源自死亡供体的用于促进移植物耐受性的细胞组合物及其制造和用途的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年9月18日提交的美国临时申请第62/732,823号；于2018年9月18日提交的美国临时申请第62/732,827号；于2018年9月18日提交的美国临时申请第62/732,830号；于2018年9月18日提交的美国临时申请第62/732,832号的权益和优先权，这些美国临时申请中的每个美国临时申请的内容通过引用并入本文。

本发明总体上涉及包括源自死亡供体的细胞的治疗组合物及其制造和使用方法。

背景技术：

美国每年执行近35,000例器官移植。器官移植的主要并发症是接受者的免疫系统对器官的排斥。为了避免器官排斥，大多数移植接受者必须在其余生中服用免疫抑制药物。然而，免疫抑制疗法携带其自身的一系列风险，包含感染、癌症、高血压和肝损伤的风险增加。另外，免疫抑制不能保证接受者对移植物耐受。

可以通过重建接受者的免疫系统以包括供体源性和接受者源性的细胞的混合物(被称为混合嵌合的状态)来实现没有免疫抑制的长期移植物耐受性。因此，在器官移植接受者中建立混合嵌合已经变得非常令人期望。

可以通过为接受者提供供体血细胞，包含造血干细胞和祖细胞(hspc)以及t细胞来实现混合嵌合。不幸的是，由于难以从活的供体获得hspc，来自成人供体的血细胞的供应受到限制。可以通过手术摘除从活的供体收集hspc，但手术通常涉及全身麻醉，可能会很痛并且携带对神经和肌肉造成感染或损伤的风险。可替代地，可以通过以下以非手术方式恢复hspc：向供体施用将hspc从骨髓动员到血液中的药剂并且通过单采术从外周血收集细胞。然而，单采术可能需要长达六个小时，可能需要重复若干天以获得足够量的hspc，并带来感染和凝血的风险。此外，无论方法如何，捐献hspc对供体都没有任何医疗益处，因此许多个体不愿意捐献hspc，除非其与接受者有直接的家庭或个人关系。

技术实现要素：

本发明认识到，死亡供体表示hspc和t细胞的潜在替代性来源，并且本发明提供了解决与从死亡供体获得这些治疗上有用的细胞相关的挑战的各种方法和技术。具体地，本发明利用与同死亡供体的组织和体液一起工作相关的大量不同的见解和发现，这些见解和发现在本文中用于开发用于产生源自死亡供体的新的工程化造血细胞产物的新的制造过程。例如，已经开发了新的技术、产品和方法，包含但不限于用于从死亡供体收集血液的新的血液收集设备、用于从死亡供体的骨髓离体提取cd34⁺细胞的新方法、用于处理死亡供体血液的新方法以及用于分析死亡供体血液的新测定的开发。这些见解和开发中的所有见解和开发已经产生用于产生源自死亡供体的新的工程化造血细胞产物的新的制造过程。

在某些方面，本发明提供了包含源自死亡供体的骨髓的hspc和源自死亡供体的非骨髓的t细胞的新的细胞组合物。包含源自死亡供体的非骨髓(例如，死亡供体的血液)的cd3⁺t细胞的组合物先前是不可能的，直到开发了本文描述的制造过程。在某些实施例中，通过cd34的表达来鉴定骨髓源性hspc，并且通过cd3的表达来鉴定t细胞。细胞组合物含有足以促进在实体器官移植接受者中建立混合嵌合的量的cd34⁺细胞和cd3⁺细胞。

本发明的组合物和方法大大提高了干细胞转移支持器官移植的效用。首先，这些组合物和方法避免从活的个体获得hspc的需要，这些活的个体通常不愿意忍受其从中没有获得任何医疗益处的捐赠程序的副作用。同时，本文提供的组合物和方法克服了与从死亡供体获得hspc和t细胞相关的若干问题。重要的是，因为使用不同来源以获得cd34⁺细胞和cd3⁺细胞，所以优化了每种细胞类型的产量。例如，丰富的骨髓来源(如髂嵴或椎体)用作cd34⁺细胞的来源，而从血液中获得cd3⁺细胞。单独处理hspc和t细胞还允许不同来源经受促进特定细胞群的分离并保存其功能的特定方案。例如，可以用动员hspc但对t细胞可能无益处的药剂(如粒细胞集落刺激因子(g-csf))处理骨髓。本发明还提供对从死亡供体获得的hspc和t细胞进行分析以确保此类细胞的群体适合用于制备细胞产物以施用到活的接受者的方法。

在另一方面，本发明提供用于在实体器官移植接受者中建立混合嵌合的细胞产物。这些产物包含每kg接受者重量大于1x10⁵个源自死亡供体的骨髓的cd34⁺细胞以及每kg接受者重量大于1x10⁵个源自该死亡供体的非骨髓(例如，血液)的cd3⁺细胞。

在另一方面，本发明提供用于在实体器官移植接受者中建立混合嵌合的方法。这些方法包含向已经接收或将接收实体器官移植的受试者提供产物，该产物含有：每kg接受者重量大于1x10⁵个源自死亡供体的骨髓的cd34⁺细胞以及每kg接受者重量大于1x10⁵个源自该死亡供体的非骨髓的cd3⁺细胞。

细胞产物可以包含不同量的cd34⁺细胞和cd3⁺细胞中的每一种。该量可以指定为相对于接受者体重的细胞数量。例如，细胞产物可以含有每kg接受者重量至少1x10⁵个、2x10⁵个、5x10⁵个、1x10⁶个、2x10⁶个、4x10⁶个、1x10⁷个、2x10⁷个、4x10⁷个、1x10⁸个、2x10⁸个或5x10⁸个cd34⁺细胞。细胞产物可以含有每kg接受者重量至少1x10⁴个、2x10⁴个、5x10⁴个、1x10⁵个、2x10⁵个、5x10⁵个、1x10⁶个、2x10⁶个、5x10⁶个、1x10⁷个、2x10⁷个、5x10⁷个、1x10⁸个、2x10⁸个或5x10⁸个cd3⁺细胞。

细胞产物可以含有每kg接受者重量至少1x10⁵个cd34⁺细胞、每kg接受者重量至少2x10⁵个cd34⁺细胞、每kg接受者重量至少4x10⁵个cd34⁺细胞、每kg接受者重量至少5x10⁵个cd34⁺细胞、每kg接受者重量至少1x10⁶个cd34⁺细胞、每kg接受者重量至少2x10⁶个cd34⁺细胞、每kg接受者重量至少4x10⁶个cd34⁺细胞、每kg接受者重量至少5x10⁶个cd34⁺细胞、每kg接受者重量至少1x10⁷个cd34⁺细胞、每kg接受者重量至少2x10⁷个cd34⁺细胞、每kg接受者重量至少4x10⁷个cd34⁺细胞、每kg接受者重量至少1x10⁸个cd34⁺细胞、每kg接受者重量至少2x10⁸个cd34⁺细胞、每kg接受者重量至少4x10⁵个cd34⁺细胞或每kg接受者重量至少5x10⁸个cd34⁺细胞。细胞产物可以含有每kg接受者重量至少1x10⁵个cd3⁺细胞、每kg接受者重量至少2x10⁵个cd3⁺细胞、每kg接受者重量至少4x10⁵个cd3⁺细胞、每kg接受者重量至少5x10⁵个cd3⁺细胞、每kg接受者重量至少1x10⁶个cd3⁺细胞、每kg接受者重量至少2x10⁶个cd3⁺细胞、每kg接受者重量至少4x10⁶个cd3⁺细胞、每kg接受者重量至少5x10⁶个cd3⁺细胞、每kg接受者重量至少1x10⁷个cd3⁺细胞、每kg接受者重量至少2x10⁷个cd3⁺细胞、每kg接受者重量至少4x10⁷个cd3⁺细胞、每kg接受者重量至少1x10⁸个cd3⁺细胞、每kg接受者重量至少2x10⁸个cd3⁺细胞、每kg接受者重量至少4x10⁵个cd3⁺细胞或每kg接受者重量至少5x10⁸个cd3⁺细胞。细胞产物可以含有每kg接受者重量约1x10⁵个cd3⁺细胞、每kg接受者重量约2x10⁵个cd3⁺细胞、每kg接受者重量约4x10⁵个cd3⁺细胞、每kg接受者重量约5x10⁵个cd3⁺细胞、每kg接受者重量约1x10⁶个cd3⁺细胞、每kg接受者重量约2x10⁶个cd3⁺细胞、每kg接受者重量约4x10⁶个cd3⁺细胞、每kg接受者重量约5x10⁶个cd3⁺细胞、每kg接受者重量约1x10⁷个cd3⁺细胞、每kg接受者重量约2x10⁷个cd3⁺细胞、每kg接受者重量约4x10⁷个cd3⁺细胞、每kg接受者重量约1x10⁸个cd3⁺细胞、每kg接受者重量约2x10⁸个cd3⁺细胞、每kg接受者重量约4x10⁵个cd3⁺细胞或每kg接受者重量约5x10⁸个cd3⁺细胞。

骨髓可以源自任何骨头来源。例如，骨头可以源自髂嵴或椎体。

非骨髓可以是任何非骨髓的组织或流体。例如，非骨髓可以是血液、肝、淋巴结、脾或胸腺。优选地，非骨髓是血液。

死亡供体可以是成人、儿童或胎儿。

cd34⁺细胞、cd3⁺细胞或两者可以与实体器官移植接受者hla匹配。cd34⁺细胞、cd3⁺细胞或两者可以与实体器官移植接受者hla不匹配。供体和接受者可以在hla-a基因、hla-b基因、hla-c基因、hla-dp基因、hla-dq基因和hla-dr基因中的六个、八个、十个或十二个等位基因处是hla匹配的。供体和接受者可以在hla-a基因、hla-b基因、hla-c基因、hla-dp基因、hla-dq基因和hla-dr基因中的一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多等位基因处是hla不匹配的。

这些cd34⁺细胞和这些cd3⁺细胞可以在单独的容器中提供。这些cd34⁺细胞和这些cd3⁺细胞可以以混合物的形式在一个或多个公共容器中提供。

细胞产物可以含有低温保存培养基。低温保存培养基可以含有低温保护剂，如dmso或分子量为约40,000da的葡聚糖。低温保护剂可以以约1％、2％、3％、4％、5％、7.5％或10％的浓度存在。

实体器官可以是任何可以根据本领域已知的方法移植的实体器官。例如但不限于，实体器官可以是肾、肺、胰、胰岛细胞、心脏、肠、结肠、肝、皮肤、肌肉、牙龈、眼睛或牙齿。优选地，实体器官是肾。

在其它方面，本发明提供制备用于在实体器官移植接受者中建立混合嵌合的细胞产物的方法。这些方法包含：获得源自死亡供体的骨髓的cd34⁺细胞；获得源自该死亡供体的非骨髓的cd3⁺细胞；以及产生包括获得的cd34⁺细胞和获得的cd3⁺细胞的细胞产物以施用到实体器官移植接受者。细胞产物可以包含以上所述的一个或多个特征。在某些实施例中，非骨髓可以是血液、肝、淋巴结、脾或胸腺。优选地，非骨髓是血液。

这些方法可以包含在从骨髓中获得cd34⁺细胞之前，对该死亡供体进行抽血。这些方法可以包含从死亡供体的骨头部分取出骨髓。例如，可以通过抽吸或环钻术取出骨髓。涉及环钻术的方法可以包含用于从骨头碎片分离骨髓的一个或多个另外的步骤。例如但不限于，可以通过搅拌、酶解聚、清洗和过滤中的一个或多个从骨头碎片分离骨髓。

这些方法可以包含用抗凝血剂处理骨髓。例如但不限于，抗凝血剂可以是醋硝香豆素(acenocoumarol)、抗凝血酶iii阿哌沙班(antithrombiniiiapixaban)、阿加曲班(argatroban)、裂盒蕈色素(atromentin)、贝曲西班(betrixaban)、比伐卢丁(bivalirudin)、布洛迪法姆(brodifacoum)、达比加群(dabigatran)、达肝素(dalteparin)、鼠德克(difenacoum)、依度沙班(edoxaban)、edta、依诺肝素(enoxaparin)、磺达肝素(fondaparinux)、肝素(heparin)、艾卓肝素(idraparinux)、苯茚二酮(phenindione)、苯丙香豆素(phenprocoumon)、利伐沙班(rivaroxaban)或华法林(warfarin)。在从骨头部分取出骨髓之前，可以用抗凝血剂处理该骨髓，或在从骨头部分取出骨髓之后，可以用抗凝血剂处理该骨髓。

这些方法可以包含用从骨髓动员cd34⁺细胞的药剂处理骨髓。例如但不限于，从骨髓动员cd34⁺细胞的药剂可以是腺苷受体拮抗剂、bio5192、ccr1拮抗剂、ccr2拮抗剂、cxcr2拮抗剂、cxcr4拮抗剂、环磷酰胺、去纤苷(defibrotide)、epha3-fc、促红细胞生成素(epo)、糖胺聚糖(gag)模拟物、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、生长调节癌基因β(gro-β)、人生长激素、il-8、巨噬细胞炎性蛋白-1α(mip-1α)、met-sdf-1β、nsc23766、甲状旁腺激素、百日咳毒素、普乐沙福(plerixafor)、聚-[1-6]-d-吡喃葡萄糖基-[1-3]-d-吡喃葡萄糖(pgg)葡聚糖、rac1抑制剂、视黄酸受体激动剂、sb290157、sdf-1α肽类似物、干细胞因子(scf)、硫酸化聚唾液酸(sulfatedcolominicacid)、硫酸化多糖、t134、t140、血小板生成素(tpo)、tpo受体激动剂、vcam-1抑制剂、vla-1抑制剂、vla-4抑制剂或上述中的任何一种的类似物或衍生物。在从骨头部分取出骨髓之前，可以用从骨髓动员cd34⁺细胞的药剂处理该骨髓，或者在从骨头部分取出骨髓之后，可以用从骨髓动员cd34⁺细胞的药剂处理该骨髓。

