治疗性水凝胶组合物

1.本发明涉及可用于治疗性应用的水凝胶组合物。本发明还涉及用于制备这些水凝胶组合物的方法以及这些水凝胶组合物用于治疗性应用的用途，尤其是眼部和表面治疗性应用的用途。


背景技术：

2.2018年，who报道了在全球，角膜混浊是失明的主要原因。由病症例如微生物性角膜炎引起的角膜感染导致了胶原蛋白和胞外基质的紊乱，形成瘢痕。治疗通常需要用类固醇和抗生素来解决感染。未解决的角膜混浊可导致需要手术性角膜移植。尽管试图通过积极控制感染/炎症来控制角膜瘢痕形成，但使用强效的抗瘢痕形成治疗几乎没有成功。当前滴眼剂治疗的一个限制是低的黏度或弱的胶凝材料，这不会显著延长药物的滞留时间。
3.角膜混浊在全球均是视力损伤(sight impairment)的主要原因，估计全球有2790万人双侧或单侧地受到影响
1.。这样的混浊通常源于复杂的、光学上透明的角膜组织结构的改变，角膜组织结构对于将光折射到视网膜上和随后的神经视觉处理至关重要。通常，角膜瘢痕形成是由一系列病原体包括细菌、寄生虫、真菌、病毒和原生动物引起的眼部感染导致的。在发达国家，毁灭性的角膜感染最常与长期佩戴隐形眼镜和/或镜片卫生不良有关
[2
‑
4]
；铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)是突出的致病生物。在革兰氏阴性感染例如假单胞菌的情况下，角膜的结构完整性通过多种毒力因子受到损害，由此微生物侵入上皮细胞，导致许多炎性途径的激活。随后的炎症、新生血管形成、细胞改变和降解基质过程
[5]
导致复杂布置的胶原原纤维的破坏
[6]
。持续的炎症导致间质组织基质的纤维化和失调的重塑，具有更宽、紊乱的胶原原纤维和光学透明度的损失、光折射受损和视力损失。
[0004]
通常，转化生长因子β(transforming growth factor beta，tgfβ)主要局限于健康角膜中的上皮，而局部创伤会诱导上皮和基质内细胞因子包括tgfβ的产生
[7]
。如果在受伤的角膜中，生理性解决方案或外源性药物操作辅助的那些不足以抑制炎性应答，则紊乱的原纤维布置和失调的胞外基质(extracellular matrix，ecm)沉积会导致纤维化反应和永久性角膜瘢痕形成伴视力残疾。从机制上讲，tgfβ激活角膜成纤维细胞(角膜细胞)，从而导致向肌成纤维细胞的分化，通过分泌包括胶原蛋白在内的ecm分子来促进伤口收缩。
[0005]
目前，感染有细菌性角膜炎的患者的标准临床护理最初集中于对感染的眼进行灭菌，通过滴眼剂施用强效广谱抗生素，然后添加表面用皮质类固醇以减轻炎症
[8,9]
。这之后是限制瘢痕形成的策略，从加强润滑(以减少眨眼期间眼睑摩擦伤口床的生物力学创伤)到使用全身性药剂(亚抗微生物剂量的用于基质金属蛋白酶抑制的四环素
[10]
)或补充剂(用作抗氧化剂和自由基清除剂的维生素c
[11]
)以试图促进组织重塑。遗憾的是，虽然对眼灭菌有效，但患者通常会留下高度的角膜朦胧(corneal hazing)，如果其损害视轴，则会导致视敏度损失。治疗无响应且大的角膜缺损的手术干预包括：应用羊膜作为生物活性绷带，从而释放抗炎和抗纤维化因子以增强急性损伤期间的上皮再形成(re
‑
epithelialization)和伤口愈合
[12
‑
14]
；或者在已建立的视觉上显著的中央角膜瘢痕的情况下，切除瘢痕组织并更
换为供体角膜。羊膜移植和角膜移植的临床结果的可重现性和可重复性充满了失败和排斥反应的风险
[15
‑
18]
。
[0006]
如果对损伤和感染的纤维化反应可以减弱，则将使光学清晰度最大化并保留视觉功能，并且可能不需要手术干预和移植。这样的创新有可能防止数百万个体的永久性失明。如上所述，纤维化是由tgfβ
‑
1活性水平升高驱动的，并因此可能可以使用tgfβ拮抗剂来防止纤维化。饰胶蛋白聚糖(decorin)是天然存在的抗纤维化的小的富亮氨酸蛋白聚糖，其以与胶原蛋白结合的高水平天然存在于角膜基质中
22
，并且当被释放时，其通过结合生长因子并将生长因子隔离在ecm内来严格调节tgfβ活性
[19]
。饰胶蛋白聚糖通过调节多种生长因子
[20
‑
24]
(包括tgfβ{zηανγ，2007#28})以及直接干扰胶原蛋白原纤维生成
[25
‑
28]
来调节细胞增殖、存活和分化。人重组(human recombinant，hr)饰胶蛋白聚糖现在可以以gmp形式获得，并且其已显示出具有使脑和脊髓中的纤维化最小化的功能
[29
‑
31]
。迄今为止，尚未报道将可溶性饰胶蛋白聚糖应用于眼表以进行体内治疗的效力。这种情况的可能原因之一可能是由于眼滴剂的黏度相对较低，所以其在早期时间点从角膜表面的清除相对较快(在几分钟的范围内
[32,33]
)，这意味着饰胶蛋白聚糖的任何效力将是有限的。


技术实现要素：

[0007]
在本发明的第一方面中，提供了剪切稀化水凝胶组合物，其包含分散在水性载剂中的：
[0008]
(i)0.1至5.0重量％(例如0.1至3.5重量％、0.1至2.5重量％)的微凝胶颗粒形成聚合物；和
[0009]
(ii)0.5至100mm的单价和/或多价金属离子盐作为交联剂；
[0010]
并且其中所述水凝胶组合物具有在3至8范围内的ph并且当水凝胶暴露于剪切时所述水凝胶组合物的黏度降低。
[0011]
在本发明的另一方面中，剪切稀化水凝胶组合物是适合应用于眼的眼用水凝胶组合物。在本发明的另一方面中，提供了适合应用于眼的眼用水凝胶组合物，其中所述眼用水凝胶组合物包含如本文中限定的剪切稀化水凝胶组合物、基本上由其组成或由其组成。
[0012]
在另一方面中，剪切稀化水凝胶组合物是适合应用于身体表面的表面用水凝胶组合物。在本发明的另一方面中，提供了适合应用于身体表面的表面用水凝胶组合物，其中所述表面用水凝胶组合物包含如本文中限定的剪切稀化水凝胶组合物、基本上由其组成或由其组成。
[0013]
在另一方面中，本发明提供了制备如本文中限定的剪切稀化水凝胶组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0014]
a)将微凝胶形成聚合物溶解在水性载剂中以形成聚合物溶液；
[0015]
b)在高于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的温度下将步骤(a)中形成的微凝胶形成聚合物溶液与单价或多价金属离子盐的水溶液混合；以及
[0016]
c)将来自步骤b)的所得混合物冷却至低于所述微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的温度。
[0017]
在另一方面中，本发明提供了制备如本文中限定的剪切稀化水凝胶组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0018]
a)将微凝胶形成聚合物溶解在包含0.5至100mm的单价和/或多价金属离子盐作为交联剂的水性载剂中，以形成包含0.1至5.0重量％(例如0.1至3.5重量％或0.1至2.5重量％)的微凝胶颗粒形成聚合物的聚合物溶液；
[0019]
b)在高于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的温度下将步骤(a)中形成的微凝胶形成聚合物溶液混合；以及
[0020]
c)在剪切混合下将来自步骤b)的所得混合物冷却至低于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的温度。
[0021]
在另一方面中，本发明提供了剪切稀化水凝胶组合物，其可通过本文中限定的任何制备方法获得、其通过本文中限定的任何制备方法获得或者其通过本文中限定的任何制备方法直接获得。
[0022]
在另一方面中，本发明提供了如本文中限定的剪切稀化水凝胶组合物，其用于治疗。
[0023]
在另一方面中，本发明提供了如本文中限定的剪切稀化水凝胶组合物，其用于眼或表面施用。
[0024]
在另一方面中，本发明提供了如本文中限定的剪切稀化水凝胶组合物，其用于抑制瘢痕形成。
[0025]
在另一方面中，本发明提供了如本文中限定的剪切稀化水凝胶组合物，其用于治疗微生物性角膜炎。
[0026]
在另一方面中，本发明提供了如本文中限定的剪切稀化水凝胶组合物，其用于施用于皮肤伤口。
[0027]
在另一方面中，本发明提供了如本文中限定的剪切稀化水凝胶组合物，其用于通过施用于眼来治疗青光眼。
[0028]
在另一方面中，本发明提供了根据本发明的组合物，其用作药物。本发明组合物的合适的医学用途的一些实例在下文中进一步描述。合适地，本发明的组合物可用作表面用药物。
[0029]
在另一方面中，本发明提供了根据本发明的组合物，其用于抑制瘢痕形成。
[0030]
在本发明的一个合适的实施方案中，根据本发明的组合物用于抑制眼中的瘢痕形成。
附图说明
[0031]
在下文中参考附图进一步描述了本发明的一些实施方案，其中：
[0032]
图1.基于结冷胶的流体水凝胶滴眼剂的处理和固有材料特性。(a)示出了流体凝胶生产的示意图：其中初始溶胶在剪切下持续处理同时进行冷却以形成使用(i)透射显微术和(ii)扫描电子显微术所示出的“带状(ribbon
‑
like)”胶凝实体。(b)针对结冷胶滴眼剂获得的时间依赖性黏度谱，其突出了一定程度的触变性。(c)从滴眼管包装中分配的流体凝胶(凝胶已被染色为蓝色，以便在照片中可见)。(d)在单一频率(1hz，0.5％应变)下获得的作为时间的函数的小变形流变数据。数据示出了剪切之后弹性网络的演变，导致从类液体行为(liquid
‑
like behaviour)转变为类固体行为(solid
‑
like behaviour)。(e)示出了流体凝胶应用之前(顶部图像)和应用之后(底部图像)的眼表的前段oct图像。图像示出了覆
盖整个眼表的均匀层。
[0033]
图2.示出了配制的滴眼剂的生物活性的体外测定。(a)载有hrdecorin的滴眼剂在4小时(240分钟)内的累积释放曲线。最佳拟合线遵循幂函数，y＝0.7x
0.7
(r2＝0.99)。(b)pbs对照、仅胶原蛋白和胶原蛋白+hrdecorin的胶原蛋白原纤维生成浊度数据。(c)具有针对胶原蛋白、胶原蛋白+hrdecorin、胶原蛋白+仅流体凝胶(fluid gel，fg)、胶原蛋白+载有hrdecorin的流体凝胶(hrdecorin loaded fluid gel，decfg)的剂量响应曲线的胶原蛋白原纤维生成浊度数据。
[0034]
图3.角膜混浊面积测量。(a)在假单胞菌感染和处理之后第2、3、9、12和16天时拍摄的代表性照片。(b)示出了如由两名独立的不知情的眼科医生从每组的每只单独小鼠拍摄的照片(在图a中示出)中测量的混浊的平均面积
±
sem(mm2)(n＝6；**p<0.01，***p<0.001)的图。
[0035]
图4.角膜上皮再形成。(a)用于评估上皮的角膜中dari
+
