恢复人类快乐木偶综合征中父系UBE3A基因表达的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年9月21日提交的美国临时专利申请第62/734,435号的优先权，该美国临时专利申请的全部内容通过引用完全并入本文。

本公开内容涉及使用短发夹rna、核酶和/或微rna来激活人类快乐木偶综合征(angelmansyndrome)神经元中的ube3a的父系遗传等位基因表达的组合物和方法。

发明背景

快乐木偶综合征(as)是一种影响～1/15,000名个体的神经发育病症。患有as的个体有发育迟缓、严重的认知损害、共济失调步态、频繁癫痫发作(frequentseizures)、短注意力时长(shortattentionspan)、言语缺失(absentspeech)和特征性快乐举止(characteristichappydemeanor)。从来自as患者的诱导多能干细胞(ipsc)衍生的神经元表现出去极化的静息膜电位、延迟的动作电位发展和自发突触活动减少。as影响相对大的患者群体；已经建立了一个>3,000名患者的联系登记，并且每年有～250例新的as诊断。患有as的个体需要终身护理。

as由ube3a的母系拷贝功能丧失引起，ube3a是一种编码e3泛素连接酶的基因。这种功能丧失突变可以由母系等位基因中的任何类型的基因突变引起。ube3a排他地由神经元中的母系等位基因表达。所有患有as的个体都有正常的父系ube3a等位基因，该等位基因被一种称为ube3a反义转录物(ube3a-ats)的长的非编码rna进行表观遗传学上的沉默。在as小鼠模型中，父系等位基因的再激活显示出恢复ube3a蛋白表达并减轻行为缺陷。人类中ube3a表达的恢复有望改善疾病，特别是如果在婴儿中恢复有望改善疾病。

不存在用于快乐木偶综合征的治愈方法(cure)，然而，制药公司和学术实验室正在寻求两种方法来治愈这种病症。第一种是利用反义寡核苷酸(aso)切割ube3a-ats并激活父系ube3a。第二种方法是aav介导的基因疗法，以将ube3a基因导回至患者。上文提及的aso不能跨越血脑屏障，并且需要终生反复注射到脊髓中。将ube3a基因导回神经元的基因疗法缺乏调节ube3amrna和蛋白质水平的能力，并且需要从总计三种蛋白质同种型中选择单种蛋白质同种型，其中个体同种型的功能仍然不确定。这可能导致ube3a的过表达，这也可能导致另一种相关的病症dup15q综合征，以及导致重要的蛋白质同种型不存在。

发明简要概述

本发明提供了一种通过基因疗法治疗as的新方法，该方法通过抑制父系ube3a的沉默并使父系ube3a从其天然调节元件表达。神经元中的ube3a表达增加可以改善ube3a-ats对上文列出的神经元的影响。所有三种蛋白质同种型可以使用通常控制其水平的内源性调节元件来表达。因此，由于使用了天然调节元件，防止了过表达。这种方法可以通过单一治疗改善as症状，并从而避免aso所需的反复脊髓注射。

在一方面，本发明提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码短发夹rna(shrna)、核酶或微rna的第一核苷酸序列，其中shrna、核酶或微rna能够抑制父系ube3a的沉默。

在另一方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包含具有编码shrna、核酶或微rna的第一核苷酸序列的多核苷酸和启动子，其中shrna、核酶或微rna能够抑制父系ube3a的沉默。

在另一方面，本发明提供了一种病毒颗粒，所述病毒颗粒包含具有编码shrna、核酶或微rna的第一核苷酸序列的多核苷酸，其中shrna、核酶或微rna能够抑制父系ube3a的沉默。

在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含具有编码shrna、核酶或微rna的第一核苷酸序列的多核苷酸或包含该多核苷酸的病毒颗粒以及药学上可接受的载体，其中shrna、核酶或微rna能够抑制父系ube3a的沉默。

在另一方面，本发明提供了一种治疗快乐木偶综合征的方法，所述方法包括向有相应需要的患者施用治疗有效量的病毒颗粒或其药物组合物，该病毒颗粒包含具有编码shrna、核酶或微rna的第一核苷酸序列的多核苷酸，其中shrna、核酶或微rna能够抑制父系ube3a的沉默。

在另一方面，本发明提供了一种激活或增加父系ube3a基因表达的方法，所述方法包括向有相应需要的患者施用治疗有效量的病毒颗粒或其药物组合物，该病毒颗粒包含具有编码shrna、核酶或微rna的第一核苷酸序列的多核苷酸，其中shrna、核酶或微rna能够抑制父系ube3a的沉默。

在另一方面，本发明提供了一种抑制由seqidno:1编码的rna反义转录物引起的父系ube3a基因沉默的方法，所述方法包括向有相应需要的患者施用治疗有效量的病毒颗粒或其药物组合物，该病毒颗粒包含具有编码短发夹rna(shrna)、核酶或微rna的第一核苷酸序列的多核苷酸，其中shrna、核酶或微rna能够抑制父系ube3a的沉默。

在另一方面，本发明提供了由本文描述的多核苷酸编码并能够抑制父系ube3a沉默的shrna、核酶或微rna。

附图简述

图1示出了快乐木偶综合征中的染色体突变。

图2示出了父系ube3a基因的图示。

图3a示出了锤头状核酶在体外切割ube3a-ats。锤头状核酶和ube3a-atsdna使用pcr进行体外转录。所得的核酶和ube3a-atsrna在体外孵育(无细胞和无载体)，并且切割在琼脂糖凝胶上可视化。

图3b示出了锤头状核酶切割人类asipsc衍生的神经元中的ube3a-ats。

图4示出了shrna敲低ube3a-ats并激活父系ube3a。在用慢病毒转导以表达靶向ube3a-ats的shrna的asipsc衍生的神经元中进行rt-qpcr。三种shrna中的一种敲低了两种ube3a-ats并激活了父系ube3a。

图5示出了用携带551shrna2的aav9颗粒转导的as神经元。aav载体还携带egfp，允许神经元在转导后发出绿色荧光。这些神经元用1x10⁵个病毒基因组/细胞转导。

图6示出了pav-u6-gfp的质粒图谱，aav载体551用于克隆shrna2。

发明详述

ube3a

ube3a是一种编码e3泛素连接酶的基因。ube3a在负链上的基因组坐标是hg19chr15:25,582,381-25,684,175。ube3a有三种正常同种型：同种型1(登录号x98032)；同种型2(登录号x98031)；和同种型3(登录号x98033)。在神经元中，ube3a排他地由母系等位基因表达。父系ube3a等位基因被一种长的非编码rna进行表观遗传学上的沉默，该非编码rna被称为ube3a反义转录物(ube3a-ats)，由seqidno:1编码。ube3a-ats在正链上的基因组坐标是hg19chr15:25,223,730-25,664,609。以下基因组坐标特别值得关注：正链上的hg19chr15:25,522,751-25,591,391。

本发明的组合物和方法旨在靶向ube3a反义转录物(ube3a-ats)以解除父系ube3a等位基因的沉默。短发夹rna(shrna)、核酶或微rna对ube3a-ats的有效抑制可导致ube3a-ats表达水平的降低和父系ube3a等位基因表达水平的随之增加。