获得cd34⁺细胞可以包含使骨髓耗尽红细胞、血小板或两者。例如但不限于，可以通过浮力激活细胞分选、细胞裂解、羟乙基淀粉沉降(hetastarchsedimentation)、磁免疫耗尽、基于大小的离心分离或纺纱膜过滤(spinningmembranefiltration)来使骨髓耗尽红细胞和/或血小板。在从骨头部分取出骨髓之前，可以使骨髓耗尽红细胞和/或血小板，或在从骨头部分取出骨髓之后，可以使骨髓耗尽红细胞和/或血小板。

获得cd34⁺细胞可以包含从所取出的骨髓免疫性选择cd34⁺细胞。优选地，在从骨头部分取出骨髓之后，免疫性选择cd34⁺细胞。

获得cd3⁺细胞可以包含使非骨髓(例如，血液)耗尽红细胞、血小板或两者。例如但不限于，可以通过浮力激活细胞分选、细胞裂解、羟乙基淀粉沉降、磁免疫耗尽、基于大小的离心分离或纺纱膜过滤来使骨髓耗尽红细胞和/或血小板。

获得cd3⁺细胞可以包含针对cd3⁺细胞富集非骨髓的其它方法。这些方法可以包含阳性选择cd3⁺细胞、耗尽非cd3⁺细胞或其组合。阳性选择cd3⁺细胞可以包含使用固定到固体底物的结合剂结合cd3⁺细胞上的一种或多种标志物。耗尽非cd3⁺细胞可以包含使用固定到固体底物的结合剂结合不存在于cd3⁺细胞中的一种或多种标志物。用于阳性选择cd3⁺细胞的标志物可以包含cd3、cd4和cd8中的一个或多个。用于阴性选择cd3⁺细胞的标志物可以包含cd10、cd14、cd15、cd33、cd41、cd71、cd209和cd235中的一个或多个。结合剂可以是抗体。固体底物可以是珠或颗粒。获得cd3⁺细胞可以包含阻止非骨髓(例如，血液)出现凝块、细胞团块或两者和/或从非骨髓(例如，血液)去除凝块、细胞团块或两者。去除凝块和/或团块可以包含过滤，例如过滤血液或用抗凝血剂处理血液。

获得cd3⁺细胞可以包含将血液分离成细胞部分和血浆部分。

这些方法可以包含将获得的cd34⁺细胞与获得的cd3⁺细胞组合。可替代地，这些方法可以包含将获得的cd34⁺细胞和获得的cd3⁺细胞储存在单独的容器中。

这些方法可以包含低温保存获得的cd34⁺细胞和获得的cd3⁺细胞。例如，可以通过添加低温保护剂，如dmso或分子量为约40,000da的葡聚糖来低温保存细胞。

在另一方面，本发明提供由从骨髓离体获得的造血细胞产生细胞产物的方法。这些方法包含：从受试者的身体获得包括骨髓的样品；在已经从该受试者的身体取出该样品之后，从该样品获得造血细胞；以及产生含有该造血细胞的细胞产物以施用到实体器官移植接受者。

优选地，当从该受试者的身体获得该样品时，该受试者已经死亡。受试者可以是任何哺乳动物，如人或灵长类。优选地，受试者是人。

样品可以从受试者的身体中的任何骨头中获得。优选地，样品是从髂嵴或椎体或两者中获得的。

造血细胞可以是表达一种或多种标志物的造血细胞的子集。例如但不限于，造血细胞可以是b细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、造血细胞、造血干细胞和祖细胞(hspc)、淋巴细胞、淋巴祖细胞、巨噬细胞、肥大细胞、巨核细胞、单核细胞、成髓细胞、髓样祖细胞、自然杀伤(nk)细胞、嗜中性粒细胞、血小板/凝血细胞、t细胞、t调节(treg)细胞、记忆t细胞、效应记忆t细胞、中枢记忆t细胞、干细胞样记忆t细胞(tscm)、原初t细胞、细胞毒性t细胞、γδt细胞、自然杀伤t细胞、cd34⁺细胞、cd4⁺细胞或cd3⁺细胞。

造血细胞可以通过任何合适的方式从样品中获得。例如但不限于，造血细胞可以由通过抽吸或环钻术从样品取出骨髓获得。涉及环钻术的方法可以包含用于从骨头碎片(如上述那些骨头碎片)分离骨髓的一个或多个另外的步骤。可以通过使样品与从骨髓动员cd34⁺细胞的药剂(如上述药剂中的一种或多种)接触来获得造血细胞。

可以进一步处理从样品取出骨髓。例如，可以用抗凝血剂(如上述抗凝血剂)处理骨髓。例如可以通过上述方法从骨头碎片分离骨髓细胞。例如可以通过上述方法使骨髓耗尽红细胞、血小板或两者。可以从骨髓免疫性选择cd34⁺细胞。

这些方法可以包含低温保存细胞产物。可以使用低温保护剂(如上述的低温保护剂)低温保存细胞产物。

细胞产物可以为实体器官移植接受者提供治疗益处。例如，细胞产物可以促进在实体器官移植接受者中建立混合嵌合。

实体器官可以是任何实体器官，如上述那些实体器官之一。

如上文与含有cd34⁺细胞和cd3⁺细胞的细胞产物有关地描述，造血细胞可以与实体器官移植接受者hla匹配或hla不匹配。

在另一方面，本发明提供评估源自死亡供体的血液是否适合用于制造产物以施用到活的接受者的方法。这些方法包含：从死亡供体获得血液；分析该血液的组分；以及基于对该组分进行的分析来确定该血液是否适合用于制造产物以施用到活的接受者。

在另一方面，本发明提供评估源自死亡供体的血液是否适合用于制造产物以施用到活的接受者的方法。这些方法包含：从死亡供体获得血液；分析来自该死亡供体的非血液组织的组分；以及基于对该组分进行的分析来确定该血液是否适合用于制造产物以施用到活的接受者。

非血液组织可以是骨髓、脾、肝、淋巴结或胸腺。

这些方法可以包含对多种组分进行分析。这些方法可以包含对多种血液组分、来自非血液组织的多种组分或至少一种血液组分以及来自非血液组织的至少一种组分进行分析。

血液或非血液组织的组分可以是细胞类型或细胞群。例如但不限于，细胞可以是b细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、造血细胞、造血干细胞和祖细胞(hspc)、淋巴细胞、淋巴祖细胞、巨噬细胞、肥大细胞、巨核细胞、单核细胞、成髓细胞、髓样祖细胞、自然杀伤(nk)细胞、嗜中性粒细胞、血小板/凝血细胞、t细胞、t调节(treg)细胞、记忆t细胞、效应记忆t细胞、中枢记忆t细胞、干细胞样记忆t细胞、原初t细胞、细胞毒性t细胞、γδt细胞、自然杀伤t细胞、cd34⁺细胞、cd4⁺细胞或cd3⁺细胞。

血液或非血液组织的组分可以是非细胞组分，如分子。例如但不限于，该分子可以是细胞因子、促炎性细胞因子、抗炎性细胞因子、趋化因子、抗体或免疫球蛋白。

血液在用于制造产物以施用到活的接受者的适用性可以包含对t细胞进行分析。例如但不限于，可以分析t细胞活化、耗竭、无反应性、增殖、活力和细胞凋亡中的一个或多个。对t细胞活化、耗竭和无反应性中的一个或多个进行的分析可以包含检测t细胞表面上的一种或多种标志物或受体。

血液在用于制造产物以施用到活的接受者的适用性可以包含对hspc进行分析。例如但不限于，可以分析hspc增殖、hspc活力和hspc细胞凋亡中的一个或多个。可以在集落形成、长期培养或小鼠模型再增殖测定中测定hspc增殖和/或活力。

血液在用于制造产物以施用到活的接受者的适用性可以包含对细胞因子或趋化因子进行分析。

对来自死亡供体的血液或非血液组织的组分的分析可以包含与来自活的供体的相同组分进行比较。

这些方法可以包含如果确定该血液适合此类用途，则在制造该产物时使用来自该血液的物质。来自血液的物质可以是细胞类型或细胞群。例如但不限于，细胞可以是b细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、造血细胞、造血干细胞和祖细胞(hspc)、淋巴细胞、淋巴祖细胞、巨噬细胞、肥大细胞、巨核细胞、单核细胞、成髓细胞、髓样祖细胞、自然杀伤(nk)细胞、嗜中性粒细胞、血小板/凝血细胞、t细胞、t调节(treg)细胞、记忆t细胞、效应记忆t细胞、中枢记忆t细胞、干细胞样记忆t细胞、原初t细胞、细胞毒性t细胞、γδt细胞、自然杀伤t细胞、cd34⁺细胞、cd4⁺细胞或cd3⁺细胞。来自血液的物质可以是非细胞组分，如分子。例如但不限于，该分子可以是细胞因子、趋化因子、抗体或免疫球蛋白。这些方法可以包含在制造产物时使用来自血液的多种物质。

这些方法可以包含使细胞物质扩展以用于制造产物。

这些方法可以包含处理血液以最小化或减轻对可以用于制造产物的血液中的物质的损伤。

在一方面，本发明提供源自单个死亡供体的用于在多个实体器官移植接受者中建立混合嵌合的多种细胞产物。每种细胞产物包含每kg接受者重量大于1x10⁵个cd34⁺细胞以及每kg接受者重量大于1x10⁵个cd3⁺细胞，并且多种产物源自单个死亡供体。cd34⁺细胞源自骨髓，并且cd3⁺细胞源自非骨髓。细胞产物可以包含上述细胞产物的特征中的任何特征。

在另一方面，本发明提供用于在多个实体器官移植接受者中建立混合嵌合的方法。这些方法包含向已经接收或将接收实体器官移植的多个受试者中每个受试者提供产物，该产物含有每kg接受者重量大于1x10⁵个cd34⁺细胞以及每kg接受者重量大于1x10⁵个cd3⁺细胞。每种产物的cd34⁺细胞源自一个死亡供体的骨髓，并且每种产物的cd3⁺细胞源自该死亡供体的非骨髓。这些方法可以包含上文与用于在实体器官移植接受者中建立混合嵌合的方法有关地描述的特征中的任何特征。

每种产物可以含有每kg接受者重量至少1x10⁵个、2x10⁵个、5x10⁵个、1x10⁶个、2x10⁶个、4x10⁶个、1x10⁷个、2x10⁷个、4x10⁷个、1x10⁸个、2x10⁸个或5x10⁸个cd34⁺细胞。每种产物可以含有每kg接受者重量至少1x10⁴个、2x10⁴个、5x10⁴个、1x10⁵个、2x10⁵个、5x10⁵个、1x10⁶个、2x10⁶个、5x10⁶个、1x10⁷个、2x10⁷个、4x10⁷个、1x10⁸个、2x10⁸个或5x10⁸个cd3⁺细胞。

在一方面，本发明提供将来自死亡供体的血液分离成细胞组分和非细胞组分以及使用细胞组分中的物质产生用于在实体器官移植接受者中建立混合嵌合的产物的方法。产物可以具有上述细胞产物的任何特征。

这些方法可以涉及用抗凝血剂(如上述抗凝血剂)处理血液或血液的组分。用抗凝血剂处理可以在将血液分离成细胞组分和非细胞组分之前发生，或者用抗凝血剂处理可以在分离之后发生。

这些方法可以涉及使血液或血液的组分耗尽红细胞、血小板或两者。耗尽红细胞和/或血小板可以通过上述任何方法来执行。耗尽红细胞和/或血小板可以在将血液分离成细胞组分和非细胞组分之前执行，或者耗尽红细胞和/或血小板可以在分离之后执行。

这些方法可以涉及从血液或血液的组分中去除凝块和/或团块。可以通过上述任何方法来去除凝块和/或团块。可以在将血液分离成细胞组分和非细胞组分之前去除凝块和/或团块，或者可以在分离之后去除凝块和/或团块。

这些方法可以包含针对特定类型的造血细胞富集血液或血液的组分，该特定类型的造血细胞如b细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、造血细胞、造血干细胞和祖细胞(hspc)、淋巴细胞、淋巴祖细胞、巨噬细胞、肥大细胞、巨核细胞、单核细胞、成髓细胞、髓样祖细胞、自然杀伤(nk)细胞、嗜中性粒细胞、血小板/凝血细胞、t细胞、t调节(treg)细胞、记忆t细胞、效应记忆t细胞、中枢记忆t细胞、干细胞样记忆t细胞、原初t细胞、细胞毒性t细胞、γδt细胞、自然杀伤t细胞、cd34⁺细胞、cd4⁺细胞或cd3⁺细胞。可以通过免疫性选择来富集一种或多种细胞类型。

这些方法可以包含通过上述任何方法对血液或血液的组分进行分析。这些方法可以包含确定血液或血液的组分是否适合用于制造产物以施用到活的接受者或制造用于在实体器官移植接受者中建立混合嵌合的产物。