细胞核(蓝色)的代表性图像，其举例说明了以下中的上皮的厚度和分层(细胞层数)：初始未受损伤的眼，其显示出正常的非角化复层(约5层)上皮；感染之后第2天拍摄的眼，其与增厚的水肿基质和细胞浸润有关；以及在处理之后第16天拍摄的眼，在第1组(庆大霉素和泼尼松龙)中显示出再上皮化，具有2至3层分层，伴有间质水肿的减少；在第2组(g.p.fg)中显示出分层增加；并且在第3组(g.p.decfg)中显示出完全成熟的上皮(比例尺100μm)。(b)角膜厚度
±
sem的定量，(c)上皮层厚度
±
sem的定量，以及(d)以下中的细胞上皮分层层
±
sem的定量：初始未受损伤的，(n＝6)；在第2天和来自每个处理组(对于每个组n＝6)的在第16天评估的眼。所有量化都是对观察者未知的掩蔽图像进行的。
[0036]
图5.角膜中的胞外基质水平。免疫组织化学染色的代表性图像以及量化以下的ir的附图：(a)αsma
+
(绿色以对肌成纤维细胞进行染色)、(b)ir纤连蛋白
+
(绿色以对ecm中的纤连蛋白进行染色)和(c)层黏连蛋白
+
(红色以对ecm中的层黏连蛋白进行染色)，在每种情况下都使用dari
+
对细胞核进行染色(蓝色)。对未受损伤的眼、感染之后2天拍摄的眼和用以下多种滴眼剂进行处理16天之后获得的眼进行分析：i)庆大霉素和泼尼松龙(g.p)，ii)庆大霉素、泼尼松龙和流体凝胶(g.p.fg)，以及iii)庆大霉素、泼尼松龙和hrdecorin流体凝胶(g.p.decfg)。所有研究均使用n＝6的处理组进行，其中量化是对观察者未知的掩蔽图像进行的(比例尺＝100μm)。
[0037]
图6.体内实验设计。体内假单胞菌角膜炎研究的实验设计，其中将具有和不具有hrdecorin的流体凝胶滴眼剂与单独的庆大霉素和泼尼松龙滴眼剂进行比较。
[0038]
图7：作为初始结冷胶聚合物浓度的函数的储能模量(g’)，其表示结冷胶微凝胶混悬剂内的弹性结构；使用振幅扫描确定。(a)对于在500rpm的处理速率下制备的不同聚合物浓度在1hz(20℃)下获得的应变扫描。(b)对于在1000rpm的处理速率下的不同聚合物浓度在1hz(20℃)下获得的应变扫描。
[0039]
图8：作为聚合物浓度和处理速度的函数的储能模量的比较。g’在图7中所示的振幅扫描的线性黏弹区(linear viscoelastic region，lvr)内获得。
[0040]
图9：用于治疗干眼症(dry eye)的市售滴眼剂/软膏剂的储能模量的比较。从使用与针对结冷胶混悬剂所述的相同方法进行的振幅扫描中获得的数据。同样，值是在lvr内获得的。虚线表示优化的结冷胶制剂的g’。
[0041]
图10：作为初始结冷胶聚合物浓度的函数的流动谱(flow profile)，其表示结冷胶微凝胶混悬剂的易用性(ease of application)。(a)对于在500rpm的处理速率下制备的不同聚合物浓度在0.1和600s
‑1之间在20℃下获得的黏度扫描。(b)对于在100rpm的处理速率下制备的不同聚合物浓度在0.1和600s
‑1之间在20℃下获得的黏度扫描。
[0042]
图11：在1s
‑1下的作为聚合物浓度和处理速度的函数的微凝胶混悬剂黏度的比较。瞬时黏度是通过使用图10中所示的扫描来测量在1s
‑1下的值而获得的。
[0043]
图12：用于治疗干眼症的市售滴眼剂/软膏剂在1s
‑1下的黏度的比较。从使用与针对结冷胶混悬剂所述的相同方法进行的流动谱中获得的数据。虚线表示优化的结冷胶制剂的黏度。
[0044]
图13：作为所添加的交联剂的函数的储能模量(g’)，其表示结冷胶微凝胶混悬剂内的弹性结构；使用振幅扫描确定。(a)对于用于0.9％(w/v)体系的不同交联剂浓度在1hz(20℃)下获得的应变扫描。(b)对于用于1.8％(w/v)聚合物浓度的不同交联剂浓度在1hz(20℃)下获得的应变扫描。
[0045]
图14：作为交联剂和聚合物浓度的函数的储能模量的比较。g’在图7中所示的振幅扫描的线性黏弹区(lvr)内获得。
[0046]
图15：作为交联剂浓度的函数的流动谱，其表示结冷胶微凝胶混悬剂的易用性。(左)对于用不同浓度的交联剂制备的0.9％(w/v)结冷胶体系在0.1和600s
‑1之间在20℃下获得的黏度扫描。(右)对于用不同浓度的交联剂制备的1.8％(w/v)结冷胶体系在0.1和600s
‑1之间在20℃下获得的黏度扫描。
[0047]
图16：在1s
‑1下的作为聚合物和交联剂浓度的函数的微凝胶混悬剂黏度的比较。瞬时黏度是通过使用图3中所示的扫描来测量在1s
‑1下的值而获得的。
[0048]
图17：作为处理过程中所应用的冷却速率的函数的储能模量(g’)，其表示结冷胶微凝胶混悬剂内的弹性结构；使用振幅扫描确定。(a)对于用于在1000rpm的处理速率下制备的0.9％(w/v)体系的不同冷却速率在1hz(20℃)下获得的应变扫描。(b)对于用于在1000rpm的处理速率下的1.8％(w/v)聚合物浓度的不同冷却速率在1hz(20℃)下获得的应变扫描。
[0049]
图18：作为冷却速率和聚合物浓度的函数的储能模量的比较。g’在图7中所示的振幅扫描的线性黏弹区(lvr)内获得。
[0050]
图19：作为处理过程中所应用的冷却速率的函数的流动谱，其表示结冷胶微凝胶混悬剂的易用性。(a)对于在多种冷却速率下制备的0.9％(w/v)结冷胶体系在0.1和600s
‑1之间在20℃下获得的黏度扫描。(b)对于在多种冷却速率下制备的1.8％(w/v)结冷胶体系在0.1和600s
‑
之间在20℃下获得的黏度扫描。
[0051]
图20：在1s
‑1下的作为聚合物浓度和处理过程中所应用的冷却速率的函数的微凝胶混悬剂黏度的比较。瞬时黏度是通过使用图9中所示的扫描来测量在1s
‑1下的值而获得的。
[0052]
图21：作为处理过程中所施加的机械剪切的函数的储能模量(g’)，其表示结冷胶微凝胶混悬剂内的弹性结构；使用振幅扫描确定。(a)对于用于0.9％(w/v)体系的不同处理速度在1hz(20℃)下获得的应变扫描。(a)对于用于1.8％(w/v)聚合物浓度的不同处理速度在1hz(20℃)下获得的应变扫描。
[0053]
图22：作为处理速度和聚合物浓度的函数的储能模量的比较。g’在图7中所示的振幅扫描的线性黏弹区(lvr)内获得。
[0054]
图23：作为处理过程中所施加的机械剪切的函数的流动谱，其表示结冷胶微凝胶混悬剂的易用性。(a)对于在多种处理速度下制备的0.9％(w/v)结冷胶体系在0.1和600s
‑1之间在20℃下获得的黏度扫描。(b)对于在多种处理速度下制备的1.8％(w/v)结冷胶体系在0.1和600s
‑
之间在20℃下获得的黏度扫描。
[0055]
图24：在1s
‑1下的作为聚合物浓度和胶凝期间的处理速度的函数的微凝胶混悬剂黏度的比较。瞬时黏度是通过使用图9中所示的扫描来测量在1s
‑1下的值而获得的。
[0056]
图25：根据本发明的剪切稀化水凝胶组合物减少了与瘢痕形成相关的标志物在培养的成纤维细胞中的表达。向培养的人真皮成纤维细胞施用tgf
‑
β提高了α
‑
平滑肌肌动蛋白的表达，α
‑
平滑肌肌动蛋白是与瘢痕形成相关的肌成纤维细胞的标志物。图示出了用实验性水凝胶组合物进行的处理对这种表达的影响。具有或不具有抗纤维化剂饰胶蛋白聚糖的水凝胶组合物能够降低α
‑
sma的表达，指示抑制瘢痕形成的能力。
[0057]
图26：针对琼脂、结冷胶、κ卡拉胶和藻酸盐获得的振幅扫描数据。
[0058]
图27：针对琼脂、结冷胶、κ卡拉胶和藻酸盐获得的频率扫描数据。
[0059]
图28：针对琼脂、结冷胶、κ卡拉胶和藻酸盐获得的黏度扫描数据。
[0060]
图29举例说明了关于并入了以下活性剂的根据本发明的剪切稀化水凝胶组合物获得的标准曲线：青霉素
‑
链霉素；地塞米松；蛋白酶k；布洛芬；葡聚糖(dextran)和葡聚糖蓝。
[0061]
图30举例说明了关于并入了以下活性剂的根据本发明的剪切稀化水凝胶组合物获得的曲线：青霉素
‑
链霉素；地塞米松；蛋白酶k；布洛芬；葡聚糖和葡聚糖蓝。
[0062]
图31示出了举例说明使用根据本发明的剪切稀化水凝胶组合物进行的抑菌圈(zone of inhibition)测定结果的照片，所述组合物包含与抗感染剂(青霉素
‑
链霉素)组合的聚合物藻酸盐或结冷胶。这些结果证明了对大肠杆菌(e.coli)和金黄色葡萄球菌(s.aureus)的有效性。结果的总结也在附表中提供。该图还包括举例说明了使用根据本发明的剪切稀化水凝胶组合物进行的抑菌圈测定结果的图，所述组合物包含与替代抗感染剂(万古霉素)组合的藻酸盐。测试了万古霉素针对mrsa的抗微生物有效性。
[0063]
图32示出了展示示例性ecm分子纤维蛋白(在照片中显示为白色凝胶)在从根据本发明的藻酸盐或结冷胶剪切稀化水凝胶组合物释放的活性剂蛋白酶k的作用下随时间分解的照片。
[0064]
图33是举例说明了该研究的结果并比较了以下情况在405nm处的吸光度(y轴)的图：单独的胶原蛋白(“仅胶原蛋白”)、或与单独的饰胶蛋白聚糖(“hrdecorin”)一起孵育的胶原蛋白、或与提高浓度的具有(“decfg”)或不具有(“fg”)人重组饰胶蛋白聚糖(galacorin
tm
)的本发明结冷胶流体凝胶剪切稀化水凝胶组合物一起孵育的胶原蛋白。
[0065]
图34表示用于研究本发明组合物对实验性微生物性角膜炎的作用的小鼠模型。
[0066]
图35列出了示出了以下的图：在不同时间点与不同处理相关的混浊面积、所研究的多个对照组和处理组的高于阈值的α
‑
平滑肌肌动蛋白像素的百分比、所研究的多个对照组和处理组的高于阈值的纤连蛋白像素的百分比，以及所研究的多个对照组和处理组的高于阈值的层黏连蛋白像素的百分比。
[0067]
图36示出了高血压大鼠眼内压的研究结果，其中经处理的大鼠以虚线示出，并且未经处理的对照以实黑线示出。结果用双因素anova和sidak多重比较检验进行分析，并且显示在高眼压大鼠中，本发明的组合物与对照相比到d28时显著降低了眼内压(p<0.05)。
具体实施方式
[0068]
定义
[0069]
术语“水凝胶”在本文中用于指由分散在水性载剂中的亲水性聚合物形成的凝胶。
[0070]
术语“水性载剂”在本文中用于指水或基于水的流体(例如缓冲液，例如如磷酸盐缓冲盐水或生理流体，例如如血清)。
[0071]
术语“微凝胶”在本文中用于指由聚合物的微丝的网络形成的凝胶的微观颗粒。
[0072]
术语“剪切稀化”在本文中用于限定本发明的水凝胶组合物。该术语在本领域中是公知的，并且是指当对水凝胶施加剪切力时黏度降低的水凝胶组合物。本发明的剪切稀化水凝胶组合物具有“静息(resting)”黏度(在没有施加任何剪切力的情况下)，并且当施加剪切力时具有较低的黏度。水凝胶组合物的这种特性使得它们能够流动并且当施加剪切力(例如，通过向包含本发明的水凝胶组合物的管或分配器施加力)时能够被施用于身体。一旦在施加剪切下应用并且所施加的剪切力去除，水凝胶组合物的黏度就会提高。通常，本发明的水凝胶组合物在受到剪切力以施用该水凝胶组合物时将具有低于1pa.s的黏度。在低于1pa.s的黏度下，水凝胶组合物将能够流动。静息黏度通常高于1pa.s，例如大于2pa.s、大于3pa.s或大于4pa.s。
