中，酶可包含r107p取代。在另一具体方面中，酶可包含a436t取代。
在其他方面中，酶可包含至少一个选自l72n、h102w、a282p、f306w、i331s和n333t的取代。在某些方面中，酶包含至少两个、三个、四个或五个选自l72n、h102w、a282p、f306w、1331s和n333t的取代。在一些方面中，酶可包含取代l72n、h102w、a282p、f306w、i331s和n333t。在其他方面中，酶相对于kyn的催化活性(kcat/km)为至少8000m-1s-1。在其他方面中，酶相对于kyn的催化活性(kcat/km)介于约8000m-1s-1与40000m-1s-1之间、介于10000m-1s-1与40000m-1s-1之间、介于20000m-1s-1与40000m-1s-1之间或介于25000m-1s-1与35000m-1s-1之间。
在其他方面中，多肽包含与表1的多肽中的一者的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％一致性的氨基酸序列。在具体方面中，多肽包含与表1的多肽中的一者具有100％一致性的氨基酸序列。在其他方面中，多肽包含与seqidno：2的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。在具体方面中，多肽包含与seqidno：2具有100％一致性的氨基酸序列。在某些方面中，氨基酸序列与seqidno：3的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。在具体方面中，多肽包含与seqidno：3具有100％一致性的氨基酸序列。
在又一方面中，实施例的犬尿氨酸酶进一步包含wo/2015/031771、wo/2016/033488或wo/2017/151860中公开的氨基酸取代中的一者，所述案件各自全文以引用方式并入本文中。
在其他方面中，提供能够降解kyn的包含天然或经修饰的人类或灵长类动物犬尿氨酸酶的多肽。在一些实施例中，多肽在生理条件下能够降解kyn。举例而言，多肽对于kyn的催化效率(kcat/km)为至少或约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、104、105、106m-1s-1或其中可推导出的任何范围。
如上文讨论的经修饰的多肽的特征可在于，与未经修饰的多肽(例如，天然多肽，例如seqidno：1的人类犬尿氨酸酶)或本文公开的任何多肽序列相比，具有某一百分比的一致性。举例而言，未经修饰的多肽可包含天然犬尿氨酸酶的至少或至多约150、200、250、300、350、400、450或465个残基(或其中可推导出的任何范围)。经修饰的多肽与未经修饰的多肽之间或任两个序列相比的一致性百分比可为约、至多或至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％(或其中可推导出的任何范围)。还预计，上文讨论的一致性百分比可能和与多肽的未经修饰的区相比多肽的特定修饰的区有关。例如，多肽可含有犬尿氨酸酶的经修饰或突变底物识别位点，其可基于犬尿氨酸酶的经修饰或突变底物识别位点的氨基酸序列与来自相同物种或不同物种的未经修饰或突变犬尿氨酸酶的氨基酸序列的一致性进行表征。经修饰或突变人类多肽的特征在于(例如)与未经修饰的犬尿氨酸酶具有至少90％一致性，此意味着所述经修饰或突变人类多肽中的至少90％氨基酸与未经修饰的多肽中的氨基酸一致。
所述未经修饰的多肽可为天然犬尿氨酸酶，特别是人类同种型或其他灵长类动物同种型。举例而言，天然人类犬尿氨酸酶可具有seqidno：1的序列。天然灵长类动物犬尿氨酸酶的非限制性示例包括苏门答腊猩猩(pongoabelii)犬尿氨酸酶(genbankid：xp_009235962.1，gi：686708656)、长尾猕猴(macacafascicularis)犬尿氨酸酶(genbankid：ehh54849.1，gi：355750522)，以及黑猩猩属(pantroglodytes)犬尿氨酸酶(genbankid：xp_003309314.1，gi：332814521)。例示性天然多肽包括与seqidno：1具有约、至多或至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性(或其中可推导出的任何范围)的序列。举例而言，天然多肽可包含seqidno：1的序列的至少或至多约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或465个残基(或其中可推导出的任何范围)。
在一些方面中，实施例的多肽包含连接至异源氨基酸序列的犬尿氨酸酶。举例而言，犬尿氨酸酶可连接至异源氨基酸序列作为融合蛋白。在特定实施例中，犬尿氨酸酶连接至氨基酸序列，例如用于延长活体内半衰期的iggfc、白蛋白、白蛋白结合蛋白或xten多肽。
为了增加血清持久性，犬尿氨酸酶可连接至一或多个聚醚分子。在特定实施例中，聚醚为聚乙二醇(peg)。多肽可通过特定氨基酸残基(例如离氨酸或半胱氨酸)连接(例如，共价)至peg。对于治疗性施用而言，包含犬尿氨酸酶的所述多肽可分散于医药学上可接受的载剂中。
在一些方面中，涵盖编码所述犬尿氨酸酶的核酸。在一些实施例中，核酸经密码子优化用于在细菌中表达。在特定实施例中，细菌为大肠杆菌(e.coli)。在其他方面中，核酸经密码子优化用于在真菌(例如，酵母)、昆虫或哺乳动物中表达。在其他方面中，提供含有所述核酸的载体，例如表达载体。在特定实施例中，编码犬尿氨酸酶的核酸可操作连接至启动子，包括(但不限于)异源启动子。在一个实施例中，犬尿氨酸酶由载体(例如，基因疗法载体)递送至靶细胞。所述病毒可通过重组dna技术经修饰以使得编码犬尿氨酸酶的核酸能够在靶细胞中表达。所述载体可源自非病毒(例如，质体)或病毒(例如，腺病毒、腺相关病毒、反转录病毒、慢病毒属、疱疹病毒或牛痘病毒)来源的载体。非病毒载体优选地与药剂复合以有利于dna跨细胞膜进入。所述非病毒载体复合物的示例包括与多阳离子剂的调配物，所述多阳离子剂有利于dna与基于脂质的递送系统的缩合。基于脂质的递送系统的示例将包括基于脂质体的核酸递送。
在其他方面中，本发明进一步涵盖包含所述载体的宿主细胞。宿主细胞可为细菌(例如，大肠杆菌)、真菌细胞(例如，酵母)、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
在一些实施例中，将载体引入宿主细胞中用于表达犬尿氨酸酶。蛋白质可以任何适宜方式表达。在一个实施例中，蛋白质在宿主细胞中表达，使得蛋白质糖基化。在另一实施例中，蛋白质在宿主细胞中表达，使得蛋白质无糖基化。
在一些实施例中，癌症为对犬尿氨酸耗竭敏感的任何癌症。在一个实施例中，本发明涵盖治疗肿瘤细胞或癌症患者的方法，其包括投与包含所述多肽的调配物。在一些实施例中，投与是在使得杀死癌细胞的至少一部分的条件下发生。在另一实施例中，调配物包含在生理条件下具有犬尿氨酸降解活性且进一步包含连接的聚乙二醇链的所述犬尿氨酸酶。在一些实施例中，调配物为包含上文讨论的犬尿氨酸酶中的任一者和医药学上可接受的赋形剂的医药调配物。所述医药学上可接受的赋形剂为本领域技术人员熟知的。预计所有上述犬尿氨酸酶都可用于人类疗法。
在又一实施例中，还提供治疗肿瘤细胞的方法，其包括投与包含具有犬尿氨酸降解活性的非细菌(哺乳动物，例如灵长类动物或小鼠)犬尿氨酸酶或编码其的核酸的调配物。
根据本发明的某些方面，含有犬尿氨酸酶的所述调配物可经静脉内、真皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、滑膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、肿瘤内、肌内、皮下、结膜下、囊泡内、经黏膜、心包内、脐内、眼内、经口、外用、通过吸入、输注、连续输注、局部灌注、经由导管、经由灌洗、于脂质组合物(例如，脂质体)内或通过如本领域技术人员所知的其他方法或上述的任何组合来投与。
在又一实施例中，所述方法还包括向个体至少投与第二抗癌疗法。第二抗癌疗法可为手术疗法、化学疗法、辐射疗法、冷冻疗法、激素疗法、免疫疗法或细胞介素疗法。在某些方面中，第二抗癌疗法可为免疫检查点抑制剂疗法，例如抗pd-1、抗ctla-4、抗pd-l1抗体、抗lag3、抗tim-3、抗icos、抗cd137、抗cd40、抗kir、抗cd40l、抗gitr或抗ox40疗法。在其他方面中，第二抗癌疗法可为抗体疗法，例如抗体-药物缀合物。在其他方面中，第二抗癌疗法为免疫疗法，例如投与免疫效应细胞或免疫原性组合物。举例而言，免疫原性组合物可包含癌细胞抗原和视情况的佐剂。在一些方面中，免疫效应细胞可包含nk细胞、t细胞(例如，cart细胞)或nk/t细胞。
在一些实施例中，涵盖包含嵌合抗原受体(car)和实施例的犬尿氨酸酶的t细胞，其用于治疗患有癌症的个体。在一些方面中，细胞可经编码car和犬尿氨酸酶和在一些情形下转座酶的dna转染。
car可靶向任何感兴趣的癌细胞抗原，包括(例如)her2、cd19、cd20和gd2。抗原结合区或结构域可包含源自特定人类单株抗体(例如全文以引用方式并入本文中的美国专利7,109,304中所述的那些抗体)的单链可变片段(scfv)的vh和vl链的片段。片段也可为人类抗原特异性抗体的任何数目的不同抗原结合结构域。在更具体实施例中，片段为由针对在人类细胞中表达的人类密码子使用优化的序列编码的抗原特异性scfv。对于car的附加示例，参见(例如)wo2012/031744、wo2012/079000、wo2013/059593和美国专利8,465,743，所有所述案件的全文都以引用方式并入本文中。