这些方法可以包含使血液的细胞组分扩展。

在另一方面，本发明提供用于从死亡供体收集血液的装置。在某些实施例中，这些装置包含耦接到冷却系统的一个或多个接受器。

该装置可以具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多接受器。优选地，接受器的组合容量为约5到约10升。例如，每个接受器的容量可以为约0.5升、1升、2升、3升、4升、5升、6升、7升、8升、9升或10升。

冷却系统被配置成在接受器中将血液冷却到目标温度。目标温度可以为约2℃到约8℃。冷却系统可以阻止血液冻结或在血液中形成冰晶。冷却系统可以在一定时间段内将血液冷却到目标温度。例如，冷却系统可以在约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、不少于4小时、不少于5小时、不少于6小时、不少于7小时、不少于8小时、不超过6小时、不超过7小时、不超过8小时、不超过9小时或不超过10小时内将血液冷却到目标温度。

该装置可以包含耦接到该一个或多个接受器的针。该针可以通过管道耦接到该一个或多个接受器。

该装置可以包含被配置成施加真空以从死亡供体取出血液的真空系统。真空系统可以耦接到针、管道和接受器中的一个或多个。

在一方面，本发明提供从死亡供体收集血液以用于制造产物以转移到活的接受者的方法。这些方法可以包含将血液转移到包含耦接到冷却系统的一个或多个接受器的装置。该装置可以包含上述特征中的任何特征。

这些方法可以包含将针插入死亡供体的血管、动脉或静脉中。这些方法可以包含向死亡供体的血管、动脉或静脉施加真空。

这些方法可以包含使血液与稳定剂接触。稳定剂可以是抗凝血剂(如上述抗凝血剂)，或渗透稳定剂(如人血清白蛋白)。

这些方法可以包含使血液与低温保护剂(如上述低温保护剂)接触。

附图说明

图1是根据本发明的实施例的髓提取装置的外部皮质切割套管针的图示。

图2是根据本发明的实施例的髓提取装置的内部套管针的图示。

图3示出了根据本发明的实施例的血液收集装置。

图4示出了根据本发明的实施例的血液收集装置。

图5是展示了根据本发明的实施例的制备细胞组合物的方法的流程图。

图6是来自图5中流程图的组织收集步骤的扩展图。

图7是来自图5中流程图的骨髓制备步骤的扩展图。

图8是来自图5中流程图的血液制备步骤的步骤的扩展图。

图9是来自图5中流程图的缓冲液制备步骤的扩展图。

图10是来自图5中流程图的cd34⁺细胞富集步骤的扩展图。

图11是来自图5中流程图的划分步骤的扩展图。

图12是来自图5中流程图的低温保存步骤的扩展图。

图13是展示了根据本发明的实施例的制备细胞组合物的方法的流程图。

具体实施方式

在器官移植中要克服的主要障碍是使接受者的免疫系统对供体的组织耐受。如果接受者的免疫系统检测到捐赠的器官是外来的，则该免疫系统就会攻击组织，从而导致移植物排斥。为了避免移植物排斥，大多数移植接受者必须服用抑制免疫系统的药物，但是此类药物会增加接受者感染和癌症的风险。作为阻止移植物排斥的另一种方式，可以通过供体源性血细胞祖细胞的转移来实现实体器官的移植。提供供体血细胞允许重构接受者的免疫系统以包含已经被教育成将器官识别为非外来组织的细胞。因此，捐献的器官未被攻击，并且接受者对移植物耐受。

一种用于重建接受者的免疫系统的策略需要将接受者的造血系统完全替换成仅供体源性细胞以达到完全嵌合的状态。然而，与完全嵌合相关的风险是，完全供体源性免疫系统可能会将接受者的组织鉴定为外来的并攻击该组织，这是一种被称为移植物抗宿主病(gvhd)。参见例如，sach等人,“通过混合嵌合来诱导耐受性(inductionoftolerancethroughmixedchimerism)”《冷泉港医学展望(coldspringharbperspectmed)》2014；4:a015529,doi:10.1101/cshperspect.a015529，这些文献的内容通过引用并入本文。因此，完全嵌合的患者必须无限期地保持接受免疫抑制疗法。

另一种策略是用供体源性细胞和受体源性细胞的混合物再增殖接受者的免疫系统以达到被称为混合嵌合的状态。与完全嵌合相比，混合嵌合与较低的gvhd发生率有关。另外，混合嵌合方案最初需要较低剂量的免疫抑制疗法，并且在接受者的混合嵌合的稳定性建立之后允许全面停止免疫抑制。迄今为止，诱导混合嵌合是在无需维持免疫抑制疗法的情况下人产生移植物耐受性的唯一方法。

目前建立混合嵌合的方法需要从供体中转移两种不同的造血细胞群。成熟的t细胞将移植的器官识别为“自身”组织，并阻止免疫系统对其进行攻击。成熟的t细胞表达细胞表面标志物cd3，并且可以在血液和淋巴结中找到不同的亚群。尽管cd3⁺t细胞在转移时促进耐受性，但其寿命有限并且无法自我再生。因此，造血干细胞和祖细胞(hspc)，即可以分化为t细胞的多能细胞的转移，对于实现供体源性t细胞群的持续补充也是必要的。hspc表达细胞表面标志物cd34，并且主要存在于骨髓中。

在没有终身免疫抑制疗法的情况下，活的供体为支持移植接受者的长期移植物耐受性而必须做出的牺牲是巨大的。因此，活的供体必须在利他主义高度激励下进行提供支持无免疫抑制移植物耐受性所需的组织和细胞所需的程序。因此，少有个体愿意成为实体器官和造血细胞的活的供体，尤其是如果这些个体与预期接受者没有家庭或个人关系的话。

相比之下，远远更高比例的个体愿意死后捐献器官和血细胞。然而，当供体死亡时，获得适合转移到活的接受者的造血细胞更具挑战性。例如，必须迅速地从死亡供体取出组织以避免在脑死亡过程期间释放的细胞因子的不利影响。然而，hspc必须取自大多数死亡供体的骨髓，而血液是t细胞的最佳来源。因此，必须从死亡供体采集三种类型的组织或流体：主要关注的实体器官、血液和骨髓。此外，在确保尽可能快得完成整个程序的同时，必须以最佳保存细胞物质的三个来源中的每个来源的功能的顺序从身体取出三个来源。

使用来自死亡供体的造血细胞的另一个问题是此类细胞用于转移到活的接受者中的适用性不确定。对于t细胞，细胞的活化、耗竭和无反应性状态影响细胞是否能够促进接受者中的移植物耐受性，并且这些特性可以根据供体的死亡原因、预验健康、年龄、性别、生活方式和其它因素而变化。细胞活力、增殖潜力和细胞凋亡状态是决定产物中hspc和t细胞两者促进接受者中的混合嵌合的可用性的关键变量。

本发明提供制备方法和分析方法，这些方法克服从死亡供体获得造血细胞以及使用这些细胞制备适于转移到活的接受者中的组合物的困难。本发明的组合物促进在实体器官移植接受者中建立混合嵌合，并且因此允许此类接受者在没有免疫抑制疗法的情况下发展长期移植物耐受性。因此，本发明解锁了从死亡供体捐赠的组织延长并改善需要器官移植的患者的生命的治疗潜力。

源自死亡供体的用于转移到活的接受者的细胞产物

本发明提供含有从死亡供体获得的造血细胞的细胞产物。所有造血细胞都源自hspc，即可以分化为各种特化细胞并且还繁殖以产生新的hspc的多能细胞。分化的hspc形成淋巴祖细胞或髓样祖细胞。淋巴祖细胞产生淋巴细胞和自然杀伤细胞。髓样祖细胞产生髓样和红系谱系细胞，如红细胞(erythrocyte)、血小板、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和抗原呈递细胞，如树突细胞。在成人中，大多数造血发育发生在骨髓中，但是一些淋巴细胞的成熟和活化发生在脾、胸腺和淋巴结中。

本发明的细胞组合物包含允许供体hspc在接受者的身体内发育成免疫系统的成熟细胞的两个细胞群体。一个群体包含cd34⁺细胞。cd34是在干细胞及其直接后代，即多能祖细胞中表达的细胞表面标志物，这些细胞不属于髓样或淋巴系。因此，cd34的表达是用于鉴定含有hspc的细胞群的有用度量。在成人中，cd34⁺细胞主要存在于骨髓中。

本发明的细胞组合物还包含cd3⁺细胞。cd3包括与t细胞受体的两条多肽链相互作用以形成t细胞受体复合物的一组多肽。cd3复合物包含γ链、δ链和两条ε链。cd3在成熟t细胞的表面上表达，并且因此可用作t细胞的标志物。循环血液中cd3⁺细胞丰富。

为了促进在接受者中建立混合嵌合，细胞产物包含适当数量的cd34⁺细胞和cd3⁺细胞。细胞产物可以含有限定量的cd34⁺细胞和cd3⁺细胞。产物中细胞数量的有用单位是相对于接受者体重的细胞数量。例如但不限于，细胞产物可以含有每kg接受者重量至少1x10⁴个、2x10⁴个、5x10⁴个、1x10⁵个、2x10⁵个、5x10⁵个、1x10⁶个、2x10⁶个或4x10⁶个、1x10⁷个、2x10⁷个、4x10⁷个、1x10⁸个、2x10⁸个或5x10⁸个cd34⁺细胞。例如但不限于，细胞产物可以含有每kg接受者重量至少1x10⁴个、2x10⁴个、5x10⁴个、1x10⁵个、2x10⁵个、5x10⁵个、1x10⁶个、2x10⁶个、5x10⁶个、1x10⁷个、2x10⁷个、5x10⁷个、1x10⁸个cd3⁺、2x10⁸个或5x10⁸个细胞。

细胞产物可以含有每kg接受者重量至少1x10⁵个cd34⁺细胞、每kg接受者重量至少2x10⁵个cd34⁺细胞、每kg接受者重量至少4x10⁵个cd34⁺细胞、每kg接受者重量至少5x10⁵个cd34⁺细胞、每kg接受者重量至少1x10⁶个cd34⁺细胞、每kg接受者重量至少2x10⁶个cd34⁺细胞、每kg接受者重量至少4x10⁶个cd34⁺细胞、每kg接受者重量至少5x10⁶个cd34⁺细胞、每kg接受者重量至少1x10⁷个cd34⁺细胞、每kg接受者重量至少2x10⁷个cd34⁺细胞、每kg接受者重量至少4x10⁷个cd34⁺细胞、每kg接受者重量至少1x10⁸个cd34⁺细胞、每kg接受者重量至少2x10⁸个cd34⁺细胞、每kg接受者重量至少4x10⁵个cd34⁺细胞或每kg接受者重量至少5x10⁸个cd34⁺细胞。细胞产物可以含有每kg接受者重量至少1x10⁵个cd3⁺细胞、每kg接受者重量至少2x10⁵个cd3⁺细胞、每kg接受者重量至少4x10⁵个cd3⁺细胞、每kg接受者重量至少5x10⁵个cd3⁺细胞、每kg接受者重量至少1x10⁶个cd3⁺细胞、每kg接受者重量至少2x10⁶个cd3⁺细胞、每kg接受者重量至少4x10⁶个cd3⁺细胞、每kg接受者重量至少5x10⁶个cd3⁺细胞、每kg接受者重量至少1x10⁷个cd3⁺细胞、每kg接受者重量至少2x10⁷个cd3⁺细胞、每kg接受者重量至少4x10⁷个cd3⁺细胞、每kg接受者重量至少1x10⁸个cd3⁺细胞、每kg接受者重量至少2x10⁸个cd3⁺细胞、每kg接受者重量至少4x10⁵个cd3⁺细胞或每kg接受者重量至少5x10⁸个cd3⁺细胞。细胞产物可以含有每kg接受者重量约1x10⁵个cd3⁺细胞、每kg接受者重量约2x10⁵个cd3⁺细胞、每kg接受者重量约4x10⁵个cd3⁺细胞、每kg接受者重量约5x10⁵个cd3⁺细胞、每kg接受者重量约1x10⁶个cd3⁺细胞、每kg接受者重量约2x10⁶个cd3⁺细胞、每kg接受者重量约4x10⁶个cd3⁺细胞、每kg接受者重量约5x10⁶个cd3⁺细胞、每kg接受者重量约1x10⁷个cd3⁺细胞、每kg接受者重量约2x10⁷个cd3⁺细胞、每kg接受者重量约4x10⁷个cd3⁺细胞、每kg接受者重量约1x10⁸个cd3⁺细胞、每kg接受者重量约2x10⁸个cd3⁺细胞、每kg接受者重量约4x10⁵个cd3⁺细胞或每kg接受者重量约5x10⁸个cd3⁺细胞。

美国专利第9,504,717号和美国专利第9,561,253号中例证了其它浓度，这些专利中的每个专利的内容通过引用以其整体并入本文。

细胞产物可以含有处于指定纯度水平的cd34⁺细胞。例如，细胞产物可以含有至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％纯度的cd34⁺细胞。美国专利第9,504,717号和美国专利第9,561,253号中例证了其它纯度，这些专利中的每个专利的内容通过引用以其整体并入本文。

cd34⁺细胞和cd3⁺细胞可以以混合物的形式在一个或多个容器中提供。cd34⁺细胞和cd3⁺细胞可以在单独的容器中提供。可以使用任何经批准用于容纳细胞产物的可商购容器。