[0073]
应理解，对“治疗”的提及包括预防病症以及缓解已确定的病症症状。因此，“治疗”状态(state)、障碍或病症包括：(1)预防或延迟可能患有或易患有所述状态、障碍或病症但尚未经历或表现出所述状态、障碍或病症的临床或亚临床症状的人中发生的所述状态、障碍或病症的临床症状的出现，(2)抑制所述状态、障碍或病症，即阻止、减少或延迟疾病的发生或其复发(在维持治疗的情况下)或其至少一种临床或亚临床症状，或者(3)缓解或减轻疾病，即，引起状态、障碍或病症或者其临床或亚临床症状中的至少一种的消退。
[0074]“治疗有效量”意指当施用于哺乳动物以治疗疾病时足以实现对疾病的这样的治疗的化合物的量。“治疗有效量”将根据化合物、疾病及其严重程度以及待治疗的哺乳动物的年龄、体重等而变化。
[0075]
在本说明书的描述和权利要求书通篇，词语“包含/包括”和“含有/包含”及其变化形式意指“包括但不限于”，并且其不旨在(并且不)排除其他添加物、组分、整数或步骤。在本说明书的描述和权利要求书通篇，除非上下文另外要求，否则单数涵盖复数。特别地，在使用没有数量词修饰的名词的情况下，除非上下文另外要求，否则本说明书应理解为涵盖一个/种或更多个/种。
[0076]
将读者的注意力引导至与本技术有关的与本说明书同时或在本说明书之前提交并且与本说明书一起公开以供公众查看的所有文件和文献，并且所有这样的文件和文献的内容均通过引用并入本文。
[0077]
本发明的水凝胶组合物
[0078]
在本发明的第一方面中，提供了剪切稀化水凝胶组合物，其包含分散在水性载剂中的：
[0079]
(i)0.1至5.0重量％(例如0.1至3.5重量％或0.1至2.5重量％)的微凝胶颗粒形成聚合物；和
[0080]
(ii)0.5至100mm的单价和/或多价金属离子盐作为交联剂；
[0081]
并且其中所述水凝胶组合物具有在3至8范围内的ph并且当水凝胶暴露于剪切时所述水凝胶组合物的黏度降低。
[0082]
本发明的水凝胶组合物是剪切稀化的，这意味着当水凝胶暴露于剪切时组合物的黏度降低。这种特性使得当施加剪切力时水凝胶能够降低黏度和流动，从而使得能够通过施加剪切力(例如，通过挤压滴眼管或管的侧面)对它们进行分配和施用，例如从滴眼管到管。一旦施用并且施加至水凝胶的剪切力减小，水凝胶的黏度就会提高以形成能够在施用点停留较长时间的较稠凝胶。
[0083]
通常，本发明的水凝胶组合物在受到剪切力以施用所述水凝胶组合物时将具有低于1pa.s的黏度。在低于1pa.s的黏度下，水凝胶组合物将能够流动。静息黏度通常高于1pa.s，例如大于2pa.s、大于3pa.s或大于4pa.s。
[0084]
在一个实施方案中，本发明的剪切稀化水凝胶组合物不包含胶原蛋白和/或纤维蛋白。
[0085]
微凝胶颗粒形成聚合物可以是能够在水性载剂中形成微凝胶颗粒的任何聚合物。由微凝胶颗粒形成聚合物形成的微凝胶颗粒可以具有任何合适的形态(例如，它们可以是线状的丝或者规则或不规则形状的颗粒)和/或粒度。与大凝胶结构相反，微凝胶颗粒的形成促进了期望的剪切稀化特性。不希望受任何特定理论的束缚，假设在不存在剪切或在低剪切水平的情况下，微凝胶颗粒结合在一起，基本上阻碍了水凝胶的整体流动。然而，在施加剪切力时，相邻微凝胶颗粒之间的相互作用被克服，并且黏度降低，从而使得水凝胶组合物能够流动。一旦所施加的剪切力被去除，则相邻微凝胶颗粒之间的相互作用可以重新形成，使得黏度再次提高并且容易流动的能力受到阻碍。
[0086]
合适地，水凝胶组合物包含0.5至5.0重量％的微凝胶颗粒形成聚合物。在一个实施方案中，水凝胶组合物包含0.5至3.5重量％的微凝胶颗粒形成聚合物。在一个实施方案中，水凝胶组合物包含0.5至2.5重量％的微凝胶颗粒形成聚合物。在一个实施方案中，水凝胶组合物包含0.8至1.8重量％的微凝胶颗粒形成聚合物。在另一个实施方案中，水凝胶组合物包含0.8至1.0重量％(例如0.9重量％)的微凝胶颗粒形成聚合物。
[0087]
合适地，微凝胶颗粒形成聚合物是一种或更多种多糖微凝胶颗粒形成聚合物。在一个实施方案中，微凝胶颗粒形成聚合物选自以下组中的一种或更多种：结冷胶、藻酸盐、卡拉胶(例如iota
‑
卡拉胶、κ
‑
卡拉胶)、琼脂、琼脂糖或壳聚糖。在一个具体实施方案中，微凝胶颗粒形成聚合物选自以下组中的一种或更多种：琼脂、结冷胶、藻酸盐或卡拉胶。在一个具体实施方案中，微凝胶颗粒形成聚合物选自以下组中的一种或更多种：结冷胶、藻酸盐或卡拉胶。在一个更具体的实施方案中，微凝胶颗粒形成聚合物选自结冷胶或藻酸盐。在又一个实施方案中，微凝胶颗粒形成聚合物是结冷胶。在又一个实施方案中，微凝胶颗粒形成聚合物是藻酸盐。
[0088]
在一个替代实施方案中，微凝胶颗粒形成聚合物是明胶。
[0089]
合适地，水凝胶组合物是透明或半透明的。在一个具体实施方案中，水凝胶组合物是透明的。
[0090]
在一个实施方案中，水凝胶组合物是透明或半透明的并且微凝胶颗粒形成聚合物选自结冷胶、藻酸盐和/或卡拉胶。在另一个实施方案中，水凝胶组合物是透明的并且微凝胶颗粒形成聚合物选自结冷胶、藻酸盐和/或卡拉胶。在一个具体实施方案中，水凝胶组合物是透明的并且微凝胶颗粒形成聚合物是结冷胶或藻酸盐。在另一个实施方案中，水凝胶组合物是透明的并且微凝胶颗粒形成聚合物是结冷胶。
[0091]
gelan(也称为结冷胶)是由细菌伊乐藻鞘氨醇单胞菌(sphingomonas elodea)产生的水溶性阴离子型多糖。其可以以商品名kelco gel(kelco gel cg la,azelis,uk)以低酰基形式商购获得。
[0092]
水凝胶组合物包含5至100mm的单价和/或多价金属离子盐作为交联剂。金属离子盐可以作为一种组分添加至组合物，但它也可以存在于组合物的其他组分中，例如如存在于组合物中的缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水)或任何生理流体例如如血清的组分中。
[0093]
合适地，水凝胶组合物包含5至40mm的单价和/或多价金属离子盐作为交联剂。在一个实施方案中，水凝胶组合物包含5至30mm的单价和/或多价金属离子盐作为交联剂。在另一个实施方案中，水凝胶组合物包含5至20mm的单价和/或多价金属离子盐作为交联剂。在又一个实施方案中，水凝胶组合物包含5至15mm的单价和/或多价金属离子盐作为交联剂。在又一个实施方案中，水凝胶组合物包含8至12mm(例如10mm)的单价和/或多价金属离子盐作为交联剂。
[0094]
在本发明的一个具体实施方案中，微凝胶颗粒形成聚合物是结冷胶并且组合物包含0.5至40mm、5至15mm、8至12mm或10mm的单价金属离子盐(例如nacl)作为交联剂。
[0095]
在本发明的另一个实施方案中，微凝胶颗粒形成聚合物是藻酸盐并且组合物包含0.5至40mm、5至15mm、8至12mm或10mm的多价金属离子盐(例如ca
2+
盐)作为交联剂。
[0096]
合适地，水凝胶组合物具有在6至8范围内的ph。在一个实施方案中，水凝胶组合物具有在6.5至8范围内的ph。在另一个实施方案中，水凝胶组合物具有在7至7.5范围内的ph(例如ph 7.4)。
[0097]
合适地，本发明的水凝胶组合物具有1pa.s或更大(例如，1pa.s至200pa.s或1pa.s至100pa.s)的静息黏度(即零剪切下的黏度)。更合适地，静息黏度为2pa.s或更大(例如，2pa.s至200pa.s或2pa.s至100pa.s)、3pa.s或更大(例如，3pa.s至200pa.s或3pa.s至100pa.s)、4pa.s或更大(例如，4pa.s至200pa.s或4pa.s至100pa.s)、或者5pa.s或更大(例如，5pa.s至200pa.s或5pa.s至100pa.s)。
[0098]
当水凝胶组合物受到剪切力时，黏度降低。合适地，黏度降低至低于静息黏度的、凝胶可以流动和施用的值。通常，当施加剪切力时，黏度将降低至小于1pa.s的值。
[0099]
在一个实施方案中，水凝胶组合物具有1pa.s或更大(例如，1pa.s至200pa.s或1pa.s至100pa.s)的静息黏度，并且当受到剪切力时，黏度降低至低于1pa.s。
[0100]
在另一个实施方案中，水凝胶组合物具有2pa.s或更大(例如，2pa.s至200pa.s或2pa.s至100pa.s)的静息黏度，并且当受到剪切力时，黏度降低至低于2pa.s(例如，降低至低于1pa.s)。
[0101]
在另一个实施方案中，水凝胶组合物具有3pa.s或更大(例如，3pa.s至200pa.s或3pa.s至100pa.s)的静息黏度，并且当受到剪切力时，黏度降低至低于3pa.s(例如，降低至低于1pa.s)。
[0102]
在另一个实施方案中，水凝胶组合物具有4pa.s或更大(例如，4pa.s至200pa.s或4pa.s至100pa.s)的静息黏度，并且当受到剪切力时，黏度降低至低于4pa.s(例如，降低至低于1pa.s)。
[0103]
在另一个实施方案中，水凝胶组合物具有5pa.s或更大(例如，5pa.s至200pa.s或5pa.s至100pa.s)的静息黏度，并且当受到剪切力时，黏度降低至低于5pa.s(例如，降低至低于1pa.s)。
[0104]
为避免疑义，本文中引用的所有黏度值均在20℃的正常环境温度下引用。本发明的水凝胶组合物的黏度可以使用本领域中公知的标准技术来确定。例如，可以使用配备有喷砂平行板(40mm，1mm间隙高度)的ar
‑
g2(ta instruments,uk)流变仪在20℃下获得黏度谱。
[0105]
合适地，水凝胶在零剪切下具有5pa至40pa的弹性模量。
[0106]
本发明的水凝胶的弹性模量可以通过本领域中公知的技术来确定。
[0107]
一些具体实施方案
[0108]
本发明的一些具体实施方案包括其中剪切稀化水凝胶组合物包含以下的那些：
[0109]
(i)0.1至5.0重量％的微凝胶颗粒形成聚合物(例如，结冷胶)；
[0110]
0.5至40mm的单价金属离子盐(例如，nacl)或多价金属离子盐(例如，ca
2+
)作为交联剂；并且
[0111]
水凝胶组合物的ph为3.5至8。
[0112]
(ii)0.1至5.0重量％的微凝胶颗粒形成聚合物(例如，结冷胶)；
[0113]
0.5至40mm的单价金属离子盐(例如，nacl)或多价金属离子盐(例如，ca
2+
)作为交联剂；并且
[0114]
水凝胶组合物的ph为6至8。
[0115]
(iii)0.1至5.0重量％的微凝胶颗粒形成聚合物(例如，结冷胶)；
[0116]
0.5至40mm的单价金属离子盐(例如，nacl)或多价金属离子盐(例如，ca
2+
)作为交联剂；并且
[0117]
水凝胶组合物的ph为6.5至7.5。
[0118]
(iv)0.1至3.5重量％的微凝胶颗粒形成聚合物(例如，结冷胶)；
[0119]