犬尿氨酸酶可为本文公开的任何犬尿氨酸酶。转染细胞的方法为业内熟知，但在某些方面中，采用高效率转染方法，例如电穿孔。举例而言，可使用核转染装置将核酸引入细胞中。优选地地，转染步骤不包括用病毒感染或转导细胞，所述病毒可引起基因毒性和/或在经治疗个体中导致对含有病毒序列的细胞的免疫反应。
多种car构建体和其表达载体为业内已知且在本文中进一步详述。举例而言，在一些方面中，car表达载体为dna表达载体，例如质体、线性表达载体或游离基因组。在一些方面中，载体包含附加序列，例如有利于car(例如启动子、增强子、多-a信号和/或一或多个内含子)表达的序列。在优选方面中，car编码序列侧接转座子序列，使得转座酶的存在允许编码序列整合至经转染细胞的基因组中。
在某些方面中，进一步用转座酶转染细胞，所述转座酶有利于car编码序列整合至经转染细胞的基因组中。在一些方面中，转座酶提供为dna表达载体。然而，在优选方面中，转座酶提供为可表达的rna或蛋白质，使得在转基因细胞中不出现转座酶的长期表达。根据实施例可使用任何转座酶系统。在其他方面中，可用慢病毒属感染细胞以有利于car编码序列和犬尿氨酸酶编码序列整合至细胞的基因组中。
在一个实施例中，提供包含犬尿氨酸酶或编码犬尿氨酸酶的核酸的组合物，其用于治疗个体的肿瘤。在另一实施例中，提供犬尿氨酸酶或编码犬尿氨酸酶的核酸在制造用于治疗肿瘤的药剂中的用途。犬尿氨酸酶可为实施例的任何犬尿氨酸酶。
在本发明的方法和/或组合物的上下文中讨论的实施例可相对于本文所述的任何其他方法或组合物采用。因此，属于一种方法或组合物的实施例也可应用于本发明的其他方法和组合物。
如本文所用的“基本上不含”就指定组分来说在本文中用于意指没有指定组分被有目的地调配成组合物和/或仅作为污染物或以痕量存在。由组合物的任何非预期污染引起的指定组分的总量优选地低于0.01％。最优选的是其中用标准分析方法不能检测到任何指定组分的量的组合物。
如本文说明书和权利要求书中所用的“一(a或an)”意指一或多个。如本文说明书和权利要求书中所用，当与词语“包含”一起使用时，词语“一(a或an)”可意指一个或多于一个。如本文说明书和权利要求书中所用，“另一”或“又一”可意指至少第二或更多。
如本文说明书和权利要求书中所用的术语“约”用于指示，值包括器件的固有误差变化(所述方法用于测定值)，或者存在于研究目标物中的变化。
据以下详细说明，本发明的其他目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应理解，详细说明和具体示例虽然指示本发明的某些实施例，但仅藉助说明给出，这是因本领域技术人员自此详细说明将明了在本发明的精神和范围内的各种改变和修改。
附图说明
以下图式构成本说明书的一部分，且包括以进一步说明本发明的某些方面。通过参考所述图式中的一或多者结合本文提出的具体实施例的详细说明，可以更好地理解本发明。
图1a至图1c：hskyn蛋白质工程者的成功结果。a)人类变异体的kyn催化活性(kcat/km)增加＞500倍，与细菌工具kynase相当。b)人类变异体极大地改善了活体外人类血清中的催化稳定性。c)如本文表1中所示，人类变异体(68)和(153)在单次静脉内剂量后显示小鼠中延长的kyn降解。
图2a至图2b：hskyn变异体的活体内性能。a)在ct26模型中，蛋白质(68)与抗pd-1组合显示出优于epacadostat的显著肿瘤生长抑制/存活益处。b)用ct26再攻击完全反应者(cr)，且没有cr发生肿瘤，确认针对ct26的抗肿瘤记忆。相比之下，用ct26接种的幼稚小鼠发生肿瘤。
图3a至图3b：在携带ct26肿瘤的小鼠中的蛋白质(68)的免疫分型。a)使用nanostring的多任务基因表达分析公开在hskyn+/-抗pd1治疗后ifnγ基因印记的上调。b)fac分析展现hskyn治疗增加了cd8/treg和m1/m2巨噬细胞比率。
图4a至图4c：毒物学物种(toxspecies)中蛋白质(153)的pd/pk特性。a)在单次和重复的10mg/kg的每周静脉注射剂量后，蛋白质(153)在大鼠中展现稳健且耐久的血浆kyn耗竭。b)在猕猴中单次静脉注射后，蛋白质(153)降解血浆kyn≥50％高达7天。c)具有有利的t1/2＞6天的蛋白质(153)猴pk曲线。
具体实施方式
本申请案要求于2018年4月16日提出申请的美国临时专利申请案号62/658,261的权益，其全文以引用方式并入本文中。
本发明是在国立卫生研究院授予的批准号r01ca154754的政府支持下完成。美国政府在本发明中享有一定的权利。
i.本实施例
在某些实施例中，本公开案提供犬尿氨酸酶(kynase)，一种kyn耗竭酶。具体地，本申请案提供与野生型人类犬尿氨酸酶相比，对犬尿氨酸降解显示至少高100倍的催化活性的一组人类犬尿氨酸酶变异体。在一些方面中，本文提供的犬尿氨酸酶变异体另外具有增加的对血清中失活的抗性。因此，所述酶具有显著改善的性质，所述性质使得其对于治疗性疾病介入(例如癌症的治疗)是理想的。在一些方面中，酶(或编码酶的序列)可用于治疗癌症患者，如具有ido1和/或tdo2表达肿瘤的那些患者。
在本研究中，人类kynase(h-kynase)已成功地经工程改造以展现相对于wt酶大大改善的对kyn的催化活性和稳定性，且在小鼠中达成耐久的血浆kyn耗竭。在ct26和b16-ido模型中也展现单一药剂和pd1组合性能优于主要ido1抑制剂epacadostat，且所得的完全反应者(cr)对肿瘤再攻击具有抗性。肿瘤免疫分型公开在hskyn+/-pd1治疗时ifng标记基因表达和m1/m2巨噬细胞比率的上调。主要hskyn变异体在大鼠和非人类灵长类动物中显示有利的kyn降解和pk特征，且可用于治疗癌症，例如其中ido1和/或tdo2路径起免疫抑制作用的癌症。
ii.定义
如本文所用术语“蛋白质”和“多肽”指包含通过肽键接合的氨基酸的化合物且可互换使用。
如本文所用术语“融合蛋白”指含有以非天然方式可操作连接的蛋白质或蛋白质片段的嵌合蛋白。
如本文所述术语“半衰期”(1/2-生命)指例如在哺乳动物中注射后其多肽浓度在活体外或活体内下降一半所需的时间。
术语“以可操作组合”、“以可操作顺序”和“可操作连接”指其中所述组分处于允许其以其预期方式起作用的关系的链接，例如，以核酸分子能够指导给定基因的转录和/或期望蛋白质分子的合成的方式的核酸序列的链接，或以产生融合蛋白的方式的氨基酸序列的链接。
术语“连接体”意指作为可操作地连接两个不同分子的分子桥的化合物或部分，其中连接体的一部分可操作连接至第一分子，且其中连接体的另一部分可操作连接至第二分子。
术语“聚乙二醇化”指与聚乙二醇(peg)缀合，鉴于其高度生物兼容性和易于修饰，其已广泛用作药物载剂。peg可经由化学方法通过peg链末端的羟基与活性剂偶合(例如，共价连接)；然而，peg本身每分子限于至多两种活性剂。在另一方法中，peg和氨基酸的共聚物已经被探索作为新颖生物材料，其将保留peg的生物兼容性，但每个分子将具有多个连接点的附加优点(从而提供更大的载药量)，且可以合成方式经设计以适应各种应用。
术语“基因”是指包含产生多肽或其前体所必需的控制和编码序列的dna序列。多肽可由全长编码序列或编码序列的任一部分编码，以便保留期望酶活性。
术语“天然”是指当自天然来源分离时基因、基因产物或所述基因或基因产物的特征的典型形式。天然形式是在自然群体中最常观察到的形式，且因此被任意地命名为正常或野生型形式。相比之下，术语“经修饰”、“变异体”或“突变体”是指当与天然基因或基因产物相比时，显示序列和功能性质(即，改变的特征)的修饰的基因或基因产物。
术语“载体”用于指载体核酸分子，其中可插入核酸序列以引入可被复制的细胞中。核酸序列可为“外源的”，此意指其对于引入载体的细胞是外源的，或者序列与细胞中的序列同源但在其中通常未发现序列的宿主细胞核酸内的位置。载体包括质体、黏粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如，yac)。本领域技术人员可通过标准重组技术将载体充分配备至构建体。
术语“表达载体”是指任何类型的遗传构建体，其包含编码能够被转录的rna的核酸。在一些情形下，rna分子接着翻译成蛋白质、多肽或肽。在其他情形下，所述序列例如在反义分子或核酶的产生中不被翻译。表达载体可含有多种“控制序列”，其是指在特定宿主细胞中转录和可能翻译可操作连接编码序列所必需的核酸序列。除了管控转录和翻译的控制序列外，载体和表达载体可含有也用于其他功能且在下文中阐述的核酸序列。
如本文所用的术语“治疗有效量”是指用于实现治疗效应的方法中的细胞和/或治疗组合物(例如治疗性多核苷酸和/或治疗性多肽)的量。如贯穿本申请案中使用的术语“治疗有益益处”或“治疗有效”是指相对于此病况的医学治疗促进或增强个体健康状况的任何事物。此包括(但不限于)降低疾病的体征或症状的频率或严重程度。举例而言，癌症的治疗可能涉及(例如)肿瘤大小的减小、肿瘤侵袭性的降低、癌症生长速度的降低或转移的预防。癌症的治疗也可以指延长患有癌症的个体的存活期。
如本文所用术语“km”是指酶的michaelis-menten常数，且定义为特定底物的浓度，在所述浓度下给定的酶在酶催化反应中产生其最大速度的一半。本文所用术语“kcat”是指每单位时间每个酶位点转化为产物的转换数或底物分子数，且其中酶以最大效率起作用。如本文所用术语“kcat/km”是特异性常数，其是酶将底物转化为产物的效率的量度。
