作为JAK抑制剂的5至7元杂环酰胺的制作方法

作为jak抑制剂的5至7元杂环酰胺
技术领域
1.本发明涉及用作jak激酶抑制剂的化合物。本发明还涉及包含这些化合物的医药组合物和使用这些化合物治疗呼吸道疾病的方法。


背景技术：

2.哮喘为气管的慢性疾病，它没有预防或治愈方法。所述疾病的特征为气管发炎、纤维化、高反应性和重构，其皆促成气流限制。全世界估计有3亿人罹患哮喘，且据估计，截至2025年，患有哮喘的人数将增长超过1亿。在美国，约6％至8％的人口罹患哮喘，使其成为美国最常见的慢性疾病中的一种。虽然大多数患者可以用吸入皮质类固醇实现对哮喘症状的控制，所述吸入皮质类固醇可与白三烯修饰剂和/或长效β促效剂组合，但仍有一部分患有重度哮喘的患者的疾病不受惯用疗法控制。重度持续性哮喘被定义为对吸入皮质类固醇的较高剂量保持不受控制的疾病。虽然估计重度气喘患者占所有哮喘患者的约5％，其罹病率和死亡率高危且对气喘患者中健保资源利用的不相称份额负责。仍需要新颖治疗剂来治疗这些患者。
3.细胞介素为细胞间信号传导分子，其包括趋化因子、干扰素、介白素、淋巴介质和肿瘤坏死因子。细胞介素对于正常细胞生长和免疫性调节至关重要且还驱动免疫介导的疾病且有助于恶性细胞生长。多种细胞介素的经提高水平涉及哮喘发炎的病理学。举例来说，已展示靶向介白素(il)
‑
5和13的基于抗体的治疗剂以为重度哮喘患者子组提供临床益处。在涉及哮喘发炎的细胞介素中，多种视通过转录因子的信号转导与转录活化因子(signal transducer and activator of transcription；stat)家族传导信号的酪氨酸激酶(jak)的杰纳斯(janus)家族而定，通过信号传导路径起作用。涉及通过jak
‑
stat路径传导信号的哮喘发炎的细胞介素包括：il
‑
2、il
‑
3、il
‑
4、il
‑
5、il
‑
6、il
‑
9、il
‑
11、il
‑
13、il
‑
23、il
‑
31、il
‑
27、胸腺基质淋巴生成素(thymic stromal lymphopoietin；tslp)、干扰素
‑
γ(ifnγ)和粒细胞
‑
巨噬细胞群落刺激因子(granulocyte
‑
macrophage colony
‑
stimulating factor；gm
‑
csf)。
4.jak家族包含四个成员：jak1、jak2、jak3和酪氨酸激酶2(tyk2)。细胞介素结合至jak依赖性细胞介素受体诱发受体二聚，其使得jak激酶上的酪氨酸残基磷酸化，从而影响jak活化。磷酸化jak转而结合且使各种stat蛋白质磷酸化，所述stat蛋白质在单元细胞核中二聚、内化且直接调节基因转录，在其它作用中，导致与发炎疾病相关的下游作用。jak通常与细胞介素受体成对缔合作为均二聚体或杂二聚体。特定细胞介素与特定jak配对相关。jak家族的四个成员中的每一者涉及与哮喘发炎相关的细胞介素中的至少一者的信号传导。因此，相对于jak家族的所有成员，具有泛活性的化学抑制剂可调节有助于重度哮喘的宽范围促炎性路径。
5.然而，这些抑制剂的较宽抗炎性作用可抑制正常免疫细胞功能，潜在地引起感染风险提高。用jak抑制剂托法替尼(tofacitinib)观测到感染风险提高的证据，所述抑制剂经口给药以用于治疗类风湿性关节炎。在哮喘中，发炎定位于呼吸道。除哮喘以外，气管发
炎为其它呼吸疾病所特有的。慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease；copd)、囊肿性纤维化(cystic fibrosis；cf)、肺炎、间质肺病(包括特发性肺纤维化)、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合症、支气管炎、气肿和类肉瘤病也是呼吸道疾病，其中据信病理生理学与jak信号传导细胞介素有关。通过吸入向肺部局部施用jak抑制剂提供通过将有效抗细胞介素药剂直接递送至作用位点而治疗上有效的可能性，限制全身性暴露且因此限制不利的全身性免疫抑制的可能性。仍需要适用于向肺部局部施用以便治疗呼吸疾病的有效jak抑制剂。
6.jak信号传导细胞介素还在t细胞活化中起主要作用，t细胞为对许多免疫过程重要的免疫细胞亚类。病理性t细胞活化对于多种呼吸道疾病的病因至关重要。自体反应性t细胞在阻塞性细支气管炎伴机化性肺炎(还称为cos)中起作用。类似于cos，肺移植排斥反应的病因与移植供体肺的受体t细胞的异常t细胞活化有关。肺移植排斥反应可早期以原发性移植物功能障碍(primary graft dysfunction；pgd)、机化性肺炎(organizing pneumonia；op)、急性排斥反应(acute rejection；ar)或淋巴球性细支气管炎(lymphocytic bronchiolitis；lb)形式发生，或其可在肺移植后数年以慢性肺同种异体移植物功能障碍(chronic lung allograft dysfunction；clad)形式发生。clad先前已知为阻塞性细支气管炎(bronchiolitis obliterans；bo)，但现在被认为可以具有不同病理学表现的综合症，包括bo、限制性clad(rclad或ras)和嗜中性球性同种异体移植物功能障碍。慢性肺同种异体移植物功能障碍(clad)为长期管理肺移植受体中的主要挑战，因为其造成移植肺逐渐失去功能(高蒂埃(gauthier)等人,《当前移植代表(curr.transplant.rep.)》,2016,3(3),185
‑
191)。clad对治疗的反应不佳，且因此，仍需要能够预防或治疗此病况的有效化合物。例如ifnγ和il
‑
5的若干jak依赖性细胞介素在clad和肺移植排斥反应中上调(贝拉斯特吉(berastegui)等人,《临床移植(clin.transplant.)》2017,31,e12898)。此外，在jak依赖性ifn信号传导下游的cxcr3趋化因子(例如cxcl9和cxcl10)的高肺含量与肺移植患者的恶化结果有关(西诺(shino)等人,《科学公共图书馆综合(plos one)》,2017,12(7),e0180281)。全身性jak抑制经展示在肾脏移植排斥反应中有效(维森特(vicenti)等人,《美国移植杂志(american journal of transplantation)》,2012,12,2446
‑
56)。因此，jak抑制剂有可能有效治疗或预防肺移植排斥反应和clad。如描述为肺移植排斥反应的基础的类似t细胞活化事件还视为造血干细胞移植后可能发生的肺移植物抗宿主病(graft
‑
versus
‑
host disease；gvhd)的主要驱动因素。类似于clad，肺gvhd为一种慢性进行性病况，其结果非常不好且目前尚无经批准的治疗。95位接受全身性jak抑制剂卢佐替尼(ruxolitinib)作为补救治疗的患有类固醇难治性急性或慢性gvhd的患者的回溯性多中心调查研究证实，大多数患者(包括患有肺gvhd的这些患者)对卢佐替尼完全或部分反应(蔡瑟(zeiser)等人,《白血病(leukemia)》,2015,29,10,2062
‑
68)。由于全身性jak抑制与严重不良事件和小治疗指数相关，仍需要吸入肺部定向的非全身性jak抑制剂以预防和/或治疗肺移植排斥反应或肺gvhd。


技术实现要素：

7.一方面，本发明提供具有作为jak激酶抑制剂的活性的新颖化合物。
8.因此，本发明提供一种式(i)化合物：
[0009][0010]
其中：
[0011]
a为含有两个氮原子的6至7元单环杂环，其中a通过氮原子连接至(i)中的羰基，a经1至3个r2基团取代且任选地两个r2基团与a一起形成
‑
(ch2)
‑
桥接环；或
[0012]
a为吡咯烷基，其中所述吡咯烷基通过氮原子连接至(i)中的羰基且其中所述吡咯烷基经nr3r4取代；
[0013]
r1为c1‑3烷基；
[0014]
各r2独立地为任选地经
‑
oh取代的c1‑3烷基；
[0015]
r3为c1‑3烷基；
[0016]
且r4为c1‑3烷基；
[0017]
或其医药学上可接受的盐。
[0018]
本发明还提供一种包含本发明的化合物和医药学上可接受的载体的医药组合物。
[0019]
本发明还提供一种治疗哺乳动物的呼吸道疾病(尤其哮喘或clad)的方法，所述方法包含向哺乳动物施用治疗有效量的化合物或本发明的医药组合物。
[0020]
本发明还提供一种如本文中所描述的本发明化合物，其用于医学疗法中；以及本发明的化合物的用途，其用于制造用于治疗哺乳动物的呼吸道疾病的调配物或药物。
具体实施方式
[0021]
在一个实施例中，本发明提供具有作为jak激酶抑制剂的活性的新颖化合物。因此，本发明提供一种式(i)化合物：
[0022][0023]
其中：
[0024]
a为含有两个氮原子的6至7元单环杂环，其中a通过氮原子连接至(i)中的羰基，a经1至3个r2基团取代且任选地两个r2基团与a一起形成
‑
(ch2)
‑
桥接环；或
[0025]
a为吡咯烷基，其中所述吡咯烷基通过氮原子连接至(i)中的羰基且其中所述吡咯烷基经nr3r4取代；
[0026]
r1为c1‑3烷基；
[0027]
各r2独立地为任选地经
‑
oh取代的c1‑3烷基；
[0028]
r3为c1‑3烷基；
[0029]
且r4为c1‑3烷基；
[0030]
或其医药学上可接受的盐。
[0031]
在一些实施例中，化合物(i)具有式(i')：
[0032][0033]
在一些实施例中，r1选自由以下组成的群组：甲基、丙基和异丙基。
[0034]
在一些实施例中，a选自由以下组成的群组：哌嗪基、2,5
‑
二氮杂双环[2.2.1]庚基和1,4
‑
二氮杂环庚基，其中的每一者经1或2个r2基团取代，其中各r2独立地为任选地经
‑
oh取代的c1‑3烷基，或a为经nr3r4取代的吡咯烷基，其中r3为c1‑3烷基且r4为c1‑3烷基。
[0035]
在一些实施例中，a选自由以下组成的群组：
[0036][0037]
其中r2为任选地经
‑
oh取代的c1‑3烷基，r3为c1‑3烷基且r4为c1‑3烷基。
[0038]
在另一实施例中，本发明提供下式的化合物：
[0039][0040]
或其医药学上可接受的盐。
[0041]
在另一实施例中，本发明提供下式的化合物：
[0042][0043]
或其医药学上可接受的盐。
[0044]
在另一实施例中，本发明提供下式的化合物：
[0045][0046]
或其医药学上可接受的盐。
[0047]
在另一实施例中，本发明提供下式的化合物：
[0048][0049]
或其医药学上可接受的盐。
[0050]
在另一实施例中，本发明提供下式的化合物：
[0051][0052]
或其医药学上可接受的盐。
[0053]
在另一实施例中，本发明提供下式的化合物：
[0054][0055]
或其医药学上可接受的盐。
[0056]
在另一实施例中，本公开提供一种式(ii)化合物：
[0057][0058]
其中：
[0059]
r1为c1‑3烷基；
[0060]
a1选自由以下组成的群组：
[0061]
其中r2为任选地经
‑
oh取代的c1‑3烷基；
[0062]
或其医药学上可接受的盐。
[0063]
在一些实施例中，式(ii)化合物具有式(ii')：
[0064][0065]
在一些实施例中，r1选自由甲基和丙基组成的群组。
[0066]
在一些实施例中，a1选自由以下组成的群组：
[0067][0068]
在一些实施例中，a1选自由以下组成的群组：
[0069][0070]
且r1选自由甲基和丙基组成的群组。
[0071]
在另一实施例中，本公开提供一种式(iii)化合物：
[0072][0073]
其中：
[0074]
r1为c1‑3烷基；
[0075]
a2选自由以下组成的群组：
[0076][0077]
其中各r2独立地为任选地经
‑
oh取代的c1‑3烷基，r3为c1‑3烷基且r4为c1‑3烷基；
[0078]
或其医药学上可接受的盐。
[0079]
在一些实施例中，式(iii)化合物具有式(iii')：
[0080][0081]
在一些实施例中，r1选自由以下组成的群组：甲基、异丙基和丙基。
[0082]
在一些实施例中，a2选自由以下组成的群组：
[0083][0084]
在一些实施例中，r1选自由以下组成的群组：甲基、异丙基和丙基，且a2选自由以下组成的群组：
[0085][0086]
在另一实施例中，本公开提供一种式(iv)化合物：
[0087][0088]
其中：
[0089]
r1为c1‑3烷基；
[0090]
a3选自由以下组成的群组：
[0091][0092]
其中各r2独立地为任选地经
‑
oh取代的c1‑3烷基，r3为c1‑3烷基且r4为c1‑3烷基；
[0093]
或其医药学上可接受的盐。
[0094]
在一些实施例中，式(iv)化合物具有式(iv')：
[0095][0096]
在一些实施例中，r1选自由以下组成的群组：甲基、异丙基和丙基。
[0097]
在一些实施例中，a3选自由以下组成的群组：
[0098][0099]
在一些实施例中，r1选自由以下组成的群组：甲基、异丙基和丙基，且a3选自由以下组成的群组：
[0100][0101]
此外，四氢咪唑并哌啶部分的咪唑并部分以互变异构形式存在，如下文针对本公开的化合物的片段所说明。
[0102][0103]
根据iupac公约，这些图示产生咪唑部分的原子的不同编号：(1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
1h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶(结构a)对比于(1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶(结构b)。应理解，虽然结构以特定形式展示或命名，但本发明还包括其互变异构体。
[0104]
本公开的化合物可含有一或多个手性中心，且因此，这些化合物(和其中间物)可以外消旋混合物、纯立体异构体(也就是说，对映异构体或非对映异构体)、富含立体异构体的混合物等形式存在。除非另外指示，否则本文中所展示或所命名的在手性中心不具有确定立体化学的手性化合物打算包括在未确定的立体中心的任何或所有可能的立体异构体变化形式。除非另外指示，否则特定立体异构体的描述或命名意味着所指示立体中心具有经指定的立体化学，同时应理解为还可存在少量的其它立体异构体，其限制条件为所描绘或所命名的化合物的效用不因另一立体异构体的存在而消除。
[0105]
本公开的化合物还可含有若干碱基(例如，氨基)，且因此，这些化合物可以游离碱的形式或以各种盐形式存在，例如单质子化盐形式、二质子化盐形式、三质子化盐形式或其混合物。除非另外指示，否则所有这些形成均包括在本发明的范围内。
[0106]
本发明还包括经同位素标记的式(i)、(i')、(ii)、(ii')、(iii)、(iii')、(iv)和
(iv')的化合物，也就是说一或多个原子经原子数相同但原子质量不同于在自然界中占绝大多数的原子质量的原子置换或富集的式(i)、(i')、(ii)、(ii')、(iii)、(iii')、(iv)和(iv')的化合物。可并入至式(i)、(i')、(ii)、(ii')、(iii)、(iii')、(iv)和(iv')的化合物中的同位素的实例包括(但不限于)2h、3h、
11
c、
13
c、
14
c、
13
n、
15
n、
15
o、
17
o和
18
o。备受关注的是富含氚或碳14的式(i)、(i')、(ii)、(ii')、(iii)、(iii')、(iv)和(iv')的化合物，所述化合物可用于例如组织分布研究中。还备受关注的是尤其在代谢位点处富含氘的式(i)、(i')、(ii)、(ii')、(iii)、(iii')、(iv)和(iv')的化合物，所述化合物预期具有较高代谢稳定性。此外，备受关注的是富含例如
11
c、
15
o和
13
n的正电子发射同位素的式(i)、(i')、(ii)、(ii')、(iii)、(iii')、(iv)和(iv')的化合物，所述化合物可用于例如正电子发射断层摄影法(positron emission tomography；pet)研究中。
[0107]
定义
[0108]
除非另外指示，否则当描述本发明(包括其各种方面和实施例)时，以下术语具有以下含义。
[0109]
术语“烷基”意味着可以是直链或分支链或其组合的单价饱和烃基。除非另外定义，否则这些烷基通常含有1至10个碳原子。代表性烷基包括例如甲基(me)、乙基(et)、正丙基(n
‑
pr)或(npr)、异丙基(i
‑
pr)或(ipr)、正丁基(n
‑
bu)或(nbu)、仲丁基、异丁基、叔丁基(t
‑
bu)或(tbu)、正戊基、正己基、2,2
‑
二甲基丙基、2
‑
甲基丁基、3
‑
甲基丁基、2
‑
乙基丁基、2,2
‑
二甲基戊基、2
‑
丙基戊基等。
[0110]
当特定数目的碳原子打算用于特定术语时，碳原子数目在术语前展示。举例来说，术语“c1‑3烷基”意味着具有1至3个碳原子的烷基，其中碳原子呈任何化学上可接受的组态，包括直链或分支链组态。
[0111]
术语“环烷基”意味着可以是单环或多环的单价饱和碳环基。除非另外定义，否则这些环烷基通常含有3至10个碳原子。代表性环烷基包括例如环丙基(cpr)、环丁基(cbu)、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、金刚烷基等。
[0112]
术语“环丙基(cpropyl)”意味着环丙基(cyclopropyl)。
[0113]
术语“杂环基(heterocyclyl)”、“杂环(heterocycle)”、“杂环的(heterocyclic)”或“杂环(heterocyclic ring)”意味着总共具有3至10个环原子的单价饱和或部分不饱和环状非芳族基团，其中环含有2至9个碳环原子和1至4个选自氮、氧和硫的环杂原子。杂环基可以是单环或多环(也就是说，稠合或桥连)的。代表性杂环基包括例如吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、咪唑啶基、吗啉基、硫吗啉基、吲哚啉
‑3‑
基、2
‑
咪唑啉基、四氢哌喃基、1,2,3,4
‑
四氢异喹啉
‑2‑
基、奎宁环基、7
‑
氮杂降莰烷基、降托烷基(nortropanyl)等，其中连接点在任何可用的碳或氮环原子处。在上下文使得杂环基的连接点显而易见的情况下，这些基团可替代地称为非价物种，也就是说吡咯啶、哌啶、哌嗪、咪唑、四氢哌喃等。
[0114]
术语“卤基”意味着氟基、氯基、溴基或碘基。
[0115]
术语“治疗有效量”意味着当向有需要治疗的患者施用时足以实现治疗的量。
[0116]
术语“治疗(treating/treatment)”意味着预防、改善或抑止正治疗患者(特定来说是人类)的医学病况、疾病或病症(例如，呼吸道疾病)；或缓解医学病况、疾病或病症的症状。
[0117]
术语“医药学上可接受的盐”意味着向患者或哺乳动物(例如人类)施用可接受的
盐(例如，对于既定剂量方案具有可接受哺乳动物安全性的盐)。代表性医药学上可接受的盐包括以下的盐：乙酸、抗坏血酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、乙二磺酸、反丁烯二酸、龙胆酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、马尿酸、氢溴酸、氢氯酸、羟乙基磺酸、乳酸、乳糖酸、顺丁烯二酸、苹果酸、杏仁酸、甲磺酸、黏液酸、萘磺酸、萘
‑
1,5
‑
二磺酸、萘
‑
2,6
‑
二磺酸、烟碱酸、硝酸、乳清酸、双羟萘酸、泛酸、磷酸、丁二酸、硫酸、酒石酸、对甲苯磺酸和羟萘甲酸等。
[0118]
术语“其盐”意味着当酸的氢经阳离子(例如金属阳离子或有机阳离子等)置换时所形成的化合物。举例来说，阳离子可以是式(i)、(i')、(ii)、(ii')、(iii)、(iii')、(iv)或(iv')的化合物的质子化形式，也就是说其中一或多个氨基由酸质子化的形式。通常，所述盐为医药学上可接受的盐，但此对于不打算向患者施用的中间化合物的盐来说是不需要的。
[0119]
通用合成程序
[0120]
本发明的化合物和其中间物可根据以下通用方法和程序使用可商购或常规制备的起始材料和试剂来制备。除非另外指示，否则以下流程中所使用的取代基和变量(例如，a、r1、r2、r3等)具有与本文中其它地方所定义相同的含义。此外，除非另外指示，否则具有酸性或碱性原子或官能团的化合物可用作盐或可作为盐产生(在一些情况下，在特定反应中使用盐将需要在进行反应之前使用常规程序将盐转化为非盐形式，例如游离碱)。
[0121]
虽然可在以下程序中展示或描述本发明的特定实施例，但所属领域技术人员将认识到本发明的其它实施例或方面还可使用这些程序或通过使用所属领域技术人员已知的其它方法、试剂和起始材料来制备。特定来说，应了解，本发明的化合物可通过多种工艺途径制备，其中反应物以不同次序组合以提供不同中间物烯途径，以制备最终产物。
[0122]
以下流程中说明制备本发明的最终化合物的通用方法。
[0123][0124]
使化合物k
‑
18与酮或醛在还原剂的存在下反应，以得到式k
‑
19化合物。接着使化合物k
‑
19与胺a在典型酰胺键形成条件下反应，以得到化合物(i)。通常，使羧酸与约1当量与约4当量之间的胺a在过量碱的存在下接触。酰胺键形成反应可利用偶合剂，例如n,n,n',n'
‑
四甲基
‑
o
‑
(7
‑
氮杂苯并三唑
‑1‑
基)脲鎓六氟磷酸盐(hatu)或所属领域中已知的其它酰胺偶合剂。可添加肼以分解非所要副产物。反应通常在室温下进行约5分钟与约24小时之间或直至反应基本上完成为止。
[0125]
医药组合物
[0126]
本发明的化合物和其医药学上可接受的盐通常以医药组合物或调配物的形式使用。这些医药组合物可有利地通过吸入向患者施用。另外，可通过任何可接受的施用途径施用医药组合物，包括(但不限于)经口、经直肠、经鼻、局部(包括经皮)和肠胃外施用模式。
[0127]
因此，在其组合物方面中的一者中，本发明涉及一种医药组合物，其包含医药学上可接受的载体或赋形剂和式(i)、(i')、(ii)、(ii')、(iii)、(iii')、(iv)或(iv')的化合物，
其中如上文所定义，“式(i)、(i')、(ii)、(ii')、(iii)、(iii')、(iv)或(iv')的化合物”意味着式(i)、(i')、(ii)、(ii')、(iii)、(iii')、(iv)或(iv')的化合物或其医药学上可接受的盐。任选地，必要时这些医药组合物可含有其它治疗剂和/或调配剂。当论述组合物和其用途时，“本发明的化合物”在本文中还可称为“活性剂”。如本文中所使用，术语“本发明的化合物”打算包括式(i)所涵盖的所有化合物以及以式(ii)形式体现的物种和其医药学上可接受的盐。
[0128]
本发明的医药组合物通常含有治疗有效量的本发明的化合物。然而，所属领域技术人员将认识到，医药组合物可含有超过治疗有效量(也就是说，主体组合物)或小于治疗有效量(也就是说，经设计以用于多次施用以获得治疗有效量的个别单位剂量)。
[0129]
通常，这些医药组合物将含有约0.01至约95重量％的活性剂；包括例如约0.05至约30重量％；和约0.1重量％至约10重量％的活性剂。
[0130]
任何惯用载体或赋形剂可用于本发明的医药组合物中。选择特定载体或赋形剂，或载体或赋形剂的组合将视用于治疗特定患者或特定类型的医学病况或疾病状态的施用模式而定。就此来说，针对特定施用模式制备适合医药组合物很好地在熟习医药技术者的范围内。此外，本发明的医药组合物中所使用的载体或赋形剂是可以是商购的。借助于进一步说明，惯用调配技术描述于《雷明顿药学科学与实践(remington:the science and practice of pharmacy)》,第20版,马里兰州巴尔的摩的利平科特威廉姆斯怀特(lippincott williams&white,baltimore,maryland)(2000)；和h.c.安塞尔(h.c.ansel)等人,医药剂型和药物递送系统(pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems),第7版,马里兰州巴尔的摩的利平科特威廉姆斯怀特(lippincott williams&white,baltimore,maryland)(1999)中。