细胞产物可以冷冻提供。因此，细胞产物可能含有低温保护剂。可以使用本领域已知的任何低温保护剂。例如但不限于，低温保护剂可以是dmso、平均分子量为40kda的葡聚糖、血清，例如牛血清、白蛋白，例如人血清白蛋白或细胞培养基。低温保护剂可以以限定浓度存在。例如，细胞产物可以含有约1％dmso、约2％dmso、约5％dmso、约7.5％dmso、约10％dmso、约12.5％dmso、约15％dmso或约20％dmso。细胞产物可以含有约1％葡聚糖、约2％葡聚糖、约5％葡聚糖、约7.5％葡聚糖、约10％葡聚糖、约12.5％葡聚糖、约15％葡聚糖或约20％葡聚糖。低温保护剂可以是可商购冷冻培养基，如生物生命解决方案公司(biolifesolutions)(美国博瑟尔(bothell,wa))以商品名cryostor10出售的培养基。美国专利第9,504,717号和美国专利第9,561,253号中讨论了低温保护，这些专利中的每个专利的内容通过引用以其整体并入本文。

细胞产物可以含有增强接受者中的造血细胞的移植或功能动员的药剂。细胞产物可以含有阻止接受者与造血细胞的负面反应的药剂。例如但不限于，药物组合物可以含有细胞因子、趋化因子、生长因子、酶、赋形剂、载体、抗体或其片段、小分子、药物、激动剂、拮抗剂、基质蛋白或互补细胞类型。

在某些实施例中，细胞产物含有酶、底物或两者。例如，细胞产物可以含有一种或多种α1,3-岩藻糖基转移酶、岩藻糖供体或两者。hspc的岩藻糖基化增强了与e-选择素和p-选择素的结合，并提高了hspc归巢到骨髓的能力。α1,3-岩藻糖基转移酶的实例包含α1,3-岩藻糖基转移酶iv、α1,3-岩藻糖基转移酶vi和α1,3-岩藻糖基转移酶vii。岩藻糖供体可以是gdp-岩藻糖。hspc的岩藻糖基化在美国专利第7,776,591号中详细描述，该专利的内容通过引用并入本文。

细胞产物可以含有缓冲液。细胞产物可以被缓冲以维持生理上相容的ph。例如，细胞产物可以被缓冲至中性ph，如从约6.0到约8.0。

细胞产物可以以药物组合物的形式供应，该药物组合物包括在充分无菌的条件下制备的用于人施用的等渗赋形剂。根据用于施用的途径和装置调整对组合物的细胞赋形剂和任何伴生元素的选择。关于药用调配物的一般原则，参见《细胞疗法：干细胞移植、基因疗法和细胞免疫疗法(celltherapy:stemcelltransplantation,genetherapy,andcellularimmunotherapy)》,g.morstyn和w.sheridan.等人,剑桥大学出版社(cambridgeuniversitypress),1996；以及《造血干细胞疗法(hematopoieticstemcelltherapy)》,e.d.ball、j.lister和p.law，《丘吉尔利文斯通(churchilllivingstone)》,2000。

cd34⁺细胞、cd3⁺细胞或两者可能与接受者hla匹配或hla不匹配。人白细胞抗原(hla)(也被称为主要组织相容性复合物(mhc)抗原)是在为这些细胞赋予独特的抗原同一性的细胞的表面上表达的蛋白质分子。mhc/hla抗原是由t细胞和自然杀伤(nk)细胞识别为源自与免疫效应细胞(“自身”)相同的造血干细胞来源或识别为源自造血重建细胞(“非自身”)的另一个来源的靶分子。识别出了两类主要的hla抗原：hlai类和hlaii类。hlai类抗原(人中的a、b和c)使每个细胞可识别为“自身”，而hlaii类抗原(人中的dr、dp和dq)涉及淋巴细胞与抗原呈递细胞之间的反应。

hla基因系统的关键方面是其多态性。每个基因以不同的等位基因存在。等位基因产物在一个或多个α和/或β结构域的一个或多个氨基酸方面不同。个体的每个基因具有两个等位基因，在hla-a基因、hla-b基因、hla-c基因、hla-dp基因、hla-dq基因和hla-dr基因中一共十二个等位基因。hla匹配的供体可以在选自以下的任何组合的六个、八个、十个或十二个等位基因处与接受者匹配：hla-a基因、hla-b基因、hla-c基因、hla-dp基因、hla-dq基因和hla-dr基因。对于hla分型最重要的基因是hla-a、hla-b和hla-dr，因此供体和接受者可以在hla-a基因、hla-b基因和hla-dr基因的所有六个等位基因处匹配。hla不匹配的供体可以在hla-a基因、hla-b基因、hla-c基因、hla-dp基因、hla-dq基因和hla-dr基因中的一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多等位基因处存在不匹配。可以通过本领域已知的任何方法来执行hla分型。hla分型方法的实例包含血清学细胞毒性、流式细胞术和dna分型。此类方法在例如美国专利第9,561,253号中进行描述，该专利的内容通过引用并入本文。

hla基因在存在于染色体位置6p21上的超级基因座中聚类。因此，存在于单个染色体(也就是说，单倍型)上的等位基因组往往作为群体继承。鉴定患者的单倍型可以帮助预测找到匹配供体的概率并有助于制定搜索策略。单倍型在其在一般群体中的常见程度及其在不同种族和族群内的出现频率的方面不同。

从死亡供体制造细胞产物可以包含对产物进行另外表征。例如，可以针对含有cd34⁺细胞和/或cd3⁺细胞的组合物建立一个或多个分泌分子(如细胞因子或趋化因子)的谱式。可替代地或另外，可以针对组合物建立细胞表面标志物如cd3、cd34或cd45的表达谱式。可以使用任何合适的方法来表征组合物，包含上文与分析来自死亡供体的血液有关地描述的方法中的一种或多种方法。还可以测试细胞产物中病原体的存在，这些病原体如支原体或证明病原体存在的内毒素。

由死亡供体制备用于转移到活的接受者的细胞产物

本发明提供制备含有从死亡供体获得的cd34⁺细胞和cd3⁺细胞的细胞产物的方法。如上文所指示的，考虑到cd34⁺细胞和cd3⁺细胞的主要解剖位置，不同组织或流体是两种细胞类型的优选来源。因此，本发明提供从死亡供体的骨髓中获得cd34⁺细胞以及从来自供体的不同来源(如血液、肝、淋巴结、脾或胸腺)获得cd3⁺细胞。

骨头包含被称为皮质骨或密质骨的坚硬的外层以及被称为松质骨的内部海绵状部分(其含有骨髓)。可以从大骨头(如骨盆、椎骨、肋骨、股骨、胫骨和胸骨)的松质骨物质中获得骨髓。骨髓的优选来源是骨盆的髂嵴和椎骨的椎体。

这些方法可以包含以任一顺序从死亡供体的身体取出骨髓和cd3⁺细胞的来源，如血液。优选地，首先取出血液，也就是说，对身体抽血，并且然后获得骨髓。这些方法可以包含取出所关注实体器官，如肾、肺、胰、胰岛细胞、心脏、肠、结肠、肝、皮肤、肌肉、牙龈、眼睛或牙齿。所关注实体器官、骨髓和cd3⁺细胞来源(如血液)可以以任何顺序取出。优选地，取出按以下顺序发生：所关注实体器官、血液和骨髓。

可以通过任何合适的方法从死亡供体的身体取出骨髓。在一些方法中，通过抽吸取出骨髓。抽吸涉及将针插入到骨头中并抽取骨髓。在一些方法中，通过环钻术取出骨髓。环钻是具有切入骨头以提取骨头的圆柱形部分的圆形刀片的锯。

图1是根据本发明的实施例的髓提取装置的外部皮质切割套管针101的图示。外部套管针101包含可以由手术钢制成的中空轴113。位于外部套管针101的远端处的是切割尖端115，如齿锯。切割尖端115可以手动、气动或电驱动。切割尖端115并且可以是可更换的。位于外部套管针101的近端处的是可拆卸的气动驱动适配器117。气动驱动适配器117将外部套管针101与气动驱动器联接，并且可以从外部套管针101去除。外部套管针101可以包含抽吸适配器，该抽吸适配器将外部套管针101与真空泵或其它抽吸源联接以促进骨头碎片的取出。当去除驱动适配器117时，可以将抽吸适配器装配到外部套管针101的近端，或者该抽吸适配器可以直接装配到驱动适配器117中。

图2是根据本发明的实施例的髓提取装置的内部套管针201的图示。内部套管针201包含具有一个或多个定位在远端处的可展开的骨钳刀片219的轴223。骨钳刀片可以以不同的角度定位，以实现不同的圆形切割半径。调节切割半径可用于切割成不同大小的骨头。例如，需要较小的切割半径以取出椎体，而较大的切割半径最适合从股骨或胫骨提取骨头段。内部套管针201还在其近端包含一个或多个手柄217或翼。手柄217可以用手旋转，以允许手动提取骨头段。可替代地或另外，内部套管针201可以联接到气动驱动器，以用于低速操作。

以下一系列步骤可以用于从死亡供体取出骨头部分。以下顺序仅用于说明的目的，本领域的技术人员将理解在本发明的范围内其它骨头取出的方法是可能的。首先，通过标准手术程序来暴露目标骨头的皮质表面。接下来，具有切割尖端115和放置在气动驱动器的卡盘中的气动驱动适配器117的外部切割套管针101用于切割穿过骨头皮质并进入骨髓腔中。然后从驱动器去除气动驱动适配器117。接下来，将实心内部套管针201插入穿过外部套管针101的轴113，并且展开骨钳刀片219。手柄217用于扭转骨钳刀片219并破坏骨髓小梁。可替代地，内部套管针201可以以低速接合到气动驱动器。然后从轴113去除内部套管针201，并且将抽吸适配器附连到中空套管针。最后，通过抽吸适配器附接抽吸装置，并且应用抽吸以将骨髓腔排空到收集袋中。

因为通过环钻术获得的骨头部分通常含有骨头碎片，所以从骨头部分获得cd34⁺细胞的方法可以包含从骨头碎片分离骨髓细胞的程序。可以使用多种方法(如物理搅拌、酶解聚、清洗和过滤)从骨头碎片分离骨髓细胞。方法可以包含用动员造血细胞的一种或多种药剂(如上述那些药剂)处理骨头碎片，以提高来自骨头部分的hpsc的产量。处理可以包含将骨头碎片沉浸在含有一种或多种动员剂的保存溶液或液体中。处理可以发生在储存容器内，使得在运输或装运所提取物质期间发生hspc释放。因此，可以在第一位点处从供体提取骨头部分并装运到第二位点处的接受者，并且在组织运输时，可能至少部分地发生造血细胞的动员。

由于与成骨细胞、基质细胞和细胞外基质的分子相互作用，hspc主要存在于骨髓中。在体内，此类相互作用将hspc拴系到骨髓上，并阻止hspc进入循环血液。在提取hspc期间，相同的分子相互作用可能会阻碍从其它细胞类型和非细胞物质分离cd34⁺细胞。因此，制备cd34⁺细胞以在细胞产物中用于支持器官移植的方法可以包含用从骨髓动员cd34⁺细胞的一种或多种药剂处理骨髓或骨头部分。从骨髓动员hspc的药剂的类别包含化学治疗药物、造血生长因子、细胞因子、趋化因子受体的抑制剂和整合素抑制剂。例如但不限于，动员剂可以是腺苷受体拮抗剂、bio5192、ccr1拮抗剂、ccr2拮抗剂、cxcr2拮抗剂、cxcr4拮抗剂、环磷酰胺、去纤苷、epha3-fc、促红细胞生成素(epo)、糖胺聚糖(gag)模拟物、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、生长调节癌基因β(gro-β)、人生长激素、il-8、巨噬细胞炎性蛋白-1α(mip-1α)、met-sdf-1β、nsc23766、甲状旁腺激素、百日咳毒素、普乐沙福、聚-[1-6]-d-吡喃葡萄糖基-[1-3]-d-吡喃葡萄糖(pgg)葡聚糖、rac1抑制剂、视黄酸受体激动剂、sb290157、sdf-1α肽类似物、干细胞因子(scf)、硫酸化聚唾液酸、硫酸化多糖、t134、t140、血小板生成素(tpo)、tpo受体激动剂、vcam-1抑制剂、vla-1抑制剂、vla-4抑制剂或其类似物或衍生物。

尽管骨髓是hspc的天然环境，但hspc仅表示骨髓细胞的小部分。cd34⁺细胞仅占骨髓中所有有核细胞的约1％。因此，本发明的方法可以包含针对cd34⁺细胞从死亡供体富集骨髓提取物的步骤。

富集的一种形式是从去核细胞(如红细胞和血小板)和具有多叶核的细胞(如粒细胞，包含中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞)分离单核细胞。用于富集以分离或富集单核细胞的若干方法是本领域已知的。例如但不限于，可以通过浮力激活细胞分选、细胞裂解、羟乙基淀粉沉降、磁免疫耗尽、基于大小的离心分离和纺纱膜过滤来分离或富集单核细胞。用于浮力激活细胞分选的系统可从赛斯卡医疗公司(cescatherapeutics,inc.)(加利福尼亚兰乔科尔多瓦(ranchocordova,ca))商购并且例如在美国专利第9,695,394号中描述，该专利的内容通过引用并入本文。用于基于大小的离心分离系统可从赛分科技有限公司(sepaxtechnologies,inc.)(特拉华州纽瓦克(newark,de))商购。用于纺纱膜过滤的系统是可商购的，该系统如美国费森尤斯卡比有限责任公司(freseniuskabiusa,llc)(伊利诺伊州，苏黎世湖(lakezurich,il))以商标名lovo自动化细胞处理系统(lovoautomatecellprocessingsystem)出售的系统。