如本文所用术语“嵌合抗原受体(car)”可以指例如人工t细胞受体、嵌合t细胞受体或嵌合免疫受体，且涵盖将人工特异性移植至特定免疫效应细胞中的经工程改造的受体。car可用于将单株抗体的特异性赋予t细胞，从而允许产生大量特异性t细胞，例如，用于过继细胞疗法。在具体实施例中，例如，car将细胞的特异性指向肿瘤相关抗原。在一些实施例中，car包含细胞内激活结构域、跨膜结构域和包含肿瘤相关抗原结合区的细胞外结构域。在特定方面，car包含源自单株抗体(例如全文以引用方式并入本文中的美国专利7,109,304中所述的那些抗体)的单链可变片段(scfv)与cd3-ζ跨膜和胞内结构域融合的融合物。其他car设计的特异性可源自受体(例如，肽)的配位体或源自模式识别受体，例如dectin。在特定实施例中，可通过使用对b谱系分子cd19具有特异性的car复位向t细胞的特异性来靶向恶性b细胞。在某些情形下，可修饰抗原识别结构域的间隔以减少激活诱导的细胞死亡。在某些情形下，car包含用于附加共刺激信号传导的结构域，例如cd3-ζ、fcr、cd27、cd28、cd137、dap10和/或ox40。在一些情形下，分子可与car共表达，包括共刺激分子、用于成像(例如，用于正电子发射断层摄影术)的报导基因、在添加前药时有条件地消融t细胞的基因产物、归巢受体、趋化介素、趋化介素受体、细胞介素和细胞介素受体。
“治疗(treatment和treating)”是指出于获得疾病或健康相关病况的治疗益处的目的，向个体投与或应用治疗剂或对个体实施程序或方式。举例而言，治疗可包括投与医药有效量的犬尿氨酸酶。
“个体”和“患者”是指人类或非人类，例如灵长类动物、哺乳动物和脊椎动物。在特定实施例中，个体为人类。
iii.犬尿氨酸酶多肽
一些实施例涉及经修饰的蛋白质和多肽。特定实施例涉及展现至少一种与未经修饰形式相当的功能活性、优选地犬尿氨酸降解活性的经修饰的蛋白质或多肽。在其他方面中，可进一步修饰蛋白质或多肽以增加血清稳定性。因此，当本申请案涉及“经修饰的蛋白质”或“经修饰的多肽”的功能或活性时，本领域技术人员将理解，此包括(例如)具有超过未经修饰的蛋白质或多肽的附加优点(例如犬尿氨酸降解活性或热力学稳定性)的蛋白质或多肽。
活性的测定可使用本领域技术人员熟悉的分析来实现，特别是关于蛋白质的活性，且出于比较目的可包括使用经修饰或未经修饰的蛋白质或多肽的天然和/或重组形式。
在某些实施例中，经修饰的多肽(例如经修饰的犬尿氨酸酶)可基于其在犬尿氨酸中的增加来鉴别。举例而言，可鉴别未经修饰的多肽的底物识别位点。此鉴别可基于结构分析或同源性分析。可产生涉及所述底物识别位点的修饰的突变体群体。在又一实施例中，具有增加的犬尿氨酸降解活性的突变体可选自突变体群体。期望突变体的选择可包括诸如检测来自犬尿氨酸降解的副产物或产物等方法。
经修饰的蛋白质可具有氨基酸的缺失和/或取代；因此，具有缺失的蛋白质、具有取代的蛋白质和具有缺失和取代的蛋白质是经修饰的蛋白质。在一些实施例中，所述经修饰的蛋白可进一步包括插入或添加的氨基酸，例如与融合蛋白或具有连接体的蛋白质。“经修饰的缺失蛋白质”缺少天然蛋白质的一或多个残基，但可具有天然蛋白质的特异性和/或活性。“经修饰的缺失蛋白质”也可具有降低的免疫原性或抗原性。经修饰的缺失蛋白质的示例为具有自至少一个抗原性区(即经测定在特定生物体、例如可投与经修饰的蛋白质的类型的生物体中具有抗原性的蛋白质的区)缺失的氨基酸残基的蛋白质。
取代或置换变异体通常含有在蛋白质内的一或多个位点处将一种氨基酸交换为另一种，且可经设计以调节多肽的一种或多种性质，特别是其效应物功能和生物利用度。取代可为保守的或可不为保守的，即一个氨基酸经具有相似形状和电荷的一个氨基酸置换。保守取代为业内所熟知且包括(例如)以下变化：丙氨酸至丝氨酸；精氨酸至离氨酸；天冬酰氨至麸酰氨酸或组氨酸；天冬氨酸盐至麸氨酸盐；半胱氨酸至丝氨酸；麸酰氨酸至天冬酰氨；麸氨酸盐至天冬氨酸盐；甘氨酸至脯氨酸；组氨酸至天冬酰氨或麸酰氨酸；异白氨酸至白氨酸或缬氨酸；白氨酸至缬氨酸或异白氨酸；离氨酸至精氨酸；甲硫氨酸至白氨酸或异白氨酸；苯丙氨酸至酪氨酸、白氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸至苏氨酸；苏氨酸至丝氨酸；色氨酸至酪氨酸；酪氨酸至色氨酸或苯丙氨酸；和缬氨酸至异白氨酸或白氨酸。
除了缺失或取代之外，经修饰的蛋白质可具有残基的插入，其通常涉及在多肽中添加至少一个残基。此可包括靶向肽或多肽的插入或仅包括单个残基。下文讨论称为融合蛋白的末端添加物。
术语“生物学功能等效物”在业内是公知的且在本文中进一步详细定义。因此，包括具有约70％至约80％或约81％至约90％或甚至约91％至约99％与对照多肽的氨基酸一致或功能上等效的氨基酸的序列，前提是维持蛋白质的生物活性。在某些方面中，经修饰的蛋白质在生物学上可在功能上等效于其天然对应体。
还应理解，氨基酸和核酸序列可包括附加残基，例如附加n-或c-末端氨基酸或5′或3′序列，但仍基本上如本文公开的序列中的一者所示，只要序列符合上述标准，包括维持与蛋白质表达有关的生物蛋白质活性。末端序列的添加特别适用于核酸序列，其可(例如)包括侧接编码区的5′或3′部分中的任一者的各种非编码序列或可包括各种内部序列，即，已知在基因内出现的内含子。
在某些实施例中，根据实施例的犬尿氨酸酶包含与seqidno：1、2或3的犬尿氨酸酶具有至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。在其他方面中，犬尿氨酸酶与seqidno：1、2或3的犬尿氨酸酶具有至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性，且包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个选自由以下组成的组的氨基酸取代：l8p、k38e、y47l、i48f、k50q、i51m、s60n、k64n、d65g、e66k、n67d、n67p、d67s、a68f、a68t、a68v、f71l、f71m、l72n、k84e、e88n、e89k、e89s、e90q、d92e、k93n、k93t、a95h、a95q、k96n、i97h、i97l、i97v、a98g、a99g、a99i、a99r、a99s、a99t、a99v、y100n、y100s、y100t、g101a、h102w、e103f、e103h、e103n、e103q、e103r、e103v、e103w、v104d、v104e、v104f、v104h、v104k、v104l、v104r、g105a、g105h、g105s、g105t、e106d、k106d、k106e、k106h、k106n、r107p、r107s、p108r、i110a、i110f、i110l、i110m、i110t、t111d、t111h、t111n、t111r、g112a、g112c、g112d、g112k、g112l、g112m、g112q、g112r、g112s、g112t、g112y、n127k、i131v、a132v、l133v、a136t、l137t、t138s、n140d、h142q、q14r、y156h、k163t、d168e、h169r、q175l、i183f、i183l、i183p、i183s、e184a、e184d、e184r、e184t、e184v、e185t、m187l、m189i、k191a、k191g、k191h、k191m、k191n、k191r、k191s、k191t、k191w、e197a、e197d、e197f、e197k、e197m、e197q、e197s、e197t、e197v、i201c、i201e、i201f、i201h、i201l、i201s、i201t、i201v、h203k、l219m、l219w、f220l、v223i、f225y、h230f、h230l、h230y、n232s、y246f、f249w、d250e、s274a、s274c、s274g、s274n、s274t、l278m、a280g、a280s、a280t、g281s、a282m、a282p、g284n、i285l、v303l、v303s、f306w、f306y、d311n、k315e、d317e、d317k、i331c、i331l、i331n、i331s、i331t、i331v、n333t、p334n、p335t、l337t、l338a、l338q、s341i、k373e、k373n、n375a、n375h、y376c、y376f、y376l、k378g、k378p、k378q、k378r、k380g、k380s、a382g、a382r、a382t、t383s、k384g、k384n、p386k、p386s、v387l、n389e、i405l、f407y、s408d、s408n、n411r、d413s、d413v、q416t、e419a、e419l、k420e、r421n、v424i、k427m、n429e、g432a和a436t。在其他方面中，犬尿氨酸酶与表1中提供的犬尿氨酸酶中的一者具有至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。在特定方面中，犬尿氨酸酶是选自表1中提供的那些犬尿氨酸酶中的一者。在一些方面中，例如根据表1的犬尿氨酸酶可经聚乙二醇化或可未经聚乙二醇化。
下表1列出了可与本公开案的组合物和方法连同使用的各种犬尿氨酸酶。尽管未在表1中明确列出，但“蛋白质(1)”在本文中是指野生型人类犬尿氨酸酶，其氨基酸序列在seqidno：1中示出。
iv.疗法的酶促犬尿氨酸降解
在某些方面中，多肽可用于治疗疾病，包括对犬尿氨酸耗竭敏感的癌症，利用耗竭犬尿氨酸的酶，以防止肿瘤介导的致耐受性效应且反而介导肿瘤消融促发炎反应。在某些方面中，预计犬尿氨酸酶用于治疗表达ido1、ido2和/或tdo的肿瘤。
本发明的某些方面提供用于治疗疾病(例如肿瘤)的经修饰的犬尿氨酸酶。具体地，经修饰的多肽可具有人类多肽序列且因此可预防人类患者中的过敏反应，允许重复给药，且提高治疗性能。