[0131]
可充当医药学上可接受的载体的材料的代表性实例包括(但不限于)以下：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素，例如微晶纤维素和其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末状黄蓍；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如丙三醇、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；褐藻酸；无热原质水；等渗盐水；林格氏溶液(ringer's solution)；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；和医药组合物中采用的其它无毒性兼容物质。
[0132]
通常通过将活性剂与医药学上可接受的载体和一或多种任选的成分充分且紧密地混合或掺合来制备医药组合物。接着可使用惯用程序和设备使所得均匀掺合的混合物成形为锭剂、胶囊、丸剂等或装载至其中。
[0133]
一方面，医药组合物适用于吸入施用。用于吸入施用的医药组合物通常呈气雾剂或散剂形式。这些组合物一般使用吸入器递送装置施用，例如干燥散剂吸入器(dry powder inhaler；dpi)、定量吸入器(metered
‑
dose inhaler；mdi)、喷雾器吸入器或类似递送装置。
[0134]
在一特定实施例中，医药组合物通过吸入，使用干燥散剂吸入器施用。这些干燥散剂吸入器通常以在吸气期间分散于患者的气流中的自由流动散剂形式来施用医药组合物。为获得自由流动散剂组合物，治疗剂通常用例如乳糖、淀粉、甘露糖醇、右旋糖、聚乳酸(pla)、聚乳酸交酯
‑
共
‑
乙交酯(plga)或其组合的适合赋形剂来调配。通常，使治疗剂微粉
化且与适合载体组合以形成适用于吸入的组合物。
[0135]
用于干燥散剂吸入器的代表性医药组合物包含呈微粉化形式的乳糖和本发明的化合物。这些干燥散剂组合物可例如通过将干燥研磨乳糖与治疗剂组合，且接着干掺合组分来制得。接着，通常将组合物装载至干燥散剂分配器中或与干燥散剂递送装置一起使用的吸入套筒或胶囊中。
[0136]
适用于通过吸入施用治疗剂的干燥散剂吸入器递送装置描述于所属领域中且这些装置的实例为可商购的。举例来说，代表性干燥散剂吸入器递送装置或产物包括：aeolizer(novartis)；airmax(ivax)；clickhaler(innovata biomed)；diskhaler(glaxosmithkline)；diskus/accuhaler(glaxosmithkline)；ellipta(glaxosmithkline)；easyhaler(orion pharma)；eclipse(aventis)；flowcaps(hovione)；handihaler(boehringer ingelheim)；pulvinal(chiesi)；rotahaler(glaxosmithkline)；skyehaler/certihaler(skyepharma)；twisthaler(schering
‑
plough)；turbuhaler(astrazeneca)；ultrahaler(aventis)；等。
[0137]
在另一特定实施例中，医药组合物通过吸入，使用定量吸入器施用。这些定量吸入器通常使用压缩推进剂气体排出测量量的治疗剂。因此，使用定量吸入器施用的医药组合物通常包含治疗剂于液化推进剂中的溶液或悬浮液。可采用任何适合的液化推进剂，包括氢氟烷烃(hfa)，例如1,1,1,2
‑
四氟乙烷(hfa 134a)和1,1,1,2,3,3,3
‑
七氟
‑
正丙烷(hfa227)；和氯氟碳化物，例如ccl3f。在一特定实施例中，推进剂为氢氟烷烃。在一些实施例中，氢氟烷烃调配物含有共溶剂，例如乙醇或戊烷；和/或表面活性剂，例如脱水山梨糖醇三油酸酯、油酸、卵磷脂和丙三醇。
[0138]
用于定量吸入器的代表性医药组合物包含约0.01重量％至约5重量％的本发明的化合物；约0重量％至约20重量％的乙醇；和约0重量％至约5重量％的表面活性剂；其中剩余部分为hfa推进剂。通常通过向含有治疗剂、乙醇(如果存在)和表面活性剂(如果存在)的适合容器中添加经冷却或经加压的氢氟烷烃来制备这些组合物。为制备悬浮液，将治疗剂微米尺寸化，且接着与推进剂组合。接着将组合物装载至气雾剂罐中，其通常形成定量吸入器装置的部分。
[0139]
适用于通过吸入施用治疗剂的定量吸入器装置描述于所属领域中且这些装置的实例为可商购的。举例来说，代表性定量吸入器装置或产物包括：aerobid吸入器系统(forest pharmaceuticals)；atrovent吸入气雾剂(boehringer ingelheim)；flovent(glaxosmithkline)；maxair吸入器(3m)；proventil吸入器(schering)；serevent吸入气雾剂(glaxosmithkline)；等。
[0140]
在另一特定方面中，医药组合物通过吸入，使用喷雾器吸入器施用。这些喷雾器装置通常产生使医药组合物以喷雾为进入患者的呼吸道中的雾状物的高速空气流。因此，当调配以用于喷雾器吸入器时，可将治疗剂溶解于适合载体中以形成溶液。替代地，治疗剂可经微米尺寸化或奈米研磨且与适合载体组合以形成悬浮液。
[0141]
用于喷雾器吸入器的代表性医药组合物包含溶液或悬浮液，其包含约0.05μg/ml至约20mg/ml的本发明的化合物和与雾化调配物相容的赋形剂。在一个实施例中，溶液具有约3至约8的ph。
[0142]
适用于通过吸入施用治疗剂的喷雾器装置描述于所属领域中且这些装置的实例
为可商购的。举例来说，代表性喷雾器装置或产物包括：respimat softmist吸入器(boehringer ingelheim)；aerx肺部递送系统(aradigm corp.)；pari lc plus可再用喷雾器(pari gmbh)；等。
[0143]
在又一方面中，本发明的医药组合物可替代地以打算用于经口施用的剂量形式来制备。用于经口施用的适合医药组合物可呈胶囊、锭剂、丸剂、口含锭、扁囊剂、糖衣药丸、散剂、颗粒形式；或呈于水性或非水性液体中的溶液或悬浮液形式；或呈水包油或油包水液体乳液形式；或呈酏剂或糖浆形式；等；各自含有预定量的本发明的化合物作为活性成分。
[0144]
当以固体剂量形式打算用于经口施用时，本发明的医药组合物将通常包含活性剂和一或多种医药学上可接受的载体，例如柠檬酸钠或磷酸二钙。任选地或替代地，这些固体剂型还可包含：填充剂或增量剂、黏合剂、保湿剂、溶液阻滞剂、吸收加速剂、湿润剂、吸附剂、润滑剂、着色剂和缓冲剂。释放剂、湿润剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于本发明的医药组合物中。
[0145]
替代调配物还可包括控制释放调配物、用于经口施用的液体剂量形式、经皮贴片和肠胃外调配物。制备这些替代调配物的惯用赋形剂和方法描述于例如前述雷明顿(remington)参考文献中。
[0146]
以下非限制性实例说明本发明的代表性医药组合物。
[0147]
干燥散剂组合物
[0148]
将微米尺寸化式(i)化合物(1g)与经研磨的乳糖(25g)掺合。接着，将此掺合混合物以每剂量足以提供约0.1mg至约4mg之间的式i化合物的量装载至可剥离泡壳封装的单独泡壳中。使用干燥散剂吸入器施用泡壳的内含物。
[0149]
干燥散剂组合物
[0150]
将微米尺寸化式(i)化合物(1g)与经研磨的乳糖(20g)掺合，以形成化合物与经研磨的乳糖的重量比为1:20的主体组合物。将掺合组合物封装于每剂量能够递送约0.1mg至约4mg之间的式i化合物的干燥散剂吸入装置中。
[0151]
定量吸入器组合物
[0152]
将微米尺寸化式(i)化合物(10g)分散于通过使卵磷脂(0.2g)溶解于去矿物质水(200ml)中所制备的溶液中。喷雾干燥所得悬浮液，且接着经微米尺寸化以形成包含平均直径小于约1.5μm的粒子的微米尺寸化组合物。接着，将微米尺寸化组合物装载至以当通过定量吸入器施用时每剂量足以提供约0.1mg至约4mg式i化合物的量含有加压1,1,1,2
‑
四氟乙烷的定量吸入器套筒中。
[0153]
喷雾器组合物
[0154]
将式(i)化合物(25mg)溶解于含有1.5
‑
2.5当量盐酸的溶液中，随后添加氢氧化钠以将ph调节至3.5至5.5和3重量％的甘油。充分搅拌溶液直至所有组分溶解为止。使用每剂量提供约0.1mg至约4mg式(i)化合物的喷雾器装置施用溶液。
[0155]
效用
[0156]
本发明的jak抑制剂已经设计用于治疗呼吸道的发炎性和纤维化疾病。特定来说，化合物经设计以使得能够将有效抗细胞介素试剂直接递送至肺中的呼吸疾病作用位点，同时限制全身性暴露。
[0157]
本发明的化合物经展示为以下酶的jak家族的有效抑制剂：jak1、jak2、jak3和
tyk2。此外，化合物经证实有效抑制促炎性和促纤维化细胞介素。已认识到，jak抑制剂的较宽抗炎性作用可抑制正常免疫细胞功能，潜在地导致感染风险提高。本化合物因此优化以限制自肺至血浆中的吸收，因此使免疫抑制风险降至最低。
[0158]
如以下实验部分中所描述，典型化合物的吸收和分布已在临床前分析中描绘。化合物1至6在小鼠中进行测试且在给药后5小时展示肺组织中的高浓度和至血浆中的低吸收。本发明的化合物经展示以抑制小鼠肺组织中的促炎性细胞介素il
‑
13的作用。特定来说，化合物经证实抑制stat6在肺组织中的il
‑
13诱发的磷酸化，此提供活体内局部肺jak目标参与的证据。当在施用测试化合物之后4小时施用促炎性细胞介素il
‑
13时观测到此作用，从而提供肺中的显著滞留的其它证据。
[0159]
所测试化合物经证实以在肺组织中的细胞水平和显著滞留方面展现两个有效抑制活性。本发明者广泛调查测定，虽然有可能鉴别在细胞水平下有效的化合物或展示肺中的显著滞留的化合物，但发现同时展现两个所需特征的化合物更加困难。
[0160]
jak抑制剂的抗炎性活性已稳固地在哮喘的临床前模型中证实(玛拉维亚(malaviya)等人,《国际免疫药理学杂志(int.immunopharmacol.)》,2010,10,829,
‑
836；松永(matsunaga)等人,生物化学和生物物理学研究通讯(biochem.and biophys.res.commun.),2011,404,261
‑
267；库达克(kudlacz)等人,《欧洲药理学杂志(eur.j.pharmacol)》,2008,582,154
‑
161)。涉及通过jak
‑
stat路径传导信号的哮喘发炎的细胞介素包括：il
‑
2、il
‑
3、il
‑
4、il
‑
5、il
‑
6、il
‑
9、il
‑
11、il
‑
13、il
‑
23、il
‑
31、il
‑
27、胸腺基质淋巴生成素(tslp)、干扰素
‑
γ(ifnγ)和粒细胞
‑
巨噬细胞群落刺激因子(gm
‑
csf)。因此，本发明的化合物预期适用于治疗发炎性呼吸道病症，特定来说哮喘。肺的发炎和纤维化的特征在于除了哮喘之外的其它呼吸道疾病，例如慢性阻塞性肺病(copd)、囊肿性纤维化(cf)、肺炎、间质性肺病(包括特发性肺纤维化)、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合症、支气管炎、气肿、阻塞性细支气管炎和类肉瘤病。因此，本发明化合物还预期适用于治疗慢性阻塞性肺病、囊肿性纤维化、肺炎、间质性肺病(包括特发性肺纤维化)、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合症、支气管炎、气肿、阻塞性细支气管炎和类肉瘤病。
[0161]
当与对应氟基类似物(化合物c
‑
1、c
‑
2、c
‑
3、c
‑
4、c
‑
5和c
‑
6)进行比较时，化合物1至6经展示具有类似的jak活性。然而，其具有引起硫酸化代谢显著减少的优点，如分析5中所证实。这是重要的，因为硫酸化代谢发生在肺部，其可能引起活性亲本化合物的暴露的快速减少。
[0162]
本公开的化合物经证实抑制与发炎相关的细胞介素。因此，本公开的化合物可能适用于治疗某些特定呼吸道疾病，如下文详述。
[0163]
嗜酸性球性气管发炎为统称为嗜酸性球性肺病的疾病的典型特征(科坦(cottin)等人,《临床胸科医学(clin.chest.med.)》,2016,37(3),535
‑
56)。嗜酸性球性疾病与il
‑
4、il
‑
13和il
‑
5信号传导相关。嗜酸性球性肺病包括感染(特定来说蠕虫感染)、药物诱发的肺炎(例如通过例如抗生素、苯妥英(phenytoin)或l
‑
色氨酸的治疗药物诱发)、真菌诱发的肺炎(例如，过敏性支气管肺曲霉病)、过敏性肺炎和伴随多血管炎的嗜酸性球性肉芽肿(先前已知为彻奇
‑
斯全司综合症(churg
‑
strauss syndrome))。未知病因的嗜酸性球性肺病包括特发性急性嗜酸性球性肺炎、特发性慢性嗜酸性球性肺炎、嗜伊红白血球增多综合症和吕弗勒综合症(syndrome)。
[0164]
il
‑
6基因中的多形现象与升高的il
‑
6水平和增加的发生肺动脉高血压(pah)的风险有关(方(fang)等人,《美国化学学会杂志(j.am.soc.hypertens.)》,2017,11(3),171
‑
177)。确证il
‑
6于pah中的作用，il
‑
6受体链gp130的抑制改善了pah大鼠模型中的疾病(黄(huang)等人,《加拿大心脏病学杂志(can.j.cardiol.)》,2016,32(11),1356.e1
‑
1356.e10)。
[0165]
例如ifnγ、il
‑
12和il
‑
6的细胞介素已涉及一定范围的非过敏性肺病(例如类肉瘤病)和肺淋巴管平滑肌增生症(el
‑
哈希姆(el
‑
hashemite)等人,《美国呼吸细胞与分子生物学杂志(am.j.respir.cell.mol.biol.)》,2005,33,227
‑
230，和el
‑
哈希姆(el
‑
hashemite)等人,《癌症研究(cancer res.)》,2004,64,3436
‑
3443)。本发明的化合物还经展示以抑制ifnγ信号传导。
[0166]
支气管扩张症和浸润性肺病为与慢性嗜中性球性发炎有关的疾病。
[0167]
病理性t细胞活化对于多种呼吸道疾病的病因至关重要。自体反应性t细胞在阻塞性细支气管炎伴机化性肺炎(还称为cos)中起作用。类似于cos，肺移植排斥反应的病因与移植供体肺的受体t细胞的异常t细胞活化有关。肺移植排斥反应可早期以原发性移植物功能障碍(pgd)、机化性肺炎(op)、急性排斥反应(ar)或淋巴球性细支气管炎(lb)形式发生，或其可在肺移植后数年以慢性肺同种异体移植物功能障碍(clad)形式发生。clad先前已知为阻塞性细支气管炎(bo)，但现在被认为可具有不同病理学表现的综合症，包括bo、限制性clad(rclad或ras)和嗜中性球性同种异体移植物功能障碍。慢性肺同种异体移植物功能障碍(clad)为长期管理肺移植受体中的主要挑战，因为其造成移植肺逐渐失去功能(戈蒂埃(gauthier)等人,《当前移植代表(curr transplant rep.)》,2016,3(3),185
‑
191)。clad对治疗的反应不佳，且因此，仍需要能够预防或治疗此病况的有效化合物。例如ifnγ和il
‑
5的若干jak依赖性细胞介素在clad和肺移植排斥反应中上调(贝拉斯特吉(berastegui)等人,《临床移植(clin.transplant.)》2017,31,e12898)。此外，在jak依赖性ifn信号传导下游的cxcr3趋化因子(例如cxcl9和cxcl10)的高肺含量与肺移植患者的恶化结果有关(西诺(shino)等人,《科学公共图书馆综合(plos one)》,2017,12(7),e0180281)。全身性jak抑制经展示在肾脏移植排斥反应中有效(维森特(vicenti)等人,《美国移植杂志(american journal of transplantation)》,2012,12,2446
‑
56)。因此，jak抑制剂有可能有效治疗或预防肺移植排斥反应和clad。如描述为肺移植排斥反应的基础的类似t细胞活化事件还视为造血干细胞移植后可能发生的肺移植物抗宿主病(gvhd)的主要驱动因素。类似于clad，肺gvhd为一种慢性进行性病况，其结果极其不佳且目前尚无经批准的治疗。95位接受全身性jak抑制剂卢佐替尼作为补救治疗的患有类固醇难治性急性或慢性gvhd的患者的回溯性多中心调查研究证实，大多数患者(包括患有肺gvhd的这些患者)对卢佐替尼完全或部分反应(蔡瑟(zeiser)等人,《白血病(leukemia)》,2015,29,10,2062
‑
68)。由于全身性jak抑制与严重不良事件和小治疗指数相关，仍需要吸入肺部定向的非全身性jak抑制剂以预防和/或治疗肺移植排斥反应或肺gvhd。本公开的化合物具有满足此需求所需的特征。近年来，免疫检查点抑制剂诱发的肺炎(另一种t细胞介导的肺病)随着免疫检查点抑制剂的使用增加而出现。在用这些t细胞刺激剂治疗的癌症患者中，可能产生致死性肺炎。
[0168]
因此，一方面，本发明提供一种治疗哺乳动物(例如，人类)的呼吸道疾病的方法，所述方法包含向哺乳动物施用治疗有效量的本公开的化合物或其医药学上可接受的盐或
医药组合物，所述医药组合物包含医药学上可接受的载体和本发明的化合物或其医药学上可接受的盐。
[0169]
一方面，呼吸道疾病为哮喘、慢性阻塞性肺病、囊肿性纤维化、肺炎、慢性阻塞性肺病(copd)、囊肿性纤维化(cf)、肺炎、间质性肺病(包括特发性肺纤维化)、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合症、支气管炎、气肿、阻塞性细支气管炎或类肉瘤病。另一方面，呼吸道疾病为哮喘或慢性阻塞性肺病。
[0170]
一方面，呼吸道疾病为肺部感染、嗜酸性球性疾病、蠕虫感染、肺动脉高血压、类肉瘤病、肺淋巴管平滑肌增生症、支气管扩张症、浸润性肺病、药物诱发的肺炎、真菌诱发的肺炎、过敏性支气管肺曲霉病、过敏性肺炎、伴随多血管炎的嗜酸性球性肉芽肿、特发性急性嗜酸性球性肺炎、特发性慢性嗜酸性球性肺炎、嗜伊红白血球增多综合症、吕弗勒综合症、阻塞性细支气管炎伴有机化肺炎、急性和慢性肺移植排斥反应(包括pgd、op、lb、ar和clad、bo、限制性clad和嗜中性球性同种异体移植物功能障碍)、肺移植物抗宿主病、阻塞性细支气管炎伴机化性肺炎、肺动脉高血压、支气管扩张症或免疫检查点抑制剂诱发的肺炎。
[0171]
本发明进一步提供一种治疗哺乳动物的哮喘的方法，所述方法包含向哺乳动物施用治疗有效量的本公开的化合物或其医药学上可接受的盐或医药组合物，所述医药组合物包含医药学上可接受的载体和本公开的化合物或其医药学上可接受的盐。
[0172]
当用于治疗哮喘时，本公开的化合物将通常以单次日剂量或以每天多次剂量形式施用，但可使用其它施用形式。每剂量施用的活性剂的量或每天施用的总量将通常由医师根据相关情况来确定，所述相关情况包括待治疗的病况、所选施用途径、施用的实际化合物和其相对活性、个别患者的年龄、体重和反应、患者症状的严重程度等。
[0173]
本发明进一步提供一种治疗哺乳动物的呼吸道疾病(包括(但不限于)本文中所描述的疾病)的方法，所述方法包含向哺乳动物施用治疗有效量的本发明的化合物或其医药学上可接受的盐或医药组合物，所述医药组合物包含医药学上可接受的载体和本发明的化合物或其医药学上可接受的盐。
[0174]
当用于治疗呼吸道疾病(包括(但不限于)本文中所描述的疾病)时，本公开的化合物将通常以单次日剂量或以每天多次剂量形式施用，但可使用其它施用形式。每剂量施用的活性剂的量或每天施用的总量将通常由医师根据相关情况来确定，所述相关情况包括待治疗的病况、所选施用途径、施用的实际化合物和其相对活性、个别患者的年龄、体重和反应、患者症状的严重程度等。
[0175]
作为jak抑制剂，本公开的化合物还可适用于多种其它疾病。本公开的化合物可适用于多种胃肠发炎病症，包括(但不限于)发炎性肠病、溃疡性结肠炎(直肠乙状结肠炎、全结肠炎、溃疡性直肠炎和左侧结肠炎)、克罗恩氏病(crohn's disease)、胶原性结肠炎、淋巴球性结肠炎、白塞氏病(behcet's disease)、乳糜泻、免疫检查点抑制剂诱发的结肠炎、回肠炎、嗜酸性球性食道炎、移植物抗宿主疾病相关的结肠炎和感染性结肠炎。溃疡性结肠炎(雷蒙德(reimund)等人,《临床免疫学杂志(j.clin.immunology)》,1996,16,144
‑
150)、克罗恩氏病(伍伍德(woywodt)等人,《欧洲胃肠病与肝病杂志(eur.j.gastroenterology hepatology)》,1999,11,267
‑
276)、胶原性结肠炎(库马瓦特(kumawat)等人,《分子免疫学(mol.immunology)》,2013,55,355
‑
364)、淋巴球性结肠炎(库马瓦特(kumawat)等人,2013)、嗜酸性球性食道炎(温布兰德
‑
戈希伯格(weinbrand
‑
goichberg)等人,《免疫学研究
(immunol.res.)》,2013,56,249
‑
260)、移植物抗宿主疾病相关的结肠炎(科格希尔(coghill)等人,《血液(blood)》,2001,117,3268
‑
3276)、感染性结肠炎(施塔尔马赫(stallmach)等人,《国际结直肠疾病杂志(int.j.colorectal dis.)》,2004,19,308
‑
315)、白塞氏病(周(zhou)等人,《自体免疫综述(autoimmun.rev.)》,2012,11,699
‑
704)、乳糜泻(尼托(de nitto)等人,《世界胃肠病学杂志(world j.gastroenterol.)》,2009,15,4609
‑
4614)、免疫检查点抑制剂诱发的结肠炎(例如，ctla
‑
4抑制剂诱发的结肠炎；(矢野(yano)等人,《转化医学杂志(j.translation.med.)》,2014,12,191)、pd
‑
1或pd
‑
l1抑制剂诱发的结肠炎)和回肠炎(山本(yamamoto)等人,《消化和肝病(dig.liver dis.)》,2008,40,253
‑
259)的特征为某些促炎性细胞介素水平的升高。因为许多促炎性细胞介素通过jak活化进行信号传导，因此本申请中所描述的化合物可能能够减轻发炎且提供症状缓解。特定来说，本公开的化合物可适用于诱发且维持溃疡性结肠炎的缓解，且用于治疗克罗恩氏病、免疫检查点抑制剂诱发的结肠炎和移植物抗宿主疾病中的胃肠不良效应。因此，一方面，本公开提供一种治疗哺乳动物(例如，人类)的胃肠发炎性疾病的方法，所述方法包含向哺乳动物施用本公开的化合物或其医药学上可接受的盐或医药组合物，所述医药组合物包含医药学上可接受的载体和本公开的化合物或其医药学上可接受的盐。
[0176]
异位性皮肤炎和其它发炎性皮肤病与依赖于jak
‑
stat路径的促炎性细胞介素的升高有关。因此，本公开的化合物或其医药学上可接受的盐可能有益于许多皮肤发炎或瘙痒病况，其包括(但不限于)异位性皮肤炎、斑秃、白癜风、牛皮癣、皮肌炎、皮肤t细胞淋巴瘤(尼奇普鲁克(netchiporouk)等人,《细胞周期(cell cycle)》,2014；13,3331
‑
3335)和亚型(塞扎莱综合症(sezary syndrome)、蕈样霉菌病、佩吉特样网状细胞增多症(pagetoid reticulosis)、肉芽肿性松弛皮肤、淋巴瘤样丘疹病、慢性苔藓样糠疹、急性痘疮样苔癣样糠疹、cd30+皮肤t细胞淋巴瘤、继发性皮肤cd30+大细胞淋巴瘤、非蕈样霉菌病cd30
‑
皮肤大t细胞淋巴瘤、多形性t细胞淋巴瘤、伦纳特淋巴瘤(lennert lymphoma)、皮下t细胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤、母细胞性nk细胞淋巴瘤)、结节性痒疹、扁平苔藓、原发性局部皮肤淀粉样变性、大疱性类天疱疮、移植物抗宿主病的皮肤表现、类天疱疮、盘状狼疮、环状肉芽肿、慢性单纯性苔癣、外阴/阴囊/肛周瘙痒症、硬化性苔癣、带状疱疹后神经痛痒、扁平苔藓和脱发性毛囊炎。特定来说，异位性皮肤炎(包(bao)等人,jak