在本发明的若干方面，本文的组合物和方法涉及as的治疗或预防。在旨在治疗有需要的患者或人类的方法的任何前述实施方案的某些方面，有需要的患者或人类患有as或处于发展as的风险。如本文使用的，术语“有需要的患者”包括需要这些治疗或预防方法的任何哺乳动物，尤其包括人类。受试者可以是雄性或雌性。在某些方面，根据本文提供的方法治疗的患有as的有需要的患者可以表现出焦虑、学习、平衡、运动功能和/或癫痫发作的改善，或者该方法可以将神经元静息膜电位恢复至约-70mv，改善动作电位发展延迟，增加自发突触活性，并且可以改善与基强度、动作电位特征(例如形状)、膜电流、突触电位、离子通道电导等相关的神经元表型的另外的改变。

shrna、核酶、微rna和编码序列

根据本发明的一方面，多核苷酸包含编码短发夹rna(shrna)、核酶或微rna的第一核苷酸序列，所述短发夹rna(shrna)、核酶或微rna导致ube3a-ats序列seqidno:1的表达降低。例如，shrna、核酶或微rna的一部分可以与由seqidno:1编码的rna序列或其中包含的序列互补。

shrna、核酶和微rna是由第一核苷酸序列编码的rna多核苷酸。包含第一核苷酸序列的多核苷酸可以是适于克隆到适当的载体(例如质粒)中用于培养和随后产生病毒颗粒的dna多核苷酸。继而，病毒颗粒可以以适用于感染的形式包含具有核苷酸编码序列的dna多核苷酸。因此，第一核苷酸序列可以是克隆到用于病毒颗粒产生的质粒中或封装在病毒颗粒中的dna序列。由于逆转录病毒携带rna多核苷酸形式的核苷酸编码序列，逆转录病毒颗粒(例如慢病毒)包含rna多核苷酸，该rna多核苷酸包含第一核苷酸序列作为相应的rna序列。

第一核苷酸序列可以编码shrna。例如，第一核苷酸序列可以是seqidno:2。第一核苷酸序列也可以是这样的修饰的seqidno:2：seqidno:2中的粗体核苷酸被seqidno:9-508中的任一种代替，并且seqidno:2中的斜体核苷酸被与seqidno:9-508中的那些互补的核苷酸代替。

第一核苷酸序列可以编码核酶。例如，第一核苷酸序列可以是seqidno:3。第一核苷酸序列可以是seqidno:4。

第一核苷酸序列可以编码微rna。例如，第一核苷酸序列可以是seqidno:8。第一核苷酸序列也可以是这样的修饰的seqidno:8：seqidno:8中的粗体核苷酸被seqidno:9-508中的任一种代替，并且seqidno:8中的斜体核苷酸被与seqidno:9-508中的那些互补的核苷酸代替。斜体核苷酸和与seqidno:9-508中的那些互补的核苷酸可以小于100％互补。

如本文使用的，“靶”意指能够通过氢键合与核苷酸序列(诸如从ube3a-ats的较大基因组序列中的核苷酸序列转录的核苷酸序列)进行杂交的有效rna多核苷酸。有效rna多核苷酸与从ube3a-ats的较大基因组序列中的核苷酸序列转录的核苷酸序列的杂交，可导致与不存在有效rna多核苷酸的情况下ube3a-ats的表达水平相比，在存在有效rna多核苷酸的情况下ube3a-ats的表达水平降低。优选地，有效rna多核苷酸包含与ube3a-ats的较大基因组序列中编码的rna序列互补的shrna、核酶或微rna的核苷酸序列。例如，shrna或微rna包含与由seqidno:5和seqidno:9-508编码的rna序列互补的核苷酸序列，并且核酶包含与由seqidno:6或seqidno:7编码的rna序列互补的核苷酸序列。因此，有效rna多核苷酸是指在将shrna、核酶或微rna同化到靶生物体中并加工为功能状态之后，shrna、核酶或微rna的有效部分。

“降低表达”是指ube3a-ats的表达或活性的降低或阻断，并且不一定是指表达或活性的完全消除。降低靶表达的机制包括有效rna多核苷酸与从较大基因组ube3a-ats序列(seqidno:1)内的一个或更多个序列转录的一个或更多个靶序列的杂交，其中杂交的结果或效果是靶降解或靶占据，其中涉及例如转录或剪接的细胞机制随之停滞。

不希望受限于特定理论，本发明的shrna、核酶和微rna可以通过以下抑制父系ube3a的沉默：(1)切割由seqidno:1编码的rna转录物；(2)降低由seqidno:1编码的rna转录物的稳态水平(即处于稳态时的基线水平)；和(3)终止seqidno:1的转录。例如，切割和降低由seqidno:1编码的rna转录物的稳态水平可以通过涉及rna诱导的沉默复合物(risc)的机制而发生。shrna和微rna两者都可以利用risc。在携带shrna或微rna的基因组物质的载体整合到宿主基因组中后，shrna或微rna基因组物质在宿主中被转录成pri-微rna。pri-微rna被核糖核酸酶诸如drosha分别加工成前shrna(pre-shrna)或前微rna(pre-microrna)，并从核输出。前shrna或前微rna由内切核糖核酸酶诸如dicer加工，以分别形成小干扰rna(sirna)或微rna。对于sirna，sirna被加载到risc中，其中有义链被降解并且反义链充当将risc引导至mrna中的互补序列的指导(guide)。对于微rna，来自微rna的单链被加载到risc中，充当将risc引导至mrna中的互补序列的指导。当序列具有完全互补性时，risc切割mrna，并且当序列具有不完全互补性时，risc阻遏mrna的翻译。在另一个实例中，切割和降低由seqidno:1编码的rna转录物的稳态水平可以通过涉及核酶的机制发生。在携带核酶的基因组物质的载体整合到宿主基因组中，其在宿主中被转录成rna。rna形成具有催化结构域和与靶mrna互补的区域的二级结构。当核酶与靶mrna结合时，催化结构域裂解靶mrna。seqidno:1的转录可以被鱼雷机制(torpedomechanism)终止，其中5’-3’和3’-5’核酸外切酶(例如xrn2)附接到正被转录的靶rna的被裂解的、未加帽的末端。5’-3’核酸外切酶捕获聚合酶，并使聚合酶与dna脱离。因此，由第一核酸序列编码的shrna、核酶和微rna可以通过降低ube3a-atsrna的稳态水平来增加父系ube3a的表达。

如本文使用的，术语“核酸”是指包括单体核苷酸的分子。核酸的实例包括核糖核酸(rna)、脱氧核糖核酸(dna)、单链核酸、双链核酸、小干扰核糖核酸(sirna)、短发夹rna(shrna)和微rna(mirna)。“核苷酸”意指具有与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷。“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指连接的核苷酸的聚合物，每个核苷酸可以彼此独立地被修饰或不被修饰。

如本文使用的，“短发夹rna(shrna)”包括常规的茎环shrna，它形成前体微rna(前mirna)。“shrna”还包括嵌入微rna的shrna(基于mirna的shrna)，其中mirna双链体的指导链和过客链(passengerstrand)被整合到现有的(或天然的)mirna中或到修饰的或合成的(设计的)mirna中。当转录时，常规的shrna(即不是mir-451shrna模拟物)形成初级mirna(primarymirna,pri-mirna)或与天然pri-mirna非常相似的结构。pri-mirna随后被drosha及其辅因子加工成前shrna。因此，术语“shrna”包括pri-mirna(shrna-mir)分子和前shrna分子。

“茎环结构”是指具有包括已知或预测形成在一侧由主要为单链核苷酸的区域(环部分)连接的双链或双链体的核苷酸区域(茎部分)的二级结构的核酸。本领域已知，环部分为至少4个核苷酸长，优选地6个核苷酸长(例如seqidno:2中加下划线的序列)。术语“发夹”和“折回(fold-back)”结构在本文中也用来指茎环结构。这样的结构是本领域中熟知的，并且该术语的使用与其在本领域中的已知含义一致。如本领域所知的，二级结构不需要精确的碱基配对。因此，茎可以包括一个或更多个碱基错配或凸起。可选地，碱基配对可以是精确的，即不包括任何错配。