本发明治疗方法有用的肿瘤包括任何恶性细胞类型，例如在实体瘤或血液肿瘤中发现的那些肿瘤。例示性实体肿瘤可包括(但不限于)选自胰脏、结肠、盲肠、胃、脑、头、颈、卵巢、肾、喉、肉瘤、肺、膀胱、黑色素瘤、前列腺和乳房的器官的肿瘤。例示性血液肿瘤包括骨髓、t或b细胞恶性病、白血病、淋巴瘤、胚细胞瘤、骨髓瘤和诸如此类的肿瘤。可使用本文提供的方法治疗的癌症的其他示例包括(但不限于)癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤、白血病、鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric或stomachcancer)(包括胃肠癌和胃肠基质癌)、胰脏癌、神经胶母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney或renalcancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、各种类型的头颈癌、黑色素瘤、表浅扩散性黑色素瘤、雀斑样恶性黑色素瘤、肢端雀斑样黑色素瘤、结节性黑色素瘤以及b细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(non-hodgkin′slymphoma)(nhl)；小淋巴球(sl)nhl；中间级/滤泡性nhl；中间级弥漫性nhl；高级免疫母细胞性nhl；高级淋巴母细胞性nhl；高级小的非裂解细胞nhl；巨大疾病nhl；外套细胞淋巴瘤；aids有关的淋巴瘤；和瓦登斯特隆巨球蛋白血症(waldenstrom′smacroglobulinemia))、慢性淋巴球性白血病(cll)、急性淋巴母细胞性白血病(all)、毛细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性骨髓性白血病(aml)和慢性骨髓母细胞性白血病。
癌症可具体属于以下组织学类型，但不限于所述组织学类型：恶性肿瘤；癌；未分化型癌；巨大和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛基质癌；移行细胞癌；乳突状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆道癌；肝细胞癌；合并肝细胞癌和胆道癌；小梁性腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；恶性类癌肿瘤；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；难染性癌；嗜酸性球癌；噬氧性腺癌；嗜碱性球癌；透明细胞腺癌；粒细胞癌；滤泡性腺癌；乳突状和滤泡性腺癌；非包裹性硬化型癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附件癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；耵聍性腺癌；黏液表皮样癌；囊腺癌；乳突状囊腺癌；乳突状浆液性囊腺癌；黏液性囊腺癌；黏液腺癌；戒环细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；发炎癌；乳房佩吉特氏病(paget′sdisease)；腺泡细胞癌；腺鳞状癌；腺癌伴随鳞状转移瘤；恶性胸腺瘤；恶性卵巢基质瘤；恶性泡膜细胞瘤；恶性粒层细胞瘤；恶性雄胚瘤；支持细胞癌；恶性莱迪希氏细胞(leydigcell)肿瘤；恶性脂质细胞瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳房外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑色素瘤；无黑色素性黑色素瘤；表浅扩散性黑色素瘤；巨大色素痣中的恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑色素瘤；恶性蓝痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维性组织细胞瘤；黏液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎型横纹肌肉瘤；小泡型横纹肌肉瘤；基质肉瘤；恶性混合瘤；苗勒混合瘤(mullerianmixedtumor)；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间叶瘤；恶性勃勒纳瘤(brennertumor)；恶性叶状瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎性癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺肿；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西氏肉瘤(kaposi′ssarcoma)；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；近皮质骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性软骨母细胞瘤；间叶型软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因氏肉瘤(ewing′ssarcoma)；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；造釉纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性神经胶质瘤；室管膜瘤；星细胞瘤；原形质星细胞瘤；原纤维性星细胞瘤；星形母细胞瘤；神经胶母细胞瘤；寡树突神经胶细胞瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经胚外层瘤；小脑肉瘤；神经节成神经细胞瘤；神经胚细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅觉神经瘤；恶性脑脊髓膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金氏病(hodgkin′sdisease)；霍奇金氏；类肉芽肿；小淋巴球性恶性淋巴瘤；大细胞弥漫性恶性淋巴瘤；滤泡性恶性淋巴瘤；蕈样肉芽肿病；其他指定型非霍奇金氏淋巴瘤；恶性组织球增生症；多发性骨髓瘤；肥胖细胞肉瘤；免疫增生小肠疾病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞性白血病；红血球性白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；骨髓性白血病；嗜碱性球性白血病；嗜酸性球性白血病；单核球性白血病；肥胖细胞白血病；巨核细胞白血病；骨髓肉瘤；和毛细胞白血病。
犬尿氨酸酶可在本文中以各种方式用作抗肿瘤剂，用于自肿瘤组织耗竭犬尿氨酸和/或犬尿氨酸源代谢物，或患有癌症的哺乳动物的循环，或用于耗竭犬尿氨酸，其中犬尿氨酸的耗竭被认为是其期望的。
耗竭在哺乳动物的循环中可在活体内执行，在期望组织培养基或其他生物培养基中的犬尿氨酸和/或犬尿氨酸源代谢物耗竭的情形下在活体外执行，且若生物体液、细胞或组织在体外被操纵且随后返回至患者哺乳动物的身体则以离体程序执行。自循环、培养基、生物体液或细胞中耗竭犬尿氨酸可减少欲处理的材料可及的犬尿氨酸的量，且因此包括使欲耗竭的材料与犬尿氨酸耗竭量的犬尿氨酸酶在犬尿氨酸耗竭条件下接触，以便降解所接触材料中的环境犬尿氨酸。
耗竭可针对细胞的营养源，而不一定针对细胞本身。因此，在活体内应用中，处理肿瘤细胞包括使肿瘤细胞群体的营养培养基与犬尿氨酸酶接触。在此实施例中，培养基可为期望犬尿氨酸耗竭的血液、淋巴液、脊髓液和诸如此类体液。
犬尿氨酸-和/或犬尿氨酸源代谢物耗竭效率可根据应用而广泛变化，且通常取决于材料中存在的犬尿氨酸的量、期望耗竭速率以及暴露于犬尿氨酸酶的材料的耐受性。材料中的犬尿氨酸和犬尿氨酸代谢物水平和因此犬尿氨酸和犬尿氨酸代谢物自材料中耗竭的速率可容易地通过业内熟知的各种化学和生化方法监测。例示性犬尿氨酸耗竭量在本文中进一步产生，且范围可为0.001至100单位(u)的犬尿氨酸，优选地约0.01至10u，且更优选地约0.1至5u的犬尿氨酸酶/毫升(ml)欲处理的材料。典型剂量可基于体重投与，且在约5-1000u/公斤(kg)/天、优选地约5-100u/kg/天、更优选地约10-50u/kg/天且更优选地约20-40u/kg/天的范围内。
犬尿氨酸耗竭条件为与犬尿氨酸酶的生物活性兼容的缓冲液和温度条件，且包括与酶兼容的适当温度、盐和ph条件，例如生理条件。例示性条件包括约4-40℃，离子强度等效于约0.05至0.2mnacl，且ph为约5至9，同时包括生理条件。
在特定实施例中，本发明涵盖使用犬尿氨酸酶作为抗肿瘤剂的方法，且因此包括使肿瘤细胞群体与治疗有效量的犬尿氨酸酶接触足以抑制肿瘤细胞生长的时间段。
犬尿氨酸酶的治疗有效量是经计算以实现期望效应，即耗竭肿瘤组织或患者的循环中的犬尿氨酸且从而介导肿瘤消融促发炎反应的预定量。因此，本发明的犬尿氨酸酶的投与的剂量范围为足以产生期望效应的那些剂量，其中肿瘤细胞分裂和细胞循环的症状减少。剂量不应太大，以致引起不良副作用，例如，高黏稠度症候群、肺水肿、郁血性心脏衰竭神经学影响和诸如此类。通常，剂量将随患者的年龄、疾病状况、性别和疾病程度而变化，且可由本领域技术人员确定。倘若出现任何并发症，则个体医师可调整剂量。
犬尿氨酸酶可通过注射或通过随时间逐渐输注非经肠投与。犬尿氨酸酶可经静脉内、腹膜内、经口、肌内、皮下、腔内、经皮、经表皮可通过蠕动方式递送，可直接注射至含有肿瘤细胞的组织中，或可以通过连接至导管的泵来投与，所述导管可含有犬尿氨酸的潜在生物传感器。