‑
stat,2013,2,e24137)、斑秃(邢(xing)等人,《自然医学(nat.med.)》2014,20,1043
‑
1049)、白斑病(克雷格(craiglow)等人,《jama皮肤病(jama dermatol.)》2015,151,1110
‑
1112)、结节性痒疹(雄科伊(sonkoly)等人,《过敏与临床免疫学杂志(j.allergy clin.immunol.)》2006,117,411
‑
417)、扁平苔癣(威尔士
‑
库比亚克(welz
‑
kubiak)等人,《免疫学研究杂志(j.immunol.res.)》2015,id:854747)、原发性局部皮肤淀粉样变性(田中(tanaka)等人,《英国皮肤病学杂志(br.j.dermatol.)》2009,161,1217
‑
1224)、大疱性类天疱疮(费利恰尼(feliciani)等人,《国际免疫病理学和药理学杂志(int.j.immunopathol.pharmacol.)》1999,12,55
‑
61)和移植物抗宿主疾病的皮肤表现(沖山(okiyama)等人,《皮肤病学研究杂志(j.invest.dermatol.)》2014,134,992
‑
1000)的特征为通过jak活化传导信号的某些细胞介素的升高。因此，本公开的化合物或其医药学上可接受的盐可能能够减轻由这些细胞介素驱动的相关皮肤炎或瘙痒症。特定来说，本公开的化合物或其医药学上可接受的盐可预期适用于治疗异位性皮肤炎和其它发炎性皮肤病。因此，一方面，本公开提供一种治疗哺
乳动物(例如，人类)的发炎性皮肤病的方法，所述方法包含向哺乳动物的皮肤施加包含本公开的化合物或其医药学上可接受的盐和医药载剂的医药组合物。一方面，发炎性皮肤病为异位性皮肤炎。
[0177]
许多眼部疾病已展示与依赖于jak
‑
stat路径的促炎性细胞介素的升高有关。因此，本公开的化合物或其医药学上可接受的盐可适用于治疗许多眼部疾病，包括(但不限于)葡萄膜炎、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、干眼病、年龄相关的黄斑变性以及异位性角膜结膜炎。特定来说，葡萄膜炎(洞井(horai)和卡斯皮(caspi),《干扰素和细胞因子研究杂志(j.interferon cytokine res.)》,2011,31,733
‑
744)、糖尿病性视网膜病变(阿布科维(abcouwer),临床细胞免疫学杂志(j.clin.cell.immunol.),2013,增刊1,1
‑
12)、糖尿病性黄斑水肿(索恩(sohn)等人,《美国眼科学杂志(american journal of opthamology)》,2011,152,686
‑
694)、干眼病(史蒂文森(stevenson)等人,《眼科学文献(arch.ophthalmol.)》,2012,130,90
‑
100)和年龄相关的黄斑变性(科尼克贝恩(knickelbein)等人,《国际眼科诊所(int.ophthalmol.clin.)》,2015,55(3),63
‑
78)的特征为通过jak
‑
stat路径传导信号的某些促炎性细胞介素的升高。因此，本公开的化合物或其医药学上可接受的盐可能能够减轻相关眼部发炎且逆转疾病进展或提供症状缓解。因此，一方面，本公开提供一种治疗哺乳动物的眼部疾病的方法，所述方法包含向哺乳动物的眼部施用包含本公开的化合物或其医药学上可接受的盐和医药载剂的医药组合物。一方面，眼部疾病为葡萄膜炎、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、干眼病、年龄相关的黄斑变性或异位性角膜结膜炎。一方面，所述方法包含通过玻璃体内注射施用本公开的化合物或其医药学上可接受的盐。本公开的化合物或其医药学上可接受的盐还可与一或多种适用于眼部疾病的化合物组合使用。
[0178]
本公开的化合物或其医药学上可接受的盐还可适用于治疗其它疾病，例如其它发炎疾病、自体免疫疾病或癌症。本公开的化合物或其医药学上可接受的盐可用于治疗以下中的一或多者：关节炎、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、移植排斥反应、干眼症、牛皮癣性关节炎、糖尿病、胰岛素依赖性糖尿病、运动神经元疾病、骨髓发育不良综合症、疼痛、肌肉减少症、恶病质、败血性休克、全身性红斑性狼疮症、白血病、慢性淋巴球性白血病，慢性骨髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、僵直性脊椎炎、骨髓纤维化、b细胞淋巴瘤、肝细胞癌、霍奇金氏病(hodgkins disease)、乳癌、多发性骨髓瘤、黑素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢透明细胞癌瘤、卵巢肿瘤、胰脏肿瘤、真性红细胞增多症、休格连综合症(sjoegrens syndrome)、软组织肉瘤、肉瘤、脾肿大、t细胞淋巴瘤以及重型地中海贫血。
[0179]
组合疗法
[0180]
本公开的化合物或其医药学上可接受的盐可与通过相同机制或不同机制起作用来治疗疾病的一或多种试剂组合使用。不同试剂可在独立组合物或相同组合物中依序或同时施用。用于组合疗法的适用类别的试剂包括(但不限于)：β2肾上腺素受体促效剂、蕈毒碱受体拮抗剂、糖皮质激素促效剂、g蛋白偶合受体
‑
44拮抗剂、白三烯d4拮抗剂、蕈毒碱m3受体拮抗剂、组织胺h1受体拮抗剂、免疫球蛋白e拮抗剂、pde 4抑制剂、il
‑
4拮抗剂、蕈毒碱m1受体拮抗剂、组织胺受体拮抗剂、il
‑
13拮抗剂、il
‑
5拮抗剂、5
‑
脂肪加氧酶抑制剂、β肾上腺素受体促效剂、ccr3趋化因子拮抗剂、cftr刺激剂、免疫球蛋白调节剂、介白素33配位体抑
制剂、pde 3抑制剂、磷酸肌醇
‑
3激酶δ抑制剂、凝血脂素a2拮抗剂、弹性蛋白酶抑制剂、kit酪氨酸激酶抑制剂、白三烯e4拮抗剂、白三烯拮抗剂、pgd2拮抗剂、tnfα配位体抑制剂、tnf黏结剂、补体级联抑制剂、伊红趋素配位体抑制剂、谷胱甘肽还原酶抑制剂、组织胺h4受体拮抗剂、il
‑
6拮抗剂、il2基因刺激剂、免疫球蛋白γfc受体iib调节剂、干扰素γ配位体、介白素13配位体抑制剂、介白素17配位体抑制剂、l
‑
选择蛋白拮抗剂、白血球弹性蛋白酶抑制剂、白三烯c4拮抗剂、白三烯c4合成酶抑制剂、膜铜胺氧化酶抑制剂、金属蛋白酶
‑
12抑制剂、金属蛋白酶
‑
9抑制剂、螨过敏原调节剂、蕈毒碱受体调节剂、烟碱酸乙酰胆碱受体促效剂、核因子κb抑制剂、p
‑
选择蛋白拮抗剂、pde 5抑制剂、pdgf受体拮抗剂、磷酸肌醇
‑
3激酶γ抑制剂、tlr
‑
7促效剂、tnf拮抗剂、abl酪氨酸激酶抑制剂、乙酰胆碱受体拮抗剂、酸性哺乳动物壳质酶抑制剂、acth受体促效剂、肌动蛋白聚合调节剂、腺苷a1受体拮抗剂、腺苷酸环化酶刺激剂、肾上腺素受体拮抗剂、促肾上腺皮质激素配位体、醇去氢酶5抑制剂、α1抗胰蛋白酶刺激剂、α1蛋白酶抑制剂、雄激素受体调节剂、血管收缩素转化酶2刺激剂、anp促效剂、bcr蛋白抑制剂、β1肾上腺素受体拮抗剂、β2肾上腺素受体拮抗剂、β2肾上腺素受体调节剂、β淀粉样调节剂、bmp10基因抑制剂、bmp15基因抑制剂、钙信道抑制剂、组织蛋白酶g抑制剂、ccl26基因抑制剂、ccr3趋化因子调节剂、ccr4趋化因子拮抗剂、细胞黏附分子抑制剂、伴侣蛋白刺激剂、壳质酶抑制剂、胶原蛋白i拮抗剂、补体c3抑制剂、csf
‑
1拮抗剂、cxcr2趋化因子拮抗剂、细胞介素受体共享β链调节剂、细胞毒性t淋巴球蛋白
‑
4刺激剂、脱氧核糖核酸酶i刺激剂、脱氧核糖核酸酶刺激剂、二肽基肽酶i抑制剂、dna旋转酶抑制剂、dp前列腺素受体调节剂、e
‑
选择蛋白拮抗剂、egfr家族酪氨酸激酶受体抑制剂、弹性蛋白调节剂、内皮素et
‑
a拮抗剂、内皮素et
‑
b拮抗剂、环氧化物水解酶抑制剂、fgf3受体拮抗剂、fyn酪氨酸激酶抑制剂、gata 3转录因子抑制剂、葡糖神经酰胺酶调节剂、谷氨酸受体调节剂、gm
‑
csf配位体抑制剂、鸟苷酸环化酶刺激剂、h+k+atp酶抑制剂、血红素调节剂、肝素促效剂、组蛋白去乙酰酶抑制剂、组蛋白去乙酰酶
‑
2刺激剂、hmg coa还原酶抑制剂、i
‑
κb激酶β抑制剂、icam1基因抑制剂、il
‑
17拮抗剂、il
‑
17受体调节剂、il
‑
23拮抗剂、il
‑
4受体调节剂、免疫球蛋白g调节剂、免疫球蛋白g1促效剂、免疫球蛋白g1调节剂、免疫球蛋白εfc受体ia拮抗剂、免疫球蛋白γfc受体iib拮抗剂、免疫球蛋白κ调节剂、胰岛素敏化剂、干扰素β配位体、介白素1样受体拮抗剂、介白素18配位体抑制剂、介白素受体17a拮抗剂、介白素
‑
1β配位体抑制剂、介白素
‑
5配位体抑制剂、介白素
‑
6配位体抑制剂、kcna电压闸控钾信道
‑
3抑制剂、kit配位体抑制剂、层黏连蛋白
‑
5促效剂、白三烯cyslt1受体拮抗剂、白三烯cyslt2受体拮抗剂、loxl2基因抑制剂、lyn酪氨酸激酶抑制剂、marcks蛋白抑制剂、mdr相关蛋白4抑制剂、金属蛋白酶
‑
2调节剂、金属蛋白酶
‑
9调节剂、盐皮质素受体拮抗剂、蕈毒碱m2受体拮抗剂、蕈毒碱m4受体拮抗剂、蕈毒碱m5受体拮抗剂、利尿钠肽受体a促效剂、自然杀伤细胞受体调节剂、烟碱酸ach受体α7次单元刺激剂、nk细胞受体调节剂、核因子κb调节剂、类鸦片生长因子受体促效剂、p
‑
醣蛋白抑制剂、p2x3嘌呤受体拮抗剂、p38 map激酶抑制剂、肽酶1调节剂、磷脂酶a2抑制剂、磷脂酶c抑制剂、纤维蛋白溶酶原活化剂抑制剂1抑制剂、血小板激活因子受体拮抗剂、pparγ促效剂、前列腺环素促效剂、蛋白酪氨酸激酶抑制剂、sh2结构域肌醇磷酸酶1刺激剂、信号转导抑制剂、钠通道抑制剂、stat
‑
3调节剂、干细胞抗原
‑
1抑制剂、超氧化歧化酶调节剂、t细胞表面醣蛋白cd28抑制剂、t细胞表面醣蛋白cd8抑制剂、tgfβ促效剂、tgfβ拮抗剂、凝血脂素合成酶抑制剂、胸腺基质淋巴蛋白配位体抑制剂、胸腺素促效剂、胸腺素β
4配位体、tlr
‑
8促效剂、tlr
‑
9促效剂、tlr9基因刺激剂、拓朴异构酶iv抑制剂、肌钙蛋白i快速骨骼肌刺激剂、肌钙蛋白t快速骨骼肌刺激剂、i型il
‑
1受体拮抗剂、ii型tnf受体调节剂、离子通道调节剂、子宫球蛋白刺激剂和vip促效剂。
[0181]
可与本jak抑制剂化合物组合使用的特定试剂包括(但不限于)：醋酸罗斯普特(rosiptor acetate)、芜地溴铵(umeclidinium bromide)、塞库金单抗(secukinumab)、醋酸米特法林(metenkefalin acetate)、醋酸特瑞得卡(tridecactide acetate)、丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)、α
‑
环糊精稳定的萝卜硫素、特泽派单抗(tezepelumab)、糠酸莫米松(mometasone furoate)、bi
‑
1467335、度匹鲁单抗(dupilumab)、阿地铵(aclidinium)、福莫特罗(formoterol)、azd
‑
1419、hi
‑
1640v、瑞威潘塞(rivipansel)、cmp
‑
001、甘露醇、anb
‑
020、奥马珠单抗(omalizumab)、曲加力单抗(tregalizumab)、米提扎西(mitizax)、苯纳珠单抗(benralizumab)、戈利木单抗(golimumab)、罗氟司特(roflumilast)、伊马替尼(imatinib)、regn
‑
3500、马赛替尼(masitinib)、阿普司特(apremilast)、rpl
‑
554、阿克姆(actimmune)、阿达木单抗(adalimumab)、卢帕他定(rupatadine)、帕罗格列(parogrelil)、mk
‑
1029、二丙酸倍氯米松(beclometasone dipropionate)、富马酸福莫特罗(formoterol fumarate)、莫格利珠单抗(mogamulizumab)、塞曲司特(seratrodast)、ucb
‑
4144、奈米昔布(nemiralisib)、ck
‑
2127107、非维兰特(fevipiprant)、达尼利辛(danirixin)、波生坦(bosentan)、阿巴西普(abatacept)、ec
‑
18、杜维昔布(duvelisib)、多西普林斯顿(dociparstat)、环丙沙星(ciprofloxacin)、沙丁胺醇(salbutamol)hfa、厄多司坦(erdosteine)、prep
‑
001、奈多罗米(nedocromil)、cdx
‑
0158、沙丁胺醇、恩博沙(enobosarm)、r
‑
tpr
‑
022、朗齐鲁单抗(lenzilumab)、糠酸氟替卡松(fluticasone furoate)、三氟甲磺酸威兰特罗(vilanterol trifenatate)、丙酸氟替卡松、沙美特罗(salmeterol)、pt
‑
007、prs
‑
060、雷米特梅尔
‑
l(remestemcel
‑
l)、瓜氨酸、rpc
‑
4046、氧化氮、ds
‑
102、吉瑞利单抗(gerilimzumab)、阿克泰(actair)、糠酸氟替卡松、芜地铵(umeclidinium)、威兰特罗(vilanterol)、ag
‑
npp709、凯明斯(gamunex)、英利昔单抗(infliximab)、阿美匹恩(ampion)、阿库马皮莫德(acumapimod)、康纳单抗(canakinumab)、ins
‑
1007、cyp
‑
001、思鲁库单抗(sirukumab)、丙酸氟替卡松、美泊利单抗(mepolizumab)、匹伐他汀(pitavastatin)、索利霉素(solithromycin)、依那西普(etanercept)、依伐卡托(ivacaftor)、阿那白滞素(anakinra)、mpc
‑
300
‑
iv、格隆溴铵(glycopyrronium bromide)、阿地溴铵(aclidinium bromide)、fp
‑
025、里森基单抗(risankizumab)、格隆铵(glycopyrronium)、富马酸福莫特罗、阿迪迫赛(adipocell)、ypl
‑
001、噻托溴铵(tiotropium bromide)、格隆溴铵、马来酸茚达特罗(indacaterol maleate)、安德西单抗(andecaliximab)、奥达特罗(olodaterol)、埃索美拉唑(esomeprazole)、尘螨疫苗、艾蒿花粉过敏原疫苗、万莫龙(vamorolone)、格法皮克斯(gefapixant)、瑞芬那新(revefenacin)、吉非替尼(gefitinib)、瑞胶因(rejoin)、泰鲁斯特(tipelukast)、贝多拉明(bedoradrine)、scm
‑
cgh、shp
‑
652、rns
‑
60、布罗达单抗(brodalumab)、bio
‑
11006、芜地溴铵、三氟甲磺酸威兰特罗、异丙托溴铵(ipratropium bromide)、塔罗金单抗(tralokinumab)、pur
‑
1800、vx
‑
561、vx
‑
371、奥洛他定(olopatadine)、妥布特罗(tulobuterol)、富马酸福莫特罗、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、瑞利珠单抗(reslizumab)、羟萘甲酸沙美特罗(salmeterol xinafoate)、丙酸
氟替卡松、二丙酸倍氯米松、富马酸福莫特罗、噻托溴铵、利盖利珠单抗(ligelizumab)、ruti、柏替木单抗(bertilimumab)、奥马珠单抗、格隆溴铵、sens
‑
111、二丙酸倍氯米松、chf
‑
5992、lt
‑
4001、茚达特罗(indacaterol)、格隆溴铵、糠酸莫米松、菲索芬那定(fexofenadine)、格隆溴铵、阿奇霉素(azithromycin)、azd
‑
7594、福莫特罗、chf
‑
6001、贝特芬特罗(batefenterol)、oatd
‑
01、奥达特罗、cjm
‑
112、罗格列酮(rosiglitazone)、沙美特罗、塞提普兰特(setipiprant)、吸入干扰素β、azd
‑
8871、普卡那肽(plecanatide)、氟替卡松、沙美特罗、二十碳五烯酸单甘油酸酯(eicosapentaenoic acid monoglyceride)、雷布瑞奇单抗(lebrikizumab)、rg
‑
6149、qbkpn、莫米松(mometasone)、茚达特罗、azd
‑
9898、丙酮酸钠、齐留通(zileuton)、cg
‑
201、咪达那新(imidafenacin)、cnto
‑
6785、clbs
‑
03、莫米松、rgn
‑
137、丙卡特罗(procaterol)、福莫特罗、cci
‑
15106、pol
‑
6014、茚达特罗、倍氯米松(beclomethasone)、mv
‑
130、gc
‑
1112、艾瑞戈瓦克库(allergovac depot)、medi
‑
3506、qbw
‑
251、zpl
‑
389、乌地那非(udenafil)、gsk
‑
3772847、左旋西替利嗪(levocetirizine)、axp
‑
1275、adc
‑
3680、替马兰特(timapiprant)、阿贝特罗(abediterol)、azd
‑
7594、异丙托溴铵、硫酸沙丁胺醇(salbutamol sulfate)、塔得克尼α(tadekinig alfa)、act
‑
774312、脱氧核糖酶α、伊洛前列素(iloprost)、贝特芬特罗(batefenterol)、糠酸氟替卡松、阿利卡弗森(alicaforsen)、环索奈德(ciclesonide)、金刚砂胺(emeramide)、阿福莫特罗(arformoterol)、sb
‑
010、奥扎格雷(ozagrel)、btt
‑
1023、德克单抗(dectrekumab)、左旋沙丁胺醇(levalbuterol)、普鲁司特(pranlukast)、玻尿酸、gsk
‑
2292767、福莫特罗、nov
‑
14、芦西纳坦(lucinactant)、沙丁胺醇、泼尼松龙(prednisolone)、依巴司汀(ebastine)、地塞米松培酯(dexamethasone cipecilate)、gsk
‑
2586881、bi
‑
443651、gsk
‑
2256294、vr
‑
179、vr
‑
096、hdm
‑
asit+、布地奈德(budesonide)、gsk
‑
2245035、vtx
‑
1463、依美斯汀(emedastine)、右旋普拉克索(dexpramipexole)、左旋沙丁胺醇、n
‑
6022、地塞米松磷酸钠(dexamethasone sodium phosphate)、pin
‑
201104、opk
‑
0018、tev
‑
48107、司特(suplatast)、bi
‑
1060469、吉米鲁司特(gemilukast)、干扰素γ、达拉扎提德(dalazatide)、比拉斯汀(bilastine)、丙酸氟替卡松、羟萘甲酸沙美特罗、rp
‑
3128、苯环喹溴铵(bencycloquidium bromide)、瑞利珠单抗、pbf
‑
680、crth2拮抗剂、普鲁司特、羟萘甲酸沙美特罗、丙酸氟替卡松、噻托溴铵单水合物(tiotropium bromide monohydrate)、马鲁司特(masilukast)、rg
‑
7990、多索茶碱(doxofylline)、阿贝特罗(abediterol)、格隆溴铵、tev
‑
46017、asm
‑
024、丙酸氟替卡松、格隆溴铵、羟萘甲酸沙美特罗、沙丁胺醇、ta
‑
270、氟尼缩松(flunisolide)、色甘酸钠、epsi
‑
gam、zpl
‑
521、沙丁胺醇、阿肽地尔(aviptadil)、trn
‑
157、扎鲁司特(zafirlukast)、斯迪姆喷索(stempeucel)、哌罗来斯钠(pemirolast sodium)、纳多洛尔(nadolol)、丙酸氟替卡松+羟萘甲酸沙美特罗、rv
‑
1729、硫酸沙丁胺醇、二氧化碳+全氟辛基溴化物、apl
‑
1、德克单抗+vak
‑
694、赖氨酸乙酰基水杨酸盐(lysine acetylsalicylate)、齐留通、tr
‑
4、人类同种异体脂肪衍生之间叶细胞祖细胞疗法、medi
‑
9314、pl
‑
3994、hmp
‑
301、td
‑
5471、nktt
‑
120、哌罗来斯(pemirolast)、二丙酸倍氯米松、川丁特罗(trantinterol)、α鲁米诺单钠(monosodium alpha luminol)、imd
‑
1041、am
‑
211、tbs
‑
5、arry
‑
502、塞曲司特、重组麦迪司麦斯(recombinant midismase)、asm
‑
8、地夫可特(deflazacort)、班布特罗(bambuterol)、rbx
‑
10017609、异丙托铵(ipratropium)+非诺特罗(fenoterol)、氟替卡松+福莫特罗、依匹斯汀(epinastine)、win
‑
901x、valergen
‑
ds、
high performance liquid chromatography；anal.hplc)和质谱分析来监测反应混合物的进展。如在各反应中具体描述来处理反应混合物；通常通过萃取和其它纯化方法(例如温度依赖性和溶剂依赖性结晶和沉淀)来纯化反应混合物。此外，通过管柱色谱或通过制备型hplc，通常使用c18或bds管柱填充物和惯用洗提剂来常规纯化反应混合物。下文描述典型的制备型hplc条件。
[0204]
通过质谱和1h
‑
nmr光谱常规地进行反应产物的表征。对于nmr分析，将样品溶解于氘化溶剂(例如cd3od、cdcl3或d6‑
dmso)中，且在标准观测条件下用varian gemini2000仪器(400mhz)获得1h
‑
nmr光谱。通过电喷雾电离法(electrospray ionization method；esms)用耦接至自动纯化系统的applied biosystems(foster city,ca)型号api150ex仪器或waters(milford,ma)3100仪器来进行化合物的质谱鉴别。
[0205]
制备型hplc条件
[0206]
管柱：c18,5μm.21.2
×
150mm或c18,5μm 21
×
250或
[0207]
ꢀꢀꢀꢀꢀ
c14,5μm 21
×
150mm
[0208]
管柱温度：室温
[0209]
流速：20.0ml/min
[0210]
流动相：a＝水+0.05％tfa
[0211]
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
b＝acn+0.05％tfa，
[0212]
注射体积：(100
‑
1500μl)
[0213]
检测器波长：214nm
[0214]
将粗化合物以约50mg/ml溶解于1:1水:乙酸中。使用2.1
×
50mm c18管柱进行4分钟分析规模测试操作，随后使用100μl注射液用基于分析规模测试操作的b滞留％进行15或20分钟制备型规模操作。确切梯度依赖于样品。用21
×
250mm c18管柱和/或21
×
150mm c14管柱检查具有紧密操作杂质的样品以进行最佳分离。通过质谱分析来鉴别含有所需产物的洗提份。
[0215]
制备1：4
‑
(苯甲氧基)
‑2‑
乙基苯基)三氟
‑
λ4‑
甲硼烷，钾盐i
‑5[0216][0217]
(a)1
‑
(苯甲氧基)
‑3‑
乙苯(i
‑
2)
[0218]
在室温下向3
‑
乙酚(i
‑
1)(25.0g，204.0mmol)于acn(250ml，10体积)中的搅拌溶液中添加碳酸钾(42.0g，306mmol)。将所得反应块状物在室温下搅拌15分钟，随后以逐滴方式添加溴甲苯(24.0ml，204mmol)。将所得反应混合物在室温下搅拌6小时。在完成反应(tlc监测)之后，将所得反应块状物倒入水(1.0l)中，随后用etoac(2