在一些实施方案中，可用于本发明的shrna包括，但不限于，修饰的shrna，包括具有增强的体内稳定性的shrna。修饰的shrna包括含有核苷酸类似物的分子，包括那些在核碱基、糖或骨架中具有添加、缺失和/或取代的分子；以及交联的或以其他方式化学修饰的分子。一个或更多个修饰的核苷酸可以在shrna分子的部分内，或者遍及整个shrna分子。例如，shrna分子可以被修饰，或者在其5’末端、其3’末端或二者处的区域中，和/或在指导链、过客链或二者内，和/或在突出于5’末端、3’末端或二者的核苷酸内含有修饰的核酸。(参见，crooke,美国专利第6,107,094号和第5,898,031号；elmen等人，美国公布第2008/0249039号和第2007/0191294号；manoharan等人，美国公布第2008/0213891号；maclachlan等人，美国公布第2007/0135372号；和rana，美国公布第2005/0020521号；所有这些文献在此通过引用并入本文。)

在本发明中，shrna包含与从完整基因组ube3a-ats序列(seqidno:1)转录的rna核苷酸序列互补的核苷酸序列，并抑制ube3a-ats对父系ube3a的沉默。在另外的实施方案中，shrna包含与由seqidno:9-508编码的rna序列互补的核苷酸序列。在更具体的实施方案中，shrna包含与由seqidno:5编码的rna序列互补的核苷酸序列。在具体的实施方案中，shrna由seqidno:2的核苷酸序列编码。在本发明的实施方案中，包含在shrna中并与从ube3a-ats基因转录的rna核苷酸序列互补的核苷酸序列的长度为17-21个核苷酸。互补核苷酸可以是连续的，或者可以散布有非互补核苷酸。在一些实施方案中，互补核苷酸序列的长度为21个核苷酸，如seqidno:2中的粗体序列所指示的。shrna可以包含其中17个、18个、19个、20个或21个核苷酸与seqidno:5或9-508中的核苷酸互补的核苷酸序列。17个、18个、19个、20个或21个互补核苷酸可以是连续的，或者可以散布有非互补核苷酸。包括环的shrna的总长度可以是40-50个核苷酸，优选地44-48个核苷酸，更优选地48个核苷酸。

如本文使用的，术语“核酶”是指如酶一样发挥作用的rna分子或由包含该rna分子的蛋白质组成的分子，并且也称为rna酶或催化性rna。已经发现，核酶催化与具有明确三级结构的rna分子的化学反应，并具有催化或自催化性质。一些核酶将自身或其他rna分子裂解以抑制活性，并且其他核酶催化核糖体的氨基转移酶活性。这样的核酶可以包括锤头状核酶、vs核酶、发夹状核酶等。在本发明中，核酶包含与从完整基因组ube3a-ats序列(seqidno:1)转录的rna核苷酸序列互补的核苷酸序列，并抑制ube3a-ats对父系ube3a的沉默。在另外的实施方案中，核酶包含与由seqidno:6和/或seqidno:7编码的rna序列互补的核苷酸序列。在另外的实施方案中，核酶由seqidno:3或4的核苷酸序列编码。在seqidno:3和4中，粗体序列与seqidno:6或7互补，并且加下划线的序列表示核酶的催化区。

如本文使用的，术语“微rna”、“mirna”和“mir”同义地使用，指源自内源基因的约17-21个核苷酸(nt)长的非编码rna。微rna从称为前mirna的更长(约75nt)的发夹样前体加工而成。微rna在称为mirnp的核糖核蛋白复合物中组装，并通过反义互补性识别其靶。如果微rna与其靶100％匹配，即互补性是完全的，则靶mrna被裂解，并且mirna如sirna一样发挥作用。如果匹配是不完全的，即互补性是部分的，那么靶mrna的翻译被阻断。在本发明的实施方案中，包含在微rna中并与从ube3a-ats基因转录的rna核苷酸序列互补的核苷酸序列的长度为17-21个核苷酸。互补核苷酸可以是连续的，或者可以散布有非互补核苷酸。在一些实施方案中，互补核苷酸序列的长度为21个核苷酸，如seqidno:8中的粗体序列所指示的。微rna可以包含其中17个、18个、19个、20个或21个核苷酸与seqidno:5或9-508中的核苷酸互补的核苷酸序列。17个、18个、19个、20个或21个互补核苷酸可以是连续的，或者可以散布有非互补核苷酸。包括环的前体微rna的总长度可以是50-1000个核苷酸，优选地59-67个核苷酸，更优选地67个核苷酸。

在本发明中，微rna被设计成靶向从完整基因组ube3a-ats序列(seqidno:1)内的一个或更多个核苷酸序列转录的一个或更多个核苷酸序列，并抑制ube3a-ats对父系ube3a的沉默。在另外的实施方案中，微rna被设计成靶向从选自seqidno:9-508的一个或更多个序列转录的一个或更多个序列。在更具体的实施方案中，微rna靶向从seqidno:5转录的序列。在另外的实施方案中，微rna由seqidno:8的核苷酸序列编码，其中粗体序列与seqidno:5或9-508互补。

确定序列是否可与靶核酸特异性杂交的方法是本领域中熟知的。在某些实施方案中，本文提供的shrna、核酶或微rna多核苷酸包含可与从ube3a-atsseqidno:1转录的rna序列特异性杂交的核酸序列。

shrna或微rna可以包含含有与rna靶序列互补的17-21个连接的核苷酸的区域的rna多核苷酸，其中rna多核苷酸区域在其整个长度内与ube3a-atsrna核酸序列的等长度区域至少85％互补。在某些方面，rna多核苷酸区域在其整个长度内与ube3a-atsrna核酸序列的等长度区域至少90％、至少95％或100％互补。

shrna或微rna可以包含与由seqidno:5或seqidno:9-508中的任一种编码的rna序列至少85％互补并具有相等长度的核苷酸序列。shrna或微rna可以包含与由seqidno:5或seqidno:9-508中的任一种编码的rna序列至少90％互补并具有相等长度的核苷酸序列。shrna或微rna可以包含与由seqidno:5或seqidno:9-508中的任一种编码的rna序列至少95％互补并具有相等长度的核苷酸序列。shrna或微rna可以包含与由seqidno:5或seqidno:9-508中的任一种编码的rna序列100％互补并具有相等长度的核苷酸序列。

核酶可以包含这样的rna多核苷酸：该rna多核苷酸包含被催化区域分隔开的与rna靶序列互补的两个连接的核苷酸区域，其中rna多核苷酸的总非催化区域在其整个长度内与ube3a-atsrna核苷酸序列的等长度区域至少85％互补。在某些方面，rna多核苷酸的总非催化区域在其整个长度内与ube3a-atsrna核苷酸序列的等长度区域至少90％、至少95％或100％互补。在本发明的实施方案中，包含在核酶中并与从ube3a-ats基因转录的rna核苷酸序列互补的核苷酸序列的长度为17-21个核苷酸。互补核苷酸可以散布有非互补核苷酸。在一些实施方案中，互补核苷酸序列的长度为21个核苷酸，如seqidno:3-4中的粗体序列所指示的。核酶可以包含其中17个、18个、19个、20个或21个核苷酸与seqidno:6-7中的核苷酸互补的核苷酸序列。17个、18个、19个、20个或21个互补核苷酸可以散布有非互补核苷酸。包括催化环的shrna的总长度可以是50-150个核苷酸，优选地57-65个核苷酸，更优选地59个核苷酸。

核酶可以包含与由seqidno:6或7编码的rna序列至少85％互补并具有相等长度的核苷酸序列。核酶可以包含与由seqidno:6或7编码的rna序列至少90％互补并具有相等长度的核苷酸序列。核酶可以包含与由seqidno:6或7编码的rna序列至少95％互补并具有相等长度的核苷酸序列。核酶可以包含与由seqidno:6或7编码的rna序列100％互补并具有相等长度的核苷酸序列。