含有犬尿氨酸酶的治疗组合物是静脉内投与，例如通过注射单位剂量静脉内投与。术语“单位剂量”当用于治疗组合物时是指适合作为个体的单式剂量的物理上离散的单位，每个单位含有经计算可产生期望治疗效应的预定量的活性物质以及所需稀释剂，即载剂或媒剂。
组合物以与剂量调配兼容的方式且以治疗有效量投与。欲投与的量取决于欲治疗的个体、个体系统利用活性成分的能力和期望治疗效应的程度。需要投与的精确活性成分量取决于从业者的判断且为每一个体所特有的。然而，本文公开全身应用的适宜剂量范围，且其取决于投与的途径。还涵盖初始投与和加强注射的适宜方案且其典型为初始投与，之后通过随后的注射或其他投与以一或多个小时间隔重复剂量。本文阐述例示性多次投与，且尤其是连续维持犬尿氨酸的高血清和组织水平，且相反地维持犬尿氨酸的低血清和组织水平。或者，涵盖足以维持血液中的浓度在活体内疗法所指定的范围内的连续静脉内输注。
v.缀合物
本发明的组合物和方法涉及例如通过与异源肽区段或聚合物(例如聚乙二醇)形成缀合物的经修饰的犬尿氨酸酶。在其他方面中，犬尿氨酸酶可与peg连接以增加酶的流体动力学半径且从而延长血清持久性。在某些方面中，所公开的多肽可与任何靶向剂(例如具有在肿瘤细胞上特异性和稳定地结合外部受体或结合位点的配位体)结合(美国专利公开案2009/0304666)。
a.融合蛋白
本发明的某些实施例涉及融合蛋白。所述分子可具有在n-或c-末端与异源结构域连接的天然或经修饰的犬尿氨酸酶。举例而言，融合物也可采用来自其他物种的前导序列以允许蛋白质在异源宿主中重组表达。另一有用的融合物包括添加蛋白亲和力标签(例如血清白蛋白亲和力标签或六组氨酸残基)，或免疫活性结构域(例如抗体抗原表位，优选地可裂解的抗体抗原表位)，以有利于融合蛋白的纯化。非限制性亲和力标签包括聚组氨酸、几丁质结合蛋白(cbp)、麦芽糖结合蛋白(mbp)和麸胱甘肽-s-转移酶(gst)。
在特定实施例中，犬尿氨酸酶可与延长活体内半衰期的肽(例如xten多肽)(schellenberger等人，2009)、iggfc结构域、白蛋白或白蛋白结合肽连接。
产生融合蛋白的方法为本领域技术人员所熟知。所述蛋白质可通过(例如)重新合成完全融合蛋白或通过连接编码异源结构域的dna序列、之后表达完整融合蛋白来产生。
通过将基因与编码肽连接体的桥接dna区段连接，可以促进产生恢复亲本蛋白质功能活性的融合蛋白，所述连接体在串联连接的多肽之间剪接。连接体的长度足以允许所得融合蛋白的适当折叠。
b.聚乙二醇化
在本发明的某些方面中，公开与犬尿氨酸的聚乙二醇化有关的方法和组合物。举例而言，犬尿氨酸可根据本文公开的方法经聚乙二醇化。
聚乙二醇化为聚(乙二醇)聚合物链与另一分子(通常为药物或治疗性蛋白质)共价连接的过程。通过培育peg的反应性衍生物与靶大分子来常规地实现聚乙二醇化。peg与药物或治疗性蛋白质的共价连接可“遮蔽”药剂远离宿主的免疫系统(降低的免疫原性和抗原性)或增加药剂的流体动力学大小(溶液中的大小，此通过降低肾清除率延长其循环时间。聚乙二醇化也可为疏水药物和蛋白质提供水溶性。
聚乙二醇化的第一步骤为peg聚合物在一个或两个末端的适宜官能化。在每个末端用相同反应性部分激活的peg称为“同双官能”，而若存在的官能基不同，则peg衍生物称为“异双官能”或“异官能”。制备peg聚合物的化学活性或激活衍生物以将peg连接至期望分子。
适用于peg衍生物的官能基的选择是基于将与peg偶合的分子上的可用反应性基团的类型。对于蛋白质，典型的反应性氨基酸包括离氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、麸氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。也可使用n-末端氨基和c-末端羧酸。
用于形成第一代peg衍生物的技术通常为使peg聚合物与和羟基反应的基团(通常酸酐、酰氯、氯仿和碳酸酯)反应。在第二代聚乙二醇化学中，更有效的官能基(例如醛、酯、酰氨等)可用于缀合。
随着聚乙二醇化的应用变得愈来愈先进和复杂，对缀合的异双官能peg的需求已经增加。所述异双官能peg在连接两个实体方面非常有用，其中需要亲水、挠性和生物兼容型间隔物。异双官能peg的优选端基为马来酰亚胺、乙烯基砜、吡啶基二硫化物、胺、羧酸和nhs酯。
最常见的修饰剂或连接体是基于甲氧基peg(mpeg)分子。其活性取决于向醇末端添加蛋白质修饰基团。在一些情况下，聚乙二醇(peg二醇)用作前体分子。随后在两端修饰二醇以制备异聚体或均二聚体peg连接的分子。
蛋白质通常在亲核位点(例如未质子化的硫醇(半胱氨酰基残基)或氨基)经聚乙二醇化。半胱氨酰基特异性修饰试剂的示例包括peg马来酰亚胺、peg碘乙酸酯、peg硫醇和peg乙烯基砜。所有四种在温和条件和中性至略微碱性的ph下都具有强烈半胱氨酰基特异性，但每种都具有一些缺点。与马来酰亚胺形成的硫醚在碱性条件下可能有些不稳定，因此用此连接体可能对调配物选择有一些限制。与碘peg形成的硫代氨基甲酸酯键更稳定，但游离碘可在一些条件下修饰酪氨酸残基。peg硫醇与蛋白质硫醇形成二硫键，但此链接在碱性条件下也可能不稳定。与马来酰亚胺和碘peg相比，peg-乙烯基反应性相对较慢；然而，形成的硫醚链接极为稳定。其较慢的反应速率也可使peg-乙烯基砜反应更容易控制。
由于天然半胱氨酰基残基通常呈二硫键的形式或为生物活性所必需，因此很少在所述残基处实施位点特异性聚乙二醇化。另一方面，定点诱变可用于为硫醇特异性连接体纳入半胱氨酰基聚乙二醇化位点。必须设计半胱氨酸突变，使得其对聚乙二醇化试剂可及且在聚乙二醇化后仍具有生物活性。
氨特异性修饰剂包括pegnhs酯、peg甲苯磺酸酯、peg醛、peg异硫氰酸酯和其他几种。所有都在温和条件下反应且对氨基极具特异性。pegnhs酯可能为反应性较强的试剂之一；然而，其高反应性可使聚乙二醇化反应难以大规模控制。peg醛与氨基形成亚胺，其接着经氰基硼氢化钠还原为二级胺。与硼氢化钠不同，氰基硼氢化钠不会还原二硫键。然而，此化学物质毒性很大且必须小心处理，特别是在较低ph下，其会挥发。
由于大多数蛋白质上存在多个离氨酸残基，故位点特异性聚乙二醇化可能为挑战。幸运的是，由于所述试剂与未质子化的氨基反应，故可通过在较低ph下实施反应将聚乙二醇化合物引导至低-pk氨基。通常，α-氨基的pk比离氨酸残基的ε-氨基低1-2个ph单位。通过在ph7或更低ph下聚乙二醇化分子，可以经常获得对n-末端的高选择性。然而，仅当蛋白质的n-末端部分并非生物活性所必需的时，此才是可行的。此外，来自聚乙二醇化的药物动力学益处经常超过活体外生物活性的显著损失，从而导致产品具有远更大的活体内生物活性，而不管聚乙二醇化学如何。
在研发聚乙二醇化程序时，有若干参数需要考虑。幸运的是，通常有不超过四个或五个关键参数。对聚乙二醇化条件的优化的“实验的设计”方法可为极为有用的。对于硫醇特异性聚乙二醇化反应，欲考虑的参数包括：蛋白质浓度、peg对蛋白质比率(基于摩尔浓度)、温度、ph、反应时间，且在一些情况下排除氧。(氧可促进蛋白质形成分子间二硫键，此会降低聚乙二醇化产物的产率。)特别是当靶向n-末端氨基时，除了ph可能更为关键外，应考虑相同的因素(除氧气外)进行氨特异性修饰。
对于氨和硫醇特异性修饰，反应条件可能影响蛋白质的稳定性。此可能会限制温度、蛋白质浓度和ph。另外，在开始聚乙二醇化反应之前，应知晓peg连接体的反应性。举例而言，若聚乙二醇化剂的活性仅为70％，则所用peg的量应确保在蛋白质对peg反应的化学计量中仅计数活性peg分子。
vi.蛋白质和肽
在某些实施例中，本发明涉及包含至少一种蛋白质或肽(例如犬尿氨酸酶)的新颖组合物。所述肽可包含在融合蛋白中或与如上文文献所述的试剂缀合。
如本文所用，蛋白质或肽通常是指(但不限于)大于约200个氨基酸、高达自基因翻译的全长序列的蛋白质；大于约100个氨基酸的多肽；和/或约3至约100个氨基酸的肽。为方便起见，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用。
如本文所用，“氨基酸残基”是指任何天然氨基酸、任何氨基酸衍生物或业内已知的任何氨基酸模拟物。在某些实施例中，蛋白质或肽的残基是连续的，无任何非氨基酸中断氨基酸残基的序列。在其他实施例中，序列可包含一个或多个非氨基酸部分。在特定实施例中，蛋白质或肽的残基序列可由一或多个非氨基酸部分中断。
因此，术语“蛋白质或肽”涵盖包含天然蛋白质中发现的20种常见氨基酸中的至少一种或至少一种经修饰或不常见的氨基酸的氨基酸序列。
蛋白质或肽可通过本领域技术人员已知的任何技术制备，所述技术包括通过标准分子生物学技术表达蛋白质、多肽或肽，自天然来源分离蛋白质或肽，或化学合成蛋白质或肽。先前已公开对应于各种基因的核苷酸和蛋白质、多肽和肽序列，且可在本领域技术人员已知的计算器化数据库中发现。一种所述数据库是国家生物技术信息中心的genbank和genpept数据库(可自全球信息网在ncbi.nlm.nih.gov/获得)。可使用本文公开的技术或如本领域技术人员已知扩增和/或表达已知基因的编码区。或者，本领域技术人员已知蛋白质、多肽和肽的各种商业制剂。
vii.核酸和载体
在本发明的某些方面中，可公开编码犬尿氨酸酶或含有犬尿氨酸酶的融合蛋白的核酸序列。根据使用的表达系统，可基于传统方法选择核酸序列。举例而言，如果犬尿氨酸酶是源自人类犬尿氨酸酶且含有大肠杆菌中很少使用的多个密码子，则其可能会干扰表达。因此，其各别基因或变异体可经密码子优化用于大肠杆菌表达。各种载体也可用于表达感兴趣的蛋白质。例示性载体包括(但不限于)质体载体、病毒载体、转座子或基于脂质体的载体。
viii.宿主细胞