×
2l)萃取化合物。经合并的
有机物用冷水、盐水溶液洗涤且经硫酸钠干燥，过滤且在减压下蒸发。接着将粗产物通过硅胶(100
‑
200m)管柱色谱，通过使用洗提剂2％etoac/己烷来纯化，以得到作为淡黄色油性化合物的所需产物(i
‑
2)(35.0g，81％)。1h nmr(400mhz,氯仿
‑
d)δ7.46
‑
7.44(m,2h),7.39(t,j＝7.6hz,2h),7.34
‑
7.31(m,1h),7.21(t,j＝7.6hz),6.86
‑
6.80(m,3h),5.07(s,2h),2.64(q,j＝7.6hz,2h),1.24(t,j＝7.6hz,3h)。
[0219]
(b)4
‑
(苯甲氧基)
‑1‑
溴
‑2‑
乙苯(i
‑
3)
[0220]
历经15分钟的时间段向1
‑
(苯甲氧基)
‑3‑
乙苯(i
‑
2)(35.0g，164mmol)于acn(525ml，15体积)中的冰冷搅拌溶液中逐份添加n
‑
溴代丁二酰亚胺(32.0g，181mmol)。将所得反应混合物在室温下再搅拌1小时。在完成反应(tlc监测)之后，将所得反应块状物倒入冰冷的水(1.50l)中，接着用etoac(2
×
1l)萃取化合物。经合并的有机物用水洗涤且经硫酸钠干燥，过滤并在减压下蒸发，以获得粗产物。将正己烷(250ml)添加至粗材料，产生研磨浆，随后通过烧结漏斗过滤。将母液在减压下蒸发，以获得作为淡黄色油性化合物的所需产物i
‑
3(42.0g，87％)。1h nmr(400mhz,氯仿
‑
d)δ7.52
‑
7.29(m,7h),6.88(s,1h),6.68(d,j＝6.0hz,1h),5.04(s,2h),2.69(q,j＝7.6hz,2h),1.20(t,j＝7.5hz,3h)。
[0221]
(c)2
‑
(4
‑
(苯甲氧基)
‑2‑
乙基苯基)
‑
4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧杂硼杂环戊烷(i
‑
4)
[0222]
将4
‑
(苯甲氧基)
‑1‑
溴
‑2‑
乙苯(i
‑
3)(42.0g，144mmol)、双(频哪醇根基)二硼(44.0g，173mmol)和乙酸钾(28g，288mmol)于二恶烷(440ml)中的搅拌溶液通过吹扫n2(g)持续15min来脱气，随后添加pdcl2(dppf).dcm错合物(11.0g，15mmol)。使所得反应混合物加热至80℃再持续16h。在完成反应(tlc监测)之后，使反应块状物通过硅藻土床过滤且将母液在减压下蒸发，以获得粗产物。粗残余物通过硅胶(100
‑
200m)管柱色谱，通过使用洗提剂1％etoac/己烷纯化，以得到作为淡黄色油性化合物的所需产物(i
‑
4)(32.0g，66％)。1h nmr(400mhz,氯仿
‑
d)δ7.74(d,j＝8.4hz,1h),7.45
‑
7.36(m,5h),6.84
‑
6.78(m,2h),5.08(s,2h),2.91(q,j＝7.6hz),1.33(s,12h),1.19(t,j＝7.6hz,3h)。
[0223]
(d)(4
‑
(苯甲氧基)
‑2‑
乙基苯基)三氟
‑
λ4‑
甲硼烷，钾盐(i
‑
5)
[0224]
向化合物2
‑
(4
‑
(苯甲氧基)
‑2‑
乙基苯基)
‑
4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧杂硼杂环戊烷(i
‑
4)(20g，59.0mmol)于丙酮:甲醇(200ml，1:1比率，10体积)中的搅拌溶液中添加3m氟化氢钾溶液(23.0g，295mmol，溶解于98.0ml水中)。将所得反应混合物在室温下搅拌16小时。在完成反应(tlc监测)之后，将所得反应块状物在减压下蒸发。将因此获得的固体溶解于水(100ml)中且在室温下搅拌30min。将所得反应块状物通过烧结漏斗过滤，用正己烷洗涤且在减压下干燥，以得到呈白色固体状的所需产物(i
‑
5)(14.0g，74％)。1h nmr(400mhz,氯仿
‑
d)δ7.43(d,j＝7.2hz,2h),7.37(t,j＝7.5hz,2h),7.30(t,j＝7.1hz,1h),7.22(d,j＝8.0hz),6.58(s,1h),6.53(d,j＝7.9hz,1h),5.00(s,2h),2.65(q,j＝7.5hz,2h),1.07(t,j＝7.4hz,3h)。
[0225]
制备2：(s)
‑3‑
苯甲基
‑
3,4,6,7
‑
四氢
‑
5h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑
5,6
‑
二甲酸6
‑
苯甲酯5
‑
(叔丁酯)(i
‑
11)
[0226][0227]
(a)(s)
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸，盐酸盐(i
‑
7)
[0228]
向l
‑
组氨酸(i
‑
6)(5.0kg，32.14mol)于水(40l，8体积)中的冰冷搅拌悬浮液中添加浓盐酸(3.93l，33.75mol)，随后以逐滴方式添加甲醛(5.50l，67.5mol，37％水溶液)。将所得溶液在相同温度下搅拌30分钟且接着在80℃下加热8小时。通过lcms监测反应进展。在减压下去除水以获得粗产物，且将所得粗物质在甲苯(20l)中搅拌2小时。将有机物在减压下去除以去除过量水且将化合物共沸干燥。接着将所得材料放入乙醚(20l)中且搅拌2小时。接着过滤固体材料且经空气干燥，以获得呈灰白色固体状的所需产物(i
‑
7)(6.50kg，85％)。1h nmr(400mhz,d2o)δ8.69(s,1h),4.56(d,j＝15.4hz,1h),4.42(d,j＝15.5hz,1h),4.20(dd,j＝5.5,5.2hz,1h),3.42(dd,j＝5.0,17.0hz,1h),3.11(dd,j＝10.2,16.8hz,1h)。
[0229]
(b)(s)
‑
3,5
‑
双(叔丁氧基羰基)
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸(i
‑
8)
[0230]
向(s)
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸二
‑
盐酸盐(i
‑
7)(6.10kg，25.40mol)于1,4
‑
二恶烷(48l，8体积)和水(48l，8体积)中的冰冷搅拌溶液中逐滴添加三乙胺(12.36l，89mol)，随后历经30min的时间段添加二碳酸二叔丁酯(18.07l，78.74mol，溶解于5l的1,4
‑
二恶烷中)。将所得反应混合物在室温下再搅拌16小时。在完成反应(tlc&lcms监测)之后，将微黄色反应混合物用水(10l)稀释且连续用乙醚(2
×
10l)和etoac(2
×
7.50l)洗涤。丢弃有机相。水层经冷却且用6n hcl溶液使其达至ph约3；用etoac(3
×
10l)萃取水相。经合并的有机物用盐水溶液洗涤，经硫酸钠干燥，且在减压下浓缩。油性残余物自30％etoac:己烷结晶，以获得呈灰白色固体状的所需产物(i
‑
8)(5.1kg，55％)。(m/z)：c
17
h
25
n3o6的[m+h]+计算值368.18，实验值368.21。
[0231]
(c)(s)
‑
6,7
‑
二氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑
3,5,6(4h)
‑
三甲酸6
‑
苯甲酯3,5
‑
二
‑
叔丁酯(i
‑
9)
[0232]
向(s)
‑
3,5
‑
双(叔丁氧基羰基)
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸(i
‑
8)(5.1kg，13.88mol)于dcm(51l，10体积)中的冰冷溶液中依序添加饱和碳酸氢钠水溶液(41.0l，8体积)、四
‑
丁基碘化铵(5.13kg，13.88mol)和溴甲苯(2.47l，20.82mol)。将所得反应混合物在室温下再搅拌16小时。在完成反应(tlc&lcms监测)之后，分离二相溶液。用dcm(3
×
10l)萃取水层。经合并的有机物用盐水溶液洗涤，经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩以获得粗产物，所述粗产物通过硅胶(100
‑
200m)管柱色谱，通过使用洗提剂40％etoac/己烷纯化，以得到呈黏稠油状的所需产物(i
‑
9)(4.50kg，72％)。(m/z)：c
24
h
31
n3o6的[m+h]+计算值458.22，实验值458.60。
[0233]
(d)(s)
‑
3,4,6,7
‑
四氢
‑
5h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑
5,6
‑
二甲酸6
‑
苯甲酯5
‑
(叔丁酯)(i
‑
10)
[0234]
向(s)
‑
6,7
‑
二氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑
3,5,6(4h)
‑
三甲酸6
‑
苯甲酯3,5
‑
二
‑
叔丁酯(i
‑
9)(4.50kg，9.84mol)于ipa(45l，10体积)中的冰冷溶液中逐滴添加氢氧化铵(36l，8体积)。将所得反应混合物进一步在室温下再搅拌16小时。在完成反应(tlc&lcms监测)之后，将所得混合物用水(25l)稀释，接着用etoac(3
×
20l)萃取。经合并的有机物用盐水溶液洗涤，经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩以得到粗产物，所述粗产物通过硅胶(100
‑
200m)管柱色谱，通过使用洗提剂2％meoh/dcm纯化，以获得呈厚的黏稠油状的所需产物(i
‑
10)(2.70kg，77％)。(m/z)：c
19
h
23
n3o4的[m+h]+计算值358.17，实验值358.33。
[0235]
(e)(s)
‑3‑
苯甲基
‑
3,4,6,7
‑
四氢
‑
5h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑
5,6
‑
二甲酸6
‑
苯甲酯5
‑
(叔丁酯)(i
‑
11)
[0236]
向(s)
‑
3,4,6,7
‑
四氢
‑
5h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑
5,6
‑
二甲酸6
‑
苯甲酯5
‑
(叔丁酯)(i
‑
10)(2.70kg，7.55mol)于dcm(32.4l，12体积)中的冰冷溶液中添加1n氢氧化钠水溶液(24.3l，9体积)，随后依序添加四丁基碘化铵(2.80kg，7.55mol)和溴甲苯(0.99l，8.31mol)。将所得反应混合物在室温下再搅拌2小时。在完成反应(tlc&lcms监测)之后，分离二相溶液。用dcm(3
×
10l)萃取水层。经合并的有机物用盐水溶液洗涤，经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩以得到粗产物，所述粗产物通过硅胶(100
‑
200m)管柱色谱，通过使用洗提剂40％etoac/己烷纯化，以获得呈黏稠油状的所需产物(i
‑
11)(1.70kg，63％)。(m/z)：c
26
h
29
n3o4的[m+h]+计算值448.22，实验值448.20。
[0237]
制备3：(s)
‑3‑
苯甲基
‑2‑
(6
‑
(4
‑
(苯甲氧基)
‑2‑
乙基苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑
3,4,6,7
‑
四氢
‑
5h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑
5,6
‑
二甲酸6
‑
苯甲酯5
‑
(叔丁酯)(i
‑
16)
[0238][0239]
(a)4
‑
溴
‑2‑
氟苯甲酰基氯化物(i
‑
13)
[0240]
向4
‑
溴
‑2‑
氟苯甲酸(i
‑
12)(1.25kg，5.71mol)于dcm(12.5l，15体积)中的冰冷搅拌溶液中以逐滴方式添加乙二酰氯(0.98l，11.42mol)。将所得反应混合物在相同温度下搅拌10min。接着将dmf(150ml)以逐滴方式添加至反应混合物。使所得反应块状物升温至室温且搅拌2小时。在完成反应(通过tlc监测)之后，在氮气氛围下在减压下去除过量乙二酰氯，以获得粗产物(i
‑
13)(1.08kg，80％)，其不经进一步纯化即用于下一步骤中。
[0241]
(b)(s)
‑3‑
苯甲基
‑2‑
(4
‑
溴
‑2‑
氟苯甲酰基)
‑
3,4,6,7
‑
四氢
‑
5h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑
5,6
‑
二甲酸6
‑
苯甲酯5
‑
(叔丁酯)(i
‑
14)
[0242]
在室温下向(s)
‑3‑
苯甲基
‑
3,4,6,7
‑
四氢
‑
5h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑
5,6
‑
二甲酸6
‑
苯甲酯5
‑
(叔丁酯)(i
‑
11)(1.70kg，3.80mol)于acn(13.6l，8体积)中的搅拌溶液中添加三乙胺(2.11l，15.2mol)，随后添加4
‑
溴
‑2‑
氟苯甲酰氯(i
‑
13)(1.08kg，4.56mol于3.4l acn中，2体积)。在完成添加之后，所得反应混合物颜色自淡黄色变为棕色。将所得反应混合物在相同温度下搅拌30min，且通过tlc监测反应进展。将所得反应混合物用冰冷的水(10l)淬灭，接着用etoac(3
×
5l)萃取且将经合并的有机物用盐水溶液洗涤。有机物经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩以得到粗产物，所述粗产物通过硅胶(100
‑
200m)管柱色谱，通过使用洗提剂20％etoac/己烷纯化，以获得所需产物(i
‑
14)(1.74kg，71％)。(m/z)：c
33
h
31
brfn3o5的[m+h]+计算值648.14，实验值648.20。
[0243]
(c)(s)
‑3‑
苯甲基
‑2‑
(6
‑
溴
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑
3,4,6,7
‑
四氢
‑
5h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑
5,6
‑
二甲酸6
‑
苯甲酯5
‑
(叔丁酯)(i
‑
15)
[0244]
在室温下，向(s)
‑3‑
苯甲基
‑2‑
(4
‑
溴
‑2‑
氟苯甲酰基)
‑
3,4,6,7
‑
四氢
‑
5h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑
5,6
‑
二甲酸6
‑
苯甲酯5
‑
(叔丁酯)(i
‑
14)(1.74kg，2.68mol)于thf(26.0l，15体积)中的搅拌溶液中添加水合肼(0.705l，13.4mol)。将所得反应混合物在60℃下加热3小时。在完成反应(tlc监测)之后，将所得反应块状物倒入冰冷的水(10l)中，接着用etoac(3
×
10l)萃取化合物。经合并的有机物用盐水洗涤且经硫酸钠干燥，过滤，并且在减压下蒸发以得到粗产物，所述粗产物通过硅胶(100
‑
200m)管柱色谱，通过使用洗提剂20％etoac/己烷纯化，以获得呈灰白色固体状的所需产物(i
‑
15)(1.12kg，65％)。(m/z)：c
33
h
32
brn5o4的[m+h]+计算值642.16，实验值642.21。
[0245]
(d)(s)
‑3‑
苯甲基
‑2‑
(6
‑
(4
‑
(苯甲氧基)
‑2‑
乙基苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑
3,4,6,7
‑
四氢
‑
5h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑
5,6
‑
二甲酸6
‑
苯甲酯5
‑
(叔丁酯)(i
‑
16)
[0246]
将双(频哪醇根基)二硼(250g，984mmol)与丙
‑2‑
醇(1.882l，2.46e+04mmol)一起装入至预先使用氟化学物质蚀刻的5l 3颈单壁烧瓶且搅拌混合物直至充分溶解为止。溶解为吸热的(
‑
4℃)。在预先使用氟化学物质蚀刻的4l锥形瓶中，将氟化钾氢氟酸盐(538g，6891mmol)溶解于水(2.306l，1.28e+05mmol)中以形成3m溶液。溶解为吸热的(
‑
12℃)。接着过滤溶液以自氟化钾氢氟酸盐去除少量不溶材料。一旦充分溶解两种溶液，则历经15分钟将锥形瓶的内含物逐份装入至单壁烧瓶中。观测到适度发热(+10℃)。在添加期间，溶液变为厚而半透明的半不透光灰色研磨浆，且延长搅拌以保持内含物良好混合。将混合物搅拌1.5h，且接着通过粗糙的玻璃烧结漏斗(4l，预先蚀刻)过滤。需要30
‑
45分钟来完成过滤。丢弃透明的二相滤过物。将白色固体在过滤器上干燥10分钟(观测到饼状物的裂解)。将固体转移回至干净的5l 3颈单壁烧瓶中且用水(1.33l，7.38e+04mmol)再制成浆液。将研磨浆搅拌2h，此后其形成透明的均匀水凝胶。将溶液搅拌另外1h，随即使用4l粗糙玻璃漏斗(预先蚀刻)滤除固体/凝胶。将固体在过滤器上干燥30分钟。将固体转移回至干净的5l 3颈单壁烧瓶且用丙酮(1.084l，1.48e+04mmol)再制成浆液。将白色/灰色研磨浆搅拌1h且接着在4l粗糙玻璃漏斗(预先蚀刻)上过滤。需要20分钟来完成过滤，且接着在漏斗上干燥另外1h。在此时间过程中，偶尔搅动固体以确保均匀干燥。淡白色粉末在干燥之后保留于过滤器上。将固体随着缓慢氮气渗出在真空下在55℃下干燥20h，以获得疏松白色固体(收集到200.3g)。
[0247]
向(s)
‑3‑
苯甲基
‑2‑
(6
‑
溴
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑
3,4,6,7
‑
四氢
‑
5h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑
5,6
‑
二甲酸6
‑
苯甲酯5
‑
(叔丁酯)(i
‑
15)(10.0g，16.0mmol)于2
‑
甲基四氢呋喃(100ml，
10体积)中的搅拌溶液中添加(4
‑
(苯甲氧基)
‑2‑
乙基苯基)三氟
‑
λ4‑
甲硼烷，钾盐(i
‑
5)(8.0g，20mmol)和上文所获得的疏松白色固体(0.20g)。使所得反应混合物经氮气脱气30分钟。向此溶液中添加所制备的碳酸铯水溶液(20.0g，62.0mmol于60ml水中，6体积)。将所得反应混合物进一步脱气15分钟，随后添加双(二
‑
叔丁基(4
‑
二甲氨基苯基)膦)二氯化钯(ii)(0.66g，0.93mmol)，且将反应混合物在真空下排空并通过氮气冲洗。将所得反应混合物在110℃下加热20小时。在完成反应(tlc&lcms监测)之后，使所得反应混合物冷却至室温且通过硅藻土床过滤，接着用etoac(3
×
0.5l)进一步洗涤。经合并的有机物用1n氢氧化钠溶液(3
×
0.5l)洗涤。接着经合并的有机物用盐水洗涤且经硫酸钠干燥，过滤，且在减压下蒸发以得到粗产物，所述粗产物通过硅胶(100
‑
200m)管柱色谱，通过使用洗提剂20％etoac/己烷纯化，以获得呈淡黄色固体状的所需产物(i
‑
16)(作为n
‑
苯甲基区位异构体的混合物)(8.0g，66％)。(m/z)：c
48
h
47
n5o5的[m+h]+计算值774.36，实验值774.59。
[0248]
制备4：(s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸，盐酸盐(i
‑
18)
[0249][0250]
(a)(s)
‑3‑
苯甲基
‑2‑
(6
‑
(4
‑
(苯甲氧基)
‑2‑
乙基苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸苯甲酯，盐酸盐(i
‑
17)
[0251]
将(s)
‑3‑
苯甲基
‑2‑
(6
‑
(4
‑
(苯甲氧基)
‑2‑
乙基苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑
3,4,6,7
‑
四氢
‑
5h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑
5,6
‑
二甲酸6
‑
苯甲酯5
‑
(叔丁酯)(i
‑
16)(1.0g，1.292mmol)溶解于二恶烷(8ml)和水(1.5ml)中，接着添加氯化氢溶液(4m于二恶烷中)(7ml，28.0mmol)且将反应混合物在室温下搅拌3小时(通过lcms监测反应进展)。接着冷冻且冻干反应混合物，且将粗产物(i
‑
17)直接用于下一反应中(假定定量产率)。(m/z)：c
43
h
39
n5o3的[m+h]+计算值674.31，实验值674.3。
[0252]
(b)(s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸，盐酸盐(i
‑
18)
[0253]
将(s)
‑3‑
苯甲基
‑2‑
(6
‑
(4
‑
(苯甲氧基)
‑2‑
乙基苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸苯甲酯，盐酸盐(i
‑
17)(0.918g，1.292mmol)在50℃下溶解于2
‑
丙醇(15ml)、氯化氢溶液(5m于水中)(0.258ml，1.292mmol)和水(0.25ml)中，接着添加钯(10％wt.于碳上)，50％水(0.138g，0.065mmol)。接着用氮气吹扫反应烧瓶，连接氢气气囊且将反应混合物在50℃下搅拌4天，其中在需要时补给氢气气囊(通过lcms监测反应进展)。接着通过过滤去除所有固体且浓缩所得溶液。将残余物溶解于1:1acn/水中，冷冻且冻干。所得粉末(i
‑
18)不经进一步纯化即使用(假定定量产率)。(m/z)：c
22
h
21
n5o3的[m+h]+计算值404.17，实验值404.2。
[0254]
制备5：(s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
异丙基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸(i
‑
19)
[0255][0256]
将(s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸，hcl(i
‑
18)(0.25g，0.568mmol)悬浮于dmf(2.5ml)和丙酮(2.5ml)中，接着添加乙酸(0.098ml，1.705mmol)和氰基硼氢化钠(0.179g，2.84mmol)且将反应混合物在室温下搅拌24小时(通过lcms监测反应进展)。浓缩反应混合物，接着将粗产物通过逆相色谱(5
‑
70％acn/水梯度，50g c18aq管柱)纯化，以得到标题化合物的tfa盐(149mg，47％产率)。(m/z)：c
25
h
27
n5o3的[m+h]+计算值446.21，实验值446.3。
[0257]
制备6：(s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
丙基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸(i
‑
20)
[0258][0259]
将(s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸，hcl(i
‑
18)(0.160g，0.364mmol)和丙醛(0.039ml，0.546mmol)溶解于甲醇(3.0ml)中，接着添加氰基硼氢化钠(0.069g，1.091mmol)且将反应混合物在室温下搅拌24小时(通过lcms监测反应进展)。浓缩反应混合物且将粗产物通过逆相色谱(5