在某些方面，shrna、核酶或微rna是单链rna多核苷酸。在若干方面，rna多核苷酸是修饰的rna多核苷酸。互补性百分比在本文中以常规意义使用，以指腺嘌呤和胸腺嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶(rna)以及鸟嘌呤和胞嘧啶之间的碱基配对。

如果shrna、核酶或微rna保持能够与ube3a-ats核苷酸序列特异性杂交，那么shrna、核酶或微rna与ube3a-ats核苷酸序列之间的非互补核碱基可以被容忍。此外，shrna、核酶或微rna可以在ube3a-ats核苷酸序列的一个或更多个区段内杂交，使得间插或相邻区段不参与杂交事件(例如，环结构、错配或发夹结构)。

在某些实施方案中，本文提供的shrna、核酶或微rna或其指定部分与ube3a-atsrna核苷酸序列、ube3a-ats区域、ube3a-ats区段或其指定部分70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补，或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补。shrna、核酶或微rna与ube3a-ats核苷酸序列的互补性百分比可以使用常规方法确定。

例如，其中shrna、核酶或微rna的20个核碱基中的18个核碱基与ube3a-ats区域互补并因此将特异性杂交的shrna、核酶或微rna，代表90％的互补性。在这个实例中，剩余的非互补核碱基可以簇集或散布有互补核碱基，并且不需要彼此相邻或与互补核碱基相邻。因此，长度为18个核碱基、具有侧翼为与靶核苷酸序列完全互补的两个区域的四个非互补核碱基的shrna、核酶或微rna具有与靶核苷酸序列的77.8％总体互补性，并因此落入本发明的范围。shrna、核酶或微rna与ube3a-ats核苷酸序列的区域的互补性百分比可以常规地使用本领域已知的blast程序(基本局部比对搜索工具)和powerblast程序(altschul等人,j.mol.biol.,1990,215,403-410；zhang和madden,genomeres.,1997,7,649-656)来确定。同源性百分比、序列同一性或互补性可以由例如gap程序(wisconsin序列分析包,用于unix的版本8,geneticscomputergroup,universityresearchpark,madisonwis.)使用默认设置来确定，该程序使用smith和waterman(adv.appl.math.,1981,2,482-489)的算法。

在某些实施方案中，本文提供的shrna、核酶或微rna或其指定部分与ube3a-ats核苷酸序列或其seqidno:1的转录产物的指定部分完全互补(即100％互补)。例如，shrna、核酶或微rna可以与ube3a-ats核苷酸序列或其区域或其区段或其序列完全互补。如本文使用的，“完全互补”意指shrna、核酶或微rna的每个核碱基能够与从ube3a-ats核苷酸序列转录的相应rna核碱基精确碱基配对。

shrna、核酶或微rna的有效浓度或剂量可以将ube3a-ats对父系ube3a的沉默抑制至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。

shrna、核酶或微rna的有效浓度或剂量可以使ube3a-ats的转录终止至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。

shrna、核酶或微rna的有效浓度或剂量可以使ube3a-ats的稳态水平降低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。

shrna、核酶或微rna的有效浓度或剂量可以切割ube3a-ats并使其降低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。

shrna、核酶或微rna的有效浓度或剂量可以使ube3a-ats的表达降低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％，并且将父系ube3a的表达增加至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。

如本文使用的，术语“ube3a-ats”和“ube3a-ats”可以互换使用，其拼写不进行大写表示任何特定物种或种间同源物。“ube3a”和“ube3a”可以互换使用，其拼写不进行大写表示任何特定的物种或种间同源物。此外，“ube3a”、“ube3a”、“ube3a”和“ube3a”可以互换使用，无斜体表示核酸或蛋白质，除非有相反的特别说明。

病毒载体

“载体”是另一个dna区段可插入其中以便引起所插入区段的复制的复制子，诸如质粒、噬菌体或黏粒。通常，载体在与适当的控制元件缔合时能够复制。合适的载体骨架包括，例如，本领域中常规使用的那些载体骨架，诸如质粒、包含病毒基因组的质粒、病毒或人工染色体。术语“载体”包括克隆和表达载体、以及病毒载体和整合载体。

对本领域技术人员来说明显的是，术语“病毒载体”广泛用于指包括通常促进核酸分子向细胞或病毒颗粒转移的病毒核酸元件的核酸分子(例如，转移质粒)，其介导核酸序列转移和/或核酸序列整合到细胞基因组中。

病毒载体包含主要来源于病毒的结构和/或功能遗传元件。期望地，病毒载体是无毒、无免疫原性、易于产生，并有效地保护和递送dna或rna到靶细胞中。根据本发明的组合物和方法，病毒载体可以包含编码本发明的shrna、核酶和/或微rna的dna。在具体实施方案中，病毒载体是慢病毒载体或腺相关病毒(aav)载体。

如本文使用的，术语“慢病毒”是指一组(或一个属的)复杂的逆转录病毒。说明性的慢病毒包括但不限于：hiv(人类免疫缺陷病毒；包括1型hiv和2型hiv)；维斯纳梅迪病毒(vmv)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(caev)；马传染性贫血病毒(eiav)；猫免疫缺陷病毒(fiv)；牛免疫缺陷病毒(biv)；和猿猴免疫缺陷病毒(siv)。慢病毒会转导分裂细胞和有丝分裂后细胞。

术语“慢病毒载体”是指包含主要来源于慢病毒的结构和功能遗传元件或其部分(包括长末端重复序列(ltr))的病毒载体(例如，病毒质粒)。慢病毒载体是杂合载体(例如，呈转移质粒的形式)，包含用于核酸序列(例如，编码序列)的逆转录、复制、整合和/或包装的逆转录病毒(例如，慢病毒)序列。术语“逆转录病毒载体”是指包含主要来源于逆转录病毒的结构和功能遗传元件或其部分的病毒载体(例如，转移质粒)。

腺病毒载体被设计成直接向活的受试者施用。与逆转录病毒载体不同，大多数腺病毒载体基因组不整合到宿主细胞的染色体中。而是，使用腺病毒载体导入细胞中的基因作为持续一段延长的时间的染色体外元件(附加体)维持在核中。腺病毒载体会在体内转导许多不同组织中的分裂细胞和非分裂细胞，包括气道上皮细胞、内皮细胞、肝细胞和各种肿瘤(trapnell,1993；chuah等人,2003)。

术语腺相关病毒(aav)是指一种小的ssdna病毒，其感染人类和其他一些灵长类动物物种，已知不引起疾病，并且只引起非常轻微的免疫应答。aav可以感染分裂细胞和非分裂细胞二者，并可以将其基因组整合到宿主细胞的基因组中。这些特征使aav成为产生用于基因疗法的病毒载体的非常有吸引力的候选物，尽管载体的克隆能力相对有限。在本发明的优选实施方案中，使用的载体来源于腺相关病毒(即aav载体)。多于30种天然存在的aav血清型是可得的。aav衣壳中存在许多天然变体，允许鉴定和使用具有特别适合于特定靶细胞类型的性质的aav。aav病毒可以通过常规的分子生物学技术进行工程化，使得优化这些颗粒用于细胞特异性递送shrna、核酶或微rnadna序列、用于使免疫原性最小化、用于调节稳定性和颗粒寿命、用于有效降解、用于精确递送至核等成为可能。

“表达载体”是包含调节区的载体。许多载体和表达系统从诸如novagen(madison,wis.)、clontech(paloalto,calif.)、stratagene(lajolla,calif.)和invitrogen/lifetechnologies(carlsbad,calif.)公司商购可得。表达载体可以是来源于特定病毒的病毒表达载体。