0.5至40mm的单价金属离子盐(例如，nacl)或多价金属离子盐(例如，ca
2+
)作为交联剂；并且
[0120]
水凝胶组合物的ph为3.5至8。
[0121]
(v)0.1至3.5重量％的微凝胶颗粒形成聚合物(例如，结冷胶)；
[0122]
0.5至40mm的单价金属离子盐(例如，nacl)或多价金属离子盐(例如，ca
2+
)作为交联剂；并且
[0123]
水凝胶组合物的ph为6至8。
[0124]
(vi)0.1至3.5重量％的微凝胶颗粒形成聚合物(例如，结冷胶)；
[0125]
0.5至40mm的单价金属离子盐(例如，nacl)或多价金属离子盐(例如，ca
2+
)作为交联剂；并且
[0126]
水凝胶组合物的ph为6.5至7.5。
[0127]
(1)0.1至2.5重量％的微凝胶颗粒形成聚合物(例如，结冷胶)；
[0128]
0.5至40mm的单价金属离子盐(例如，nacl)或多价金属离子盐(例如，ca
2+
)作为交联剂；并且
[0129]
水凝胶组合物的ph为3.5至8。
[0130]
(2)0.1至2.5重量％的微凝胶颗粒形成聚合物(例如，结冷胶)；
[0131]
0.5至40mm的单价金属离子盐(例如，nacl)或多价金属离子盐(例如，ca
2+
)作为交联剂；并且
[0132]
水凝胶组合物的ph为6至8。
[0133]
(3)0.1至2.5重量％的微凝胶颗粒形成聚合物(例如，结冷胶)；
[0134]
0.5至40mm的单价金属离子盐(例如，nacl)或多价金属离子盐(例如，ca
2+
)作为交联剂；并且
[0135]
水凝胶组合物的ph为6.5至7.5。
[0136]
(4)0.5至2.0重量％的微凝胶颗粒形成聚合物(例如，结冷胶)；
[0137]
0.5至40mm的单价金属离子盐(例如，nacl)或多价金属离子盐(例如，ca
2+
)作为交联剂；并且
[0138]
水凝胶组合物的ph为3.5至8。
[0139]
(5)0.8至1.8重量％的微凝胶颗粒形成聚合物(例如，结冷胶)；
[0140]
0.5至40mm的单价金属离子盐(例如，nacl)或多价金属离子盐(例如，ca
2+
)作为交联剂；并且
[0141]
水凝胶组合物的ph为6至8。
[0142]
(6)0.8至1.0重量％的微凝胶颗粒形成聚合物(例如，结冷胶)；
[0143]
0.5至40mm的单价金属离子盐(例如，nacl)或多价金属离子盐(例如，ca
2+
)作为交联剂；并且
[0144]
水凝胶组合物的ph为6.5至7.5。
[0145]
(7)0.5至2.5重量％的微凝胶颗粒形成聚合物(例如，结冷胶)；
[0146]
0.5至40mm的单价金属离子盐(例如，nacl)或多价金属离子盐(例如，ca
2+
)作为交联剂；并且
[0147]
水凝胶组合物的ph为3.5至8。
[0148]
(8)0.5至2.5重量％的微凝胶颗粒形成聚合物(例如，结冷胶)；
[0149]
5至20mm的单价金属离子盐(例如，nacl)或多价金属离子盐(例如，ca
2+
)作为交联剂；并且
[0150]
水凝胶组合物的ph为6至8。
[0151]
(9)0.5至2.5重量％的微凝胶颗粒形成聚合物(例如，结冷胶)；
[0152]
5至15mm的单价金属离子盐(例如，nacl)或多价金属离子盐(例如，ca
2+
)作为交联剂；并且
[0153]
水凝胶组合物的ph为6至8。
[0154]
(10)0.5至2.5重量％的微凝胶颗粒形成聚合物(例如，结冷胶)；
[0155]
8至12mm(例如，10mm)的单价金属离子盐(例如，nacl)或多价金属离子盐(例如，ca
2+
)作为交联剂；并且
[0156]
水凝胶组合物的ph为6至8。
[0157]
(11)0.5至2.5重量％的微凝胶颗粒形成聚合物(例如，结冷胶)；
[0158]
0.5至40mm的单价金属离子盐(例如，nacl)或多价金属离子盐(例如，ca
2+
)作为交联剂；并且
[0159]
水凝胶组合物的ph为6至8。
[0160]
(12)0.8至1.8重量％的微凝胶颗粒形成聚合物(例如，结冷胶)；
[0161]
5至20mm的单价金属离子盐(例如，nacl)或多价金属离子盐(例如，ca
2+
)作为交联剂；并且
[0162]
水凝胶组合物的ph为6至8。
[0163]
(13)0.8至1.0重量％的微凝胶颗粒形成聚合物(例如，结冷胶)；
[0164]
5至15mm的单价金属离子盐(例如，nacl)或多价金属离子盐(例如，ca
2+
)作为交联剂；并且
[0165]
水凝胶组合物的ph为6至8。
[0166]
(14)0.8至1.0重量％的微凝胶颗粒形成聚合物(例如，结冷胶)；
[0167]
8至12mm(例如，10mm)的单价金属离子盐(例如，nacl)或多价金属离子盐(例如，ca
2+
)作为交联剂；并且
[0168]
水凝胶组合物的ph为6至8。
[0169]
治疗剂
[0170]
在本发明的某些实施方案中，水凝胶组合物可还包含一种或更多种药理学活性剂。可存在任何合适的药理学活性剂。例如，水凝胶组合物可包含选自以下的一种或更多种药理学活性剂：抗纤维化剂；抗感染剂；疼痛缓解剂；抗炎剂；抗增殖剂；角质软化剂；胞外基质调节剂；细胞连接调节剂；基膜调节剂；和色素沉着调节剂。抗纤维化剂可以是饰胶蛋白聚糖。应理解，在本发明的上下文中，当饰胶蛋白聚糖并入到本发明的水凝胶组合物中时，它可以作为并入到水凝胶中的活性剂存在，而不是作为水凝胶本身的成分存在。
[0171]
水凝胶组合物可包含任何合适量的药理学活性剂。例如，水凝胶组合物可包含0.01至50重量％的药理学活性剂。
[0172]
在一个实施方案中，水凝胶组合物包含饰胶蛋白聚糖，任选地量为0.1至1.0mg/ml；0.1至0.5mg/ml；0.1至0.4mg/ml；或0.2至0.3mg/ml。
[0173]
在另一个实施方案中，水凝胶组合物包含饰胶蛋白聚糖，任选地量为0.1至1.0mg/ml；0.1至0.5mg/ml；0.1至0.4mg/ml；或0.2至0.3mg/ml，在以上段落(1)至(14)中限定的任一种水凝胶组合物中。
[0174]
在包含抗感染剂例如抗生素庆大霉素的本发明组合物的一个实施方案中，所述抗感染剂可以以1至5mg/ml的量存在。例如，抗感染剂，例如庆大霉素，可以以1至4mg/ml、1至3mg/ml或1至2mg/ml的量存在。抗感染剂，例如庆大霉素，可以以2至4mg/ml或2.5至3.5mg/ml的量存在。
[0175]
在包含抗炎剂例如类固醇泼尼松龙的本发明组合物的一个实施方案中，所述抗炎剂可以以0.5至250mg/ml的量存在。合适地，抗炎剂例如泼尼松龙可以以1.25至170mg/ml，例如1.25至50mg/ml或1.25至10mg/ml的量存在。
[0176]
眼用组合物
[0177]
在另一方面中，本发明提供了适合施用于眼的眼用水凝胶组合物，其中所述眼用
水凝胶组合物是如上文限定的剪切稀化水凝胶组合物。
[0178]
在本发明的另一方面中，提供了适合应用于眼的眼用水凝胶组合物，其中所述眼用水凝胶组合物包含如上文限定的剪切稀化水凝胶组合物、基本上由其组成或由其组成。
[0179]
本发明的眼用水凝胶组合物适用于施加至眼。
[0180]
表面用组合物
[0181]
在另一方面中，本发明提供了适合于表面施用的水凝胶组合物，其中眼用水凝胶组合物是如上文限定的剪切稀化水凝胶组合物。
[0182]
在本发明的另一方面中，提供了适合于表面施加至身体的表面用水凝胶组合物，其中所述表面用水凝胶组合物包含如上文限定的剪切稀化水凝胶组合物、基本上由其组成或由其组成。
[0183]
制备本发明的水凝胶组合物的方法
[0184]
本发明提供了制备如本文中限定的剪切稀化水凝胶组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0185]
a)将微凝胶颗粒形成聚合物溶解在水性载剂中以形成聚合物溶液；
[0186]
b)在高于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的温度下将步骤(a)中形成的微凝胶颗粒形成聚合物溶液与单价或多价金属离子盐的水溶液混合；以及
[0187]
c)在剪切混合下将来自步骤b)的所得混合物冷却至低于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的温度。
[0188]
合适地，步骤a)通过将微凝胶颗粒形成聚合物和水性载剂加热至高于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的温度来进行。例如，在其中微凝胶颗粒形成聚合物是结冷胶的一些实施方案中，结冷胶/水性载剂混合物可加热至60至90℃(例如70℃)以溶解结冷胶聚合物。
[0189]
应理解，所溶解的聚合物的量将取决于水凝胶组合物中所需的聚合物的量(即，其将在上文中针对水凝胶组合物所限定的限制内)。
[0190]
在步骤b)中，将步骤a)中形成的溶液合适地维持在高于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的温度下，并与单价或多价金属离子盐的水溶液混合。合适地，在步骤b)中，在添加单价或多价金属离子盐的溶液之前、期间和/或之后，持续搅拌来自步骤a)的溶液。例如，混合物可以以50至2000转/分钟(revolution per minute，rpm)的速率混合以确保彻底混合。在一个实施方案中，可以使用300至900rpm或500至800rpm的混合速率。本领域技术人员将理解，可以改变混合速率和混合装置以提供期望水平的剪切/搅拌。
[0191]
在其中微凝胶颗粒形成聚合物是结冷胶的一个实施方案中，来自步骤a)的结冷胶/水性载剂溶液可以被冷却至例如35至50℃(例如40℃)的温度，然后与单价阳离子溶液混合。
[0192]
应理解，所添加的单价或多价金属离子盐溶液的量将取决于最终水凝胶组合物中所需的金属离子盐的量(即，其将在上文中针对水凝胶组合物所限定的限制内)。
[0193]
在步骤c)中，将来自步骤b)的混合物冷却至低于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的温度，使得在水凝胶组合物中形成微凝胶颗粒。合适地，来自步骤b)的混合物在恒定的混合下逐渐冷却。在一个实施方案中，来自步骤b)的混合物在施加持续搅拌/剪切的情况下以恒定的冷却速率冷却。在搅拌/剪切下的冷却可以继续直到混合物达到环境温度(例如20
℃)，此时可以收集并储存最终的水凝胶组合物，例如在冷藏条件下。
[0194]
步骤c)中使用的冷却速率和所施加的剪切/搅拌量可以变化。例如，可以使用0.2至4℃/分钟、0.5至3℃/分钟、0.5至2℃/分钟、0.5至1.5℃/分钟或1℃/分钟的冷却速率。所施加的剪切量可以是例如50至2000rpm、300至900rpm或400至500(例如450)rpm。可以使用任何合适的设备来提供所需的搅拌/剪切。在所附实施例中，使用配备有杯(cup)和叶片几何形状(杯：直径35mm，叶片：直径28mm)的旋转流变仪(ar