‑
70％acn/水梯度，50g c18管柱)纯化，以得到标题化合物的tfa盐(78mg，38％产率)。(m/z)：c
25
h
27
n5o3的[m+h]+计算值446.21，实验值446.3。
[0260]
制备7：(s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
甲基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸(i
‑
21)
[0261][0262]
将(s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸，hcl(i
‑
18)(0.160g，0.364mmol)和甲醛溶液(37wt％于水中)(0.032ml，0.436mmol)溶解于甲醇(3.0ml)中，接着添加氰基硼氢化钠(0.069g，1.091mmol)且将反应混合物在室温下搅拌4小时(通过lcms监测反应进展)。添加硼氢化钠(14mg，0.364mmol)以
淬灭任何过量甲醛，接着浓缩反应混合物。将粗产物通过逆相色谱(5
‑
70％acn/水梯度，50g c18管柱)纯化，以得到标题化合物的tfa盐(110mg，57％产率)。(m/z)：c
23
h
23
n5o3的[m+h]+计算值418.18，实验值418.2。
[0263]
制备8：(r)
‑2‑
(3
‑
甲基哌嗪
‑1‑
基)乙
‑1‑
醇，二盐酸盐(i
‑
24)
[0264][0265]
(a)(r)
‑4‑
(2
‑
羟乙基)
‑2‑
甲基哌嗪
‑1‑
甲酸叔丁酯(i
‑
23)
[0266]
将(r)
‑1‑
boc
‑2‑
甲基
‑
哌嗪(0.2g，0.999mmol)、dipea(0.698ml，3.99mmol)和2
‑
溴乙醇(0.085ml，1.198mmol)溶解于dmf(5ml)中且将反应混合物在60℃下搅拌16小时(通过lcms监测反应进展)。浓缩反应混合物，接着将10ml乙醚添加至残余物。声波处理溶液直至残余物凝胶消失且固体形成为止。接着将醚溶液自固体倾倒出来。接着将固体直接用于下一反应中(假定定量产率)。(m/z)：c
12
h
24
n2o3的[m+h]+计算值245.18，实验值245.4。
[0267]
(b)(r)
‑2‑
(3
‑
甲基哌嗪
‑1‑
基)乙
‑1‑
醇，二盐酸盐(i
‑
24)
[0268]
将(r)
‑4‑
(2
‑
羟乙基)
‑2‑
甲基哌嗪
‑1‑
甲酸叔丁酯(0.244g，0.999mmol)溶解于二恶烷(3.0ml)和水(0.5ml)中，接着添加氯化氢溶液(4m于二恶烷中)(2.0ml，65.8mmol)且将反应混合物在室温下搅拌3小时(通过lcms监测反应进展)。冷冻且冻干反应混合物，且所得产物不经纯化即使用(假定定量产率)。(m/z)：c7h
16
n2o的[m+h]+计算值145.13，实验值145.4。
[0269]
实例1：(s)
‑
(2
‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
丙基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
基)(4
‑
(2
‑
羟乙基)哌嗪
‑1‑
基)甲酮
[0270][0271]
将(s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
丙基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸，tfa(i
‑
20)(40mg，0.071mmol)、正
‑
(2
‑
羟乙基)哌嗪(0.018ml，0.143mmol)和dipea(0.025ml，0.143mmol)溶解于dmf(1.5ml)中，接着添加hatu(40.8mg，0.107mmol)且将反应混合物在室温下搅拌3小时(通过lcms监测反应进展)。添加肼(0.011ml，0.357mmol)以裂解非所要副产物，接着将溶液在室温下搅拌10分钟。接着浓缩反应混合物且将粗产物通过制备型hplc(5
‑
70％acn/水梯度，c18管柱)纯化，以得到标题化合物的tfa盐(31mg，56％产率)。(m/z)：c
31
h
39
n7o3的[m+h]+计算值558.31，实验值558.3。1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ13.10(s,1h),12.27(d,j＝48.92hz,1h),9.40(s,1h),8.28(t,j＝8.10hz,1h),7.30(s,1h),7.04(m,2h),6.71(d,j＝2.46hz,1h),6.64(dd,j＝2.50,8.23hz,1h),4.44(t,j＝5.31hz,1h),4.11(q,j＝5.26,2h),3.96(m,1h),3.86
‑
3.52(m,6h),3.49(q,j＝6.01hz,2h),2.95(m,2h),2.48(q,j＝7.48hz,2h),2.42
‑
2.21(m,4h),2.37(t,j＝
6.20hz,2h),1.42(m,2h),1.00(t,j＝7.52hz,3h),0.81(m,3h)。
[0272]
实例2：((s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
丙基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
基)((1s,4s)
‑5‑
甲基
‑
2,5
‑
二氮杂双环[2.2.1]庚
‑2‑
基)甲酮
[0273][0274]
将(s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
丙基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸，tfa(i
‑
20)(40mg，0.071mmol)、(1s,4s)
‑5‑
甲基
‑
2,5
‑
二氮杂双环[2.2.1]庚烷二氢溴酸盐(29.4mg，0.107mmol)和dipea(0.062ml，0.357mmol)溶解于dmf(1.5ml)中，接着添加hatu(40.8mg，0.107mmol)且将反应混合物在室温下搅拌3小时(通过lcms监测反应进展)。添加肼(0.011ml，0.357mmol)以裂解非所要副产物，接着将溶液在室温下搅拌10分钟。接着浓缩反应混合物且将粗产物通过制备型hplc(5
‑
70％acn/水梯度，c18管柱)纯化，以得到标题化合物的tfa盐(32mg，59％产率)。(m/z)：c
31
h
37
n7o2的[m+h]+计算值540.30，实验值540.3。
[0275]
实例3：((s)
‑
2,4
‑
二甲基哌嗪
‑1‑
基)((s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
甲基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
基)甲酮
[0276][0277]
(a)(s)
‑4‑
((s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
甲基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
羰基)
‑3‑
甲基哌嗪
‑1‑
甲酸叔丁酯(i
‑
25)
[0278]
将(s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
甲基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸，tfa(i
‑
21)(55mg，0.103mmol)、(s)
‑4‑
正
‑
boc
‑2‑
甲基哌嗪(41.5mg，0.207mmol)和dipea(0.036ml，0.207mmol)溶解于dmf(1.5ml)中，接着添加hatu(59.0mg，0.155mmol)且将反应混合物在室温下搅拌16小时(通过lcms监测反应进展)。添加肼(0.016ml，0.517mmol)以裂解非所要副产物，接着将反应混合物在室温下搅拌10分钟。接着浓缩反应混合物且将粗产物通过逆相色谱(5
‑
70％acn/水梯度，50g c18管柱)纯化，以得到标题化合物的tfa盐(54mg，72％产率)。(m/z)：c
33
h
41
n7o4的[m+h]+计算值600.33，实验值600.3。
[0279]
(b)((s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
甲基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
基)((s)
‑2‑
甲基哌嗪
‑1‑
基)甲酮(i
‑
26)
[0280]
将(s)
‑4‑
((s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
甲基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
羰基)
‑3‑
甲基哌嗪
‑1‑
甲酸叔丁酯，tfa(i
‑
25)(0.126g，
0.177mmol)溶解于二恶烷(1.5ml)和水(0.3ml)中，接着添加氯化氢溶液(4m于二恶烷中)(1.5ml，6.00mmol)且将反应混合物在室温下搅拌2小时(通过lcms监测反应进展)。冷冻且冻干反应混合物，且将所得粉末直接用于下一反应中(假定定量产率)。(m/z)：c
28
h
33
n7o2的[m+h]+计算值500.27，实验值500.3。
[0281]
(c)((s)
‑
2,4
‑
二甲基哌嗪
‑1‑
基)((s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
甲基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
基)甲酮
[0282]
将((s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
甲基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
基)((s)
‑2‑
甲基哌嗪
‑1‑
基)甲酮，二盐酸盐(0.101g，0.176mmol)和甲醛溶液(37wt％于水中)(0.016ml，0.212mmol)溶解于甲醇(3.0ml)中，接着添加氰基硼氢化钠(0.055g，0.882mmol)且将反应混合物在室温下搅拌16小时(通过lcms监测反应进展)。添加硼氢化钠(7mg，0.176mmol)以淬灭任何剩余甲醛。浓缩反应混合物，接着将粗产物通过制备型hplc(5
‑
60％acn/水梯度，c18管柱)纯化，以得到标题化合物的tfa盐(28mg，21％产率)。(m/z)：c
29
h
35
n7o2的[m+h]+计算值514.29，实验值514.3。
[0283]
实例4：(s)
‑
(2
‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
异丙基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
基)(4
‑
甲基
‑
1,4
‑
二氮杂环庚烷
‑1‑
基)甲酮
[0284][0285]
将(s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
异丙基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸，tfa(i
‑
19)(50mg，0.089mmol)、1
‑
甲基高哌嗪(0.022ml，0.179mmol)和dipea(0.031ml，0.179mmol)溶解于dmf(1.5ml)中，接着添加hatu(51.0mg，0.134mmol)且将反应混合物在室温下搅拌3小时(通过lcms监测反应进展)。添加肼(0.014ml，0.447mmol)以裂解非所要副产物，且将溶液在室温下搅拌10分钟。接着浓缩反应混合物且将粗产物通过制备型hplc(2
‑
70％acn/水梯度，c18管柱)纯化，以得到标题化合物的tfa盐(29mg，42％产率)。(m/z)：c
31
h
39
n7o2的[m+h]+计算值542.32，实验值542.3。1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ13.08(s,1h),12.21(d,j＝29.9hz,1h),9.40(s,1h),8.27(d,j＝8.33hz,1h),7.30(s,1h),7.04(t,j＝8.05,2h),6.71(d,j＝2.53hz,1h),6.64(dd,j＝2.54,8.23hz,1h),4.11(m,3h),3.91
‑
3.52(m,6h),2.97(m,1h),2.91
‑
2.53(m,4h),2.49(q,j＝7.46,2h),2.23(d,j＝13.9hz,3h),1.76(m,2h),1.0(m,9h)。
[0286]
实例5：((s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
甲基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
基)((r)
‑4‑
(2
‑
羟乙基)
‑2‑
甲基哌嗪
‑1‑
基)甲酮
[0287]
[0288]
将(s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
甲基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸，tfa(i
‑
21)(55mg，0.103mmol)、(r)
‑2‑
(3
‑
甲基哌嗪
‑1‑
基)乙
‑1‑
醇，二盐酸盐(i
‑
24)(33.7mg，0.155mmol)和dipea(0.090ml，0.517mmol)溶解于dmf(1.5ml)中，接着添加hatu(59.0mg，0.155mmol)且将反应混合物在室温下搅拌16小时(通过lcms监测反应进展)。添加肼(0.016ml，0.517mmol)以裂解非所要副产物，接着将反应混合物在室温下搅拌10分钟。接着浓缩反应混合物，且将粗产物通过制备型hplc(5
‑
70％acn/水梯度，c18管柱)纯化，以得到标题化合物的tfa盐(22mg，28％产率)。(m/z)：c
30
h
37
n7o3的[m+h]+计算值544.30，实验值544.3。
[0289]
实例6：((s)
‑3‑
(二甲氨基)吡咯啶
‑1‑
基)((s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
异丙基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
基)甲酮
[0290][0291]
将(s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
异丙基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸，tfa(i
‑
19)(50mg，0.089mmol)、(s)
‑
(
‑
)
‑3‑
(二甲氨基)吡咯啶(0.023ml，0.179mmol)和dipea(0.031ml，0.179mmol)溶解于dmf(1.5ml)中，接着添加hatu(51.0mg，0.134mmol)且将反应混合物在室温下搅拌3小时(通过lcms监测反应进展)。添加肼(0.014ml，0.447mmol)以裂解非所要副产物，且将溶液在室温下搅拌10分钟。接着浓缩反应混合物且将粗产物通过制备型hplc(5
‑
70％acn/水梯度，c18管柱)纯化，以得到标题化合物的tfa盐(37mg，53％产率)。(m/z)：c
31
h
39
n7o2的[m+h]+计算值542.32，实验值542.3。
[0292]
制备9：2
‑
(4
‑
(苯甲氧基)
‑2‑
乙基
‑5‑
氟苯基)
‑
4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧杂硼杂环戊烷
[0293][0294]
(a)1
‑
(苯甲氧基)
‑4‑
溴
‑5‑
乙基
‑2‑
氟苯
[0295]
向4
‑
溴
‑5‑
乙基
‑2‑
氟苯酚(20g，910.32mmol)于acn(250ml)中的溶液中添加k2co3(31.55g，228.3mmol)，随后逐滴添加溴甲苯(13.10ml，109.58mmol)。将所得反应混合物在80℃下搅拌2h。水层用etoac萃取(三次)，经合并且用盐水洗涤。有机层经na2so4干燥且在减压下蒸发，以获得呈浅黄色油性液体状的标题中间物(25g，89％产率)。1h nmr(400mhz,氯仿
‑
d)δ7.48
‑
7.30(m,5h),7.27(d,j＝10.5hz,1h),6.87(d,j＝8.7hz,1h),5.12(s,2h),2.66(q,j＝7.5hz,2h),1.16(t,j＝7.5hz,3h)。
[0296]
(b)2
‑
(4
‑
(苯甲氧基)
‑2‑
乙基
‑5‑
氟苯基)
‑
4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧杂硼杂环戊烷
[0297]
向先前步骤的产物(12.5g，40.45mmol)于二恶烷(100ml)中的溶液中添加双(频哪
醇根基)二硼(15.40g，60.67mmol)和koac(11.9g，121.35mmol)。将反应混合物用氮气吹扫15min，随后添加与二氯甲烷错合的[1,1'
‑
双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(ii)(1.65g，2.023mmol)。搅拌所得反应混合物且在110℃下加热3h，通过硅藻土过滤且用etoac洗涤残余物。滤过物用过量etoac(200ml)稀释且用水(100ml)，随后盐水(100ml)洗涤，经硫酸钠干燥且在真空中浓缩以得到粗产物，所述粗产物通过(100
‑
200)硅胶管柱色谱纯化，经3
‑
5％etoac:己烷洗提，以获得呈灰白色固体状的所需产物(9.50g，66％产率)。1h nmr(400mhz,氯仿
‑
d)δ7.54
‑
7.27(m,6h),6.81(d,j＝7.9hz,1h),5.16(s,2h),2.84(q,j＝7.5hz,2h),1.32(s,12h),1.14(t,j＝7.5hz,3h)。
[0298]
制备10：6
‑
(4
‑
(苯甲氧基)
‑2‑
乙基
‑5‑
氟苯基)
‑1‑
(四氢
‑
2h
‑
哌喃
‑2‑
基)
‑3‑
(三甲基锡烷基)
‑
1h
‑
吲唑
[0299][0300]
(a)6
‑
(4
‑
(苯甲氧基)
‑2‑
乙基
‑5‑
氟苯基)
‑1‑
(四氢
‑
2h
‑
哌喃
‑2‑
基)
‑
1h
‑
吲唑
[0301]
向6
‑
溴
‑1‑
(四氢
‑
2h
‑
哌喃
‑2‑
基)
‑
1h
‑
吲唑(50g，178.57mmol)和2
‑
(4
‑
(苯甲氧基)
‑2‑
乙基
‑5‑
氟苯基)
‑
4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧杂硼杂环戊烷(76.3g，214.29mmol)于dmf:h2o(480:120ml)中的溶液中添加k3po4(94.64g，446.86mmol)。将反应混合物经氮气脱气15min，接着添加pd(pph3)2cl2催化剂(6.26g，8.93mmol)且将混合物再次经氮气脱气5min，经搅拌且在100至110℃下加热5h。通过硅藻土过滤反应混合物且用etoac洗涤残余物。滤过物用etoac稀释，用冷水和盐水洗涤，经硫酸钠干燥且在真空中浓缩以得到粗产物，所述粗产物通过急骤管柱色谱纯化，以获得呈白色固体状的标题中间物(65g，86％产率)。(m/z)：c
27
h
27
fn2o2的[m+h]
+
计算值431.21，实验值431.46。1h nmr(400mhz,氯仿
‑
d)δ8.06
‑
7.98(m,2h),7.70(d,j＝8.2hz,1h),7.51
‑
7.32(m,5h),7.08(dd,j＝809.6,8.3hz,1h),7.03(d,j＝11.9hz,1h),6.95(d,j＝8.5hz,1h),5.76
‑
5.64(m,1h),5.20(s,2h),4.04(d,j＝10.1hz,1h),3.72(t,j＝9.7hz,1h),2.52(q,j＝7.5hz,2h),2.22
‑
2.02(m,3h),1.80
‑
1.71(m,3h),1.06(t,j＝7.5hz,3h)。
[0302]
(b)6
‑
(4
‑
(苯甲氧基)
‑2‑
乙基
‑5‑
氟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
[0303]
向先前步骤的产物(65g，151.16mmol)于甲醇(700ml)中的溶液中添加浓hcl
(120ml)且使所得溶液在60
‑
65℃下加热3h，冷却至室温，且在真空中浓缩。将残余物溶解于etoac中且用nahco3饱和水溶液和水洗涤。有机层经无水na2so4干燥且在真空中浓缩，以获得呈白色固体状的标题中间物(52g，99％(粗物质))。1h nmr(400mhz,氯仿
‑
d)δ8.13(s,1h),7.77(d,j＝8.3hz,1h),7.59
‑
7.30(m,6h),7.10(d,j＝8.3hz,1h),7.01(d,j＝11.8hz,1h),6.96(d,j＝8.4hz,1h),5.21(s,2h),2.53(q,j＝7.5hz,2h),1.05(t,j＝7.5hz,3h)。
[0304]
(c)6
‑
(4
‑
(苯甲氧基)
‑2‑
乙基
‑5‑
氟苯基)
‑3‑
碘
‑
1h
‑
吲唑
[0305]
向6
‑
(4
‑
(苯甲氧基)
‑2‑
乙基
‑5‑
氟苯基)
‑
1h
‑
吲唑(56g，161.18mmol)于dmf(400ml)中的溶液中添加koh(36.2g，647.39mmol)且将混合物搅拌5min。在0℃下缓慢添加碘(82.2g，323.69mmol)于dmf(100ml)中的溶液且在室温下搅拌30min，用水(3
×
150ml)稀释且用etoac(3
×
200ml)萃取。有机层用偏亚硫酸氢钠饱和水溶液(3
×
200ml)和水(400ml)洗涤，经无水na2so4干燥且在减压下浓缩以得到粗产物，所述粗产物通过急骤管柱色谱纯化，以获得呈浅褐色半固体状的标题中间物(64g，84％产率)。1h nmr(400mhz,氯仿
‑
d)δ10.49(s,1h),7.57
‑
7.32(m,7h),7.16(d,j＝8.3hz,1h),7.04
‑
6.91(m,2h),5.20(s,2h),2.51(q,j＝7.4hz,2h),1.04(t,j＝7.5hz,3h)。
[0306]
(d)6
‑
(4
‑
(苯甲氧基)
‑2‑
乙基
‑5‑
氟苯基)
‑3‑
碘
‑1‑
(四氢
‑
2h
‑
哌喃
‑2‑
基)
‑
1h
‑
吲唑
[0307]
向先前步骤的产物(60g，127.12mmol)于dcm(700ml)中的冰冷溶液中添加对甲苯磺酸(4.84g，25.423mmol)，随后逐滴添加3,4
‑
二氢
‑
2h
‑
哌喃(17.43ml，190.68mmol)。将反应混合物在室温下搅拌隔夜，用dcm稀释且用nahco3饱和水溶液和盐水洗涤。有机层经无水na2so4干燥且在减压下浓缩以得到粗产物，所述粗产物通过急骤色谱(硅胶)纯化，以获得呈灰白色固体的标题中间物(64g，91％产率)。(m/z)：c
27
h
26
fin2o2的[m+h]
+
计算值557.10，实验值557.30。1h nmr(400mhz,氯仿
‑
d)δ7.56