宿主细胞可为任何可经转化以允许犬尿氨酸酶和其缀合物表达和分泌的细胞。宿主细胞可为细菌、哺乳动物细胞、酵母或丝状真菌。各种细菌包括埃希氏菌属(escherichia)和芽孢杆菌属(bacillus)。发现属于酵母菌属(saccharomyces)或毕赤酵母属(pichia)的酵母可用作适当的
ix.医药组合物
预计新颖犬尿氨酸酶可全身或局部投与以在患有局部晚期或转移性癌症的癌症患者中抑制肿瘤细胞生长且最优选地杀死癌细胞。其可经静脉内、鞘内和/或腹膜内投与。其可单独或与抗增殖药物组合投与。在一个实施例中，其是在手术或其他程序之前投与以减少患者中的癌症负荷。或者，其可在手术后投与以确保任何剩余的癌症(例如，手术未能消除的癌症)不能存活。
本发明并不意欲受到治疗制剂的特定性质的限制。举例而言，所述组合物可与生物学上可耐受的液体、凝胶或固体载体、稀释剂和赋形剂一起提供于调配物中。所述治疗制剂可投与哺乳动物用于兽医用途，例如用于家畜，以及在人类中以类似于其他治疗剂的方式临床使用。一般来说，治疗性能所需的剂量将根据使用类型和投与方式以及个别个体的特殊要求而变化。
所述组合物通常作为注射物制备为液体溶液或悬浮液。适宜稀释剂和赋形剂为(例如)水、盐水、右旋糖、甘油或诸如此类以及它们的组合。另外，如果期望的话，则所述组合物可含有微量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、稳定剂或ph缓冲剂。
在涵盖临床应用的情况下，可能需要以适合于预期应用的形式制备包含蛋白质、抗体和药物的医药组合物。通常，医药组合物可包含有效量的一或多种犬尿氨酸酶或在医药学上可接受的载剂中溶解或分散的其他药剂。词组“医药学或药理学上可接受的”是指当投与动物时(例如如果适当的话，人类)不产生不利的、过敏或其他不利反应的分子实体和组合物。如由以引用方式并入本文中remington′spharmaceuticalsciences(第18版，1990)所例示，本领域技术人员根据本公开案将已知含有至少一种通过本文公开的方法分离的犬尿氨酸酶或附加活性成分的医药组合物的制备。此外，对于动物(例如，人类)投与，应理解，制剂应满足fda生物标准办公室所需的无菌、致热原性、一般安全性和纯度标准。
如本文所用的“医药学上可接受的载剂”包括如本领域技术人员所知的任何和所有溶剂、分散介质、涂料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、黏合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料、诸如此类材料以及它们的组合(参见，例如remington’spharmaceuticalsciences，第18版，1990，以引用方式并入本文中)。除非任何传统载剂与活性成分不兼容，否则涵盖其在医药组合物中的使用。
本发明的某些实施例可包含不同类型的载体，此取决于其是以固体、液体还是气溶胶形式投与，以及其是否需要对于投与的途径(例如注射)是无菌的。组合物可经静脉内、真皮内、经皮、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、直肠内、肌内、皮下、黏膜、经口、外用、局部、通过吸入(例如，气溶胶吸入)、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过局部灌注直接浸浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、于脂质组合物(例如，脂质体)中或通过如本领域技术人员已知的上述的任何组合来投与(参见，例如remington’spharmaceuticalsciences，第18版，1990，以引用方式并入本文中)。
可将经修饰的多肽调配成呈游离碱、中性或盐形式的组合物。医药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如，与蛋白质性组合物的游离氨基形成的那些盐，或与无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸或苦杏仁酸)形成的那些盐。与游离羧基形成的盐也可衍生自无机碱，例如钠、钾、铵、钙或铁的氢化物；或有机碱，例如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因(procaine)。在调配时，溶液将以与剂量调配物兼容的方式和以治疗有效的量投与。调配物易于以各种剂型投与，例如调配用于非经肠投与，例如可注射溶液或用于递送至肺的气溶胶，或调配用于饮食投与，例如药物释放胶囊和诸如此类。
此外，根据本发明的某些方面，适用于投与的组合物可在具有或无惰性稀释剂的医药学上可接受的载剂中提供。载剂应可同化且包括液体、半固体，即膏糊或固体载体。除非任何传统介质、试剂、稀释剂或载剂对接受者或其中所含组合物的治疗有效性有害，否则其在可投与组合物中用于实践所述方法的用途是适当的。载剂或稀释剂的示例包括脂肪、油、水、盐水溶液、脂质、脂质体、树脂、黏合剂、填充剂和诸如此类或它们的组合。所述组合物也可包含各种抗氧化剂以阻止一或多种组分的氧化。另外，预防微生物的作用可由防腐剂实现，例如各种抗菌剂和抗真菌剂，包括(但不限于)对羟苯甲酸酯(例如，对羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯)、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞或它们的组合。
根据本发明的某些方面，以任何方便且实用的方式，即通过溶解、悬浮、乳化、混合、囊封、吸收和诸如此类组合组合物与载体。所述程序对于本领域技术人员是常规的。
在本发明的具体实施例中，将组合物与半固体或固体载剂彻底组合或混合。混合可以任何方便的方式(例如研磨)实施。也可在混合过程中添加稳定剂，以保护组合物免于损失治疗活性，即在胃中变性。用于组合物中的稳定剂的示例包括缓冲剂、氨基酸(例如甘氨酸和离氨酸)、碳水化合物(例如右旋糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇、甘露醇等)。
在其他实施例中，本发明可涉及包括犬尿氨酸酶、一或多种脂质和水性溶剂的医药脂质媒剂组合物的用途。如本文所用术语“脂质”将被定义为包括任何广泛范围的物质，所述物质的特征在于在水中不溶且可用有机溶剂萃取。此类广泛的化合物为本领域技术人员所熟知，且如本文所用的术语“脂质”，其不限于任何特定的结构。示例包括含有长链脂肪族烃和其衍生物的化合物。脂质可为天然或合成的(即，由人设计或产生)。然而，脂质通常为生物物质。生物脂质为业内所熟知，且包括(例如)中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜烯、溶血脂、鞘醣脂、醣酯、硫脂、具有醚和酯连接的脂肪酸的脂质、可聚合脂质以及它们的组合。当然，除了本文具体阐述的那些化合物以外的化合物也被本领域技术人员理解为也包括在组合物和方法中的脂质。
本领域技术人员可熟悉用于在脂质媒剂中分散组合物的技术范围。举例而言，犬尿氨酸酶或其融合蛋白可分散于含有脂质的溶液中，用脂质溶解，用脂质乳化，与脂质混合，与脂质组合，与脂质共价键结，包含作为脂质中的悬浮液，含有或与胶束或脂质体复合，或者通过本领域技术人员已知的任何方法与脂质或脂质结构缔合。分散可能会或可能不会导致脂质体的形成。
投与动物患者的组合物的实际剂量可通过物理和生理因素来确定，例如患者的体重、病况的严重程度、所治疗的疾病的类型、先前或同时的治疗介入、特发病，以及投与的途径。根据投与的剂量和途径，优选地剂量和/或有效量的投与数量可根据个体的反应而变化。在任一情形下，负责投与的执业医师将决定组合物中活性成分的浓度和用于个别个体的适当剂量。
在某些实施例中，医药组合物可包含(例如)至少约0.1％的活性化合物。在其他实施例中，活性化合物可包含约2％至约75％，或约25％至约60％和其中可衍生的任何范围的重量单位。当然，每种治疗上有用的组合物中活性化合物的量可以在任何给定单位剂量的化合物中获得适宜剂量的方式制备。诸如溶解度、生物利用度、生物半衰期、投与途径、产品储放寿命等因素以及其他药理学考虑将由本领域技术人员涵盖用于制备所述医药制剂，且因此，可能期望多种剂量和治疗方案。
在其他非限制性示例中，剂量也可包含每次投与约1微克/kg/体重、约5微克/kg/体重、约10微克/kg/体重、约50微克/kg/体重、约100微克/kg/体重、约200微克/kg/体重、约350微克/kg/体重、约500微克/kg/体重、约1毫克/kg/体重、约5毫克/kg/体重、约10毫克/kg/体重、约50毫克/kg/体重、约100毫克/kg/体重、约200毫克/kg/体重、约350毫克/kg/体重、约500毫克/kg/体重至约1000毫克/kg/体重或更多和其中可衍生的任何范围。在自本文列示的数字的可衍生范围的非限制性示例中，基于上述数字，可投与约5毫克/kg/体重至约100毫克/kg/体重、约5微克/kg/体重至约500毫克/kg/体重等的范围。
x.组合治疗
在某些实施例中，本发明实施例的组合物和方法涉及与第二或另外的疗法组合投与犬尿氨酸酶。所述疗法可应用于治疗与犬尿氨酸依赖性相关的任何疾病。举例而言，所述疾病可为癌症。
方法和组合物(包括组合疗法)增强治疗或保护效应，和/或增加另一抗癌疗法或抗过度增殖疗法的治疗效应。治疗性和预防性方法和组合物可以有效实现期望效应(例如杀死癌细胞和/或抑制细胞过度增殖)的组合量提供。所述过程可涉及投与犬尿氨酸酶和第二疗法。第二疗法可能具有或可能不具有直接细胞毒性效应。举例而言，第二疗法可为上调免疫系统而无直接细胞毒性效应的药剂。组织、肿瘤或细胞可暴露于一或多种包含一或多种药剂(例如，犬尿氨酸酶或或抗癌剂)的组合物或药理学调配物，或通过暴露组织、肿瘤和/或细胞于两种或更多种不同组合物或调配物，其中一种组合物提供1)犬尿氨酸酶，2)抗癌剂，或3)犬尿氨酸酶和抗癌剂二者。而且，预计所述组合疗法可与化学疗法、放射疗法、手术疗法或免疫疗法结合使用。