可以基于一种或多种细胞表面标志物的定性或定量表达来纯化cd34⁺细胞。合适的细胞表面标志物的实例包含ac133、cd3、cd34、cd38、cd45和thy-1。cd34⁺细胞可以基于标志物的存在或不存在或基于标志物的表达水平(例如，高相对于低)进行纯化。cd34⁺细胞的纯化可以包含比较起始物质与针对cd34⁺细胞富集的物质之间的标志物表达、全血细胞计数和/或单核细胞计数。

可以通过将合适的亲和试剂与cd34或另一种标志物选择性地结合以纯化cd34⁺细胞。亲和试剂可以是抗体、全长抗体、抗体片段、天然存在的抗体、合成抗体、工程化抗体、全长亲和体、亲和体片段、全长泛素(affilin)、泛素片段、全长抗卡林(anticalin)、抗卡林片段、全长阿非莫(avimer)、阿非莫片段、全长darpin、darpin片段、全长飞诺莫(fynomer)、飞诺莫片段、全长kunitz结构域肽、kunitz结构域肽片段、全长单体、单体片段、肽、聚氨基酸等。亲和试剂可以直接与检测试剂和/或纯化试剂缀合。检测试剂和纯化试剂可以相同或者可以不同。例如，检测试剂和/或纯化试剂可以是荧光的、磁性的等。检测试剂和/或纯化试剂可以是用于柱纯化的磁性颗粒。例如，磁性柱纯化可以使用柱、抗体、缓冲液、制备物质和试剂等的本领域的技术人员已知的美天旎(miltenyi)系统来执行。对包含cd34⁺细胞和cd3⁺细胞的造血细胞进行的亲和纯化以及对经纯化群体进行的分析的方法例如在美国专利第9,561,253号；和第9,452,184号中进行描述，这些专利的内容通过引用并入。

可以通过任何方法来分离、富集或纯化cd34⁺细胞。例如，可以通过柱纯化、流式细胞术、细胞分选或免疫吸附柱分离来分离、富集或纯化cd34⁺细胞。优选地，使用免疫磁性柱系统，如美天旎生物技术有限公司(miltenyibiotecinc.)(加利福尼亚州奥本(auburn,ca))以商品名clinimacs出售的那些免疫磁性柱系统来纯化cd34⁺细胞。对包含cd34⁺细胞的造血细胞进行的亲和纯化以及对经纯化群体进行的分析的方法在例如以下中进行描述：美国专利第9,561,253号；美国专利第9,452,184号；ng等人,“人造血干细胞与小鼠造血干细胞的分离(isolationofhumanandmousehematopoieticstemcells)”,《分子生物学方法(methodsmolbiol.)》(2009)506:13-21.doi:10.1007/978-1-59745-409-4_2；以及spohn等人,“外周血干细胞单采产物的自动化cd34⁺细胞分离(automatedcd34⁺cellisolationofperipheralbloodstemcellapheresisproduct)”,《细胞疗法(cytotherapy)》(2015)十月；17(10):1465-71.doi:10.1016/j.jcyt.2015.04.005，这些文献中的每个文献的内容通过引用并入本文。这些方法可以包含阳性选择、阴性选择或两者。

这些方法可以包含骨髓、血液或其它组织来源的促进cd34⁺细胞和/或cd3⁺细胞的恢复率以在制造产物中用于施用到活的接受者的各种其它处理。例如，可以处理血液、骨髓或其它组织以去除凝块和/或细胞团块，也就是说，凝集。可以通过任何合适的方法去除凝块和团块。去除凝块和团块的非限制性实例包含过滤，例如如上所述的纺纱膜过滤；用溶栓药物处理，该溶栓药物如阿替普酶、阿尼普酶(anistreplase)、溶栓酶(kabikinase)、重组组织型纤溶酶原激活剂、瑞替普酶(reteplase)、链激酶(streptokinase)、替奈普酶(tenecteplase)和尿激酶(urokinase)；超声；和机械摩擦，例如在以下中所述：khalil等人,“使用螺旋形机器人摩擦血凝块：建模和体外实验验证(rubbingagainstbloodclotsusinghelicalrobots:modelingandinvitroexperimentalvalidation)”,《美国电气电子工程师学会机器人和自动化快报(ieeeroboticsandautomationletters)》2(2):927-934,2017年4月,doi:10.1109/lra.2017.2654546，其内容通过引用结合于此。

可以用一种或多种抗凝血剂来处理骨髓、血液或其它组织以阻止或最小化凝血。例如但不限于，抗凝血剂包含醋硝香豆素、抗凝血酶iii阿哌沙班、阿加曲班、裂盒蕈色素、贝曲西班、比伐卢丁、布洛迪法姆、达比加群、达肝素、鼠德克、依度沙班、edta、依诺肝素、磺达肝素、肝素、艾卓肝素、苯茚二酮、苯丙香豆素、利伐沙班和华法林。可以将抗凝血剂施用到死亡供体的身体。可替代地或另外，可以在从身体取出之后用抗凝血剂处理骨髓、血液或其它组织。

骨髓、血液或其它组织可以被处理以耗尽红细胞和/或血小板。例如但不限于，可以通过如上所述的浮力激活细胞分选、细胞裂解、羟乙基淀粉沉降、磁免疫耗尽、基于大小的离心分离或纺纱膜过滤来耗尽红细胞和/或血小板。

用于从血液获得cd3⁺细胞的方法可以包含将血液分离成不同的成分，如细胞部分和血浆部分，如下文详细描述的。

获得cd3⁺细胞可以包含针对cd3⁺细胞富集血液或其它非骨髓来源的其它方法。富集可以包含阳性选择cd3⁺细胞、耗尽非cd3⁺细胞或其组合。例如但不限于，可以通过使用结合cd3⁺细胞(如cd3、cd4或cd8)的表面上的标志物的抗体或其它药剂来阳性选择cd3⁺细胞。例如但不限于，可以通过使用结合不存在于cd3⁺细胞(如cd10、cd14、cd15、cd33、cd41、cd71、cd209或cd235)的表面的标志物的抗体药剂来耗尽非cd3⁺细胞。可以通过以下来执行阳性选择或耗尽：将缀合到颗粒或珠的抗体与细胞亚群结合以及通过本领域已知的方法分选细胞亚群，这些方法如美国专利第9,090,871号；美国专利公开第2010/0310588号；和国际专利公开第wo2017/005647号中描述的那些方法，这些文献中的每个文献的内容通过引用并入本文。

在制备cd34⁺细胞和/或cd3⁺细胞以在细胞产物中使用期间，可以在任何阶段冷冻(也就是说，低温保存)细胞。低温保存可以包含添加一种或多种低温保护剂，如上文与本发明的细胞产物有关地描述的那些低温保护剂。低温保存通常涉及以受控的速率降低含细胞样品的温度。低温保存可以包含对含细胞样品进行解冻并清洗样品以去除一种或多种低温保护剂。用于低温保存(包含冷冻、解冻和清洗样品)的方法和试剂是本领域已知的并在例如美国专利第9,561,253号中描述，该专利的内容通过引用并入本文。

在一些情况下，最初从死亡供体获得的cd34⁺细胞和/或cd3⁺细胞的数量可能不足以产生用于促进活的接受者中混合嵌合的产物。因此，这些方法可以包含离体扩增cd34⁺细胞和/或cd3⁺细胞。可以扩增任何期望的细胞类型或细胞群。例如但不限于，扩增的群体可以包含hspc、t细胞、t调节(treg)细胞、记忆t细胞、效应记忆t细胞、中枢记忆t细胞、干细胞样记忆t细胞、原初t细胞、细胞毒性t细胞、γδt细胞、b细胞、自然杀伤(nk)细胞、自然杀伤t(nkt)细胞、巨核细胞、成髓细胞、成单核细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、cd34⁺细胞、cd3⁺细胞或cd4⁺细胞。扩增可以发生在冷冻之前或之后。扩增可以包含提供一种或多种生长因子，并且扩增可以包含在存在另一种细胞类型(例如，饲养细胞)的情况下培养细胞。用于扩增造血细胞的方法在例如美国专利第9,561,253号中进行描述，该专利的内容通过引用并入本文。

cd34⁺细胞和/或cd3⁺细胞可以是离体遗传修饰的。例如，在供体细胞的自体转移中，可以使用基因疗法校正遗传缺损。基因疗法的方法在例如以下中描述：mali,“基因疗法的递送系统(deliverysystemsforgenetherapy)”,《印度人类遗传学期刊(indianjhumgenet.)》2013年1月-3月；19(1):3–8,doi:10.4103/0971-6866.112870；gennadyermak(2015)前言.新兴医疗技术(emergingmedicaltechnologies),isbn:978-981-4675-80-2,doi.org/10.1142/9789814675826_fmatter；以及bakhuraysah等人,“针对多发性硬化的造血干细胞移植：这是临床现实吗？(hematopoieticstemcelltransplantationformultiplesclerosis:isitaclinicalreality？)”《干细胞研究和疗法(stemcellresther.)》2016中；7:12,doi:10.1186/s13287-015-0272-1，这些文献中的每个文献的内容通过引用并入本文。

从骨髓离体提取造血细胞

本发明还提供了从死亡供体的骨髓提取造血细胞(如cd34⁺细胞)以在用于制造细胞产物以转移到活的接受者的方法。如上文所指示，成人中的cd34⁺细胞主要存在于骨髓中，在骨髓中这些细胞栓系到其它细胞和细胞外基质上。可以通过用破坏骨髓的cd34⁺细胞与组分之间的相互作用的药剂处理来动员cd34⁺细胞以进入活的患者的血液，但最大限度的动员需要若干天。动员身体中的cd34⁺细胞减慢任何制造过程，并且在死亡供体的情况下延长细胞对细胞因子以及在脑死亡时释放的其它因子的暴露。本发明提供了通过可以加快制造过程的执行离体动员来改善从死亡供体的骨髓收获cd34⁺细胞的方法，因为在将骨髓装运到制造设施时，可以在容器中发生cd34⁺细胞的提取。

从骨髓中离体提取造血细胞加快了本发明的细胞组合物的产生。提取涉及使骨头样品与促进从骨髓释放所关注细胞的一种或多种药剂(如动员上述cd34⁺细胞的药剂)接触，同时骨头样品在容器中。因此，可以在样品在储存中或运输到加工设施时执行该步骤。另外，因为离体提取允许快速恢复骨髓细胞，所以离体提取改善了细胞质量以用于制造产物以促进混合嵌合。

这些方法涉及从死亡供体获得骨头样品。样品可以来自任何含有松质物质的大骨头，如骨盆、椎骨、肋骨、股骨、胫骨和胸骨。优选地，样品来自骨盆的髂嵴和椎骨的椎体。

这些方法进一步涉及在已经从身体取出骨头样品之后，从该骨头样品获得骨髓细胞。可以通过任何方法从骨头样品获得骨髓细胞。例如，如上所述，可以通过环钻术或抽吸来获得骨髓细胞。如上所述，可以处理通过环钻术获得的样品以取出骨头碎片。

这些方法可以包含用从骨髓动员cd34⁺细胞的药剂(如上述动员药剂之一)处理骨头样品。

这些方法可以用于获得任何类型的造血细胞。例如但不限于，细胞可以是b细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、造血细胞、造血干细胞和祖细胞(hspc)、淋巴细胞、淋巴祖细胞、巨噬细胞、肥大细胞、巨核细胞、单核细胞、成髓细胞、髓样祖细胞、自然杀伤(nk)细胞、嗜中性粒细胞、血小板/凝血细胞、t细胞、t调节(treg)细胞、记忆t细胞、效应记忆t细胞、中枢记忆t细胞、干细胞样记忆t细胞、原初t细胞、细胞毒性t细胞、γδt细胞、自然杀伤t细胞、cd34⁺细胞、cd4⁺细胞或cd3⁺细胞。优选地，细胞是hspc或cd34⁺细胞。

这些方法可以包含一个或多个另外的步骤，如上文与制备细胞产物有关地描述的那些步骤。例如，这些方法可以包含以下中任何一种：用抗凝血剂(如上述抗凝血剂)处理造血细胞；耗尽造血细胞或红细胞和/或血小板；以及针对细胞类型或细胞群(如cd34⁺细胞)富集造血细胞。

这些方法可以包含使用从骨髓离体提取的造血细胞以用于制造产物以转移到活的接受者中，该产物如上述细胞组合物之一。

本发明还包含可用于从死亡供体的骨髓离体提取造血细胞(如cd34⁺细胞)的物质。例如，本发明提供预装载有一种或多种从骨髓动员cd34⁺细胞的试剂(如上述动员试剂之一)的接受器。本发明还包含包括容器的系统，该容器含有一种或多种此类药剂以及源自死亡供体的一个或多个骨头部分。

用于离体提取造血细胞的物质和系统可以由其随时间推移将特定细胞类型或细胞群释放到悬浮液中的能力表征。例如，与参考储存系统相比，这些物质和系统可以将从cd34⁺细胞从骨髓的释放增加2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或更多。

用于离体提取造血细胞的物质和系统可以在限定时间内，如1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时或更长时间内实现将特定细胞类型或细胞群释放到悬浮液中。