‑
7.31(m,7h),7.14(d,j＝8.3hz,1h),7.01(d,j＝11.8hz,1h),6.95(d,j＝8.5hz,1h),5.68(d,j＝9.3hz,1h),5.20(s,2h),4.08
‑
3.99(m,1h),3.77
‑
3.64(m,1h),2.50(q,j＝7.2hz,2h),2.23
‑
1.97(m,3h),1.81
‑
1.68(m,3h),1.06(t,j＝7.4hz,3h)。
[0308]
(e)6
‑
(4
‑
(苯甲氧基)
‑2‑
乙基
‑5‑
氟苯基)
‑1‑
(四氢
‑
2h
‑
哌喃
‑2‑
基)
‑3‑
(三甲基锡烷基)
‑
1h
‑
吲唑
[0309]
向6
‑
(4
‑
(苯甲氧基)
‑2‑
乙基
‑5‑
氟苯基)
‑3‑
碘
‑1‑
(四氢
‑
2h
‑
哌喃
‑2‑
基)
‑
1h
‑
吲唑(20g，35.97mmol)于甲苯(150ml)中的溶液中添加六甲基二锡(9.2ml，43.17mmol)。反应混合物经氮气脱气20min，随后添加四(2.0g，1.80mmol)且接着在100℃下搅拌2h，冷却至室温，通过硅藻土过滤且用etoac洗涤残余物。浓缩滤过物且通过管柱色谱(经中性氧化铝)纯化，用2
‑
5％etoac:己烷洗提，以获得标题化合物(17.50g，82％产率)。(m/z)：c
30
h
35
fn2o2sn的[m+h]
+
计算值595.17、593.17；实验值595.49、593.55。1h nmr(400mhz,氯仿
‑
d)δ7.68(d,j＝8.0hz,1h),7.57
‑
7.29(m,6h),7.13
‑
7.00(m,2h),6.96(d,j＝8.4hz,1h),5.81
‑
5.68(m,1h),5.21(s,2h),4.13
‑
4.00(m,1h),3.81
‑
3.66(m,1h),2.54(q,j＝7.3hz,2h),2.23
‑
2.00(m,2h),1.87
‑
1.59(m,4h),1.08(t,j＝7.5hz,3h),0.47(s,9h)。
[0310]
制备11：(s)
‑2‑
碘
‑3‑
((2
‑
三甲基硅烷基)乙氧基)甲基)
‑
3,4,6,7
‑
四氢
‑
5h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑
5,6
‑
二甲酸5
‑
(叔丁酯)6
‑
甲酯
[0311][0312]
(a)(s)
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸
[0313]
在0℃下向l
‑
组氨酸(50g，322.24mmol)于水(420ml)中的搅拌悬浮液中逐滴添加浓hcl(29ml)，随后在0℃下一次性添加甲醛(55ml，676.72mmol)。将所得反应混合物搅拌30min，且接着在75℃下加热6h并浓缩。将所得粗物质与乙醚搅拌2h，过滤且用ipa:thf(100:300ml)洗涤，以得到呈灰白色固体状的标题中间物的hcl盐(75g，99％产率(粗物质))。(m/z)：c7h9n3o2的[m+h]
+
计算值168.07，实验值168.17。
[0314]
(b)(s)
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸甲酯
[0315]
在0℃下，向先前步骤的产物(75.0g，312.5mmol)于甲醇(1500ml)中的搅拌溶液中逐滴添加socl2(45.6ml，625mmol)且在室温下搅拌16h，接着加热直至回流(70℃)持续1h。通过蒸馏去除溶剂且粗产物用甲醇，随后乙醚研磨，以得到呈灰白色固体状的标题中间物的粗hcl盐(80g粗物质)。1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ9.05(s,1h),4.71(dd,j＝9.4,5.2hz,1h),4.36(d,j＝15.5hz,1h),4.30(d,j＝15.6hz,1h),3.82(s,3h),3.44
‑
3.21(m,2h)。
[0316]
(c)(s)
‑
3,4,6,7
‑
四氢
‑
5h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑
5,6
‑
二甲酸5
‑
(叔丁酯)6
‑
甲酯
[0317]
在0℃下，向先前步骤的产物(80.0g，314.96mmol)于甲醇(1000ml)中的搅拌溶液中添加dipea(282ml，1574mmol)，随后二碳酸二叔丁酯(172ml，787.48mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16h且接着添加液体nh3(150ml，25％于水中)，且将反应混合物在室温下再次搅拌16h，通过蒸馏去除甲醇并用dcm(3
×
200ml)萃取残余物。经合并的有机萃取物经无水na2so4干燥，浓缩且通过急骤色谱(100
‑
200目硅胶)纯化，用5％meoh:dcm洗提，以获得标题中间物(41g,46％产率)。(m/z)：c
13
h
19
n3o4的[m+h]
+
计算值282.14，实验值282.21。1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ11.85(s,1h),7.50(s,1h),5.18(dd,j＝49.3,5.1hz,1h),4.51(t,j＝14.2hz,1h),4.09(dd,j＝43.9,16.1hz,1h),3.59(s,3h),3.08(d,j＝15.5hz,1h),2.94(d,j＝15.1hz,1h),1.45(s,9h)。
[0318]
(d)(s)
‑2‑
碘
‑
3,4,6,7
‑
四氢
‑
5h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑
5,6
‑
二甲酸5
‑
(叔丁酯)6
‑
甲酯
[0319]
在0℃下，向先前步骤的产物(41.0g，145.9mmol)于thf(500ml)中的溶液中添加n
‑
碘代丁二酰亚胺(66.0g，291.8mmol)且将所得溶液在室温下搅拌4h，用水稀释并用乙酸乙酯萃取。有机部分用10％硫代硫酸钠溶液(3
×
200ml)洗涤。经合并的有机层经无水硫酸钠干燥，且经浓缩，以得到标题化合物60g(粗物质)，其不经进一步纯化即用于下一步骤中。(m/z)：c
13
h
18
in3o4的[m+h]
+
计算值408.03，实验值408.31。1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ12.48(s,1h),5.34
‑
4.97(m,1h),4.67
‑
4.35(m,1h),4.12
‑
3.95(m,1h),3.60(s,3h),3.14
‑
2.82(m,2h),1.44(s,9h)。
[0320]
(e)(s)
‑2‑
碘
‑3‑
((2
‑
三甲基硅烷基)乙氧基)甲基)
‑
3,4,6,7
‑
四氢
‑
5h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑
5,6
‑
二甲酸5
‑
(叔丁酯)6
‑
甲酯
[0321]
在0℃下，向(s)
‑2‑
碘
‑
3,4,6,7
‑
四氢
‑
5h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑
5,6
‑
二甲酸5
‑
(叔丁酯)6
‑
甲酯(40g，0.098mol)于dmf(150ml)中的搅拌溶液中添加dipea(35.1ml，0.19mol)。将反应混合物搅拌10min，接着在0℃下逐滴添加2
‑
(三甲基硅烷基)
‑
乙氧基甲基氯(19.1ml，0.10mol)。将所得反应混合物在室温下搅拌3h。在4h之后，添加冷冻水且反应混合物用etoac(2
×
200ml)萃取。有机层经无水硫酸钠干燥，浓缩且通过急骤管柱色谱纯化，用20
‑
35％etoac:己烷洗提，以获得呈浅黄色黏稠液态状的标题产物(27g)。(m/z)：c
19
h
32
in3o5si的[m+h]
+
计算值538.12，实验值538.42。1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ5.33
‑
5.04(m,3h),4.79
‑
4.56(m,1h),4.54
‑
4.14(m,1h),3.60(s,3h),3.47(t,j＝7.8hz,2h),3.31
‑
3.16(m,1h),2.97(t,j＝18.9hz,1h),1.44(s,9h),0.92
‑
0.74(m,2h),
‑
0.03(s,9h)。
[0322]
制备12：(6s)
‑5‑
(叔丁氧基羰基)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑5‑
氟
‑4‑
羟苯基)
‑1‑
(四氢
‑
2h
‑
哌喃
‑2‑
基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑3‑
((2
‑
(三甲基硅烷基)乙氧基)甲基)
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸
[0323][0324]
(a)(6s)
‑2‑
(6
‑
(4
‑
(苯甲氧基)
‑2‑
乙基
‑5‑
氟苯基)
‑1‑
(四氢
‑
2h
‑
哌喃
‑2‑
基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑3‑
((2
‑
(三甲基硅烷基)乙氧基)甲基)
‑
3,4,6,7
‑
四氢
‑
5h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑
5,6
‑
二甲酸5
‑
(叔丁酯)6
‑
甲酯
[0325]
向(s)
‑2‑
碘
‑3‑
((2
‑
三甲基硅烷基)乙氧基)甲基)
‑
3,4,6,7
‑
四氢
‑
5h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑
5,6
‑
二甲酸5
‑
(叔丁酯)6
‑
甲酯(17.0g，31.65mmol)于甲苯(500ml)中的搅拌溶液中添加6
‑
(4
‑
(苯甲氧基)
‑2‑
乙基
‑5‑
氟苯基)
‑1‑
(四氢
‑
2h
‑
哌喃
‑2‑
基)
‑3‑
(三甲基锡烷基)
‑
1h
‑
吲唑(20g，34.82mmol)。将反应混合物用氩气吹扫15min，添加pd(pph3)4(3.6g，3.16mmol)和碘化铜(1.20g,6.33mmol)且将反应混合物在120℃下搅拌16h。反应混合物通过硅藻土过滤，在减压下浓缩滤过物且通过硅胶管柱色谱(redisep 80g管柱，用dcm洗提10min且接着15
‑
20％etoac/己烷洗提)纯化，以获得呈黄色固体状的标题中间物(15.10g，58％产率)。(m/z)：c
46
h
58
fn5o7si的[m+h]
+
计算值840.41，实验值840.54。1h nmr(400mhz,氯
仿
‑
d)δ8.43(s,1h),7.54
‑
7.33(m,6h),7.20(s,1h),7.05(d,j＝11.4hz,1h),6.95(d,j＝8.5hz,1h),6.09
‑
5.69(m,3h),5.59
‑
5.36(m,1h),5.20(s,2h),4.97
‑
4.80(m,1h),4.12
‑
3.90(m,1h),3.68(s,3h),3.57
‑
3.47(m,2h),3.40(d,1h),3.21
‑
3.05(m,1h),2.74
‑
2.34(m,4h),2.25
‑
2.07(m,2h),1.94
‑
1.65(m,4h),1.54(s,9h),1.12
‑
0.99(m,3h),0.91
‑
0.75(m,2h),
‑
0.12(s,9h)。
[0326]
(b)(6s)
‑2‑
(6
‑
(4
‑
(苯甲氧基)
‑2‑
乙基
‑5‑
氟苯基)
‑1‑
(四氢
‑
2h
‑
哌喃
‑2‑
基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑3‑
((2
‑
(三甲基硅烷基)乙氧基)甲基)
‑
3,4,6,7
‑
四氢
‑
5h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑
5,6
‑
二甲酸6
‑
苯甲酯5
‑
(叔丁酯)
[0327]
向圆底烧瓶中添加含先前步骤的产物(15.0g，17.85mmol)的甲苯(400ml)、苯甲醇(46.3ml)和ti(oet)4(7.15ml，35.70mmol)且使反应混合物剧烈回流(140℃)48h，用水稀释且用dcm萃取。过滤悬浮液，滤过物经na2so4干燥，在减压下浓缩且通过硅胶管柱色谱(redisep 80g管柱，0
‑
5％etoac/己烷)纯化20min以去除过量苯甲醇，接着用10
‑
15％etoac/己烷洗提，以得到标题中间物。1h nmr与结构一致。(m/z)：c
52
h
62
fn5o7si的[m+h]
+
计算值916.44，实验值916.86。
[0328]
(c)(6s)
‑5‑
(叔丁氧基羰基)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑5‑
氟
‑4‑
羟苯基)
‑1‑
(四氢
‑
2h
‑
哌喃
‑2‑
基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑3‑
((2
‑
(三甲基硅烷基)乙氧基)甲基)
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸
[0329]
向先前步骤的产物(21.0g，22.92mmol)于1:1ipa:thf(400ml)中的搅拌溶液中添加pd(oh)2(5.0g)。将反应混合物在氢气气囊下在室温下搅拌16h，通过硅藻土过滤，在减压下浓缩且通过硅胶管柱色谱(redisep 80g管柱，用25
‑
40％etoac/己烷洗提)纯化，以得到呈灰白色固体状的标题化合物(6.1g，8.29mmol)。(m/z)：c
38
h
50
fn5o7si的[m+h]
+
计算值736.35，实验值736.5。1h nmr与结构一致。(m/z)：c
38
h
50
fn5o7si的[m+h]
+
计算值736.35，实验值736.5。1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ12.94(s,1h),9.86(s,1h),8.34(t,j＝7.6hz,1h),7.66(s,1h),7.20(d,j＝8.7hz,1h),7.03(d,j＝11.8hz,1h),6.93(d,j＝9.1hz,1h),6.11
‑
5.77(m,3h),5.33
‑
5.06(m,1h),4.87
‑
4.56(m,1h),4.52
‑
4.14(m,1h),3.97
‑
3.69(m,2h),3.53
‑
3.40(m,2h),3.23
‑
3.11(m,1h),3.11
‑
2.93(m,1h),2.47
‑
2.44(m,2h),2.13
‑
1.96(m,2h),1.68(d,j＝70.9hz,4h),1.48(s,9h),1.02(t,j＝7.5hz,3h),0.86
‑
0.68(m,2h),
‑
0.17(s,9h)。
[0330]
制备13：(s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑5‑
氟
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸
[0331][0332]
在0℃下，向(6s)
‑5‑
(叔丁氧基羰基)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑5‑
氟
‑4‑
羟苯基)
‑1‑
(四氢
‑
2h
‑
哌喃
‑2‑
基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑3‑
((2
‑
(三甲基硅烷基)乙氧基)
‑
甲基)
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸(5.7g，7.75mmol)于5:1二恶烷:水(60ml)中的搅拌溶液中逐滴添加浓hcl(20ml)。使反应混合物升温且在90℃下搅拌16h并在真空下蒸馏以得到粗残
余物，所述粗残余物依序用经冷冻乙醚和乙腈研磨，以得到呈淡棕色固体状的标题化合物的hcl盐(3.6g，95％产率)。(m/z)：c
22
h
20
fn5o3的[m+h]
+
计算值422.16，实验值422.24。1h nmr(400mhz,d2o/dmso
‑
d6)δ8.22(d,j＝8.4hz,1h),7.49(s,1h),7.19(d,j＝8.1hz,1h),6.99(d,j＝11.9hz,1h),6.91(d,j＝9.0hz,1h),4.56
‑
4.51(m,1h),4.36(d,j＝15.5hz,1h),4.30(d,j＝15.5hz,1h),3.35
‑
3.25(m,1h),3.15
‑
3.05(m,1h),2.4
‑
2.55(m,2h),0.97(t,j＝7.5hz,3h)。
[0333]
制备14：(s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑5‑
氟
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
丙基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸
[0334][0335]
向(s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑5‑
氟
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸，hcl(400mg，0.874mmol)和丙醛(0.095ml，1.310mmol)于dmf(7ml)中的溶液中添加氰基硼氢化钠(165mg，2.62mmol)且将反应混合物在室温下搅拌隔夜。添加硼氢化钠(33mg，0.874mmol)，溶液经浓缩且通过制备型hplc纯化，以得到标题化合物的tfa盐(179mg，37％产率)(m/z)：c
25
h
26
fn5o3的[m+h]
+
计算值464.20，实验值464.5。
[0336]
制备15：(s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑5‑
氟
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
异丙基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸
[0337][0338]
向(s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑5‑
氟
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸，hcl(400mg，0.874mmol)、丙酮(0.192ml，2.62mmol)和乙酸(0.150ml，2.62mmol)于dmf(7ml)中的溶液中添加氰基硼氢化钠(274mg，4.37mmol)且将反应混合物在室温下搅拌隔夜。添加硼氢化钠(33mg，0.874mmol)，溶液经浓缩且通过制备型hplc纯化，以得到标题化合物的tfa盐(115mg，23％产率)。(m/z)：c
25
h
26
fn5o3的[m+h]
+
计算值464.20，实验值464.5。
[0339]
制备16：(s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑5‑
氟
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
甲基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸
[0340][0341]
向(s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑5‑
氟
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸，hcl(8')(300mg，0.655mmol)和(37wt％甲醛于水中)(0.059ml，0.786mmol)dmf(5ml)中的溶液中添加氰基硼氢化钠(165mg，2.62mmol)且将反应混合物在室温下搅拌隔夜。添加硼氢化钠(25mg，0.655mmol)，溶液经浓缩且通过急骤色谱(100g管柱，5
‑
75％acn/水)纯化，以得到标题化合物的tfa盐(85mg，24％产率)。(m/z)：c
23
h
22
fn5o3的[m+h]
+
计算值436.17，实验值436.45。
[0342]
实例7：(s)
‑
(2
‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑5‑
氟
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
丙基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
基)(4
‑
(2
‑
羟乙基)哌嗪
‑1‑
基)甲酮c
‑1[0343][0344]
向(s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑5‑
氟
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
丙基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸，tfa(30mg，0.052mmol)、2
‑
(哌嗪
‑1‑
基)乙醇，2hcl(0.19ml，0.156mmol)和dipea(0.027ml，0.156mmol)于dmf(1.5ml)中的溶液中添加hatu(29.6mg，0.078mmol)且将反应混合物在室温下搅拌隔夜。添加肼(5当量)，反应混合物经浓缩且通过制备型hplc纯化，以得到标题化合物的tfa盐(15.4mg，37％产率)。(m/z)：c
31
h
38
fn7o3的[m+h]
+
计算值576.30，实验值576.2。
[0345]
实例8：((s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑5‑
氟
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
丙基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
基)((1s,4s)
‑5‑
甲基
‑
2,5
‑
二氮杂双环
‑
[2.2.1]庚
‑2‑
基)甲酮c
‑2[0346][0347]
向(s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑5‑
氟
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
丙基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸，tfa(30mg，0.052mmol)、(1s,4s)
‑5‑
甲基
‑
2,5
‑
二氮杂双环
[2.2.1]庚烷二氢溴酸盐(42.7mg，0.156mmol)和dipea(0.064ml，0.364mmol)于dmf(1.5ml)中的溶液中添加hatu(29.6mg，0.078mmol)且将反应混合物在室温下搅拌隔夜。添加肼(5当量)，反应混合物经浓缩且通过制备型hplc纯化，以得到标题化合物的tfa盐(27mg，66％产率)。(m/z)：c