当应用于细胞时，术语“接触”和“暴露”在本文中用于阐述治疗性构建体和化学治疗剂或放射性治疗剂递送至靶细胞或与靶细胞直接并置放置的过程。例如，为了实现细胞杀伤，将两种药剂以有效杀死细胞或防止其分裂的组合量递送至细胞。
犬尿氨酸酶可以相对于抗癌治疗在之前、期间、之后或以各种组合投与。投与可以同时至数分钟至数天至数周的间隔。在将犬尿氨酸与抗癌剂分开提供给患者的实施例中，通常可确保在每次递送的时间之间不会停止相当长的一段时间，使得两种化合物仍然能够对患者发挥有利地组合的效应。在所述情况下，预计可彼此在约12至24或72小时内、更具体地彼此在约6-12小时内向患者提供犬尿氨酸酶和抗癌症法。在一些情况下，可能期望显著延长治疗时间段，其中在各别投与之间流逝几天(2、3、4、5、6或7天)至几周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。
在某些实施例中，疗程将持续1-90天或更长时间(此所述范围包括插入天)。预计可在第1天至第90天的任何一天(此所述范围包括插入天)或其任一组合给予一种药剂，且在第1天至第90天的任何一天(此所述范围包括插入天)或其任一组合给予另一种药剂。在一天(24小时时段)内，患者可被给予一或多种药剂的一或多次投与。此外，在疗程的后，预计有一段时间未投与抗癌治疗。根据患者的状况(例如其预后、力量、健康等)，此时间段可能持续1-7天和/或1-5周和/或1-12个月或更长时间(此所述范围包括插入天)。预计将根据需要重复治疗周期。
可以采用各种组合。对于下文的示例，犬尿氨酸酶为“a”且抗癌疗法为“b”：
向患者投与本发明实施例的任何化合物或疗法将遵循所述化合物的投与的一般方案，同时考虑药剂的毒性(如果有的话)。因此，在一些实施例中，存在可归因于组合疗法的监测毒性的步骤。
xi.实施例
本发明包括以下实施例以展现本发明的优选实施例。本领域技术人员应了解，下列实施例中公开的技术代表本发明者发现可良好用于实践本发明的技术，且因此可认为所述技术是实践本发明的优选方式。然而，那些本领域技术人员借助于本公开案应了解，可在不背离本发明的精神和范围的情况下对所公开具体实施例作出多种改变且仍获得相同或类似结果。
实施例1-人类kynase(b-kynase)的研发和表征
本研究涉及工程改造h-kynase变异体且研发变异体作为多种肿瘤的治疗剂。工程改造许多人类变异体且测定其对kyn的催化活性(kcat/km)，与细菌工具kynase相当(图1a和下面的表2)。优化变异体用于增加催化活性和在90％人类血清中的活体外抗失活性(表示为在血清中培育一段时间后的残余活性)。发现经工程改造的人类变异体极大地改善了人类血清活体外的催化稳定性(图1b和表2)。
人类变异体(例如蛋白质(68)和(153))在单次静脉内剂量后显示小鼠中延长的kyn降解(图1c)。对于所述研究，向6-8周且体重约18-20g的balb/c雌性小鼠静脉内投用媒剂(pbsph7.4)或10mg/kg(68)/(153)。在投用后6、24、48、72和120小时，最终将小鼠放血(n＝4只小鼠/时间点)且立即用含有酸的内标准品(is)溶液猝灭血浆样品且处理用于犬尿氨酸的lc/ms分析。
实施例2-hskyn性能和抗肿瘤记忆
接下来，在ct26小鼠模型以及b16-ido模型中测试hskyn变异体的活体内性能。向6-8周龄雌性balb/c小鼠的右下腹侧中皮下植入100μlpbs中的500,000个ct26细胞。在细胞接种后第4天开始给药。将蛋白质(68)以10mg/kgq6d皮下给药3个剂量；epacadostat以300mg/kgqd经口给药(5天，2天休息)；抗pd-1以10mg/kgq3d腹膜内给药5个剂量。用数字卡尺每周测量肿瘤三次，且使用公式体积＝(lxwxt)xpi/6计算肿瘤体积。当肿瘤达到＞2,000mm3时，处死动物(图2a)。在自(a)出现最后一个完全反应者(cr)后100天，将幼稚balb/c小鼠和cr用皮下植入左下腹侧的ct26再攻击。如上所述测量肿瘤体积，且结果显示在图2b中。
实施例3-hskyn肿瘤免疫分型
在携带ct26肿瘤的小鼠中实施(68)的免疫分型。向6-8周龄雌性balb/c的右下腹侧中皮下植入100μlpbs中的500,000个ct26细胞。在细胞接种后第4天开始给药。用数字卡尺每周测量肿瘤三次，且使用公式体积＝(lxwxt)xpi/6计算肿瘤体积。在最后一个剂量后24h处死动物且收集肿瘤用于进一步分析。将蛋白质(68)以10mg/kgq6d皮下给药2个剂量；抗pd-1以10mg/kgq3d腹膜内给药3个剂量。使用qiagenrnaeasy套组提取rna，且使用pancancer免疫分型组将100ngrna用于nanostring分析(图3a)。3b中的研究，将(68)以10mg/kgq6d皮下给药2个剂量。用来自miltenyi的肿瘤解离套组消解肿瘤。将单细胞悬浮液用经标记的抗体染色且使用fortessa进行分析：cd8(cd45+cd3+cd8+cd4-)；treg(cd45+cd3+cd4+cd8-foxp3+cd25+)；m1巨噬细胞(cd45+cd11b+f4/80+mhcii+cd206-)；m2巨噬细胞(cd45+cd11b+f4/80+mhcii+cd206+)。
实施例4-大鼠和nhp中的主要hskyn变异体pd和pk特性
通过经由尾静脉缓慢注射，向雄性spraguedawley大鼠(200-300g)静脉内投用单剂量或3个周剂量的10mg/kg(153)。在投药前24hr(-24h)、第一、第二或第三剂量后6、24、48、72或120hr收集血样(n＝4只小鼠/时间点)。如图1c中所述处理血浆样品，且通过lc/ms分析犬尿氨酸水平(图4a)。接下来，通过经由头静脉缓慢注射，向一只雄性和一只雌性食蟹猴(≥2岁)静脉投用单剂量的10mg/kg(153)。在投药前(0h)、投药后0.25、6、24、48、72、120、168、240和336hr收集血液。将血浆样品分成两部分：一部分如图1c所述进行处理，用于犬尿氨酸lc/ms分析(图4b)；另一部分进行聚乙二醇化蛋白的elisa分析(抗peg抗体(abcam编号ab51257)捕获和生物素化抗peg抗体(abcam编号ab53449)检测)。使用winnonlin软件程序通过非隔室方法分析血浆浓度对时间数据，且计算具有c0、cmax、t1/2、auc0-最后、auc0-inf的药物动力学参数。
因此，本研究显示，kynase的犬尿氨酸降解广泛适用于表达ido和tdo的肿瘤。hskyn蛋白质工程改造实现催化活性增加500倍以上，且大大提高了催化稳定性，从而产生了稳健且耐久的活体内kyn耗竭。与epacadostat相比，hskyn变异体展现优异单一药剂和pd1组合性能，以及持续抗肿瘤记忆。增加的ifng相关的t细胞发炎特征基因表达和m1/m2巨噬细胞比率可能为hskyn+/-pd1介导的肿瘤性能的潜在机制。最后，临床前毒物学物种的有利pk/pd特性支持主要hskyn变异体的进一步临床研发。
***
根据本公开案，无需过多实验即可制作和执行本文公开和主张的所有方法。尽管已经根据优选地实施例阐述了本发明的组合物和方法，但本领域技术人员应明了，可在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下对方法和步骤或本文所述方法的步骤的顺序进行变化。更具体地，应明了，某些在化学和生理上都相关的试剂可取代本文所述试剂且同时可达成相同或相似结果。本领域技术人员明了的所有所述相似取代和修改都被认为是在由所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念内。
参考文献
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在以下编号的实施例中进一步阐述本公开案：
实施例1.一种经分离、经修饰的人类犬尿氨酸酶，所述经修饰的酶具有与seqidno：1的人类犬尿氨酸酶具有至少90％一致性的氨基酸序列且包含至少一个选自由以下组成的组的取代：l8p、k38e、y47l、i48f、k50q、i51m、s60n、k64n、d65g、e66k、n67d、n67p、d67s、a68f、a68t、a68v、f71l、f71m、l72n、k84e、e88n、e89k、e89s、e90q、d92e、k93n、k93t、a95h、a95q、k96n、i97h、i97l、i97v、a98g、a99g、a99i、a99r、a99s、a99t、a99v、y100n、y100s、y100t、g101a、h102w、e103f、e103h、e103n、e103q、e103r、e103v、e103w、v104d、v104e、v104f、v104h、v104k、v104l、v104r、g105a、g105h、g105s、g105t、e106d、k106d、k106e、k106h、k106n、r107p、r107s、p108r、i110a、i110f、i110l、i110m、i110t、t111d、t111h、t111n、t111r、g112a、g112c、g112d、g112k、g112l、g112m、g112q、g112r、g112s、g112t、g112y、n127k、i131v、a132v、l133v、a136t、l137t、t138s、n140d、h142q、q14r、y156h、k163t、d168e、h169r、q175l、i183f、i183l、i183p、i183s、e184a、e184d、e184r、e184t、e184v、e185t、m187l、m189i