‑
g2,tainstruments,uk)来提供所需的剪切。
[0195]
可以
[0196]
i)在步骤a)期间
[0197]
ii)在步骤b)期间；或者
[0198]
iii)在步骤c)期间在其中来自步骤b)的混合物处于高于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的温度下的点添加药理学活性剂。
[0199]
合适地，将药理学活性剂添加至所述方法的步骤b)或步骤c)中的混合物。合适地，在步骤c)期间，在混合物高于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的点，添加药理学活性剂。最合适地，将来自步骤b)的混合物冷却至高于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的温度，添加药理学活性剂并将其彻底混合到混合物中，并随后将混合物进一步冷却至低于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的温度。
[0200]
合适地，将药理学活性剂添加至步骤b)或步骤c)中水溶液形式的混合物。
[0201]
在一个实施方案中，药理学活性剂是饰胶蛋白聚糖。
[0202]
在另一方面中，本发明提供了制备如本文中限定的剪切稀化水凝胶组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0203]
a)将微凝胶颗粒形成聚合物溶解在包含0.5至100mm的单价和/或多价金属离子盐作为交联剂的水性载剂中；
[0204]
b)在高于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的温度下将步骤(a)中形成的微凝胶形成聚合物溶液混合；以及
[0205]
c)将来自步骤b)的所得混合物冷却至低于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的温度。
[0206]
在本发明的上述方面中，除了将微凝胶颗粒形成聚合物直接溶解在包含0.5至100mm的单价和/或多价金属离子盐作为交联剂的水性载剂中之外，该方法与以上限定的先前方法相同。上述步骤a)、b)和c)的条件和变量同样适用于所述方法的这种变体。
[0207]
在另一方面中，本发明提供了剪切稀化凝胶组合物，其可通过本文中所限定的任何制备方法获得、其通过本文中所限定的任何制备方法获得或者其通过本文中所限定的任何制备方法直接获得。
[0208]
本发明组合物的医学用途和使用本发明组合物的治疗方法
[0209]
本发明的一个方面提供了用作药物的本发明组合物。本发明组合物适合于以下医学用途：抑制瘢痕形成(如在本发明的另一方面中所述的)；以及预防和/或治疗感染；预防和/或治疗疼痛；预防和/或治疗炎症；以及预防和/或治疗增殖性疾病。用于这样的医学用途的组合物可根据需要包含选自以下的活性剂：抗纤维化剂；抗感染剂；疼痛缓解剂；抗炎剂；抗增殖剂；角质软化剂；胞外基质调节剂；细胞连接调节剂；基膜调节剂；生物润滑剂；和
色素沉着调节剂。
[0210]
在不偏离上述内容的情况下，本发明人还发现不包含药理学活性剂的本发明组合物可成功地用于抑制瘢痕形成。本文中提供的数据证明了这样的用途。
[0211]
应理解，本发明组合物也适用于医学治疗的方法。例如，本发明组合物可用于选自以下的方法：用于抑制瘢痕形成的方法；用于预防和/或治疗感染的方法；用于预防和/或治疗疼痛的方法；用于预防和/或治疗炎症的方法；用于预防和/或治疗增殖性疾病的方法；用于预防和/或治疗色素沉着(hyperpigmentation)的方法；用于预防和/或治疗色素减退(hypopigmentation)的方法；用于诱导角质松解(keratolysis)的方法；需要调节胞外基质的方法；需要调节细胞连接的方法；以及需要调节基膜的方法。
[0212]
在实施这样的方法时，可以根据需要向以下对象施用本发明组合物：需要抑制瘢痕形成的对象；需要预防和/或治疗感染的对象；需要预防和/或治疗疼痛的对象；需要预防和/或治疗炎症的对象；需要预防和/或治疗增殖性疾病的对象；需要预防和/或治疗色素沉着的对象；需要预防和/或治疗色素减退的对象；需要角质松解的对象；需要调节胞外基质的对象；需要调节细胞连接的对象；以及需要调节基膜的对象。
[0213]
如上所述，用于这样的治疗方法的组合物可根据需要包含选自以下的活性剂：抗纤维化剂；抗感染剂；疼痛缓解剂；抗炎剂；抗增殖剂；角质软化剂；胞外基质调节剂；细胞连接调节剂；基膜调节剂；生物润滑剂；和色素沉着调节剂。
[0214]
用于抑制瘢痕形成的方法可以包括施用不包含药理学活性剂的本发明组合物。
[0215]
除非在上下文另有要求的情况下，否则本公开内容中阐述的关于本发明组合物的医学用途的考虑也应被视为适用于使用本发明组合物的治疗方法。类似地，本公开内容中阐述的关于使用本发明组合物的治疗方法的考虑也应被视为适用于本发明组合物的医学用途。
[0216]
抑制瘢痕形成
[0217]
认为瘢痕形成在许多临床情况下会导致有害作用。例如，眼的瘢痕形成可与失明和失明风险有关，而皮肤中的瘢痕形成可与行动性降低、不适和毁容(这可引起心理上的困难)有关。
[0218]
瘢痕形成还可引起并发症，并因此降低手术操作的有效性。仅举例来说，在手术插入支架(例如用于治疗青光眼)之后出现的瘢痕形成可完全或部分地阻塞支架中的通道，从而使手术无效。
[0219]
应理解，“抑制瘢痕形成”涵盖部分抑制瘢痕形成和完全抑制瘢痕形成二者。下文进一步描述了与根据本发明可抑制瘢痕形成的程度相关的合适值。
[0220]
本发明组合物可用于抑制在许多身体部位处的瘢痕形成或纤维化。仅举例来说，本发明的组合物可用于抑制：眼中的瘢痕形成；皮肤中的瘢痕形成；肌或腱中的瘢痕形成；神经中的瘢痕形成；内脏器官例如肝或肺的纤维化；或者黏连例如手术黏连或网膜黏连的形成。
[0221]
可通过本发明组合物的医学用途来抑制的眼中瘢痕形成的种类包括角膜的瘢痕形成、视网膜的瘢痕形成、眼表的瘢痕形成和视神经中和周围的瘢痕形成。虽然本发明组合物适合于表面使用，但是应理解，表面施用的药剂可对内部解剖学具有影响。因此，施用于眼表的组合物可有效抑制眼内瘢痕形成。
[0222]
可通过本发明组合物的医学用途来抑制的眼中瘢痕形成还可包括与感染例如角膜炎相关的瘢痕形成。这样的角膜炎可由微生物感染、病毒感染、寄生虫感染或真菌感染引起。本发明的组合物和方法在抑制与微生物性角膜炎相关的瘢痕形成方面显示出特别的效用。
[0223]
角膜炎也可因受伤或包括自身免疫病(例如类风湿性关节炎或舍格伦综合征(sjogren’s syndrome))在内的疾病而引起。本发明的组合物和方法还可用于抑制与由这些原因引起的角膜炎相关的瘢痕形成。
[0224]
可通过本发明组合物的医学用途来抑制的眼中瘢痕形成还可包括：与手术例如用于治疗青光眼的手术(例如通过插入支架)和手术操作例如lasik或lasek手术相关的瘢痕形成；以及与意外伤害相关的瘢痕形成。
[0225]
合适地，用于抑制瘢痕形成的本发明组合物可包含结冷胶。令人惊讶地，包含结冷胶的本发明组合物能够有效地抑制瘢痕形成，即使在不存在药理学活性剂例如活性抗纤维化剂的情况下也是如此。也就是说，将抗纤维化剂并入到本发明的组合物中证明了在抑制瘢痕形成方面的有益特性。仅举例来说，饰胶蛋白聚糖代表了适合于并入到用于抑制瘢痕形成的本发明组合物中的这样的抗纤维化剂的一个实例。
[0226]
技术人员将知道允许鉴定和量化瘢痕形成的许多合适的方法。这些方法也可用于鉴定瘢痕形成的抑制。因此，它们可用于举例说明本发明组合物的有效医学用途、鉴定抗纤维化剂的治疗有效剂量以及鉴定和/或选择并入到本发明组合物中的抗纤维化剂。
[0227]
技术人员将意识到，存在许多这样的参数：通过这些参数可以评估眼中瘢痕形成的抑制。这些参数的一些实例在实施例中进一步讨论。这些中的一些，例如ecm组分或肌成纤维细胞的诱导，也常见于眼之外的身体部位，而另一些则是眼特有的。
[0228]
例如，眼中的瘢痕形成可通过角膜混浊提高来指示。这样的角膜混浊提高可通过不透明的角膜面积的增加来证明。因此，瘢痕形成的抑制可通过与合适的对照相比角膜混浊降低来指示。这样的角膜混浊降低可通过不透明的角膜面积的减少来证明。
[0229]
在实施例中列出的数据中证明了包含抗纤维化剂饰胶蛋白聚糖的本发明组合物降低角膜混浊以及随时间维持这样的降低的能力。
[0230]
本发明组合物可用于抑制与皮肤伤口相关的瘢痕形成。合适的皮肤伤口可选自：烧伤；切口；切除；擦伤；慢性伤口；以及由身体对刺激的反应引起的伤口。后一类别的一些实例包括：导致皮肤严重起水疱和脱落的全身性化学反应和/或变态反应，以及导致皮肤结构和体内平衡受损的遗传相关疾病。这些反应或疾病可导致皮肤起水疱、脱皮以及受伤风险和受伤严重程度(即使由于相对较小的接触)显著提高。这样的疾病的一些实例包括大疱性表皮松解症(例如单纯型大疱性表皮松解症、交界型大疱性表皮松解症或营养不良型大疱性表皮松解症)和金德勒综合征(kindler syndrome)。本发明的组合物或方法适用于在患有这样的疾病的对象中抑制瘢痕形成。
[0231]
指示瘢痕形成的其他参数对于许多不同的组织可能是共同的。例如，许多身体部位处的瘢痕形成可通过提高的肌成纤维细胞的存在来指示。这样的提高可通过α
‑
平滑肌肌动蛋白表达的提高来证明。因此，瘢痕形成的抑制可通过与合适的对照相比肌成纤维细胞数目的减少来指示。该种类的肌成纤维细胞数目的减少可通过α
‑
平滑肌肌动蛋白表达的降低来证明。
[0232]
肌成纤维细胞在受伤部位处发育，并与瘢痕形成反应的进展有关。它们的特征在于它们表达α
‑
平滑肌肌动蛋白(α
‑
sma)。肌成纤维细胞对瘢痕形成具有许多不良作用，包括在愈合的区域内引起收缩。如在体外和体内评估的，本发明组合物能够抑制α
‑
sma表达。
[0233]
如实施例中进一步讨论的，在微生物性角膜炎的实验模型中，本发明组合物(具有或不具有抗纤维化剂饰胶蛋白聚糖)能够在体内抑制肌成纤维细胞分化。所述组合物，并且尤其是并入了饰胶蛋白聚糖的那些，也能够随时间维持这种降低的分化。
[0234]
肌成纤维细胞分化可响应于tgf
‑
β1的作用而提高，tgf
‑
β1是一种引起对α
‑
sma表达的诱导的纤维化生长因子。实施例列出了体外研究(在人真皮成纤维细胞中)的细节，其举例说明了本发明组合物阻断α
‑
sma表达的这种提高的能力。这举例说明了通过本发明组合物实现的对瘢痕形成的有益抑制不限于眼。此外，瘢痕形成的抑制看起来是凝胶组合物本身的抗纤维化作用，因为其即使在不存在活性抗纤维化剂的情况下也能观察到。
[0235]
纤维化还与ecm成分的表达和沉积有关。在瘢痕形成中沉积的ecm的量可增加，并且ecm的布置可与未受损的比较组织中发现的不同。实施例中提供的数据举例说明了使用本发明组合物的治疗产生了其中ecm组分的布置更接近于未受伤组织的布置的组织，由此举例说明了这些组合物在抑制瘢痕形成中的效用。