本文提供的载体还可以包括例如复制起点、支架附着区(scaffoldattachmentregions，sar)和/或标志物。标志基因可以赋予宿主细胞可选择的表型。例如，标志物可以赋予杀生物剂抗性，诸如对抗生素(例如，卡那霉素、g418、博莱霉素或潮霉素)的抗性。表达载体可以包括标签序列，该标签序列被设计成便于操纵或检测(例如，纯化或定位)所表达的多肽。标签序列，诸如绿色荧光蛋白(gfp)、谷胱甘肽s-转移酶(gst)、聚组氨酸、c-myc、血凝素或fiag^tm标签(kodak,newhaven,conn.)序列通常以与编码的多肽的融合物来表达。这样的标签可以插入多肽内的任何位置，包括羧基末端或氨基末端。

另外的表达载体还可以包括例如染色体、非染色体和合成dna序列的区段。合适的载体包括plk0.1puro、sv40的衍生物，和质粒诸如rp4；噬菌体dna，例如噬菌体1的许多衍生物，例如nm989，和其他噬菌体dna，例如m13和丝状单链噬菌体dna，可用于真核细胞中的载体，诸如可用于昆虫或哺乳动物细胞中的载体，来源于质粒和噬菌体dna的组合的载体，诸如已经被修饰以使用噬菌体dna或其他表达控制序列的质粒。

载体还可以包括调节区。术语“调节区”是指影响转录或翻译起始和速率以及转录或翻译产物的稳定性和/或移动性的核苷酸序列。调节区包括但不限于启动子序列、增强子序列、响应元件、蛋白质识别位点、可诱导元件、蛋白质结合序列、5’和3’非翻译区(utr)、转录起始位点、终止序列、多腺苷酸化序列、核定位信号和内含子。

如本文使用的，术语“可操作地连接”是指调节区和核酸中待转录的序列的定位，以便影响这样的序列的转录或翻译。例如，为了将编码序列置于启动子的控制之下，多肽的翻译阅读框的翻译起始位点通常位于启动子下游1个和约50个核苷酸之间。然而，启动子可以位于翻译起始位点上游多达约5,000个核苷酸或转录起始位点上游多达约2,000个核苷酸。启动子通常包括至少核心(基础)启动子。启动子还可以包括至少一个控制元件，诸如增强子序列、上游元件或上游激活区(uar)。待纳入的启动子的选择取决于若干因素，包括但不限于效率、选择性、可诱导性、期望的表达水平以及细胞或组织优先表达。通过适当选择和相对于编码序列定位启动子和其他调节区来调节编码序列的表达是本领域技术人员的常规工作。

载体还可以包含进一步调节基因递送和/或基因表达或者以其他方式为所靶向的细胞提供有益性质的其他组分或功能。如下文更详细描述和说明的，这样的其他组分包括，例如，影响结合或靶向细胞的组分(包括介导细胞类型或组织特异性结合的组分)；影响细胞摄取载体核酸的组分；影响摄取后细胞内多核苷酸的定位的组分(诸如介导核定位的剂)；和影响多核苷酸表达的组分。这样的组分还可以包括标志物，诸如可检测和/或可选择的标志物，所述可检测和/或可选择的标志物可以用于检测或选择已经摄取载体并表达由载体递送的核酸的细胞。这样的组分可以作为载体的天然特征提供(诸如使用某些具有介导结合和摄取的组分或功能的病毒载体)，或者载体可以被修饰以提供这样的功能。其他载体包括由chen等人；biotechniques,34:167-171(2003)描述的那些。大量这样的载体是本领域中已知的，并且通常是可得的。

“重组病毒载体”是指包含一种或更多种异源基因产物或序列的病毒载体。由于许多病毒载体表现出与包装相关的尺寸限制，异源基因产物或序列通常通过替换病毒基因组的一个或更多个部分来引入。这样的病毒可能成为复制缺陷型，需要在病毒复制和衣壳化期间以反式方式提供一种或更多种缺失的功能(例如，通过使用辅助病毒或携带复制和/或衣壳化所必需的基因产物的包装细胞系)。

在一些实施方案中，用于本发明的病毒载体以至少10⁵个病毒基因组/细胞的浓度使用。

可以容易地完成适当启动子的选择。合适的启动子的实例是rna聚合酶ii或iii启动子，诸如u6启动子。可以用于基因表达的其他合适的启动子包括但不限于763碱基对巨细胞病毒(cmv)启动子、劳斯肉瘤病毒(rsv)(davis等人,humgenether4:151(1993))、sv40早期启动子区、疱疹胸苷激酶启动子、金属硫蛋白(mmt)基因的调节序列、pgk(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子；和动物转录控制区，所述动物转录控制区表现出组织特异性并已用于转基因动物中；髓鞘碱性蛋白基因控制区，所述髓鞘碱性蛋白基因控制区在脑中的少突胶质细胞中具有活性，以及促性腺激素释放激素基因控制区，所述促性腺激素释放激素基因控制区在下丘脑中具有活性。某些蛋白质可以使用其天然启动子来表达。还可以包括能增强表达的其他元件，诸如增强子或导致高水平表达的系统，诸如tat基因和tar元件。然后可以将该盒插入载体，例如质粒载体，诸如plk0.1、puc19、puc118、pbr322或其他已知的质粒载体。参见，sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,(1989)。质粒载体还可以包括选择性标志物，诸如用于氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因，只要标志物多肽不会对被治疗的生物体的代谢产生不利影响。该盒还可以结合到合成递送系统(诸如wo95/22618中公开的系统)中的核酸结合部分。

shrna、核酶和微rna的编码序列可以使用本领域熟知的任何合适的遗传工程化技术克隆到病毒载体中，所述技术包括但不限于标准的pcr、多核苷酸合成、限制性核酸内切酶消化、连接、转化、质粒纯化和dna测序技术，如sambrook等人.(molecularcloning:alaboratorymanual.coldspringharborlaboratorypress,n.y.(1989))，coffin等人.(retroviruses.coldspringharborlaboratorypress,n.y.(1997))和"rnaviruses:apracticalapproach"(alanj.cann,ed.,oxforduniversitypress,(2000))描述的。在优选的实施方案中，shrna、核酶和微rnadna序列在5’和3’末端含有侧翼序列，该序列与质粒和/或载体上被限制性核酸内切酶切割的序列互补。如本领域熟知的，侧翼序列取决于质粒和/或载体的限制性消化期间使用的限制性核酸内切酶。因此，本领域技术人员可以相应地选择shrna、核酶和微rnadna序列的5’和3’末端的侧翼序列。在另一种优选的实施方案中，可以通过本领域目前已知的核酸融合和交换技术将靶位点克隆到载体中，所述技术包括gateway、pcrinfusion、cre-loxp和creator。

在一些实施方案中，表达载体包含启动子和多核苷酸，所述多核苷酸包含编码本发明的短发夹rna(shrna)、核酶或微rna的第一核苷酸序列。优选地，启动子和包含第一核苷酸序列的多核苷酸可操作地连接。优选地，启动子是u6启动子。表达载体中包含的第一核苷酸序列可以是seqidno:2。表达载体中包含的第一核苷酸序列可以是seqidno:3。表达载体中包含的第一核苷酸序列可以是seqidno:4。表达载体中包含的第一核苷酸序列可以是seqidno:8。表达载体中包含第一核苷酸序列的多核苷酸优选地是dna多核苷酸。表达载体的第一核苷酸序列优选地是dna核苷酸序列。由表达载体的第一核苷酸序列编码的shrna、核酶或微rna可以如本文公开的变化形式中的任一种所描述的。