31
h
36
fn7o2的[m+h]
+
计算值558.29，实验值558.3。1h nmr(400mhz,甲醇
‑
d4)δ8.17(dt,1h),7.59
‑
7.50(m,1h),7.32(dd,1h),6.95(d,1h),6.90(d,1h),5.03
‑
4.91(m,2h),4.56
‑
4.34(m,2h),4.30
‑
3.88(m,4h),3.76
‑
3.55(m,1h),3.28
‑
3.10(m,1h),3.10
‑
2.96(m,4h),2.81
‑
2.62(m,2h),2.53(q,2h),2.47
‑
2.33(m,1h),2.31
‑
2.14(m,1h),1.79
‑
1.57(m,2h),1.07(t,3h),0.97(td,3h)。
[0348]
实例9：((s)
‑
2,4
‑
二甲基哌嗪
‑1‑
基)((s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑5‑
氟
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
甲基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
基)甲酮c
‑3[0349][0350]
(a)(s)
‑4‑
((s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑5‑
氟
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
甲基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
羰基)
‑3‑
甲基哌嗪
‑1‑
甲酸叔丁酯
[0351]
将(s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑5‑
氟
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
甲基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸(0.120g，0.276mmol)、(s)
‑4‑
正
‑
boc
‑2‑
甲基哌嗪(0.110g，0.551mmol)和dipea(0.096ml，0.551mmol)溶解于dmf(3.0ml)中，接着添加hatu(0.157g，0.413mmol)且将反应混合物在室温下搅拌16小时(通过lcms监测反应进展)。添加肼(0.043ml，1.378mmol)以裂解非所要副产物，接着将反应混合物在室温下搅拌10分钟。接着浓缩反应混合物且将粗产物通过逆相色谱(5
‑
70％acn/水梯度，50g c18管柱)纯化，以得到标题化合物的tfa盐(126mg，62％产率)。(m/z)：c
33
h
40
fn7o4的[m+h]+计算值618.32，实验值618.3。
[0352]
(b)((s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑5‑
氟
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
甲基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
基)((s)
‑2‑
甲基哌嗪
‑1‑
基)甲酮
[0353]
将(s)
‑4‑
((s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑5‑
氟
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
甲基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
羰基)
‑3‑
甲基哌嗪
‑1‑
甲酸叔丁酯，tfa(0.126g，0.172mmol)溶解于二恶烷(1.5ml)和水(0.3ml)中，接着添加盐酸(4m于二恶烷中)(1.5ml，49.4mmol)且将反应混合物在室温下搅拌1小时(通过lcms监测反应进展)。冷冻且冻干反应混合物，且将所得粉末直接用于下一反应中(假定定量产率)。(m/z)：c
28
h
32
fn7o2的[m+h]+计算值518.26，实验值518.3。
[0354]
(c)((s)
‑
2,4
‑
二甲基哌嗪
‑1‑
基)((s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑5‑
氟
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
甲基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
基)甲酮
[0355]
将((s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑5‑
氟
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
甲基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
基)((s)
‑2‑
甲基哌嗪
‑1‑
基)甲酮，二盐酸盐(0.102g，0.173mmol)和甲醛溶液(37wt％于水中)(0.015ml，0.207mmol)溶解于甲醇(3.0ml)中，接着
[0363][0364]
向(s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑5‑
氟
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
异丙基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸，tfa(179mg，0.310mmol)、(s)
‑
n,n
‑
二甲基吡咯啶
‑3‑
胺(0.079ml，0.620mmol)和dipea(0.162ml，0.930mmol)于dmf(4ml)中的溶液中添加hatu(177mg，0.465mmol)且将反应混合物在室温下搅拌隔夜。添加肼(5当量)，反应混合物经浓缩且通过制备型hplc纯化，以得到标题化合物的tfa盐(107mg，44％产率)。(m/z)：c
31
h
38
fn7o2的[m+h]
+
计算值560.31，实验值560.2。1h nmr(400mhz,甲醇
‑
d4)δ8.21(d,1h),7.50(s,1h),7.26(d,1h),6.94(d,1h),6.90(d,1h),4.83
‑
4.66(m,1h),4.48
‑
4.25(m,2h),4.23
‑
4.12(m,1h),4.12
‑
3.93(m,2h),3.93
‑
3.63(m,3h),3.62
‑
3.48(m,1h),3.26
‑
3.09(m,1h),2.98(d,6h),2.67
‑
2.57(m,1h),2.53(q,2h),2.44
‑
2.12(m,1h),1.41(t,3h),1.31(d,3h),1.05(t,3h)。
[0365]
实例13：(s)
‑
(3
‑
(二甲氨基)氮杂环丁
‑1‑
基)(2
‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑5‑
氟
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
异丙基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
基)甲酮d
‑1[0366][0367]
向(s)
‑2‑
(6
‑
(2
‑
乙基
‑5‑
氟
‑4‑
羟苯基)
‑
1h
‑
吲唑
‑3‑
基)
‑5‑
异丙基
‑
4,5,6,7
‑
四氢
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]吡啶
‑6‑
甲酸，tfa(179mg，0.310mmol)、n,n
‑
二甲基氮杂环丁
‑3‑
胺，2hcl(107mg，0.465mmol)和dipea(0.162ml，0.930mmol)于dmf(4ml)中的溶液中添加hatu(177mg，0.465mmol)且将反应混合物在室温下搅拌隔夜。添加肼(5当量)，浓缩反应混合物且通过制备型hplc纯化，以得到标题化合物的tfa盐(63mg，26％产率)。(m/z)：c
30
h
36
fn7o2的[m+h]
+
计算值546.29，实验值546.7。1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ9.90(s,1h),8.29(dd,1h),7.34(s,1h),7.07(d,1h),7.01(d,1h),6.89(d,1h),4.35
‑
4.18(m,1h),4.11
‑
3.94(m,1h),3.94
‑
3.73(m,3h),3.70
‑
3.57(m,2h),3.06
‑
2.94(m,2h),2.87
‑
2.66(m,2h),2.48
‑
2.40(m,2h),2.13
‑
2.00(m,6h),1.07(t,3h),1.03
‑
0.93(m,6h)。
[0368]
生物分析
[0369]
已在以下生物分析中的一或多者中表征本发明的化合物。
[0370]
分析1：生物化学jak激酶分析
[0371]
将四种lanthascreen jak生物化学分析的组(jak1、2、3和tyk2)载于常见激酶反
应缓冲液(50mm hepes，ph 7.5，0.01％brij
‑
35，10mm mgcl2和1mm egta)中。自life technologies获取重组型gst标记的jak酶和gfp标记的stat1肽底物。
[0372]
在环境温度下在白色384孔微量盘(corning)中，使连续稀释的化合物与四种jak酶中的每一者和底物一起预培育1h。随后以具有1％dmso的10μl总体积添加atp以起始激酶反应。jak1、2、3和tyk2的最终酶浓度分别为4.2nm、0.1nm、1nm和0.25nm；所使用的对应km atp浓度为25μm、3μm、1.6μm和10μm；而对于所有四种分析，底物浓度为200nm。在添加edta(10mm最终浓度)和tb抗pstat1(ptyr701)抗体(life technologies，2nm最终浓度)于tr
‑
fret稀释缓冲液(life technologies)中的10μl制剂之前，使激酶反应在环境温度下进行1小时。在envision读取器(perkin elmer)上读取之前，使盘在环境温度下培育1h。记录且利用发射比信号(520nm/495nm)，以基于dmso和背景对照计算抑制百分比值。
[0373]
对于剂量反应分析，对比化合物浓度来绘制抑制百分比数据，且用prism软体(graphpad software)根据4参数稳固拟合模型测定ic
50
值。结果表示为pic
50
(ic
50
的负对数)，且接着使用cheng
‑
prusoff方程式转换成pk
i
(解离常数ki的负对数)。
[0374]
在四种jak分析的每一者中具有低k
i
值或高pk
i
值的测试化合物展示对jak活性的较大抑制。
[0375]
分析2：tall
‑
1 t细胞中il
‑
2刺激的pstat5的抑制
[0376]
使用alphalisa在tall
‑
1人类t细胞株(dsmz)中测量测试化合物抑制介白素
‑
2(il
‑
2)刺激的stat5磷酸化的效能。因为il
‑
2通过jak1/3传导信号，因此此分析提供jak1/3细胞效能的测量。
[0377]
通过alphalisa surefire ultra pstat5(tyr694/699)试剂盒(perkinelmer)测量磷酸化stat5。
[0378]
将来自tall
‑
1细胞株的人类t细胞在37℃、5％co2含湿气培育箱中在补充有15％热灭活胎牛血清(fbs，life technologies)、2mm glutamax(life technologies)、25mm hepes(life technologies)和1
×
pen/strep(life technologies)的rpmi(life technologies)中培养。将化合物连续稀释于dmso中且以声学方式分配至空的孔中。分配(4微升/孔)分析培养基(补充有10％fbs(atcc)的不含酚红的dmem(life technologies))且使盘在900rpm下振荡10分钟。细胞以45,000个细胞/孔接种于分析培养基(4微升/孔)中且在37℃，5％co2下培育1小时，随后添加含il
‑
2(r&d systems；最终浓度300ng/ml)的预温热分析培养基(4μl)持续30分钟。在细胞介素刺激之后，细胞用6μl含有1
×
phosstop和complete锭剂(roche)的3
×
alphalisa lysis buffer(perkinelmer)溶解。将溶解物在室温(rt)下，在900rpm下振荡10分钟。通过pstat5 alphalisa试剂盒(perkinelmer)测量磷酸化stat5。在过滤绿光的<100lux光下，将新制备的受体珠粒混合物分配于溶解物(5μl)上。使盘在900rpm下振荡2分钟，简单地快速离心且在暗处在室温下培育2小时。在过滤绿光的<100lux光下，分配供体珠粒(5μl)。使盘在900rpm下振荡2分钟，简单地快速离心且在暗处在室温下培育隔夜。在过滤绿光的<100lux光下，使用envision盘读取器(perkinelmer)在689nm激发和570nm发射下测量发光。
[0379]
为测定测试化合物响应于il
‑
2的抑制效能，在人类t细胞株中测量结合于pstat5的珠粒的平均发射强度。根据分析信号强度对比于化合物浓度的抑制曲线来测定ic
50
值。数据表示为pic
50
(负十进制对数ic
50
)值(平均值
±
标准偏差)。
[0380]
体外分析结果
[0381]
表1
[0382][0383]
分析3：肺组织中il
‑
13诱发的pstat6诱发的鼠类(小鼠)模型
[0384]
il
‑
13为哮喘的病理生理学潜在的重要细胞介素(库达克(kudlacz)等人,《欧洲药理学杂志(eur.j.pharmacol)》,2008,582,154
‑
161)。il
‑
13与细胞表面受体结合，使激酶的杰纳斯家族(jak)的成员活化，其接着使stat6磷酸化且随后进一步活化转录路径。在所描述模型中，将il
‑
13的剂量局部递送至小鼠肺部中以诱发stat6的磷酸化(pstat6)，其接着测量为终点。
[0385]
在分析中使用来自harlan的成年balb/c小鼠。在研究当天，用异氟醚轻度麻醉动物且通过经口抽吸施用媒剂或测试化合物(1mg/ml，50μl总体积，经若干次呼吸)。在给药后，将动物侧卧放置且在返回其饲养笼之前监测自麻醉的完整恢复。四小时后，再次简单地麻醉动物且在监测自麻醉恢复和返回至其饲养笼之前，通过经口抽吸用媒剂或il
‑
13(0.03μg总递送剂量，50μl总体积)进行刺激。在施用媒剂或il
‑
13后一个小时，针对肺组织匀浆中的两种pstat6检测使用perkin elmerultra
tm
hv p
‑
stat6(tyr641)分析试剂盒且针对肺和血浆二者中的总药物浓度分析收集全血和肺。使血液样品在4℃下在约12,000rpm下离心(eppendorf离心机，5804r)持续4分钟，以收集血浆。肺用杜氏磷酸盐缓冲盐水(dulbecco's phosphate
‑
buffered saline；dpbs)冲洗，经填塞干燥，急骤冷冻，称重且以1:3的稀释液于含0.1％甲酸的hplc水中均质化。通过lc
‑
ms分析，对照在测试矩阵中构建成标准曲线的分析型标准品来测定测试化合物的血浆和肺水平。将肺与血浆比率测定为在5小时时肺浓度(以ng/g为单位)与血浆浓度(以ng/ml为单位)的比率。
[0386]
通过相比于经媒剂处理、il
‑
13刺激的对照动物，在5小时时存在于经处理动物的肺中的pstat6水平降低来证明模型中的活性。经媒剂处理、il
‑
13刺激的对照动物与经媒剂处理、媒剂刺激的对照动物之间的差异分别指示任何给定实验中的0％和100％抑制作用。分析中所测试的化合物展现在如下文所记录的il
‑
13刺激之后在5小时时stat6磷酸化的抑制。
[0387]
表2：所观测的pstat6抑制和血浆/肺暴露
[0388][0389]
小鼠肺中所测试化合物中的显著浓度的观测结果确认，il
‑
13诱发的pstat6诱发的所观测抑制为测试化合物活性的结果。5小时时肺与血浆比率展示，化合物1至6在小鼠中展现肺中的暴露显著比血浆中的暴露更多。
[0390]
分析4：人类周边血液单核细胞中tslp诱发的tarc释放的抑制
[0391]
胸腺基质淋巴生成素(tslp)和胸腺和活化调节的趋化因子(tarc)在哮喘气管中过度表现，且与疾病严重程度相关。在肺中，可通过支气管上皮细胞响应于过敏原和病毒感染来释放tslp。通过il
‑
7rα/tslpr杂二聚体的tslp信号发现于广泛范围的组织和细胞类型中，包括上皮细胞、内皮细胞、嗜中性球、巨噬细胞和肥大细胞。tslp与其受体的结合诱发了构形变化，其活化jak1和jak2以磷酸化多种转录因子，包括stat3和stat5。在免疫细胞中，此触发细胞内事件的级联，所述事件引起细胞增殖、抗细胞凋亡、树突状细胞迁移和th2细胞介素和趋化因子的产生。在周边血液单核细胞(peripheral blood mononuclear cell；pbmc)中，tslp通过活化骨髓树突状细胞以吸引且刺激t细胞(由化学引诱剂tarc介导的方法)而具有促炎性作用。
[0392]
在此分析中，展示tslp刺激诱发了自pbmc释放tarc，且此反应在用化合物治疗时以剂量依赖性方式衰减。针对tarc释放的抑制测量测试化合物的效能。
[0393]
将来自3至5个供体的pbmc等分试样(预先自全血分离且在
‑
80℃下冷冻成等分试样)在37℃下解冻且逐滴添加至含40ml预温热、无菌过滤、完整rpmi培养基的50ml falcon试管中。使细胞成球粒且以2.24
×
106个细胞/毫升再悬浮于完全培养基中。细胞以85μl(190,000个细胞)/孔接种于经组织培养物处理的96孔平底微量盘中。使细胞在37℃与5％co2下静置1小时。
[0394]
化合物作为dmso中的10mm储备溶液接收。进行3.7倍连续稀释，以产生于dmso中的在300
×
最终分析测试浓度下的9种浓度的测试化合物。在完全培养基中进行150倍中间物稀释，以产生在2
×
最终分析测试浓度(0.2％dmso)下的化合物。在1小时静置时间段之后，将95μl的2
×
化合物添加至pbmc的各孔，最终分析浓度范围为33.33μm至0.95μm。将95μl的含0.2％dmso的完全培养基添加至未经处理的对照孔。细胞在刺激之前在37℃与5％co2下用化合物预处理1小时。
[0395]
将重组人类tslp蛋白以10μg/ml在具有0.1％bsa的无菌dpbs中复原且在
‑
20℃下以等分试样形式储存。在使用之前立即将等分试样解冻且在完全培养基中以20
×
最终分析浓度制备。将10μl的20
×
tslp添加至pbmc的各孔，最终分析浓度为10ng/ml。将10μl的完全培养基添加至未经刺激的对照孔。在37℃与5％co2下，在化合物存在下刺激细胞48小时。
[0396]
在刺激后，使用人类ccl17/tarc quantikine elisa kit(r&d systems#ddn00)根据制造商的说明书，采集细胞培养上清液且通过酶联结免疫吸附分析(elisa)检测tarc水平。
[0397]
对于剂量反应分析，相对于各供体的反应百分比值绘制对数[测试化合物(m)]，且使用非线性回归分析利用graphpad prism软体，使用具有变量斜率的4参数s形剂量
‑
反应算法来测定ic
50
值。数据表示为由个别供体的pic
50
值计算的平均pic
50
(负十进制对数ic
50
)值且四舍五入至一个小数位。利用原始化合物和其消氟修饰的类似物的抑制的效能值概括于表3中。
[0398]
表3：测试化合物抑制人类周边血液单核细胞中tslp诱发的tarc释放的效能值
[0399]
化合物pic50
±
标准偏差17.1
±
0.1c
‑
17.0
±
0.326.8
±
0.2c
‑
26.6
±
0.237.3
±
0.2c
‑
37.0
±
0.146.8
±
0.1c
‑
47.0
±
0.457.5
±
0.6c
‑
57.3
±
0.166.8
±
0.2c
‑
66.8
±
0.2
[0400]
分析5：肺s9代谢
[0401]
在人类肺s9片段(1μm化合物；1mg/ml s9蛋白)中评估化合物1至6和c
‑
1至c
‑
6的体外代谢稳定性。针对亲本化合物，通过高分辨率lc
‑
ms/ms来分析时间0、15、30和60分钟的样品。来自人类的肺s9片段(批次1410245)购自xenotech llc(lenexa,ks)。nadph(sigma aldrich,n1630)和3
‑
磷酸腺苷5
‑
磷酰硫酸(paps)(sigma aldrich,a1651)购自sigma aldrich(st.louis,mo)。乙腈和水获自vwr(radnor,pa)且具有hplc级别或更佳级别。雷诺昔酚(raloxifene)和甲酸购自sigma aldrich(st.louis,mo)。在96孔聚丙烯盘中，在处于37℃下在水浴中执行肺s9培育。肺s9溶液由缓冲至ph 7.4(bd biosciences,woburn,ma)的补充有1mm nadph(sigma
‑
aldrich,st.louis,mo)、3mm氯化镁(sigma aldrich,m1028)的100mm磷酸钾组成且在100μm paps(sigma
‑
aldrich,st.louis,mo)辅因子存在下，具有1mg/ml的最终培育蛋白质浓度。将雷诺昔酚(n＝1)和化合物(n＝1)的10mm dmso储备液稀释于缓冲液中且外加至培育中，以得到1μm底物浓度(0.001％dmso v/v)。培育体积由400μl组成且在0、15、30和60分钟时通过去除70μl等分试样并稀释至140μl乙腈(0％甲酸)中来获取时间点。使所有样品在5℃下在2250g下离心10分钟。自离心样品获取上清液(50μl)且稀释至含有内部标准物的100μl hplc水中。样品在dionex ultimate 3000自动取样器上操作且结合atlantis t3管柱3μm
‑
2.1
×
50mm(waters inc.,186003717)使用thermo q
‑
exactive high resolution质谱仪(thermo,waltham,ma)以全扫描模式进行分析。流动相a由水+0.2％甲酸组成且流动相b由乙腈+0.2％甲酸组成。使用gubbs gmsu软体(gubbs inc.,alpharetta，ga)实行峰整合。对于各样品，通过将分析物峰面积除以内部标准物峰面积来计算峰面积比率。对于各培育，将各t0中的分析物的峰面积比率设定为100％，且将来自60
分钟样品的峰面积比率相对于对应t0转换成剩余百分比。通过观测基于历史内部数据，对应于各亲本化合物的o
‑
硫酸盐代谢物的亲本离子通道中的早期洗提峰来定性地进行硫酸盐代谢物形成的测定。分析的结果概括于表4中(n＝2次重复)。
[0402]
表4：人类肺s9片段中的代谢稳定性
[0403][0404][0405]
当与其对应氟基类似物(化合物c
‑
1至c
‑
6)进行比较时，化合物1至6引起肺s9片段中的硫酸化代谢显著减少。
[0406]
分析6：小鼠中血浆和肺中的药物动力学
[0407]
以下文方式测定测试化合物的血浆和肺浓度和其比率。在分析中使用来自charles river laboratories的balb/c小鼠。在含20％丙二醇中的ph 4柠檬酸盐缓冲液中以0.2mg/ml的浓度单独地调配测试化合物，且通过经口抽吸将50μl的给药溶液引入至小鼠的气管中。在给药后的多个时间点(通常为0.167、2、6、24小时)，通过心脏穿刺去除血液样品，且自小鼠切除完整肺。使血液样品在4℃下在约12,000rpm下离心(eppendorf离心机，5804r)持续4分钟，以收集血浆。肺经填塞干燥、称重且以1:3的稀释液于无菌水中均匀化。通过lc