[0236]
本发明的组合物适用于手术切口部位，以抑制可能以其他方式与这样的手术伤口的愈合有关的瘢痕形成。
[0237]
与合适的对照剂相比，适合于并入到本发明组合物中的抗纤维化剂可能能够实现至少5％的纤维化抑制。例如，与合适的对照剂相比，合适的抗纤维化剂可能能够实现至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的抑制。与合适的对照剂相比，适合于并入到本发明组合物中的抗纤维化剂可能能够基本上实现对瘢痕形成的完全抑制。
[0238]
出于同样的原因，与合适的对照相比，本发明组合物抑制瘢痕形成的医学用途或使用这样的组合物抑制瘢痕形成的治疗方法可实现至少5％的抑制。例如，与合适的对照相比，这样的医学用途或治疗方法可实现至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的抑制。与合适的对照相比，本发明的医学用途或治疗方法可以基本上实现对瘢痕形成的完全抑制。
[0239]
本领域技术人员将容易地确定合适对照的选择。仅举例来说，用于评估本发明组合物抑制眼中的瘢痕形成的能力的合适对照可以由公认的标准护理(standard of care)或其实验性代用物提供。
[0240]
适合于并入到本发明组合物中的活性剂
[0241]
旨在用于医学用途或用于治疗方法的本发明组合物可包含另外的活性剂。可以参考预期的医学用途来选择合适的活性剂。然而，为了举例说明，合适的活性剂可选自：抗纤维化剂；抗感染剂；疼痛缓解剂；抗炎剂；抗增殖剂；角质软化剂；胞外基质调节剂；细胞连接调节剂；基膜调节剂；生物润滑剂；和色素沉着调节剂。为避免疑义，本发明的组合物可合适地包含多于一种活性剂。在组合物包含多于一种活性剂的情况下，所述活性剂可以是特定类别活性剂内的多于一种活性剂(例如，两种或更多种抗纤维化剂)，或选自两种或更多种
不同类别的药剂的组合(例如抗纤维化剂和抗感染剂，或抗纤维化剂和疼痛缓解剂)。
[0242]
可并入到本发明组合物中的抗纤维化剂的一些实例在下文中更详细地讨论。
[0243]
仅举例来说，适合于作为活性剂并入到本发明组合物中的抗感染剂可以是抗微生物剂、抗病毒剂、抗真菌剂或抗蠕虫剂。在抗微生物剂的情况下，合适的抗感染剂可以是抗生素，例如庆大霉素、青霉素、链霉素(任选地组合，如青霉素
‑
链霉素)或万古霉素。可并入到本发明组合物中的抗微生物剂的许多其他合适的实例，包括其他抗生素，将是本领域技术人员公知的。
[0244]
包含抗感染剂的本发明组合物可用于预防和/或治疗感染的方法中。因此，应理解，这样的组合物可以施用于需要预防和/或治疗感染的对象。需要这样的预防和/或治疗的对象可以是具有慢性伤口或感染的伤口的对象。仅举例来说，处于发生慢性伤口的风险之中的对象可以是患有糖尿病、慢性静脉功能不全或周围动脉闭塞性病的对象。
[0245]
使用抗感染剂的本发明的组合物或方法的一些实施方案还可用于预防或治疗疾病，例如可能与感染(例如，微生物性角膜炎)相关的瘢痕形成。
[0246]
适合于作为活性剂并入到本发明组合物中的疼痛缓解剂可选自：镇痛药、麻醉剂，例如苯佐卡因、丙美卡因、丁卡因、阿替卡因、地布卡因、利多卡因、丙胺卡因、普莫卡因和达克罗宁，或其酯、酰胺或醚；水杨酸盐/酯，例如水杨酸或乙酰水杨酸；发红剂，例如薄荷醇、辣椒素和/或樟脑，以及非甾体抗炎药(non
‑
steroidal anti
‑
inflammatory drug，nsaid)，例如布洛芬。
[0247]
包含疼痛缓解剂的本发明组合物可用于预防和/或治疗疼痛的方法中。因此，这样的组合物可以施用于需要预防和/或治疗疼痛的对象。合适地，需要这样的预防和/或治疗的对象可以是患有与皮肤疼痛或肌肉骨骼疼痛相关的病症或处于患有所述病症的风险之中的对象。
[0248]
用于作为活性剂并入到本发明组合物中的抗炎剂可选自：类固醇，例如皮质类固醇(例如泼尼松龙或地塞米松)；nsaid，例如布洛芬，或cox
‑
1和/或cox
‑
2酶抑制剂；抗组胺剂，例如h1受体拮抗剂；白介素
‑
10；吡非尼酮；免疫调节剂；和类肝素剂(heparin
‑
like agent)。葡聚糖或经修饰的硫酸葡聚糖和饰胶蛋白聚糖也代表可作为抗炎剂并入到本发明组合物中的合适药剂。技术人员将理解这些分子能够在体内发挥抗炎或促炎作用，但将意识到科学文献和临床文献提供了丰富的信息以允许选择合适的剂量来发挥期望的活性(抗炎或促炎)。
[0249]
包含抗炎剂的本发明组合物可用于预防和/或治疗炎症的方法中。因此，这样的组合物可以施用于需要预防和/或治疗炎症的对象。合适地，对象可以是患有慢性炎症或急性炎症或者处于发生慢性炎症或急性炎症的风险之中的对象。仅举例来说，慢性炎症可能与类风湿性关节炎或皮炎有关。急性炎症可由伤口引起。
[0250]
用于作为活性剂并入到本发明组合物中的抗增殖剂可选自：toll样受体7(tlr7)激动剂、toll样受体2(tlr2)激动剂、toll样受体4(tlr4)激动剂、toll样受体9(tlr9)激动剂；和抗代谢药。这样的tlr7激动剂的一个合适实例是咪喹莫特。这样的抗代谢药的一个合适实例是氟尿嘧啶(5
‑
fu)。
[0251]
包含抗增殖剂的本发明组合物可用于预防和/或治疗增殖性疾病的方法中。因此，这样的组合物可以施用于需要预防和/或治疗增殖性疾病的对象。合适地，对象可以是患有
皮肤增殖性疾病或处于发生皮肤增殖性疾病的风险之中的对象，所述皮肤增殖性疾病例如银屑病、癌症(例如黑素瘤或非黑素瘤皮肤癌)、湿疹或鱼鳞病。
[0252]
用于作为活性剂并入到本发明组合物中的角质软化剂可选自：酸，例如水杨酸、α羟基酸、β羟基酸和/或乳酸；酶，例如木瓜蛋白酶和/或菠萝蛋白酶；类视黄醇，例如视黄醇和/或维a酸。使用角质软化剂(例如菠萝蛋白酶)的本发明的组合物或方法可用于伤口例如烧伤的清创。
[0253]
适合于并入到本发明组合物中的胞外基质调节剂可选自：蛋白酶(例如蛋白酶k)；基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，mmp)；膜型mmp(mtmmp)；去整合素(adamalysin)(adam)；adam与溶血栓素(adamts)；解整联蛋白；金属蛋白酶组织抑制剂(timp)；丝氨酸蛋白酶，例如尿激酶；组织纤溶酶原激活剂；弹性蛋白酶；蛋白裂解酶(matriptase)；以及与基质重塑过程有关的酶，例如组织蛋白酶、乙酰肝素酶和硫酸酯酶。
[0254]
使用胞外基质调节剂的本发明的组合物或方法可用于需要调节和重塑ecm和/或调节细胞
‑
细胞黏附和细胞
‑
基质相互作用的应用中。举例来说，这样的应用可包括治疗肥厚性瘢痕或瘢痕疙瘩。根据这样的实施方案的组合物或方法可通过促进胶原蛋白比例的有益平衡或通过直接靶向ecm成分例如胶原蛋白的产生来提供临床优势。
[0255]
适合于并入到本发明组合物中的细胞连接调节剂可选自：三磷酸腺苷(atp)；环磷酸腺苷(camp)；三磷酸肌醇(ip3)；葡萄糖；谷胱甘肽；谷氨酸盐；和选自钠、钾和钙离子的离子。合适地，这样的细胞连接调节剂可以是影响细胞连接的组分例如间隙连接蛋白的抗体或其他肽。这样的蛋白质的一些实例包括钙黏着蛋白以及α
‑
联蛋白和β
‑
联蛋白。合适地，这样的药剂可以实现微管干扰。紧密连接可受到组分例如闭合蛋白、一种或更多种密封蛋白和连接黏附分子1(jam
‑
1)的干扰的影响。
[0256]
富血小板血浆(血清)可并入到本发明的组合物中。
[0257]
使用细胞连接调节剂的本发明的组合物或方法可用于治疗难以愈合的慢性伤口，例如溃疡。
[0258]
适合于并入到本发明组合物中的基膜调节剂可以是针对黏附的药剂。这样的药剂可选自：抑制整联蛋白、层黏连蛋白或黏着斑组分(例如黏着斑蛋白、踝蛋白、α
‑
辅肌动蛋白、kindlin等)的活性的阻断抗体或竞争肽。或者，合适的基膜调节剂可包含蛋白酶，例如蛋白酶k。
[0259]
使用基膜调节剂的本发明的组合物或方法也可用于治疗难以愈合的慢性伤口，例如溃疡。
[0260]
出于本公开内容的目的，生物润滑剂被认为是源自生物来源的能够用作润滑剂的药剂。在一个合适的实施方案中，用于并入到本发明水凝胶组合物中的生物润滑剂可以是血清。如下所述，血清在治疗多种眼疾病中具有治疗效用。因此，包含血清的本发明水凝胶组合物可以适合于作为滴眼剂用于眼施用。
[0261]
使用生物润滑剂例如血清的本发明的组合物或方法可用于预防和/或治疗病症，包括选自干眼综合征和干燥综合征( syndrome)的那些。
[0262]
本发明的组合物或方法可以使用色素调节剂。用于作为活性剂并入到本发明组合物中的色素调节剂可选自：脱色剂；和色素沉着促进剂。
[0263]
用于并入到本发明组合物中的合适的脱色剂可选自姜黄；黑色素产生抑制剂；和
抗氧化剂。黑色素产生抑制剂的一些合适实例可包括氢醌、间苯二酚、白藜芦醇或壬二酸。抗氧化剂的一些合适实例可包括维生素c、维生素e、谷胱甘肽、姜黄或阿魏酸。
[0264]
适合于并入到本发明组合物中的色素沉着促进剂包括影响黑色素途径组分的物质。这些物质可选自：酪氨酸(其被酪氨酸酶羟基化为l
‑
3,4
‑
二羟基苯丙氨酸(多巴(dopa)))；和多巴(其被氧化为多巴醌，并且在存在半胱氨酸基团的情况下，产生棕黑色素(phaeomelanin))。真黑色素的产生需要两种另外的酶的作用：酪氨酸酶相关蛋白1(trp1)和2(trp2/dct)，其重新布置多巴色素(由多巴醌的自发循环氧化产生)以形成dhi
‑2‑
羧酸(dhica)。这些酶或其底物也可以代表合适的色素沉着调节剂。
[0265]
使用色素沉着调节剂的本发明的组合物或方法可用于与不期望的色素减退或色素沉着相关的广泛的临床环境中。这些包括瘢痕形成，例如手术后瘢痕形成或病理性瘢痕形成(例如肥厚性瘢痕形成或疙瘩瘢痕形成)。
[0266]
包含脱色剂的本发明组合物可用于预防和/或治疗色素沉着病症的方法中。因此，这样的组合物可以施用于需要预防和/或治疗色素沉着病症的对象。合适地，对象可以是患有黄褐斑、炎症后色素沉着或艾迪生病(addison’s disease)或者处于黄褐斑、炎症后色素沉着或艾迪生病的风险之中的对象。
[0267]
在一个合适的实施方案中，根据本发明的组合物可包含用于与选自以下的一种或更多种药剂组合使用的抗纤维化剂：类固醇；和抗微生物剂。抗纤维化剂、类固醇和抗微生物剂可配制在分开的组合物中，或配制为相同组合物的一部分。
[0268]
合适地，本发明的组合物可包含用于与抗感染剂庆大霉素和抗炎剂泼尼松龙组合使用的饰胶蛋白聚糖。该种类的组合物可包含饰胶蛋白聚糖、泼尼松龙和庆大霉素。本发明的这样的组合物适用于抑制与微生物性角膜炎相关的瘢痕形成，如实施例中列出的数据所示。
[0269]
在一个合适的实施方案中，本发明的组合物可包含抗炎剂和疼痛缓解剂。这样的组合物在例如慢性炎性疾病例如皮炎或类风湿性关节炎的情况(其中可期望预防和/或治疗疼痛和炎症)下可具有特别的效用。
[0270]