如下文讨论的，重组病毒载体与包装重组病毒颗粒所需的元件一起转染到包装细胞或细胞系中。从转染的细胞上清液收集的重组病毒颗粒用于感染靶细胞或生物体，以表达shrna、核酶或微rna。转导的细胞或生物体用于瞬时表达或选择用于稳定表达。

病毒颗粒

病毒颗粒用于递送靶向ube3a-atsrna的shrna、核酶和微rna的编码核苷酸序列。病毒颗粒通常包括各种病毒组分，并且有时除了一种或更多种核酸之外还包括宿主细胞组分。核酸序列可以被包装到病毒颗粒中，该病毒颗粒能够将shrna、核酶和/或微rna核酸序列递送到有需要的患者或人类的靶细胞中。

病毒颗粒可以通过以下产生：(a)将病毒表达载体导入合适的细胞系；(b)在合适的条件下培养该细胞系，以允许产生病毒颗粒；(c)回收产生的病毒颗粒；和(d)任选地纯化回收的感染性病毒颗粒。

可以将含有编码本发明的shrna、核酶或微rna的核苷酸序列的表达载体导入适当的细胞系中，用于使用本领域普通技术人员容易获得的熟知技术进行增殖或表达。这些包括但不限于，向细胞核中显微注射微量的dna(capechi等人,1980,cell22,479-488)、capo4介导的转染(chen和okayama,1987,mol.cellbiol.7,2745-2752)、deae-葡聚糖介导的转染、电穿孔(chu等人,1987,nucleicacidres.15,1311-1326)、脂质体转染/脂质体融合(feigner等人,1987,proc.natl.acad.sci.usa84,7413-7417)、颗粒轰击(yang等人,1990,proc.natl.acad.sci.usa87,9568-9572)、基因枪、转导、感染(例如用感染性病毒颗粒)和其他技术，诸如见于sambrook等人.(molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,2001)的那些技术。

当本发明的载体有缺陷时，感染性颗粒通常在互补细胞系中产生，或者通过使用辅助病毒产生，辅助病毒以反式提供无功能的病毒基因。例如，用于与腺病毒载体互补的合适细胞系包括293细胞(graham等人,1997,j.gen.virol.36,59-72)以及常用于与e1功能互补的per-c6细胞(fallaux等人,1998,humangenether.9,1909-1917)。其他细胞系已经被工程化以与双缺陷腺病毒载体互补(yeh等人,1996,j.virol.70,559-565；krougliak和graham,1995,humangenether.6,1575-1586；wang等人,1995,genether.2,775-783；lusky等人,1998,j.virol.72,2022-2033；wo94/28152和wo97/04119)。感染性病毒颗粒可以从培养物上清液回收，也可以在裂解后从细胞回收，并任选地根据标准技术(色谱法、氯化铯梯度中的超速离心，如例如wo96/27677、wo98/00524、wo98/22588、wo98/26048、wo00/40702、ep1016700和wo00/50573中描述的)进一步纯化。

本发明还涉及宿主细胞，所述宿主细胞包含本文描述的本发明的核酸分子、载体或感染性病毒颗粒。出于本发明的目的，术语“宿主细胞”应被广义地理解，在组织、器官或分离的细胞中没有任何关于特定有机体(organization)的限制。这样的细胞可以是独特类型的细胞或一组不同类型的细胞，并包括培养的细胞系、原代细胞和增殖细胞。

因此，宿主细胞包括原核细胞、低等真核细胞诸如酵母和其他真核细胞诸如昆虫细胞、植物和高等真核细胞诸如脊椎动物细胞，并且特别优选哺乳动物(例如人类或非人类)细胞。合适的哺乳动物细胞包括但不限于造血细胞(全能干细胞、白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、apc、树突细胞、非人类细胞等)、肺细胞、气管细胞、肝细胞、上皮细胞、内皮细胞、肌(例如骨骼肌、心肌或平滑肌)细胞或成纤维细胞。优选的宿主细胞包括大肠杆菌(escherichiacoli)、芽孢杆菌(bacillus)、李斯特菌(listeria)、酵母(saccharomyces)、bhk(幼仓鼠肾)细胞、mdck细胞(madin-darby犬肾细胞系)、crfk细胞(crandell猫肾细胞系)、cv-1细胞(非洲猴肾细胞系)、cos(例如cos-7)细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、小鼠nih/3t3细胞、hela细胞和vero细胞。宿主细胞还包括能够与本发明的复制缺陷载体(例如腺病毒载体)的至少一种缺陷功能互补的互补细胞，诸如上文陈述的那些。

本发明的宿主细胞可以进一步被包封。细胞包封技术先前已经描述(tresco等人,1992,asajoj.38,17-23；aebischer等人,1996,humangenether.7,851-860)。根据所述具体实施方案，转染或感染的真核宿主细胞用形成微孔膜的化合物包封，并且所述包封的细胞可以进一步植入体内。含有感兴趣的细胞的囊可以使用中空微孔膜来制备(例如，akzonobelfaserag,wuppertal,germany；deglon等人.1996,humangenether.7,2135-2146)，该膜具有的分子量截止值适于允许蛋白质和营养物在囊内部和外部之间自由通过，同时防止植入的细胞与宿主细胞接触。

适用于本发明的病毒颗粒包括aav颗粒和慢病毒颗粒。aav颗粒携带基因组dna形式的shrna、核酶和微rna的编码序列。在另一方面，慢病毒颗粒属于逆转录病毒的类别，并携带rna形式的shrna、核酶和微rna的编码序列。

含有编码靶向ube3a-atsrna的shrna、核酶和/或微rna的dna(或在慢病毒颗粒的情况为rna)的重组工程化病毒颗粒，诸如aav颗粒、人工aav颗粒、自互补aav颗粒和慢病毒颗粒，可以被递送至靶细胞以抑制ube3a-ats对ube3a的沉默。使用aav是一种常见的dna递送方式，因为它相对无毒，提供有效的基因转移，并且可以容易地针对特定目的进行优化。在本发明的一种实施方案中，所选择的aav血清型具有天然的嗜神经性。在本发明的另外实施方案中，aav血清型是aav9或aav10。

合适的重组aav通过培养宿主细胞产生，所述宿主细胞包含编码aav血清型衣壳蛋白或其片段的核苷酸序列，如本文所定义的；功能rep基因；至少由aav反向末端重复序列(itr)和编码核苷酸序列组成的小基因；和足够的辅助功能以允许将小基因包装到aav衣壳蛋白中。在宿主细胞中培养以将aav小基因包装在aav衣壳中所需的组分可以以反式提供给宿主细胞。可选地，任何一种或更多种所需组分(例如，小基因、rep序列、cap序列和/或辅助功能)可以由稳定的宿主细胞提供，该宿主细胞已经使用本领域技术人员已知的方法被工程化以包含一种或更多种所需组分。

除非另有说明，否则本文描述的aavitr和其他选择的aav组分可以容易地选自任何aav血清型，包括但不限于aav1、aav2、aav3、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10或其他已知和未知的aav血清型。可以使用本领域技术人员可获得的技术从aav血清型容易地分离出这些itr或其他aav组分。这样的aav可以从学术、商业或公共来源(例如美国典型培养物保藏中心,manassas,va.)分离或获得。可选地，aav序列可以通过合成或其他合适的手段参考已公开的序列获得，所述已公开的序列诸如文献中可获得的或数据库诸如例如genbank、pubmed等中可获得的。

产生本发明的raav所需的小基因、rep序列、cap序列和辅助功能可以以转移其上携带的序列的任何遗传元件的形式递送到包装宿主细胞。所选择的遗传元件可以通过任何合适的方法递送。用于构建本发明的任何实施方案的方法是核酸操纵中的技术人员已知的，并包括遗传工程化、重组工程化和合成技术。参见，例如，sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborpress,coldspringharbor,n.y.。类似地，产生raav病毒颗粒的方法是熟知的，并且对合适方法的选择不是对本发明的限制。参见例如，k.fisher等人,1993j.viral.,70:520-532和美国专利第5,478,745号等。这些出版物通过引用并入本文。