‑
ms分析，对照在测试矩阵中构建成标准曲线的分析型标准品来测定测试化合物的血浆和肺浓度。将肺与血浆比率测定为肺auc(以μg hr/g为单位)与血浆auc(以μg hr/ml为单位)的比率，其中将auc惯用地定义为在测试化合物浓度对比于时间的曲线下面积。
[0408]
表5：单次经口抽吸施用测试化合物之后的血浆和肺组织暴露
[0409][0410]
分析7：il
‑
5介导的嗜酸性球存活率分析
[0411]
在自人类全血(allcells)分离的人类嗜酸性球中测量测试化合物对il
‑
5介导的嗜酸性球存活率的效能。因为il
‑
5通过jak传导信号，因此此分析提供jak细胞效能的测量。
[0412]
自健康供体的新鲜人类全血(allcells)分离人类嗜酸性球。将血液与4.5％聚葡萄糖(sigma
‑
aldrich)混合于0.9％氯化钠溶液(sigma
‑
aldrich)中。留下红血球以沉降35分钟。去除富含白血球的上部层且在ficoll
‑
paque(ge healthcare)上分层并在600g下离
心30分钟。在用水溶解粒细胞层之前去除血浆和单核细胞层，以去除任何污染的红血球。使用人类嗜酸性球分离试剂盒(miltenyi biotec)进一步纯化嗜酸性球。将一部分经纯化嗜酸性球与抗cd16 fitc(miltenyi biotec)在暗处在4℃下一起培育10分钟。使用lsrii流式细胞仪(bd biosciences)分析纯度。
[0413]
将细胞在37℃，5％co2含湿气培育箱中在补充有10％热灭活胎牛血清(fbs，life technologies)、2mm glutamax(life technologies)、25mm hepes(life technologies)和1
×
pen/strep(life technologies)的rpmi 1640(life technologies)中培养。将细胞以10,000个细胞/孔接种于培养基(50μl)中。使盘在300g下离心5分钟且去除上清液。将化合物连续稀释于dmso中且接着在培养基中稀释另外500倍，达至2
×
最终分析浓度。将测试化合物(50微升/孔)添加至细胞，且在37℃，5％co2下培育1小时，随后添加含il
‑
5(r&d systems；最终浓度1ng/ml和10pg/ml)的预温热分析培养基(50μl)持续72小时。
[0414]
在细胞介素刺激之后，将细胞在300g下离心5min，且用冷dpbs(life technologies)洗涤两次。为获得存活力和细胞凋亡，将细胞与碘化丙锭(thermo fisher scientific)和apc磷脂结合蛋白v(bd biosciences)一起培育且使用lsrii流式细胞仪(bd biosciences)进行分析。由分析细胞存活力％对比于化合物浓度的存活力曲线来测定ic
50
值。数据表示为pic
50
(负十进制对数ic
50
)值。
[0415]
分析8：人类3d气管培养物中ifnγ和il
‑
27诱发的趋化因子cxcl9和cxcl10的抑制
[0416]
可自mattek(air
‑
100)获取epiairway组织培养物。培养物来源于哮喘供体。在细胞培养插入物中，人类来源的气管/支气管上皮细胞在多孔膜载体上生长和分化，使得细胞下方的温热培养基与上述气态测试氛围具有气液界面。在37℃，5％co2含湿气培育箱中，在维持培养基(mattek，air
‑
100
‑
mm)中培养组织。可测试四个供体。在第0天，用呈10μm、1μm和/或0.1μm的测试化合物处理组织培养物。将化合物在二甲亚砜(dmso，sigma)中稀释至0.1％的最终浓度。0.1％dmso可用作媒剂对照。将测试化合物与培养物在37℃，5％co2下培育1小时，随后添加最终浓度为100ng/ml的含有ifnγ(r&d systems)或il
‑
27(r&d systems)的预温热培养基。将组织培养物维持8天。将培养基每2天用含有化合物和ifnγ或il
‑
27的新鲜培养基置换。在第8天，收集组织培养物和上清液以用于分析。针对cxcl10(ip
‑
10)和cxcl9(mig)，使用流式荧光检测术分析(emd millipore)分析上清液样品。数据表示为抑制％+/
‑
标准偏差(
±
stdv)。与经媒剂处理的细胞相比，利用化合物对ifnγ或il
‑
27诱发的cxcl10或cxcl9分泌的抑制效能来测定抑制百分比。资料为来自3或4个供体的平均值。
[0417]
分析9：细胞jak效能分析：抑制人类pbmc中il
‑
2/抗cd3刺激的ifnγ
[0418]
可在自人类全血(stanford blood center)分离的人类周边血液单核细胞(pbmc)中测量测试化合物抑制介白素
‑
2(il
‑
2)/抗cd3刺激的干扰素γ(ifnγ)的效能。因为il
‑
2通过jak传导信号，因此此分析提供jak细胞效能的测量。
[0419]
(1)使用菲科尔(ficoll)梯度自健康供体的人类全血分离人类周边血液单核细胞(pbmc)。将细胞在37℃，5％co2含湿气培育箱中在补充有10％热灭活胎牛血清(fbs，life technologies)、2mm glutamax(life technologies)、25mm hepes(life technologies)和1
×
pen/strep(life technologies)的rpmi(life technologies)中培养。将细胞以200,000个细胞/孔接种于培养基(50μl)中且培养1小时。将化合物连续稀释于dmso中且接着在培养基中稀释另外500倍(达至2
×
最终分析浓度)。将测试化合物(100微升/孔)添加至细
胞，且在37℃，5％co2下培育1h，随后添加含il
‑
2(r&d systems；最终浓度100ng/ml)和抗cd3(bd biosciences；最终浓度1μg/ml)的预温热分析培养基(50μl)持续24h。
[0420]
(2)在细胞介素刺激之后，使细胞在500g下离心5min且去除上清液并在
‑
80℃下冷冻。为测定测试化合物响应于il
‑
2/抗cd3的抑制效能，通过elisa(r&d systems)测量上清液ifnγ浓度。根据ifnγ浓度对比于化合物浓度的抑制曲线的分析来测定ic
50
值。数据表示为pic
50
(负十进制对数ic
50
)值。
[0421]
分析10：细胞jak效能分析：cd4+t细胞中il
‑
2刺激的pstat5的抑制
[0422]
使用流式细胞测量术，在自人类全血(stanford blood center)分离的人类周边血液单核细胞(pbmc)中的cd4阳性(cd4+)t细胞中测量测试化合物抑制介白素
‑
2(il
‑
2)/抗cd3刺激的stat5磷酸化的效能。因为il
‑
2通过jak传导信号，因此此分析提供jak细胞效能的测量。
[0423]
使用藻红素(pe)结合的抗cd4抗体(纯系rpa
‑
t4，bd biosciences)鉴别cd4+t细胞，而alexa fluor 647结合的抗pstat5抗体(py694，纯系47，bd biosciences)用于检测stat5磷酸化。
[0424]
(1)遵循分析9段落(1)的方案，不同的处在于用抗cd3进行细胞介素刺激持续30min而非24h。
[0425]
(2)在细胞介素刺激之后，将细胞用预温热的固定溶液(200μl；bd biosciences)在37℃，5％co2下固定10min，用dpbs缓冲液(1ml，life technologies)洗涤两次，且在4℃下再悬浮于冰冷的perm buffer iii(1000μl，bd biosciences)中持续30min。细胞用含2％fbs的dpbs(facs缓冲液)洗涤两次，且接着在室温下在暗处再悬浮于含有抗cd4 pe(1:50倍稀释)和抗cd3抗cd3 alexa fluor 647(1:5倍稀释)的facs缓冲液(100μl)中持续60min。培育之后，在使用lsrii流式细胞仪(bd biosciences)分析之前将细胞用facs缓冲液洗涤两次。为测定测试化合物响应于il
‑
2/抗cd3的抑制效能，在cd4+t细胞中测量pstat5的中位荧光强度(median fluorescent intensity；mfi)。根据mfi对比于化合物浓度的抑制曲线的分析来测定ic
50
值。数据表示为pic
50
(负十进制对数ic
50
)值。
[0426]
分析11：细胞jak效能分析：cd3+t细胞中il
‑
4刺激的pstat6的抑制
[0427]
使用流式细胞测量术，在自人类全血(stanford blood center)分离的人类周边血液单核细胞(pbmc)中的cd3阳性(cd3+)t细胞中测量测试化合物抑制介白素
‑
4(il
‑
4)刺激的stat6磷酸化的效能。因为il
‑
4通过jak传导信号，因此此分析提供jak细胞效能的测量。
[0428]
使用藻红素(pe)结合的抗cd3抗体(纯系ucht1，bd biosciences)鉴别cd3+t细胞，而alexa fluor 647结合的抗pstat6抗体(py641，纯系18/p，bd biosciences)用于检测stat6磷酸化。
[0429]
如分析9和10中自健康供体的人类全血分离人类周边血液单核细胞(pbmc)。将细胞以250,000个细胞/孔接种于培养基(200μl)中，培养1h且接着再悬浮于含有各种浓度的测试化合物的分析培养基(50μl)(补充有0.1％牛血清白蛋白(sigma)、2mm glutamax、25mm hepes和1
×
penstrep的rpmi)中。将化合物连续稀释于dmso中且接着在分析培养基中稀释另外500倍(达至2
×
最终分析浓度)。将测试化合物(50μl)与细胞在37℃，5％co2下培育1h，随后在预温热的分析培养基中添加il
‑
4(50μl)(r&d systems；最终浓度20ng/ml)持续
30min。在细胞介素刺激之后，将细胞用预温热的固定溶液(100μl)(bd biosciences)在37℃，5％co2下固定10min，用dpbs缓冲液(1ml)(含2％fbs的dpbs)洗涤两次，且在4℃下再悬浮于冰冷的perm buffer iii(1000μl)(bd biosciences)中持续30min。细胞用facs缓冲液洗涤两次，且接着在室温下在暗处再悬浮于含有抗cd3 pe(1:50稀释)和抗pstat6 alexa fluor 647(1:5稀释)的facs缓冲液(100μl)中持续60min。培育之后，在使用lsrii流式细胞仪(bd biosciences)分析之前将细胞用facs缓冲液洗涤两次。
[0430]
为测定测试化合物响应于il
‑
4的抑制效能，在cd3+t细胞中测量pstat6的中位荧光强度(mfi)。根据mfi对比于化合物浓度的抑制曲线的分析来测定ic
50
值。数据表示为pic
50
(负十进制对数ic
50
)。
[0431]
分析12：细胞jak效能分析：cd3+t细胞中il
‑
6刺激的pstat3的抑制
[0432]
使用类似于分析11的方案来测定测试化合物抑制介白素
‑
6(il
‑
6)刺激的stat3磷酸化的效能。alexa fluor 647结合的抗pstat3抗体(py705，纯系4/p，bd biosciences)用于检测stat3磷酸化。
[0433]
分析13：肺的交链孢属赤星病菌(alternaria alternata)诱发的嗜酸性球性发炎的小鼠模型
[0434]
气管嗜酸性球增多症为人类哮喘的标志。交链孢属赤星病菌为可加重人类哮喘且诱发小鼠的肺中的嗜酸性球性发炎的真菌气源性过敏原(哈弗(havaux)等人《临床与实验免疫学(clin exp immunol.)》2005年2月；139(2):179
‑
88)。在小鼠中，已证实，交链孢属间接地活化肺中的组织固有2型先天性淋巴细胞，其作出反应(例如，il
‑
2和il
‑
7)且释放jak依赖性细胞介素(例如，il
‑
5和il
‑
13)且调和嗜酸性球性发炎(巴特姆斯(bartemes)等人《免疫学杂志(j immunol.)》2012年2月1日；188(3):1503
‑
13)。
[0435]
在研究中使用来自taconic的七至九周龄雄性c57小鼠。在研究当天，用异氟醚轻度麻醉动物且通过口咽抽吸施用媒剂或测试化合物(0.03
‑
1.0mg/ml，50μl总体积，经若干次呼吸)。在给药后，将动物侧卧放置且在返回其饲养笼之前监测自麻醉的完整恢复。一个小时后，再次简单麻醉动物且在监测自麻醉恢复和返回至其饲养笼之前，通过口咽抽吸用媒剂或交链孢属萃取物(200μg总递送萃取物，50μl总体积)进行刺激。在交链孢属施用后四十八小时，收集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid；balf)且在balf中使用advia 120hematology系统(siemens)计数嗜酸性球。与经媒剂处理、交链孢属刺激的对照动物相比，在四十八小时时存在于经处理动物的balf中的嗜酸性球水平降低证明所述模型中的活性。数据表示为经媒剂处理、交链孢属刺激的balf嗜酸性球反应的抑制百分比。为计算抑制百分比，将各条件的balf嗜酸性球的数目转换成平均经媒剂处理、交链孢属刺激的balf嗜酸性球的百分比且减去一百百分比。
[0436]
分析14：细胞jak效能分析：抑制ifnγ诱发的pstat1
[0437]
使用流式细胞测量术，在自人类全血(stanford blood center)衍生的cd14阳性(cd14+)单核球中测量测试化合物抑制干扰素γ(ifnγ)刺激的stat1磷酸化的效能。因为ifnγ通过jak传导信号，因此此分析提供jak细胞效能的测量。
[0438]
使用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate；fitc)结合的抗cd14抗体(纯系rm052，beckman coulter)鉴别单核球，且alexa fluor 647结合的抗pstat1抗体(py701，纯系4a，bd biosciences)用于检测stat1磷酸化。
[0439]
使用菲科尔梯度自健康供体的人类全血分离人类周边血液单核细胞(pbmc)。将细胞在37℃，5％co2含湿气培育箱中在补充有10％胎牛血清(fbs，life technologies)、2mm glutamax(life technologies)、25mm hepes(life technologies)和1
×
pen/strep(life technologies)的rpmi(life technologies)中培养。将细胞以250,000个细胞/孔接种于培养基(200μl)中，培养2h且再悬浮于含有各种浓度的测试化合物的分析培养基(50μl)(补充有0.1％牛血清白蛋白(sigma)、2mm glutamax、25mm hepes和1
×
penstrep的rpmi)中。将化合物连续稀释于dmso中且接着在培养基中稀释另外1000倍，以使得最终dmso浓度达0.1％。将测试化合物稀释液与细胞在37℃，5％co2下培育1h，随后以0.6ng/ml的最终浓度添加含预温热的ifnγ(r&d systems)的培养基(50μl)持续30min。在细胞介素刺激之后，将细胞用预温热的固定溶液(100μl)(bd biosciences)在37℃，5％co2下固定10min，用facs缓冲液(1ml)(含1％bsa的pbs)洗涤两次，再悬浮于1:10抗cd14 fitc:facs缓冲液(100μl)中，且在4℃下培育15min。将细胞洗涤一次，且接着在4℃下再悬浮于冰冷的perm buffer iii(bd biosciences)(100μl)中持续30min。细胞用facs缓冲液洗涤两次，且接着在室温下在暗处再悬浮于1:10抗pstat1 alexa fluor 647:facs缓冲液(100μl)中持续30min，用facs缓冲液洗涤两次，且使用macsquant流式细胞仪(bd biosciences)分析。
[0440]
为测定测试化合物的抑制效能，在cd14+单核球中测量pstat1的中位荧光强度(mfi)。根据mfi对比于化合物浓度的抑制曲线的分析来测定ic
50
值。数据表示为pic
50
(负十进制对数ic
50
)值。化合物1在此分析中展现7.5的pic
50
值。化合物4在此分析中展现7.3的pic
50
值。
[0441]
分析15：细胞jak效能分析：gm
‑
csf诱发的pstat5的抑制
[0442]
使用流式细胞测量术，在自人类全血(stanford blood center)衍生的cd14阳性(cd14+)单核球中测量测试化合物抑制粒细胞
‑
巨噬细胞群落刺激因子(gm
‑
csf)刺激的stat5磷酸化的效能。因为gm
‑
csf通过jak传导信号，因此此分析提供jak细胞效能的测量。
[0443]
使用异硫氰酸荧光素(fitc)结合的抗cd14抗体(纯系rm052，beckman coulter)鉴别单核球，且alexa fluor 647结合的抗pstat5抗体(py694，bd biosciences)用于检测stat5磷酸化。
[0444]
使用菲科尔梯度自健康供体的人类全血分离人类周边血液单核细胞(pbmc)。将细胞在37℃，5％co2含湿气培育箱中在补充有10％胎牛血清(fbs，life technologies)、2mm glutamax(life technologies)、25mm hepes(life technologies)和1
×
pen/strep(life technologies)的rpmi(life technologies)中培养。将细胞以250,000个细胞/孔接种于培养基(200μl)中，培养2h且再悬浮于含有各种浓度的测试化合物的分析培养基(50μl)(补充有0.1％牛血清白蛋白(sigma)、2mm glutamax、25mm hepes和1
×
penstrep的rpmi)中。将化合物连续稀释于dmso中且接着在培养基中稀释另外1000倍，以使得最终dmso浓度达0.1％。将测试化合物稀释液与细胞在37℃，5％co2下培育1h，随后以0.3ng/ml的最终浓度添加含预温热的gm
‑
csf(r&d systems)的培养基(50μl)持续15min。在细胞介素刺激之后，将细胞用预温热的固定溶液(100μl)(bd biosciences)在37℃，5％co2下固定10min，用facs缓冲液(1ml)(含1％bsa的pbs)洗涤两次，再悬浮于1:10抗cd14 fitc:facs缓冲液(100μl)中，且在4℃下培育15min。将细胞洗涤一次，且接着在4℃下再悬浮于冰冷的perm buffer iii(bd biosciences)(100μl)中持续30min。细胞用facs缓冲液洗涤两次，且接着在室温下在暗处
再悬浮于1:10抗pstat1 alexa fluor 647:facs缓冲液(100μl)中持续30min，用facs缓冲液洗涤两次，且使用macsquant流式细胞仪(miltenyi)分析。
[0445]
为测定测试化合物的抑制效能，在cd14+单核球中测量pstat5的中位荧光强度(mfi)。根据mfi对比于化合物浓度的抑制曲线的分析来测定ic
50
值。数据表示为pic
50
(负十进制对数ic
50
)值。化合物1在此分析中展现6.7的pic
50
值。化合物4在此分析中展现6.7的pic
50
值。
[0446]
分析16：细胞jak效能分析：il
‑
12诱发的pstat4的抑制
[0447]
使用流式细胞测量术，在自人类全血(stanford blood center)衍生的cd3阳性(cd3+)t细胞中测量测试化合物抑制介白素
‑
12(il
‑
12)刺激的stat4磷酸化的效能。因为il
‑
12通过jak传导信号，因此此分析提供jak细胞效能的测量。
[0448]
使用藻红素(pe)结合的抗cd3抗体(纯系ucht1，bd biosciences)鉴别cd3+t细胞，且alexa fluor 647结合的抗pstat4抗体(纯系38/p
‑
stat4，bd biosciences)用于检测stat4磷酸化。
[0449]
使用菲科尔梯度自健康供体的人类全血分离人类周边血液单核细胞(pbmc)。将细胞在37℃，5％co2含湿气培育箱中在补充有10％胎牛血清(fbs，life technologies)、2mm glutamax(life technologies)、25mm hepes(life technologies)、1
×
pen/strep(life technologies)、盘结合的经纯化抗cd3抗体(5μg/ml，纯系ucht1，bd biosciences)和可溶的抗cd28抗体(1μg/ml，纯系cd28.2，bd biosciences)的rpmi(life technologies)中培养3天。细胞经采集，用培养基洗涤且接着再悬浮于含有介白素
‑
2(il
‑
2，10ng/ml，r&d systems)的培养基中。将细胞在37℃，5％co2含湿气培育箱中培养3天。细胞经采集，用rpmi洗涤且以250,000个细胞/孔接种于培养基(200μl)中，培养2h并再悬浮于含有各种浓度的测试化合物的分析培养基(50μl)(补充有0.1％牛血清白蛋白(sigma)、2mm glutamax、25mm hepes和1
×
penstrep的rpmi)中。将化合物连续稀释于dmso中且接着在培养基中稀释另外1000倍，以使得最终dmso浓度达0.1％。将测试化合物稀释液与细胞在37℃，5％co2下一起培育1h，随后以10ng/ml的最终浓度添加含预温热的il
‑
12(r&d systems)的培养基(50μl)持续30min。在细胞介素刺激之后，将细胞用预温热的固定溶液(100μl)(bd biosciences)在37℃，5％co2下固定10min，用facs缓冲液(1ml)(含1％bsa的pbs)洗涤两次，且在4℃下再悬浮于冰冷的perm buffer iii(1000μl)(bd biosciences)中持续30min。细胞用facs缓冲液洗涤两次，且接着在室温下在暗处再悬浮于含有抗cd3 pe(1:50倍稀释)和抗pstat4 alexa fluor 647(1:10倍稀释)的facs缓冲液(100μl)中持续45min。在培育之后，在使用macsquant流式细胞仪(miltenyi)分析之前将细胞用facs缓冲液洗涤两次。为测定测试化合物的抑制效能，在cd3+t细胞中测量pstat4的中位荧光强度(mfi)。根据mfi对比于化合物浓度的抑制曲线的分析来测定ic
50
值。数据表示为pic
50
(负十进制对数ic
50
)值。化合物1在此分析中展现6.2的pic
50
值。化合物4在此分析中展现6.0的pic
50
值。
[0450]
晶体结构
[0451]
以的分辨率获得与人类jak1结合的化合物d
‑
1的共晶体结构。观测到配位体结合于atp结合位点中。基于供体与受体原子之间的或更小的距离鉴别出七个特异性氢键相互作用。尤其应注意，在d
‑
1的化合物的环外酰胺的羰基与jak1的arg879的侧链之间鉴别出氢键相互作用。可针对本发明的化合物预期类似相互作用。在早期建模研究中，已
提出此相互作用作为提供对jak1优于其它酪氨酸激酶的选择性的方式，因为另外密切相关的激酶(例如，trka、vegfr、abl1)在同等位置处不具有精氨酸残基。晶体结构中氢键相互作用的观测结果和经改良激酶组选择性与不具有环外酰胺的系列相比验证了此设计假设。
[0452]
虽然本发明已参考其特定方面或实施例进行描述，但所属领域技术人员应了解，可进行各种变化或可取代等效物，而不偏离本发明的真实精神和范围。此外，在由适用的专利状况和法规允许的程度上，本文中所引用的所有公开案、专利和专利申请以全文引用的方式并入本文中，所述引用的程度如同将各文件单独地以引用的方式并入本文中一般。