这些物质和系统可以实现释放到特定细胞类型或细胞群的悬浮液中，这些特定细胞类型或细胞群具有改善细胞的效用以制造产物来促进混合嵌合的特性。例如但不限于，与来自参考储存系统的细胞相比，这些细胞可以具有优越的活力、增殖潜力、标志物表达、细胞凋亡特性和/或细胞凋亡特性。

对来自死亡供体的血液进行分馏

本发明还提供将来自死亡供体的血液分馏成两种或更多种成分以及在制造产物以转移到活的接受者中时使用这些成分中的一种或多种成分。对来自活的接受者的血液进行的单采涉及将血液分成不同的成分，分离一种或多种成分，以及将剩余部分返回到循环中。例如，白细胞去除术需要从供体的血液分离白细胞以及将剩余细胞和血浆返回到供体的身体。单采方法和装置是本领域已知的并且在例如以下中进行描述：美国公开第2002/0107469号；美国专利第5,607,579号；美国专利第9,364,600号；和美国专利第6,743,192号，这些专利中的每个专利的内容通过引用并入本文。

本发明提供其中使用类似于单采的程序从死亡供体分离血液组分的方法。使用来自死亡供体的血液的优点在于，在分离所关注组分之后，无需将未使用的骨头部分返回到供体身体。例如，可以将来自死亡供体的血液分成细胞部分和血浆部分或分成两个或更多个不同的细胞部分。可以按顺序对血液进行分馏。例如，在最初分离成细胞部分和非细胞部分之后，可以对细胞部分进一步处理以针对细胞群的特定细胞类型(如cd3⁺细胞)进行富集。本领域已知的任何方法都可以用于针对cd3+细胞进行富集，该方法包含上述方法中的任何方法。

将来自死亡供体的血液分成不同的部分可用于获得针对特定组分(如细胞类型或细胞群)富集的部分，以包含在本发明的细胞产物中。细胞可以是任何类型的造血细胞，如b细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、造血细胞、造血干细胞和祖细胞(hspc)、淋巴细胞、淋巴祖细胞、巨噬细胞、肥大细胞、巨核细胞、单核细胞、成髓细胞、髓样祖细胞、自然杀伤(nk)细胞、嗜中性粒细胞、血小板/凝血细胞、t细胞、t调节(treg)细胞、记忆t细胞、效应记忆t细胞、中枢记忆t细胞、干细胞样记忆t细胞、原初t细胞、细胞毒性t细胞、γδt细胞、自然杀伤t细胞、cd34⁺细胞、cd4⁺细胞或cd3⁺细胞。具体地，血液分馏可用于获得针对cd3⁺细胞富集的部分，以用于制造细胞产物。对血液进行的分馏还可用于获得针对cd34⁺细胞富集的部分，这可以用于补充本发明的产物中的骨髓源性cd34⁺细胞。

本发明的若干见解允许在制造细胞产物以转移到活的接受者中时使用来自死亡供体的经分馏血液。一种见解是如下所述，本发明的用于从死亡供体收集血液的装置和方法允许血液从身体快速取出，收集在一个或多个无菌接受器中，并冷藏到保存血液细胞活性的储存温度。如上所述，本发明还能够如上所述通过提供针对所关注细胞类型(如cd34⁺细胞和cd3⁺细胞)进行富集的方法使用来自死亡供体的经分馏血液。从死亡供体制备可用于制造治疗产物的经分馏血液的另一个进步是通过下文所述的用于确定经分馏产物作为此类产物的起始物质的效用来表征经分馏产物的能力。

分馏法的方法可以在已经补充了来自死亡供体的另外的组分的血液上执行。例如，如上所述，从骨髓或其它组织提取的细胞可以与血液结合，以针对混合物中细胞群的期望细胞类型富集。例如但不限于，富集的群体可以包含hspc、t细胞、t调节(treg)细胞、记忆t细胞、效应记忆t细胞、中枢记忆t细胞、干细胞样记忆t细胞、原初t细胞、细胞毒性t细胞、γδt细胞、b细胞、自然杀伤(nk)细胞、自然杀伤t(nkt)细胞、巨核细胞、成髓细胞、成单核细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、cd34⁺细胞、cd3⁺细胞或cd4⁺细胞。从骨髓或其它组织提取的细胞可能已经经受上述用于针对cd34⁺细胞和cd3⁺细胞进行富集的程序中的任何程序。如上所述，然后可以将补充的血液分成部分。

对来自死亡供体的血液进行分析

本发明还提供用于确定来自死亡供体的血液确定血液是否适合用于制造产物以施用到活的接受者的分析方法。这些方法可能涉及对血液本身的分析，或者可能涉及对来自死亡供体的其它组织的分析。分析方法可以与上述制备方法中的任何制备方法结合。

这些方法可用于确定血液中的物质是否适合用于制造用于转移到活的接受者的产物。优选地，来自血液的物质是细胞类型或细胞群。例如但不限于，细胞可以是b细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、造血细胞、造血干细胞和祖细胞(hspc)、淋巴细胞、淋巴祖细胞、巨噬细胞、肥大细胞、巨核细胞、单核细胞、成髓细胞、髓样祖细胞、自然杀伤(nk)细胞、嗜中性粒细胞、血小板/凝血细胞、t细胞、t调节(treg)细胞、记忆t细胞、效应记忆t细胞、中枢记忆t细胞、干细胞样记忆t细胞、原初t细胞、细胞毒性t细胞、γδt细胞、自然杀伤t细胞、cd34⁺细胞、cd4⁺细胞或cd3⁺细胞。分析方法可以与上述制备方法中的任何制备方法结合。可替代地或另外，来自血液的物质可以是非细胞组分，如分子。例如但不限于，该分子可以是细胞因子、趋化因子、抗体或免疫球蛋白。

分析来自死亡供体的t细胞的若干特性可用于确定t细胞是否会在移植接受者中促进混合嵌合。例如但不限于，对t细胞活化、无反应性、细胞凋亡、耗竭、增殖、活力和细胞因子分泌的分析提供了可以用于评估t细胞是否可以为活的接受者提供治疗益处的信息。

对来自死亡供体的t细胞或cd3⁺细胞的表征可以包含在血液中对细胞进行分析。可以使用任何合适的测定。例如但不限于，这些方法可以包含增殖测定、dna合成测定、细胞凋亡测定、集落形成测定、标志物表达测定等。对t细胞的分析方法在本领域中是已知的，并在例如以下中进行描述：brousseau等人,编辑,《免疫学方法手册(manualofimmunologicalmethods)》,crc出版社(crcpress),波卡拉顿(bocaraton),1998,isbn9780849385582；detrick等人,编辑,《分子与临床实验室免疫学手册(manualofmolecularandclinicallaboratoryimmunology)》,第八版,美国微生物学会出版社(americansocietyformicrobiologypress),美国华盛顿特区(washingtond.c.,usa),2016,isbn-13:978-1555818715；以及balakrishnan等人,《实用免疫学：实验室手册(practicalimmunology:alaboratorymanual)》,德国蓝博特学术出版(laplambertacademicpublishing),2017,isbn-13:978-3330352032，这些文献中的每个文献的内容通过引用并入本文。

对来自死亡供体的t细胞或cd3⁺细胞的表征可以包含对血液的非细胞组分进行分析。例如但不限于，该非细胞组分可以是细胞因子，例如促炎性或抗炎性细胞因子、趋化因子、抗体或免疫球蛋白。可以在来自死亡供体的血清或血浆中对非细胞组分进行分析。可以通过以下对非细胞组分进行分析：免疫测定(如酶联免疫测定(elisa))、放射免疫测定、免疫pcr以及赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific)(马萨诸塞州沃尔瑟姆(waltham,ma))以商品名luminexxmap出售的免疫测定系统；介观尺度诊断公司(mesoscalediagnostics)(马里兰州罗克维尔(rockville,md))以商品名介观尺度发现出售的免疫测定系统；珀金埃尔默(perkinelmer)(马萨诸塞州沃尔瑟姆)以商品名alphalisa和delfia出售的免疫测定系统；gyros蛋白质技术公司(gyrosproteintechnologies)(瑞典乌普萨拉(uppsala,sweden))以商品名gyrolab出售的免疫测定系统；以及milliporesigma(马萨诸塞州伯灵顿(burlington,ma))以商品名erenna出售的免疫测定系统。对非细胞组分的分析方法在本领域中是已知的，并在例如以下中进行描述：brousseau等人,编辑,《免疫学方法手册》,crc出版社,波卡拉顿,1998,isbn9780849385582；detrick等人,编辑,《分子与临床实验室免疫学手册》,第八版,美国微生物学会出版社,美国华盛顿特区,2016,isbn-13:978-1555818715；以及balakrishnan等人,《实用免疫学：实验室手册》,德国蓝博特学术出版,2017,isbn-13:978-3330352032，这些文献中的每个文献的内容通过引用并入本文。

这些方法可以包含分析来自死亡供体的血液中的hspc或cd34⁺细胞是否适合用于制造产物以转移到活的接受者中。可以分析如hspc增殖、hspc活力和hspc细胞凋亡等特性，以确定血液中的hspc是否可以为活的接受者提供治疗益处，这些特性可以用于评估hspc是否可以为活的接受者提供治疗益处。例如但不限于，分析可以包含响应于外源生长因子而测量细胞生长的集落形成测定或长期培养测定。分析可以包含对hspc在小鼠模型(如重症综合性免疫缺陷(scid)小鼠)中的自身再增殖能力的测定。这些和其它方法在本领域中是已知的并在例如以下中进行描述：loring和peterson,编辑,《人干细胞手册：实验室指南(humanstemcellmanual:alaboratoryguide)》,第二版,学术出版社(academicpress),2012,isbn:978-0-12-385473-5；stein等人,编辑,《人干细胞技术和生物学：研究指南和实验室手册(humanstemcelltechnologyandbiology:aresearchguideandlaboratorymanual)》,威利-布莱克威尔(wiley-blackwell),2011,isbn978-0-470-59545-9；frisch和calvi,“造血干细胞培养和测定(hematopoieticstemcellculturesandassays)”,《分子生物学方法(methodsmolbiol.)》2014；1130:315-324,doi:10.1007/978-1-62703-989-5_24；dickje等人,“通过nod/scid小鼠的再增殖来测定人干细胞(assayofhumanstemcellsbyrepopulationofnod/scidmice)”,《干细胞(stemcells)》,1997；增刊151:199-203；讨论204-7,doi:10.1002/stem.5530150826；以及ttatekawa等人,(2006)“使用nod/scid小鼠对人造血干细胞进行新颖直接竞争性再增殖测定(anoveldirectcompetitiverepopulationassayforhumanhematopoieticstemcellsusingnod/scidmice)”,《细胞疗法(cytotherapy)》,8:4,390-398,doi:10.1080/14653240600847191，这些文献中的每个文献的内容通过引用并入本文。

该测定可以包含提供来自死亡供体的血液或非血液组织的特性的报告。例如但不限于，该报告可以包含具有以下特性中的任何特性的细胞百分比：标志物表达、活力、增殖潜力、细胞凋亡特性、无反应性、耗竭、活化和细胞因子分泌。该报告可以描述细胞亚群的特性。例如但不限于，该报告可以包含表达特定标志物(如cd34⁺细胞或cd3⁺细胞)的细胞的以下百分比：活力、增殖潜力、细胞凋亡特性、无反应性、耗竭、活化或细胞因子分泌。

确定血液中的物质是否适合用于制造产物以转移到活的接受者中可以包含分析来自死亡供体的非血液组织。例如但不限于，非血液组织可以是骨髓、脾、肝、淋巴结或胸腺。可以分析非血液组织的细胞组分，例如造血细胞(如上述那些造血细胞)，或非细胞组分，如上述分子。可以使用任何分析方法，包含上述那些分析方法。

身体中的造血细胞的含量和位置在生长和发育期间会发生变化。例如，脾是成人淋巴细胞的丰富来源，而在发育中的胎儿中，肝含有许多淋巴细胞。因此，造血细胞的组织来源可以解释在供体死亡时的年龄。

这些方法可以包含对多种组分进行分析。这些多种组分可能来自同一来源，或者可能来自不同来源。例如，这些方法可以包含分析血液的多种细胞组分、血液的多种非细胞组分、非血液组织的多种组分或血液细胞组分、非细胞血液组分和非血液组织组分的任何组合。

为了更好地确定来自死亡供体的血液的组分是否适合用于制造产物以转移到活的接受者，分析可以包含将来自死亡供体的组织或流体的一个或多个参数与来自活的供体的对应物质进行比较。分析可以包含上述任何特性的比较。例如但不限于，分析可以包含对t细胞活化、t细胞无反应性、t细胞凋亡、t细胞耗竭、t细胞增殖、t细胞活力、t细胞细胞因子分泌、hspc增殖、hspc活力、hspc细胞凋亡、细胞因子水平、趋化因子水平、抗体水平和免疫球蛋白水平中的一种或多种进行比较。

确定来自死亡供体的血液或血液组分是否适合用于制造产物以转移到活的接受者可以依赖于对死亡供体与活的供体之间的一个或多个参数进行的比较。例如，当来自死亡供体的一个或多个参数的值与来自活的供体或活的供体群的对应值相当时，来自死亡供体的血液或血液组分可以被视为适合用于制造产物以转移到活的接受者。比较分析可以包含在脑死亡后的不同时间阶段为活的供体和供体建立特性谱式。可以比较死亡供体与满足一个或多个标准的活的供体或活的供体群之间的数值。例如，活的供体或活的供体群可能已经完成了以下：先前捐赠的实体器官；先前捐赠的造血细胞，如hspc或t细胞；或先前捐赠的支持在接受者中建立混合嵌合的组织。活的供体或活的供体群可以是健康的，在特定年龄范围内具有特定性别等。