对这些和其他常见载体和调节元件的选择是常规的，并且许多这样的序列是可得的。参见例如，sambrook等人，以及其中引用的参考文献，例如，第3.18-3.26页和第16.17-16.27页，以及ausubel等人,currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,newyork,1989)。当然，并非所有载体和表达控制序列都将同样良好地发挥功能以表达本发明的所有转基因。然而，本领域技术人员可以在这些和其他表达控制序列中做出选择而不偏离本发明的范围。

药物组合物和治疗性处理

包含编码shrna、核酶和/或微rna的期望编码序列的病毒颗粒可以配制成用于通过任何适合施用的手段施用至有需要的患者或人类。这样的配制包括使用药学上和/或生理学上可接受的媒介物或载体，特别是适用于施用至脑(例如通过颅下或脊髓注射)的媒介物或载体。此外，可以在联合治疗中施用多于一种shrna、核酶和/或微rna，或它们的任何组合。在联合治疗中，不同的shrna、核酶和/或微rna可以同时、分别、依次和以任何顺序施用。

合适地，本发明的药物组合物包含适于通过注射将其递送至人类或动物生物体的载体和/或稀释剂。这样的载体和/或稀释剂在使用的剂量和浓度是无毒的。它选自通常用于配制用于以单位剂量或多剂量形式肠胃外施用或用于通过连续或定期输注来直接输注的组合物的那些。它优选地是等渗的、低渗的或弱高渗的，并具有相对低的离子强度，诸如由糖、多元醇和等渗盐水溶液提供的离子强度。代表性实例包括无菌水、生理盐水(例如氯化钠)、抑菌水、林格液、葡萄糖或蔗糖溶液、汉克氏溶液和其他生理平衡的水性盐溶液(参见例如最新版本的remington:thescienceandpracticeofpharmacy,a.gennaro,lippincott,williams&wilkins)。本发明的组合物的ph被适当地调节和缓冲以便适合用于人类或动物，优选地处于生理ph或略微碱性的ph(约ph8至约ph9之间，其中特别优选ph8.5)。合适的缓冲液包括磷酸盐缓冲液(例如pbs)、碳酸氢盐缓冲液和/或tris缓冲液。一种特别优选的组合物以1m蔗糖、150mmnacl、1mmmgcl2、54mg/l吐温80、10mmtrisph8.5进行配制。另一种优选的组合物以10mg/ml甘露醇、1mg/mlhsa、20mmtris、ph7.2和150mmnacl进行配制。这些组合物在-70℃稳定至少6个月。

本发明的组合物可以呈各种形式，例如呈固体(例如粉末、冻干形式)或液体(例如水性)。在固体组合物的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性剂加上来自其先前无菌过滤的溶液的任何另外的期望成分的粉末。如果需要，这样的溶液可以储存在无菌安瓿中，准备通过添加即用无菌注射用水(sterilewaterforreadyinjection)进行重构。

雾化或气雾化制剂也构成本发明的一部分。鼻内施用的方法是本领域中熟知的，包括将组合物的滴、喷雾或干粉形式从加压容器或分配器(其包含合适的推进剂，例如气体诸如二氧化碳)或喷雾器(参见例如wo95/11664)施用到待治疗个体的鼻咽中。肠溶制剂，诸如用于口服施用的胃耐受胶囊和颗粒、用于直肠或阴道施用的栓剂也构成本发明的一部分。对于非肠胃外施用，组合物还可以包括增加粘膜孔径的吸收促进剂。这样的吸收促进剂包括脱氧胆酸钠、甘氨胆酸钠、二甲基-β-环糊精、月桂酰-1-溶血磷脂酰胆碱和与粘膜的磷脂结构域具有结构相似性的其他物质。

组合物还可以包含其他药学上可接受的赋形剂，用于提供期望的药学或药效动力学性质，包括例如改变或维持制剂的ph、渗透压、粘度、透明度、颜色、无菌性、稳定性、溶解速率，改变或维持释放或吸收到人类或动物生物体中。例如，聚合物诸如聚乙二醇可以用于获得期望的溶解性、稳定性、半衰期和其他药学上有利的性质(davis等人,1978,enzymeeng.4,169-173；burnham等人,1994,am.j.hosp.pharm.51,210-218)。稳定组分的代表性实例包括聚山梨醇酯80、l-精氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖，及它们的组合。特别适用于基于质粒的组合物中的其他稳定组分包括透明质酸酶(如wo98/53853中描述的，其被认为会使宿主细胞的细胞外基质不稳定)、氯喹、质子化合物诸如丙二醇、聚乙二醇、甘油、乙醇、1-甲基l-2-吡咯烷酮或它们的衍生物、非质子化合物诸如二甲基亚砜(dmso)、二乙基亚砜、二正丙基亚砜、二甲基砜、环丁砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、四甲基脲、乙腈(参见ep890362)、核酸酶抑制剂诸如肌动蛋白g(wo99/56784)，和阳离子盐诸如镁(mg²⁺)(ep998945)和锂(li⁺)(wo01/47563)，及它们的任何衍生物。本发明的组合物中的阳离子盐的量的范围优选地为约0.1mm至约100mm，且仍更优选地为约0.1mm至约10mm。粘度增强剂包括羧甲基纤维素钠、山梨醇和右旋糖。组合物还可以包含本领域已知促进跨越特定器官的血液屏障或膜进行渗透或转运的物质(例如转铁蛋白受体的抗体；friden等人,1993,science259,373-377)。聚赖氨酸和乳糖的凝胶复合物(midoux等人,1993,nucleicacidres.21,871-878)或泊洛沙姆407(pastore,1994,circulation90,1-517)可以用于促进动脉细胞中的施用。

病毒颗粒和药物组合物可以以治疗有效量向患者施用。如本文使用的，术语“治疗有效量”是指足以实现期望的生物效果的量。例如，用于治疗快乐木偶综合征的治疗有效量是足以改善如本文描述的快乐木偶综合征的一种或更多种症状(例如，发育迟缓、严重认知损害、共济失调步态、频繁癫痫发作、短注意力时长、言语缺失和特征性快乐举止)的量。此外，asipsc衍生的神经元表现出去极化的静息膜电位、延迟的动作电位发展和自发突触活动减少。因此，用于治疗as的治疗有效量可以使神经元静息膜电位恢复至约-70mv，改善动作电位发展延迟，增加自发突触活动，或改善与基强度、动作电位特征(例如形状)、膜电流、突触电位、离子通道电导等相关的神经元表型的另外改变。

适当的剂量可以根据已知的因素而变化，诸如特定活性剂的药效动力学特征、宿主生物体的年龄、健康和体重；一种或更多种待治疗的状况、症状的性质和程度、同时治疗的种类、治疗的频率、预防或治疗的需要和/或期望的效果。剂量也根据所选择的特定施用途径来计算。从业者根据相关情况例常对确定用于治疗的适当剂量所需的计算进行进一步细化。作为一般指导，基于病毒颗粒的组合物可以以至少10⁵个病毒基因组/细胞的剂量形式配制。滴度可以通过常规技术确定。基于载体质粒的组合物可以以1μg至100mg之间、有利地10μg和10mg之间、并且优选地100μg和1mg之间的剂量形式配制。施用可以以单个剂量发生，或以一定时间间隔后重复一次或若干次的剂量发生。