、k191a、k191g、k191h、k191m、k191n、k191r、k191s、k191t、k191w、e197a、e197d、e197f、e197k、e197m、e197q、e197s、e197t、e197v、i201c、i201e、i201f、i201h、i201l、i201s、i201t、i201v、h203k、l219m、l219w、f220l、v223i、f225y、h230f、h230l、h230y、n232s、y246f、f249w、d250e、s274a、s274c、s274g、s274n、s274t、l278m、a280g、a280s、a280t、g281s、a282m、a282p、g284n、i285l、v303l、v303s、f306w、f306y、s311n、k315e、d317e、d317k、i331c、i331l、i331n、i331s、i331t、i331v、n333t、p334n、p335t、l337t、l338a、l338q、s341i、k373e、k373n、n375a、n375h、y376c、y376f、y376l、k378g、k378p、k378q、k378r、k380g、k380s、a382g、a382r、a382t、t383s、k384g、k384n、p386k、p386s、v387l、n389e、i405l、f407y、s408d、s408n、n411r、d413s、d413v、q416t、e419a、e419l、k420e、r421n、v424i、k427m、n429e、g432a和a436t。
实施例2.如实施例1的酶，其中所述氨基酸序列与表1的多肽中的任一者的氨基酸序列具有至少90％一致性。
实施例3.如实施例1或2的酶，其包含a282、f306和/或f249处的取代。
实施例4.如实施例1至3中任一项的酶，其包含f306w取代。
实施例5.如实施例1至4中任一项的酶，其包含l72n取代。
实施例6.如实施例1至5中任一项的，其包含h102w和/或n333t取代。
实施例7.如实施例1至6中任一项的酶，其包含a99处的取代。
实施例8.如实施例1至7中任一项的酶，其包含g112处的取代。
实施例9.如实施例1至8中任一项的酶，其包含e103处的取代。
实施例10.如实施例1至9中任一项的酶，其包含v104处的取代。
实施例11.如实施例1至10中任一项的酶，其包含s408处的取代。
实施例12.如实施例1至11中任一项的酶，其包含i183p取代。
实施例13.如实施例1至12中任一项的酶，其包含r107p取代。
实施例14.如实施例1至13中任一项的酶，其包含a436t取代。
实施例15.如实施例1至14中任一项的酶，其包含至少一个选自l72n、h102w、a282p、f306w、i331s和n333t的取代。
实施例16.如实施例1至15中任一项的酶，其包含至少两个、三个、四个或五个选自l72n、h102w、a282p、f306w、i331s和n333t的取代。
实施例17.如实施例1至16中任一项的酶，其包含取代l72n、h102w、a282p、f306w、i331s和n333t。
实施例18.如实施例1至17中任一项的酶，其中所述酶相对于kyn的催化活性(kcat/km)为至少8000m-1s-1。
实施例19.如实施例1至18中任一项的酶，其中所述酶对犬尿胺酸(kyn)的催化活性(kcat/km)介于约8000m-1s-1与40000m-1s-1之间；介于10000m-1s-1与40000m-1s-1之间；介于20000m-1s-1与40000m-1s-1之间；或介于25000m-1s-1与35000m-1s-1之间。
实施例20.如实施例1至19中任一项的酶，其中所述氨基酸序列与seqidno：2的氨基酸序列具有至少90％一致性。
实施例21.如实施例20的酶，其中所述氨基酸序列与seqidno：2的氨基酸序列具有至少95％一致性。
实施例22.如实施例1至19中任一项的酶，其中所述氨基酸序列与seqidno：3的氨基酸序列具有至少90％一致性。
实施例23.如实施例22的酶，其中所述氨基酸序列与seqidno：3的氨基酸序列具有至少95％一致性。
实施例24.如实施例1至23中任一项的酶，其进一步包含异源肽区段。
实施例25.如实施例1至24中任一项的酶，其中所述酶与聚乙二醇(peg)偶合。
实施例26.如实施例25的酶，其中所述酶经由一或多个lys或cys残基与peg偶合。
实施例27.一种核酸，其包含编码如实施例1至26中任一项的酶的核苷酸序列。
实施例28.如实施例27的核酸，其中所述核酸经密码子优化用于在细菌、真菌、昆虫或哺乳动物中表达。
实施例29.一种表达载体，其包含如实施例27或28的核酸。
实施例30.一种宿主细胞，其包含如实施例27或28的核酸或如实施例29的表达载体。
实施例31.如实施例30的宿主细胞，其中所述宿主细胞为细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
实施例32.如实施例31的宿主细胞，其中所述宿主细胞为细菌细胞。
实施例33.如实施例31的宿主细胞，其中所述宿主细胞为哺乳动物细胞，视情况其中所述哺乳动物细胞为免疫效应细胞。
实施例34.如实施例33的宿主细胞，其中所述免疫效应细胞为nk细胞或t细胞。
实施例35.一种医药调配物，其包含于医药学上可接受的载剂中的根据实施例1至26中任一项的酶。
实施例36.一种治疗患有肿瘤的个体的方法，其包括向所述个体投与有效量的如实施例1至26中任一项的酶或如实施例35的调配物。
实施例37.一种组合物，其包含有效量的如实施例1至26中任一项的酶或如实施例35的调配物，其用于治疗患有肿瘤的个体。
实施例38.如实施例36的方法或如实施例37的组合物，其中所述个体经鉴别为患有表达ido1、ido2或tdo的肿瘤。
实施例39.如实施例36或38的方法或如实施例37或38的组合物，其中所述肿瘤为实体肿瘤。
实施例40.如实施例36或38的方法或如实施例37或38的组合物，其中所述肿瘤为血液肿瘤。
实施例41.如实施例36和38至40中任一项的方法或如实施例37至40中任一项的组合物，其中所述个体为人类患者。
实施例42.如实施例36和38至41中任一项的方法或如实施例37至41中任一项的组合物，其中所述酶或所述调配物是经肿瘤内、静脉内、真皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、眼内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、肌内、皮下、结膜下、囊泡内、经黏膜、心包内、脐内、经口、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过局部灌注直接浸浴靶细胞、通过导管或通过灌洗来投与。
实施例43.如实施例36和38至42中任一项的方法，其进一步包括至少投与第二抗癌疗法。
实施例44.如实施例43的方法，，其中所述第二抗癌疗法为辐射疗法、手术疗法、免疫疗法或第二抗癌化合物。
实施例45.如实施例44的方法，其中所述第二抗癌化合物为免疫检查点抑制剂。
实施例46.如实施例44或45的方法，其中所述第二抗癌化合物为抗体。
实施例47.如实施例44至46中任一项的方法，其中所述第二抗癌化合物包含抗pd1、抗ctla-4或抗pd-l1抗体。
实施例48.如实施例44至47中任一项的方法，其中所述第二抗癌化合物为抗体-药物缀合物。
实施例49.如实施例44至48中任一项的方法，其中所述免疫疗法包括投与免疫效应细胞或免疫原性组合物。
实施例50.如实施例49的方法，其中所述免疫原性组合物包含癌细胞抗原。
实施例51.如实施例49或50的方法，其中所述免疫效应细胞包含nk细胞或t细胞。
实施例52.如实施例49至51中任一项的方法，其中所述免疫效应细胞包含cart细胞。
实施例53.一种转基因t细胞，其包含根据实施例1至26中任一项的表达的犬尿氨酸酶。
实施例54.如实施例53的细胞，其进一步包含表达的嵌合抗原t细胞受体(car)或经工程改造的t细胞受体(tcr)。
实施例55.如实施例53或54的细胞，其中所述细胞为人类t细胞。
实施例56.如实施例54或55的细胞，其中编码所述car和所述犬尿氨酸酶的dna整合至所述细胞的基因组中。
实施例57.如实施例54至56中任一项的细胞，其中将所述car靶向癌细胞抗原。
实施例58.如实施例57的细胞，其中所述癌细胞抗原为her2、cd19、cd20或gd2。
实施例59.一种在患有肿瘤的人类个体中提供t细胞反应的方法，其包括向所述个体投与有效量的根据实施例53至58中任一项的转基因细胞。
实施例60.一种组合物，其包含有效量的根据实施例53至58中任一项的转基因细胞，其用于治疗患有肿瘤的个体。
实施例61.如实施例59的方法或如实施例60的组合物，其中所述转基因细胞为自体的。
实施例62.如实施例59的方法或如实施例60的组合物，其中所述转基因细胞为异源的。
实施例63.一种根据实施例1至26中任一项的犬尿氨酸酶、根据实施例27或28的核酸或根据实施例29的表达载体的用途，其用于制造用于治疗肿瘤的药剂。
序列附录：
seqidno：1：野生型人类kynase
seqidno：2
蛋白质168：
seqidno：3
蛋白质153：
序列表
<110>德克萨斯大学系统董事会
<120>人类犬尿氨酸酶及其用途
<130>utfb.p1194wo
<150>62/658,261
<151>2018-04-16
<160>3
<170>patentin版本3.5
<210>1
<211>465
<212>prt
<213>智人
<400>1
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