这些方法可以包含在制造产物以转移到活的接受者时使用来自死亡供体的血液的一种或物质。这些物质可以是上述任何物质，如细胞组分或非细胞组分。

这些方法可以包含扩增细胞类型或细胞群，以用于制造产物以转移到活的接受者。例如，细胞可以是b细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、造血细胞、造血干细胞和祖细胞(hspc)、淋巴细胞、淋巴祖细胞、巨噬细胞、肥大细胞、巨核细胞、单核细胞、成髓细胞、髓样祖细胞、自然杀伤(nk)细胞、嗜中性粒细胞、血小板/凝血细胞、t细胞、t调节(treg)细胞、记忆t细胞、效应记忆t细胞、中枢记忆t细胞、干细胞样记忆t细胞、原初t细胞、细胞毒性t细胞、γδt细胞、自然杀伤t细胞、cd34⁺细胞、cd4⁺细胞或cd3⁺细胞。

这些方法可以包含处理来自死亡供体的血液以减轻对可以用于制造产物以转移到活的接受者中的血液中的物质的损伤。例如，这些方法可以包含向血液添加抗凝血剂、缓冲液、低温保护剂或稳定剂。稳定剂可以防止血液组分的降解或者可以促进渗透稳定性。例如，稳定剂可以是人血清白蛋白(hsa)或百特国际公司(baxterinternationalinc.)(伊利诺伊州迪尔菲尔德(deerfield,il))以商品名plasma-lyte出售的电解质溶液。

这些方法可以包含低温保存产物。这些产物可以在适合用于长期储存的温度(如约-150℃)下冷冻。这些方法可以包含逐渐将产物的温度降低到长期储存温度。

用于从死亡供体收集血液的装置和方法

本发明还提供用于从死亡供体收集血液以用于制造产物以转移到活的接受者的装置和方法品。血液必须迅速处理，以用作用于转移到活的接受者中的物质来源。具体地，在脑死亡后，优选地在释放可以改变血细胞功能的细胞因子之前的数小时内必须从身体快速地取出该物质来源。另外，在从身体中取出时，必须将血液迅速冷却到合适的短期储存温度，通常为2-8℃，但应避免冷冻，直到血液或血液产物准备好用于低温保存。考虑到成年人的总血量可能为5升或更多，并且需要最大限度的恢复来获得足够量的cd34⁺细胞和cd3⁺细胞，从死亡供体收集血液呈现独特的挑战。

图3示出了根据本发明的实施例的血液收集装置301。装置301包含耦接到冷却系统的一个或多个接受器303a和303b。接受器的组合容量可以为约0.5升、1升、2升、3升、4升、5升、6升、7升、8升、9升或10升，并且优选地约5到约10升。这些装置可以具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多接受器。接受器可以是刚性的并且具有固定形状，或者这些接受器可以是柔性的且可扩展的。例如但不限于，接受器可以是杯子、瓶子、圆柱体、袋子、小袋等。接受器可以由柔性或易弯塑料制成。在一个实施例中，每个接受器是25cmx20cmx2cm的容量为1升的矩形棱柱。

装置301可以包含可以插入到死亡供体的静脉或动脉中的一根或多根套管305。套管可以通过连接器307a(如管道)连接到一个或多个接受器303a和303b。在具有多个接受器303a和303b的装置301中，可以并行地、顺序地或以其某种组合将血液收集到接受器303a和303b中。在具有按顺序布置的接受器的装置中，接受器303a和303b可以通过连接器307b连接。连接器307a和307b中的一个或多个可以包含单向阀，以阻止血液反向流动从穿过装置301，由此最小化血液污染并保持其无菌性。

图4示出了根据本发明的实施例的血液收集装置401。该装置包含安置在制冷室409内的接受器403a、403b、403c和403d。制冷室409包含在血液从供体取出后冷却血液的冷却剂411。可以使用任何合适的冷却剂411。例如但不限于，冷却剂411可以包含氯化铵、硝酸铵、盐水、硝酸铵钙、二甘醇、羟乙基纤维素、冰、丙二醇硅胶、聚丙烯酸钠、尿素或水。

冷却系统被配置成在接受器中将血液冷却到目标温度。目标温度可以为约2℃到约8℃。冷却系统可以阻止血液冻结或在血液中形成冰晶。冷却系统可以在规定期间内将血液冷却到目标温度。例如，冷却系统可以在约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、不少于4小时、不少于5小时、不少于6小时、不少于7小时、不少于8小时、不超过6小时、不超过7小时、不超过8小时、不超过9小时或不超过10小时内将血液冷却到目标温度。

该装置可以包含被配置成施加真空以从死亡供体取出血液的真空系统。该真空系统可以是泵。用于血液收集的真空泵是本领域已知的并且在例如以下中进行描述：美国专利公开第2010/0042015号；和美国专利公开第2008/0199949号，这些文献中的每个文献的内容通过引用并入本文。真空系统可以耦接到针、管道和接受器中的一个或多个。

本发明提供了用于使用本发明的装置从死亡供体取出血液的方法。这些方法可以包含将血液转移到耦接到冷却系统的一个或多个接受器。这些方法可以包含将针插入死亡供体的血管、动脉或静脉中。这些方法可以包含向死亡供体的血管、动脉或静脉施加真空。这些方法可以包含使血液与稳定剂或低温保护剂(如上述稳定剂低温保护剂)接触。

使用源自死亡供体的细胞产物处理器官移植接受者

本发明的细胞产物可以提供到实体器官移植的接受者。可以通过任何合适的方式提供细胞产物。例如但不限于，可以使用针、导管、中心线等通过注射来将cd34⁺细胞和/或cd3⁺细胞递送到接受者。在一些情况下，细胞可以通过血管内、静脉内、动脉内、皮下、肌内直接递送到骨头，或通过任何允许造血细胞在接受者中归巢到适当位点的来源递送到骨头，使得造血细胞在接受者中持续、再生并分化。可以通过输注来提供cd34⁺细胞和/或cd3⁺细胞。可以在住院程序或门诊程序中提供cd34⁺细胞和/或cd3⁺细胞。住院程序需要入住医院，并且患者可能会在医院住一个或多个夜晚。门诊程序不需要入住医院，并且可以在非医院环境下执行，该非医院环境如诊所、医生办公室、家庭或其它场所。

本发明的组合物可以与任何实体器官的移植结合使用。例如但不限于，实体器官可以是肾、肺、胰、胰岛细胞、心脏、肠、结肠、肝、皮肤、肌肉、牙龈、眼睛或牙齿。移植物可以包含完整的器官、器官的部分或来自器官组织的细胞。细胞产物可以在实体器官移植之前、期间或之后提供。例如但不限于，细胞产物可以在实体器官移植之前的一天、二天、三天、四天、五天或六天或一周、二周、三周或四周提供，或者可以在实体器官移植之后的一天、二天、三天、四天、五天或六天或一周、二周、三周或四周提供。

为了促进在接受者中建立混合嵌合，可以结合提供细胞产物来调节接受者的免疫系统。例如，可以使用非清髓性调节。在非清髓性调节中，接受者以过低而不能根除所有骨髓细胞的剂量暴露于药物、抗体、辐射或其组合。通常，调节方案包含用抗胸腺细胞球蛋白(atg)、全淋巴辐照和皮质类固醇(例如，泼尼松(prednisone))处理，持续约10到12天的期间(例如持续11天)。辐射可以靶向接受者身体的特定位置。例如，辐射可以靶向身体的组织、器官、区域或整个身体。辐射可以靶向淋巴结、脾或胸腺或本领域的技术人员已知的任何其他区域。当施用多个剂量的辐射时，这些剂量可以靶向相同位置或不同位置。非清髓性调节可以包含使用t细胞耗竭剂，如单克隆抗体或药物，例如氟达拉滨(fludarabine)。用于非清髓性调节的方案在本领域中是已知的，并且在例如美国专利第9,561,253号中进行描述，该专利的内容通过引用并入本文。

这些方法可以包含免疫抑制疗法。免疫抑制疗法或免疫抑制涉及用减少宿主免疫系统对供体细胞反应的药剂处理移植物接受者，这可能导致移植物排斥。主要的免疫抑制剂包含钙调神经磷酸酶抑制剂，如他克莫司(tacrolimus)、环孢菌素a。佐剂通过与钙调神经磷酸酶抑制剂结合。佐剂包含类固醇、硫唑嘌呤、霉酚酸(mpa)药剂，如霉酚酸酯、mtor抑制剂，如西罗莫司(sirolimus)以及贝拉西普(belatacept)。佐剂的使用使临床医生能够实现足够的免疫抑制，同时降低单独药剂的剂量和毒性。基于抗体的疗法可以使用单克隆抗体(例如，莫罗单抗-cd3(muromonab-cd3))或多克隆抗体或抗cd25抗体(例如，巴利昔单抗(basiliximab)、达利珠单抗(daclizumab))。基于抗体的疗法允许避免或减少钙调神经磷酸酶抑制剂的剂量，从而可能降低肾毒性的风险。用于免疫抑制疗法的方案在本领域中是已知的，并且在例如美国专利第9,561,253号中进行描述，该专利的内容通过引用并入本文。

免疫抑制也可能降低供体免疫细胞对接受者组织的反应，从而导致gvhd。gvhd可能是急性的或慢性的。急性gvhd通常发生在移植后的前3个月，并且可能涉及皮肤、肠或肝。急性gvhd的处理通常包含大剂量皮质类固醇，如泼尼松。慢性gvhd通常发生在移植后的前3个月之后，并且是晚期治疗相关并发症的主要来源。慢性gvhd可能导致功能性残疾，并且需要长期免疫抑制疗法。

免疫抑制疗法可能以多个阶段进行。例如，免疫抑制方案可能具有诱导期和维持期。诱导期策略和维持期策略可以使用以被调节成实现目标治疗水平的剂量的不同药物，以增强在接受者中建立混合嵌合。

可以在接受者中建立稳定的混合嵌合之后取消免疫抑制疗法。接受者的嵌合状态可以如下文所述进行监测并在某一时期(例如，3个月、6个月、12个月、18个月、24个月或更长时间)之后被视为稳定的。因此，可以在某一时期(例如，3个月、6个月、12个月、18个月、24个月或更长时间)之后对接受者停止免疫抑制。取消免疫抑制疗法可以包含逐渐缩小，也就是说，逐渐减少处理的剂量或频率。

可以通过分析来自如本领域已知的实体器官移植接受者的造血细胞样品(例如外周血、骨髓等)来确定个体是完全嵌合、混合嵌合或非混合嵌合。可以通过任何常规的分型方法进行分析。可以对造血细胞或其子集(如所有单核细胞、t细胞、b细胞、cd56⁺nk细胞和cd15⁺中性粒细胞)执行分析。嵌合可以通过对微卫星进行pcr分析来评估。例如，区分供体和宿主来源的短末端重复长度的多态性的商业试剂盒是可用的。自动化读取器基于来自人工供体和宿主细胞混合物的标准曲线来提供供体类型细胞的百分比。

可以基于源自供体的细胞的部分来将接受者分类为完全嵌合、混合嵌合或非混合嵌合。例如，如果接受者具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的供体源性细胞，则这些接受者可以被视为完全嵌合。如果接受者的供体源性细胞过少而无法归类为完全嵌合，但供体源性细胞的部分超过一定阈值，如至少0.5％、至少1％、至少2％、至少3％、至少5％、至少7.5％、至少10％的供体源性细胞，则接受者可以被视为混合嵌合。如果供体源性细胞的部分低于归类为混合嵌合所需的阈值，则接受者可以被视为非嵌合。

源自单个死亡供体的用于转移到多个活的接受者的细胞产物

本发明还提供源自单个死亡供体的多种细胞产物以转移到多个活的接受者。由单个供体产生含有cd34⁺细胞和cd3⁺细胞的多种细胞产物允许将产物转移到不同的接受者。因此，可以将来自死亡供体的两个或更多个实体器官移植到不同的接受者中，并且每个接受者还可以接受促进建立混合嵌合的供体cd34⁺细胞和cd3⁺细胞。例如，本发明的产物和方法允许单个死亡供体向两个接受者中的每个接受者提供肾和含有cd34⁺细胞和cd3⁺细胞的产物。因此，本发明的产物和方法增加了可以从器官移植程序中受益，而不需要另外的器官供体的患者数量。

单个死亡供体可以是在实体器官移植接受者中促进混合嵌合的1种、2种、3种、4种、5种或更多细胞产物的物质来源。来自单个死亡供体的多种细胞产物可以包括上述细胞产物的任何元素，如细胞类型、细胞数量、hla匹配或不匹配程度、细胞纯度、低温保护剂、稳定剂或移植物增强剂。

本发明还提供了从单个死亡供体制备多种细胞产物以转移到多个活的接受者的方法。这些方法包含从死亡供体的骨髓获得cd34+细胞以及从供体的非骨髓获得cd3⁺细胞。这些方法可以包含上述与制备细胞产物、从非骨髓离体提取cd3⁺细胞、对血液进行分馏或对血液进行分析有关地描述的任何元素。例如但不限于，这些方法可以包含以下中的一个或多个：取出骨髓、从骨头碎片分离细胞、用动员cd34⁺细胞的药剂处理、从去核或多核细胞分离单核细胞、耗尽rbc和血小板、富集cd34⁺细胞和/或cd3⁺细胞、去除凝块和/或细胞团块、用抗凝血剂处理、低温保存、细胞离体扩增、细胞的遗传修饰和分析t细胞活化、t细胞无反应性、t细胞凋亡、t细胞耗竭、t细胞增殖、t细胞活力、t细胞细胞因子分泌、hspc增殖、hspc活力、hspc细胞凋亡、细胞因子水平、趋化因子水平、抗体水平和/或免疫球蛋白水平。