本发明的组合物可以被包封在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。在所有情况下，组合物必须是无菌的，并且应当是流动的，达到易于注射性存在的程度。它在制造和储存条件下必须是稳定的，并且必须防止微生物诸如细菌和真菌的污染作用。无菌可注射溶液可以通过以下来制备：将活性剂(例如感染性颗粒)以需要的量掺入到上文列举的一种成分或成分的组合中，然后过滤灭菌。

本发明的病毒颗粒和药物组合物优选地通过肠胃外途径施用，包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输注、鞘内或颅内，例如脑内或脑室内施用。在一种实施方案中，脑内或脑室内施用病毒颗粒或药物组合物。在另一种实施方案中，鞘内施用病毒颗粒或药物组合物。

在本发明的方法的某些实施方案中，上文描述的病毒颗粒和药物组合物通过颅下注射到有需要的患者或人类的脑或脊髓中而向受试者施用。在本发明的具体实施方案中，颅下施用到脑中的使用导致将本发明的编码核苷酸序列直接施用至脑细胞，包括神经胶质和神经元。如本文使用的，术语“神经元”是指脑中的任何细胞或与大脑功能相关的任何细胞。该术语可以指任何一种类型的神经元，包括单极、双极、多极和伪单极的。

实施例

总体方法

人类胚胎干细胞(hesc)培养与神经分化

hesc在受辐照的小鼠胚胎成纤维细胞上培养，并每天用hesc培养基(含有敲除血清替代物、l-谷氨酰胺+β-巯基乙醇、非必需氨基酸和碱性成纤维细胞生长因子的dmem/f12)供养。hesc在37℃在潮湿培养箱中以5％co2培养。细胞每5-7天进行人工传代。

使用单层方案的修改形式使hesc分化为神经元。传代后2天，通过在n2b27培养基(神经基础培养基、1％n2、2％b27、2mml-谷氨酰胺、0.5％青霉素/链霉素、1％胰岛素-转铁蛋白-硒)中培养细胞开始神经诱导。在分化的前10天，n2b27培养基补充有新鲜头蛋白(noggin)(500ng/ml)。在开始神经诱导后大约14天，使用stemproez传代工具将神经玫瑰花结(neuralrosette)人工传代到聚-d-赖氨酸和层粘连蛋白包被的板上。神经祖细胞在分化3周左右以高密度再铺板，在分化4周左右切换到神经分化培养基(ndm)，然后在分化5周左右稀疏地铺板以进行终末分化。ndm由神经基础培养基、1％b27、2mml-谷氨酰胺、0.5％青霉素-链霉素、非必需氨基酸、1μm抗坏血酸、200μm环amp、10ng/ml脑源性神经营养因子和10ng/ml胶质细胞源性神经营养因子组成。神经元维持在培养物中直至分化10周至17周。hesc维持和神经元分化的方案先前已经描述。

shrna和核酶载体的产生

shrna和核酶通过使两个具有期望序列的互补多核苷酸退火来产生。具体地，产生shrna的多核苷酸包括待靶向的特定21个核苷酸的序列及其反向互补序列，由ctcgag的环序列分隔开，并添加了5’侧翼序列ccgg和3’侧翼序列tttttg用于克隆到质粒载体中。产生核酶的多核苷酸包括特定的41个核苷酸的序列以及用于质粒克隆的相同5’侧翼序列和3’侧翼序列。退火的多核苷酸连接到plk0.1puro载体(stewart等人rna2003apr；9(4):493-501)。shrna和核酶序列在u6启动子的控制下。所得质粒进行sanger测序以确认shrna序列的正确插入。

慢病毒产生和神经元转导

慢病毒颗粒通过用第二代包装系统使用lipofectamine3000转染293ft细胞制成。使用lenti-xconcentrator试剂盒(clontech)浓缩病毒，并使用qpcr慢病毒滴定试剂盒(abm)计算病毒滴度。10周龄的神经元以1.3个细胞/cm²的密度铺板在层粘连蛋白包被的塑料皿上，并用10个病毒颗粒/细胞进行转导。在慢病毒转导后7天，收获神经元的rna。

定量rt-pcr

使用高容量cdna逆转录试剂盒(thermofisherscientific)根据制造商的说明合成cdna。定量rt-pcr使用用于每个预期的靶的taqman基因表达测定和mastermix(thermofisherscientific)在steponeplus(thermofisherscientific)上进行。反应以技术上的一式两份进行，其中gapdh内源性对照taqman测定用作管家基因以进行归一化。使用δδct方法定量基因表达。

aav产生和神经元转导

将551shrna2以及加扰的shrna对照(scrambledshrnacontrol)克隆到pav-u6-gfp载体中，并由商业供应商(vigene)包装成病毒颗粒。神经元用551shrna2aav9颗粒使用至少1x10⁵个病毒基因组/细胞进行转导。48小时后，对神经元进行成像，以使经转导的神经元可视化。

实施例1

为了测试核酶的体外切割能力，将核酶和靶rna序列在体外转录并在受控条件下进行测试。具体地，包括t7序列的引物用于扩增预期靶的基因组序列。将pcr产物清理并浓缩，然后用于用t7聚合酶进行的体外转录测定中。dna用于用t7聚合酶进行的体外转录反应中。使用megaclear试剂盒(ambion)对rna进行柱纯化。核酶rna通过使两个互补的核酶多核苷酸退火来制备。然后用t4聚合酶对它们进行末端填充，并清理和浓缩。核酶在ddh2o中稀释至适当浓度(5pmol/μl)作为工作储液。核酶和靶rna在体外切割测定中于37摄氏度组合30分钟，并用溴化乙锭在2％琼脂糖凝胶上可视化。

首先测试了锤头状核酶，锤头状核酶是一种导致rna中的磷酸二酯键水解的催化性rna分子。这些核酶快速地裂解并且不依赖其他细胞机制，并已经在hiv和某些肿瘤的临床试验中进行了测试。设计了四种锤头状核酶来切割由功能性aso靶向的附近序列。体外切割测定揭示核酶是有活性的并且可以切割ube3a-ats序列(图3a)。最具活性的两种核酶551ribo1(seqidno:3)和551ribo2(seqidno:4)由慢病毒载体编码，所述慢病毒载体被包装到慢病毒颗粒中并用于转导成熟的asipsc衍生的神经元。ube3a-ats水平降低了～40％(图3b)。

实施例2

开发了靶向ube3a-ats基因中相似序列的shrna。shrna利用rna干扰途径来敲低rna。四种shrna通过将其克隆到慢病毒载体中来进行设计，所述慢病毒载体被包装到慢病毒颗粒中并用于转导成熟的asipsc衍生的神经元。551shrna2(seqidno:2)实现了ube3a-ats的40％敲低，以及父系ube3a的2.2倍激活(图4)。这些研究已经通过将相同的shrna克隆到腺相关病毒(aav)载体中并将其包装到aav9颗粒中进行了重复(图5和图6)。

应理解，前面的详述和所附实施例仅仅是说明性的，并且不应被认为是对本发明的范围的限制，本发明的范围仅由所附权利要求书及其等效物来限定。

对所公开的实施方案的各种变化和修改对于本领域技术人员将是明显的。在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以进行这样的变化和修改，包括而不限于与本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂或使用方法有关的那些变化和修改。

序列

seqidno:1

人类ube3a-ats基因组序列。

seqidno:2

shrna人工/合成序列。

seqidno：3

551ribo1人工/合成序列。

seqidno：4

551ribo2人工/合成序列。

seqidno：5

ube3a-ats人工/合成靶序列。

seqidno：6

ube3a-ats人工/合成序列。

seqidno：7

ube3a-ats人工/合成序列。

seqidno：8

微rna人工/合成序列。

seqidnos：9-508

ube3a-ats人工/合成序列。

seqidno:509

人类ube3a序列。