在另一个实例中，本发明的组合物可包含疼痛缓解剂和抗感染剂。这样的组合物在皮肤伤口的情况(其中可期望预防和/或治疗疼痛和感染)下可具有特别的效用。其他合适的活性剂组合是本领域技术人员已知的。
[0271]
用于医学用途的本发明组合物可并入有治疗有效量的活性剂。这样的治疗有效量将能够在单次施用中或者作为包含多次发生的施用的治疗过程的一部分实现期望的临床结果。技术人员将充分了解用于计算多个种类的活性剂的治疗有效量的合适方案和程序。
[0272]
合适地，活性剂可以以0.1ng/ml至10mg/ml的浓度并入到本发明组合物中。例如，活性剂可以以1ng/ml至5mg/ml、10ng/ml至2.5mg/ml、或20ng/ml至1mg/ml、约0.1μg/ml至0.5μg/ml，合适地约0.24μg/ml的浓度并入到本发明组合物中。
[0273]
抗纤维化剂
[0274]
抗纤维化剂是能够引起对向其提供所述抗纤维化剂的对象中或身体部位处的瘢痕形成的抑制的药剂。下面更一般地考虑瘢痕形成的抑制。
[0275]
许多抗纤维化剂是本领域技术人员已知的。因此，技术人员将能够容易地确定可以有利地并入到本发明组合物中用于抑制瘢痕形成的抗纤维化剂。下面提供了适合于这样
的用途的抗纤维化剂实例的非排他性列表。
[0276]
合适的抗纤维化剂可选自：抗纤维化胞外基质(ecm)组分；抗纤维化生长因子(出于本公开内容的目的，其应被视为还涵盖抗纤维化细胞因子、趋化因子等)；聚合物，例如葡聚糖或经修饰的硫酸葡聚糖；和纤维化剂的抑制剂，例如功能阻断抗体。应理解，这样的药剂的治疗有效性将依赖于本发明组合物提供的剂量。技术人员将了解广泛的文献和临床资源以允许选择任何所列出药剂的合适剂量来实现期望的治疗目标。
[0277]
葡聚糖或经修饰的硫酸葡聚糖能够在体内发挥抗纤维化作用和促纤维化作用二者。在葡聚糖或经修饰的硫酸葡聚糖的抗纤维化用途的背景下，技术人员将了解用于抗纤维化目的的合适剂量可为0.1至10mg/kg对象体重。在一个合适的实施方案中，用于本发明组合物中的葡聚糖或经修饰的硫酸葡聚糖可具有10kda或更小的分子量。
[0278]
抗体可通过与细胞信号传导剂结合并由此阻断由这些药剂的活性引起的功能来用于破坏某些细胞活动。可被阻断的这样的活动的一些实例包括：细胞增殖、细胞迁移、蛋白酶产生、细胞凋亡和失巢凋亡。仅举例来说，合适的阻断抗体可能能够结合以下细胞信号传导剂组中的一种或更多种：ecm组分、生长因子、细胞因子、趋化因子或matrikine。
[0279]
饰胶蛋白聚糖是抗纤维化ecm组分的一个实例，其可以有利地并入到本发明的组合物中。饰胶蛋白聚糖可以是人饰胶蛋白聚糖。合适地，饰胶蛋白聚糖可以是人重组饰胶蛋白聚糖。可以并入到本发明组合物中的人重组饰胶蛋白聚糖的一个实例是由catalent pharma solutions,inc.以“galacorin
tm”的名称生产和销售的。
[0280]
用于并入到本发明组合物中的饰胶蛋白聚糖可以是这种蛋白聚糖的全长天然存在形式。或者，本发明的组合物可以使用天然存在的饰胶蛋白聚糖的抗纤维化片段或抗纤维化变体。
[0281]
天然存在的饰胶蛋白聚糖是一种蛋白聚糖。蛋白聚糖(包含核心蛋白和糖胺聚糖链二者)或其片段可用于本发明的水凝胶组合物。然而，本发明人已经证明单独的核心蛋白(没有糖胺聚糖链)足以抑制眼中的瘢痕形成。因此，在本说明书中对饰胶蛋白聚糖(或其片段或变体)的提及可以替代地被解释为针对没有糖胺聚糖链的核心蛋白。本发明人认为，用于与纤维化生长因子(例如tgf
‑
β)结合并阻断其生物学功能的是饰胶蛋白聚糖的核心蛋白。
[0282]
饰胶蛋白聚糖的合适的抗纤维化片段可占全长天然存在分子的多至50％、全长天然存在分子的多至75％、或全长天然存在分子的多至90％。合适的饰胶蛋白聚糖抗纤维化片段可包含饰胶蛋白聚糖的tgf
‑
β结合部分。
[0283]
饰胶蛋白聚糖的抗纤维化变体与天然存在蛋白聚糖的不同之处在于核心蛋白的氨基酸序列中存在一个或更多个突变。这些突变可引起核心蛋白中存在的一个或更多个氨基酸残基的添加、缺失或替换。仅举例来说，与天然存在核心蛋白的氨基酸序列相比，适合于并入到本发明组合物中的合适的饰胶蛋白聚糖抗纤维化变体可包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少15个或至少20个突变。
[0284]
除非在上下文另有要求的情况下，否则本文中对饰胶蛋白聚糖的提及，连同该药剂在本发明组合物中的并入，也应被视为涵盖饰胶蛋白聚糖的抗纤维化片段或抗纤维化变体的使用。
[0285]
在一个合适的实施方案中，饰胶蛋白聚糖构成本发明组合物中存在的唯一ecm组
分。
[0286]
适合于并入到本发明组合物中的抗纤维化生长因子包括选自以下的那些：转化生长因子β3、血小板源性生长因子aa、胰岛素样生长因子
‑
1、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，fgf)2、fgf7、fgf10、fgf22、血管内皮生长因子a、角质形成细胞生长因子和肝细胞生长因子。
[0287]
纤维化剂的抑制剂代表可并入到本发明组合物中的合适的抗纤维化剂。这样的抑制剂的一些实例包括与纤维化剂结合并由此阻断纤维化剂活性的药剂。这样的抑制剂的一些实例包括功能阻断抗体(以上进一步讨论的)，或细胞受体(纤维化剂通过其诱导细胞信号传导)的可溶性片段。这样的抑制剂的其他实例包括阻止纤维化剂表达的药剂。这些种类的抑制剂的一些实例包括选自反义寡核苷酸和干扰rna序列的那些。
[0288]
适用于抑制瘢痕形成的本发明的组合物可并入治疗有效量的抗纤维化剂。这样的治疗有效量将能够在单次施用中或者作为包含多次发生的施用的治疗过程的一部分抑制瘢痕形成。上文考虑了可如何评估瘢痕形成的抑制以及因此可如何计算或识别治疗有效量的细节。
[0289]
仅举例来说，抗纤维化剂(例如饰胶蛋白聚糖)可以以0.1ng/ml至10mg/ml、1ng/ml至5mg/ml、10ng/ml至2.5mg/ml、20ng/ml至1mg/ml、约0.1μg/ml至0.5μg/ml，合适地约0.24μg/ml的浓度并入到本发明的组合物中。
[0290]
表面施用和表面组合物
[0291]
本发明的组合物适合于表面施用于对象。为避免疑义，在本公开内容的上下文中，“表面施用”被认为涉及将组合物直接施用于身体表面或器官表面。适合于这样的表面施用的本发明的组合物可被称为本发明的表面组合物。
[0292]
合适地，本发明的表面组合物可被用于施用于选自以下的一个或更多个身体表面：眼睛表面；皮肤；脑表面；和黏膜。举例来说，本发明的表面组合物可在手术期间或手术之后施用于身体表面。合适地，本发明的表面组合物可施用于与腹部手术(例如以抑制黏连形成)或脑手术(例如以向脑提供期望的治疗剂)相关的这样的表面。
[0293]
本发明的表面组合物可被用于施用于身体表面上的感染或损伤(包括但不限于：擦伤、烧伤和刺伤伤口)部位。例如，本发明的组合物可被用于施用于眼睛表面上的感染或损伤部位(例如微生物性角膜炎部位)或皮肤的感染或损伤(例如皮肤烧伤或擦伤)部位。
[0294]
应理解，表面组合物可以以在这样的情况下使用的常规方式配制。例如，合适的表面组合物可配制成使得其不对施用其的感染或损伤区域诱发刺激或炎症。
[0295]
本发明人已提供了用于持续递送强效抗瘢痕形成分子(hrdecorin)的新的滴眼剂系统。该滴眼剂的新颖之处在于在制备期间的结构化方法，该方法产生了可在固态和液态之间转变的材料，使得通过眨眼缓慢去除保留在动态环境中。在假单胞菌角膜炎(pseudomonas keratitis)的鼠模型中，施加滴眼剂导致在16天内降低角膜混浊。更明显的是，添加hrdecorin导致无瘢痕恢复和角膜完整性，如由完全上皮再形成以及αsma、纤连蛋白和层黏连蛋白的降低所表明的。该药物递送系统对于患有微生物性角膜炎的患者是理想的非侵入性抗纤维化治疗，可能在不求助于手术的情况下挽救可能无法进行角膜移植的发展中国家的许多人的视力。
[0296]
本发明人已提供了新类别的滴眼剂材料的报告，所述材料允许治疗剂长时间保留
在眼睛表面上，同时通过眨眼过程逐渐清除。该材料是通过对基于结冷胶的水凝胶进行剪切形成的，所述基于结冷胶的水凝胶是目前以稀释形式使用以在凝胶化过程期间增稠滴眼剂(例如timoptol)的材料。施加剪切阻止了连续聚合物网络的形成，并导致形成可呈现球形和带状形态的相互作用的颗粒。剪切处理后，当溶液静止时，这些颗粒相互作用并形成连续结构。然而，当施加剪切时(例如当通过滴眼管挤出时)，干扰颗粒的连续网络并且材料液化。随后去除剪切力导致立即愈合。该材料能够经历的固
‑
液
‑
固转变意味着它完全符合眼表，并且通过眼睑眨眼动力学逐渐去除。重要的是，结冷胶是光学透明的并且因此该材料可在施加后继续传输光，对患者造成的干扰最小。
[0297]
已开发了可载有饰胶蛋白聚糖以提供局部药物递送并保留在眼表的流体凝胶滴眼剂。该材料组合了结构化的结冷胶与蛋白聚糖，饰胶蛋白聚糖。另外，结合高光学清晰度，fda批准的聚合物(fda参考号172.665)与临床级hrdecorin相结合，提供了进入临床的快速途径。因此，本研究在充分建立的假单胞菌角膜炎鼠模型中，研究了具有和不具有hrdecorin的流体凝胶对角膜混浊、伤口愈合和纤维化的影响，作为用于管理严重细菌性感染的临床应用的前导。
[0298]
本发明人已证明，本文中所述的流体凝胶滴眼剂在预防和/或治疗青光眼方面是有益的。根据本发明，并且特别是根据本发明的该方面使用的流体凝胶滴眼剂可包含含有结冷胶的剪切稀化水凝胶组合物。本发明人已发现，如在本说明书中的其他地方公开的结果所证明的，根据本发明的剪切稀化水凝胶组合物即使在没有活性剂的情况下配制时也能够降低眼内压(公知的青光眼实验模型)。
[0299]
流体凝胶制剂和特性
[0300]
流体凝胶的处理包括使聚合物溶液、结冷胶通过带夹套的销式搅拌器，在该搅拌器中流体凝胶经历高水平的剪切同时被迫(热)通过其溶胶
‑
凝胶转变(图1a)。这限制了通常在静态凝胶的形成中观察到的长程有序(long
‑
range ordering)，从而限制了凝胶核向离散颗粒的生长
[34,35]
。以该方式制备的滴眼剂中的微观结构已使用以下两种技术显示：1)光学显微术，其中使用聚乙二醇操纵连续相的折射率，以及2)冻干以使用扫描电子显微术(scanning electron microscopy，sem)成像(分别为图1a(i)和1a(ii))。两种显微技术均突出了所得凝胶实体的绞合微观结构，其中它们的大长宽比和随后的大流体动力学半径产生了所得材料特性(黏度和弹性结构化)
[36]
。
[0301]
流体凝胶的独特特性使得它们在静止时表现出伪固体特性，但可在力下流动。在此，提高施加在系统上的剪切力导致非牛顿剪切稀化行为，这是高度絮凝化或浓缩的聚合物分散体/溶液的典型特征
[37]
(图1b)。因此，在低剪切下，观察到比典型的基于水的滴眼剂高超过数个数量级的大黏度，其在施加期间稀化并随后由于颗粒在流动中的解缠结和排列而闪烁