实例

实例1

下文描述了根据本发明的一个实施例制备细胞组合物的方法，该细胞组合物含有源自死亡供体的骨髓的cd34⁺细胞和源自死亡供体的血液的cd3⁺细胞。

图1是展示了根据本发明的一个实施例制备细胞组合物的方法的流程图，该细胞组合物含有源自死亡供体的骨髓的cd34⁺细胞和源自死亡供体的血液的cd3⁺细胞。该方法包含在下文更详细地描述的一系列步骤。该方法包含以下步骤：收集组织；制备骨髓；制备血液；制备缓冲液；从骨髓富集cd34⁺细胞；将组合的物质分为单独的剂量；以及低温保存。本文描述的步骤顺序仅是为了说明的目的。尽管本领域的技术人员将理解，某些步骤必须在其它步骤之前执行，但是这些方法不限于特定步骤顺序。

图6是来自图5中流程图的组织收集步骤的扩展图。从死亡供体的身体收获血液、骨髓和一个或多个所关注实体器官。如上所述，通过环钻术提取骨髓。如上所述，将血液收集到本发明的装置的一个或多个接受器中。对来自身体的血液或其它物质进行感染性疾病标志物(idm)测试。

图7是来自图5中流程图的骨髓制备步骤的扩展图。将提取的骨髓通过筛子取出骨头碎片，并通过上述方法之一耗尽红细胞。还分析骨髓的细胞数量、无菌性、活力、集落形成能力以及cd3、cd34和cd45标志物的表达。通过排除7-氨基放线菌素d(7-aad)来测定活力，并且通过流式细胞术来分析标志物表达。

图8是来自图5中流程图的血液制备步骤的步骤的扩展图。通过上述方法之一，使血液耗尽红细胞和血小板。还分析了血液的细胞数量、无菌性、活力以及cd3、cd34和cd45标志物的表达。通过排除7-aad来测定活力，并且通过流式细胞术来分析标志物表达。

图9是来自图5中流程图的缓冲液制备步骤的扩展图。制备两种缓冲液，一种含有hsa，并且另一种含有平衡电解质溶液。

图10是来自图5中流程图的cd34⁺细胞富集步骤的扩展图。缓冲液与从骨髓制备步骤获得的细胞一起使用，以通过纺纱膜过滤来针对cd34⁺细胞进行富集。通过免疫磁性选择进一步针对cd34⁺细胞对样品进行富集。在纺纱膜过滤之前或之后，如上所述分析细胞数量、活力、集落形成能力和标志物表达。如上所述，分析来自血液制备步骤的细胞的细胞数量、活力、标志物表达、t细胞活化、t细胞增殖和t细胞凋亡。如果确定针对cd34⁺细胞富集的骨髓源性细胞和含有cd3⁺细胞的血液源性细胞两者均适合用于细胞产物，则将两个细胞部分组合。

图11是来自图5中流程图的划分步骤的扩展图。过滤合并的细胞以去除凝块和细胞团块，也就是说，凝集。然后将合并的细胞分成两个单独的剂量，这些剂量中的每个剂量含有的cd34⁺细胞和cd3⁺细胞的量足以在单独的器官移植接受者中促进混合嵌合。在此步骤期间，如上所述，分析细胞数量、活力和标志物表达。还可以分析细胞的无菌性、内毒素、支原体、集落形成能力、细胞因子(例如，il-2)的释放。

图12是来自图5中流程图的低温保存步骤的扩展图。可以进一步将剂量分成等分试样，或者可以保持在单个容器中。通过以受控的速率将细胞产物的温度降低到目标温度的冷冻机来使剂量冷冻。在细胞产物已经达到目标温度后，将细胞产物转移到液氮中以用于长期储存。

实例2

用于制备含有cd34⁺细胞和cd3⁺细胞的细胞产物mdr-104的示例性方法在下文中描述。该方法提供了两个剂量，这些剂量中的每个剂量含有来自单个死亡供体的每kg接受者重量100x10⁶t个细胞以及每kg接受者重量>4x10⁶个cd34⁺细胞。每个剂量支持将来自死亡供体的一个肾移植到不同的接受者。该产物还包含每10⁵个细胞>500个集落形成单位(cfu)。该产物可以进一步被表征为确定il-2释放以及活性cd34⁺细胞和cd3⁺细胞的百分比。

图13是展示了根据本发明的实施例的制备细胞组合物的方法的流程图。如下文更详细描述的，cd3⁺细胞在mdr-t处理中由全血制备，cd34⁺在mdr-e处理中由骨髓制备，并且在mdr-34t处理中组合经过制备的cd3⁺细胞和hspc。

收集全血(wb)和骨髓(bm)作为起始物质，以在最终药物产品的细胞组合物中分别供应必需的cd3⁺t细胞和cd34⁺hspc。在死亡供体的全身肝素化之后，将抽血的血液收集到单个收集装置或若干较小的收集装置中，以允许从收集位点传输到制造位点。随后，使用用于血小板和红细胞耗尽的单采仪器处理全血，然后在添加cd34⁺选择的过程中中间体之前或之后，清洗全血以进行另外的血小板去除。

骨髓是通过两种方法中的一种或两种来收获的。一种方法采用从死亡供体的暴露髂嵴的标准骨髓抽吸。在第二种方法中，通过环钻矫形装置恢复髓，该环钻矫形装置能够收获含有bm的皮质骨和松质骨的核心。还可以从死亡供体的椎体恢复骨髓。将通过两种方法中的每种方法收获的骨髓放置在适当的装运容器中，以支持将恢复的bm运输到制造位点。

将分离的cd34⁺hspc与白细胞单采的血液产物结合，并根据需要进行分离以满足死亡供体肾的每个接受者的剂量要求。每个剂量都被调配并低温保存作为单独的最终药物产品批次。

将从死亡供体收集的全血用于为死亡供体肾的每个接受者供应所需剂量的cd3⁺t细胞。从收获的骨髓分离cd34⁺hpsc，以为供体肾的每个接受者供应所需剂量的cd34⁺细胞。

从抽血的死亡供体收集全血。抽血发生在全身肝素化之后并与防腐液的冷冲洗结合出现。抽血的全血经来自动脉和静脉供应两个方面的两根套管从死亡供体流出并且通过无菌连接件连接到收集装置以运输到制造位点。

通过两种单独的方法中的一种或两种来收集死亡供体骨髓：通过矫形装置，即环钻进行标准骨髓抽吸和骨髓恢复。使用肝素化注射器和jamshedie针通过重复抽吸来执行骨髓抽吸。环钻装置允许取出含有松质骨头碎片的骨髓核心。

抽血的血液需要以最小程度的血凝、红细胞裂解和细胞凝集并且以用于促进红细胞和血小板耗尽的下游处理的高白细胞活力到达制造位点。将全血收集在允许血液保持处于受控温度的装置中并在稳定的无菌运输容器中装运。收集装置还与封闭系统生物处理兼容。

通过标准抽吸实践或环钻术收集的骨髓需要以最小程度的血凝、红细胞裂解和细胞凝集并且以用于促进红细胞、血小板耗尽和cd34⁺hspc分离的下游处理的高白细胞活力到达制造位点。总cd34⁺产量和恢复率作为外推指标进行跟踪。对每种方法计算收获的骨髓总容积，并对每个死亡供体进行外推。

来自死亡供体的收获的骨髓在用作用于cd34⁺hpsc分离的起始物质之前经过下游处理。可以采用若干种方法和/或技术来建立用于由松质骨头碎片以及红细胞耗尽分离造血髓的最佳方法以获得骨髓单核细胞(bmmnc)。

在收获骨髓之前，取出死亡供体血液。

用缓冲液稀释通过针抽吸收集的传入骨髓，并用适当的过滤装置过滤以取出骨头碎片。以下方法中的一种或多种可以用于获得单核细胞(mnc)的最大恢复率：基于大小的离心分离、羟乙基淀粉沉降、免疫磁性耗尽或裂解，随后是纺纱膜过滤清洗步骤或浮力活化的细胞分离。

通过物理搅拌、酶解聚或清洗和过滤中的一个或多个来处理使用环钻获得的传入骨髓核心，以恢复嵌入在松质骨核心内部的造血髓室。

使用靶细胞群(包含但不限于cd45、cd34和cd3)的细胞表面上的特异性抗原通过流式细胞分析来分析传入骨髓的全血细胞计数、无菌性和白细胞活力。来自流式细胞术分析的数据用于确定cd34⁺活力、cd34⁺hspc频率和cd34⁺细胞计数的定量作为来自死亡供体的参考值。

在调配和低温保存之前，通过单采将从死亡供体收集的抽血的血液处理成适当的起始物质。

收纳在制造设施中的传入全血被处理成针对外周血单核细胞富集以实现用于mdr-104制造过程的适当的起始物质。传入全血起始物质首先经过单采以减少体积并获得相当的白细胞去除术过程中物质。根据需要对全血产物进行过滤，以从传入物质以及所得白细胞去除术去除凝块和细胞团块。所得白细胞去除术过程中物质用于为死亡供体的肾的每个接受者调配cd3⁺t细胞。

使用靶细胞群(包含但不限于cd45、cd34和cd3)的细胞表面上的特异性抗原通过流式细胞分析来分析传入全血的全血细胞计数、无菌性和白细胞活力。在单采之前和之后计算满足t细胞剂量预期和t细胞恢复率的可能性。

红细胞耗尽的过程中物质用于cd34⁺hspc的免疫性选择。首先，耗尽血小板，然后rbc和血小板减少的物质进行cd34免疫性选择。

使用纺纱膜过滤使从骨髓制备子过程获得的红细胞耗尽的过程中物质进一步耗尽血小板。接下来，用cd34-捕获试剂孵育rbc和血小板减少的样品，使用纺纱膜过滤清洗以出去未结合的珠并加载到免疫磁性柱系统上，以用于免疫性选择cd34⁺hspc。

使用靶细胞群(包含但不限于cd45、cd34和cd3)的细胞表面上的特异性抗原通过流式细胞分析来分析传入骨髓的全血细胞计数、无菌性和白细胞活力。在免疫性选择之前和之后计算满足cd34⁺细胞剂量预期和cd34⁺恢复率的可能性。

mdr-104是组合的产品剂量调配物，其中cd34⁺hspc与所需的t细胞数量结合，以满足cd3⁺剂量要求。首先，将mdr-e子过程分成两个单独的袋，其中cd34⁺细胞的数量足以满足对于每个死亡供体肾接受者每kg>4x10⁶个cd34⁺细胞的最低剂量要求。然后将在全血制备子过程中定量的cd3⁺t细胞添加到每个mdr-e预调配袋中，以满足所需的每kg100x10⁶个cd3t细胞的cd3⁺t细胞剂量。

mdr-t34表示将源自cd34⁺免疫性选择的mdr-e与源自全血制备操作单元的所得白细胞去除术的必需t细胞量结合的子过程步骤。

基于每kg>4x10⁶个活性cd34⁺细胞的要求患者剂量，针对活性cd34⁺hspc定量mdr-e过程中间体，并且然后将该过程中间体分成预调配袋。基于每个相应的患者的t细胞剂量要求，从白细胞去除术过程中间体定量活性cd3t细胞，并向mdr-e预调配袋中的每个预调配袋添加每kg活性cd3t细胞100x10⁶个细胞。然后，每种预调配的中间体经历另外的纺纱膜过滤步骤以进一步减少降低血小板浓度。

在纺纱膜过滤之前和之后监测血小板负荷和血小板减少的效率。还在纺纱膜过滤之前和之后监测cd34⁺hspc和cd3⁺t细胞丢失。使用全细胞计数和定量流式细胞术用于监测靶细胞群的频率和活力。必要时采用功能测定，以确保将具有预期功能特性的足够的t细胞和cd34⁺hspc维持在剂量要求下。

以1:2的比率将所得预调配的过程中间体与cryostor10(cs10)结合以产生原料药并恰好在低温保存之前分装到3-4个最终药物产品容器中。将预先调配的mdr-e和t细胞与低温保护剂结合，以产生最终产物。

在收集容器中将每个接受者的预调配mdr-t34处理中间体与等体积的cs10结合。接下来，将每种产物跨最终产物容器(每个容器的总容积为50ml)进行划分。在容器封闭和低温保存之前，根据需要对过滤的需求进行评估。在两种mdr-104产物完成并容器封闭之后，使用控制速率冷冻机使最终药物产品进行受控低温保存，并且转移到气相液体n2以用于在≤-150℃下长期储存。

通过引用并入

贯穿本公开已经参考和引用了其它文献，如专利、专利申请、专利出版物、杂志、书籍、论文、网络内容。所有此类文献特此出于所有目的通过引用以其整体并入本文。

等效物

对于本领域的技术人员而言，根据本文档的全部内容(包含对本文所引用的科学文献和专利文献的参考)，对本发明的各种修改以及本发明的除了在本文中示出且描述的实施例之外的许多另外实施例将变得显而易见。本文的主题包含重要信息、例证以及指导，它们可以适合于在本发明的不同的实施例及其等效物中实践本发明。