[38,39]
。这使得微凝胶混悬剂对于通过滴管瓶施加是理想的，在施加于眼时通过喷嘴快速剪切稀化(图1c)。施加后，3
‑
维结构矩阵的恢复是在眼表上获得高保留时间的关键。在与初始斜坡(ramp)相对的时间尺度上，剪切的时间依赖性去除被用于收集有关这样的结构化、探测滴眼剂滞后的信息。滴眼剂系统显示出一定程度的触变性(图1b)，从而恢复了大部分原始黏度。使用线性流变学以及在线性黏弹区内在应变下弹性结构的演变检查凝胶
‑
带之间的弱相互作用的存在(图1d)。观察到最初在剪切后，流体凝胶表现出典型的类液体行为，其中损耗模量(g”)主导储能模量(g’)。在此之后，作为凝胶带之间相互作用形成的函数
的g’的提高导致达到交叉，此时系统开始表现为固体
‑
凝胶
[40]
。因此，随时间的进一步结构化导致伪固体行为，其中在凝胶实体之间形成连续网络。在施加时剪切稀化同时能够在剪切后快速重构的能力使得滴眼剂能够施加于眼表充当屏障。使用单次5μl施加流体凝胶滴眼剂，显示凝胶均匀分布覆盖整个眼表，包括啮齿动物眼中的角膜、相邻结膜和穹窿(眼睑和眼球之间的空间)(图1e)。
[0302]
体外滴眼剂活性
[0303]
基于结冷胶的滴眼剂系统被配制成用于与我们的研究所使用的候选抗纤维化剂hrdecorin一起进行药物递送。从滴眼剂系统中释放hrdecorin的速率随时间几乎是线性的(图2a)。浊度被用作原纤维形成(大的、不定向胶原蛋白纤维的形成)的量度，显示为hrdecorin的函数(图2b&c)。明显的是，hrdecorin在原纤维形成的动力学中发挥了关键作用，减缓了原纤维形成的开始，并且达到平衡也快得多(图2b)。高于临界浓度0.5μg/ml，观察到hrdecorin在抑制原纤维形成方面的积极作用，突出了浓度依赖性，直至达到最小浊度(>10μg/ml)，高于该浓度没有发生进一步降低(图2c)。此外，该测定表明流体凝胶载体对原纤维形成没有影响，与仅胶原蛋白的对照紧密相关。
[0304]
载有/未载有滴眼剂对角膜混浊的体内效力
[0305]
使用良好建立的细菌性角膜炎模型
[41]
，将经麻醉的小鼠(每组n＝6)在受损的角膜表面上用铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)(105cfu)进行攻击。基于细菌性角膜炎患者的标准治疗，开发了治疗感染的治疗方案。在铜绿假单胞菌孵育12小时以确定角膜感染之后，在12小时时间内用每2小时庆大霉素(1.5％)的方案处理眼睛以对感染进行灭菌(通过拭子培养确认)。
[0306]
在灭菌阶段后，在初始接种之后2天，在上午8点至晚上8点之间每4小时施用单次5μl结冷胶滴眼剂，持续另外13天，包括以下处理组：1)庆大霉素和泼尼松龙(gentamicin and prednisolone，g.p)；2)庆大霉素、泼尼松龙和流体凝胶(gentamicin,prednisolone s and fluid gel，g.p.fg)以及；3)庆大霉素、泼尼松龙和hrdecorin流体凝胶(gentamicin,prednisolone and hrdecorin fluid gel，g.p.decfg)(表1)。
[0307]
在整个16天实验中以一定间隔拍摄角膜的图像来测量角膜混浊的变化(图3a)。在第16天对所有小鼠实施安乐死。与用单独的标准护理(庆大霉素和泼尼松龙)处理的眼相比，在用流体凝胶和用hrdecorin流体凝胶滴眼剂加标准护理处理的眼中显示出混浊面积(由对处理组不知情的两名临床眼科医生独立测量)更早的尺寸降低。因此，在第9天，与仅用庆大霉素和泼尼松龙处理的眼(3.5
±
0.4mm2)相比，用具有hrdecorin流体凝胶的标准护理处理的眼显示出显著(p<0.001)更低的混浊面积(1.9
±
0.3mm2)。在第12天时，与庆大霉素和泼尼松龙组并且还与具有标准护理的流体凝胶组相比，接受具有标准护理的hrdecorin流体凝胶滴眼剂的小鼠维持显著更低(p<0.01)的混浊面积(平均混浊面积：第1组＝3.5
±
0.7mm2，第2组＝3.0
±
0.1mm2，相比之下第3组＝2.1
±
0.2mm2；图3b)。
[0308]
具有和不具有hrdecorin的流体凝胶滴眼剂对角膜上皮再形成的影响
[0309]
上皮分层/成熟与基质厚度一起被选择作为结果测量以评估角膜上皮再形成，并观察来自水肿和细胞浸润的基质增厚(作为感染的标志物)。假单胞菌感染严重破坏了角膜结构，其中与129.3
±
10.7μm的初始角膜厚度值相比，在感染之后第2天角膜厚度平均提高为218.7
±
24μm。在第2天时感染的角膜与正常未受损伤的对照相比具有更薄的上皮层
(19.2
±
2.1μm相对于35.5
±
1.7μm；图4a&b)。在添加单独的流体凝胶的情况下以及在hrdecorin滴眼剂处理的情况下超过13天，明显的是上皮再形成得到了改善。与庆大霉素和泼尼松龙组(22.5
±
2.1μm厚，具有2.7
±
0.2个细胞层)以及庆大霉素、泼尼松龙和流体凝胶组(22.8
±
1.3μm厚，具有3.4
±
0.1个细胞层)中的上皮相比，用载有hrdecorin的流体凝胶滴眼剂处理导致上皮层的分层程度提高(26.1
±
2.4μm厚，由3.6
±
0.2个细胞层组成)。然而，不同组之间的差异没有达到统计学显著性(图4b、c和d)。
[0310]
流体凝胶对肌成纤维细胞和胞外基质水平的影响
[0311]
免疫反应性(immunoreactivity，ir)用于评估纤维化程度，作为高于从未受损伤的角膜获得的基线的像素强度的比(在此称为阈值)。在初始未受损伤的角膜中，角膜基质中的αsma免疫反应性(ir)水平非常低，表明存在很少的肌成纤维细胞(图5a)。在感染之后两天，在灭菌之后一天，感染的角膜表现出基质αsma染色提高23％，达到高于阈值26.5
±
3.0％的水平(根据未受损伤的角膜归一化)，表明肌成纤维细胞的分化提高。在用仅标准护理处理的眼中，基质irαsma的水平在第16天时保持升高，为32.7
±
6.1％。当眼也用具有或不具有hrdecorin的流体凝胶滴眼剂处理时，基质αsma ir的水平在第16天时显著降低，分别为13.4
±
2.9％和2.0
±
0.4％，表明在角膜基质内的肌成纤维细胞活化较少。hrdecorin流体凝胶在使αsma ir水平保持为低方面最有效，导致与未受损伤的角膜相似的值，表明与单独的流体凝胶相比，在流体凝胶中添加hrdecorin对肌成纤维细胞分化具有附加有益作用(图5a)。
[0312]
使用纤连蛋白和层黏连蛋白ir研究由肌成纤维细胞产生的基质ecm水平(图5b和c)。在感染之后第2天观察到基质ir纤连蛋白的量提高，在庆大霉素和泼尼松龙处理之后第16天时仍然为高(在第0天和第16天的ir纤连蛋白分别为83.9
±
5.5％和75.3
±
11.5％)。具有或不具有hrdecorin的流体凝胶显著地将纤连蛋白ir的水平分别降低至31.6
±
5.8％和13.9
±
5.3％，表明两个滴眼剂处理组之间存在临界显著差异(p＝0.051)。ir层黏连蛋白水平(图5c)表明，当与未受损伤的角膜相比时，感染提高了层黏连蛋白水平，在第2天时，从未受损伤中的2.15
±
0.6％提高至感染组中的16.3
±
4.6％。在庆大霉素和泼尼松龙处理之后的第16天，ir层黏连蛋白水平继续升高至42.5
±
8.2％。与庆大霉素和泼尼松龙组类似，在用流体凝胶处理之后的第16天，平均的ir层黏连蛋白水平仍然为高，其中ir层黏连蛋白水平为38.0
±
12.0％。向流体凝胶添加hrdecorin与庆大霉素和泼尼松龙处理相比显著降低了层黏连蛋白水平(12.4
±
5.5％相对于42.3
±
8.2％)，而不具有hrdecorin的流体凝胶对该ecm参数没有影响。
[0313]
流体凝胶对体外肌成纤维细胞水平的影响
[0314]
人真皮成纤维细胞在6孔板中以150,000个细胞/孔的密度生长。使细胞贴壁24小时，然后在hfdm
‑
1培养基中进行血清饥饿，然后用实验组合物进行处理。
[0315]
在具有或不具有抗纤维化剂饰胶蛋白聚糖的情况下制备本发明的实验水凝胶组合物。这些在图25的图中分别显示为“凝胶+dec”和“凝胶
‑
dec”。在该研究中，每孔添加1ml的实验凝胶组合物，然后用tgf
‑
β1以5ng/ml给药(“凝胶+dec(第二凝胶)”除外，其中在施用凝胶之前提供tgf
‑
β1，表明顺序没有明显改变作用)。
[0316]
如从图25可看出，添加tgf
‑
β1刺激了α
‑
sma的表达，指示形成了具有瘢痕形成特征的肌成纤维细胞。本发明的水凝胶组合物的提供降低了该α
‑
sma的表达。这在存在和不存在
抗纤维化剂饰胶蛋白聚糖的两种情况下均观察到，说明本发明的水凝胶组合物能够抑制瘢痕形成，甚至在不存在其他抗纤维化活性剂的情况下。
[0317]
讨论
[0318]
提高眼保留是提高对表面治疗的治疗响应和生物效率二者的关键，因为角膜前泪膜的周转(每分钟约20％
[42]
)导致水性药物的快速消除，降低了递送至靶组织部位的滴度。因此，目前许多眼病症是通过白天和晚上递送的强化表面治疗或许多患者不喜欢的侵入性方法(包括眼周或玻璃体内注射以靶向眼内病理状况)来治疗的。在其中药物无效的更严重的病例中，可能需要手术来治疗或去除由此产生的角膜瘢痕，从而提高发病风险并延长治疗后患者不适的持续时间。从结冷胶形成的结构化或“流体凝胶”提供了关键的进步，因为它能够持续递送能够阻止瘢痕形成并消除对侵入性手术修复策略的需求的分子，例如hrdecorin。结冷胶流体凝胶的主要优点是在当其通过施加器(applicator)并在角膜表面凝固时，它能够在固态和液态之间转变。该独特的特性集来源于由在零剪切下彼此弱相互作用的带和颗粒组成的材料的微观结构。这些相互作用通过施加剪切被打破并在其去除后重构。以该方式，材料然后可通过自然眨眼机制从眼表逐渐清除。当施加于角膜表面时，弱弹性结构的发展导致形成透明且可吸收的绷带，具有滴眼剂(施加中的)和水凝胶镜片(持续释放)的益处，没有任一者的缺点。事实上，单独的流体凝胶显示出提供了有利于伤口愈合的微环境，即使没有核糖体蛋白添加也降低角膜混浊和瘢痕形成的标志物。重要的是，如由胶原蛋白纤维生成数据所表明的，流体凝胶不干扰hrdecorin的生物活性。因此，该系统为临床环境提供了优异的候选技术，并且在许多患者组群中提高了药物施用依从性。
[0319]
铜绿假单胞菌角膜炎的小鼠模型提供了评价载有hrdecorin的流体凝胶针对假单胞菌感染的当前标准护理(庆大霉素和泼尼松龙)的抗瘢痕形成能力的稳健的、临床相关的手段
[43]
。一旦建立感染，铜绿假单胞菌侵入角膜上皮细胞，从而破坏自然愈合响应且角膜成纤维细胞转化为角膜肌成纤维细胞，导致纤维化微环境
[44]
。表面施用具有或不具有hrdecorin的滴眼剂导致在滴眼剂处理7天和10天之后角膜混浊水平降低，其中添加hrdecorin显示出明显的进一步优点。没有预期仅流体凝胶处理的作用，因为最初的体外研究表明该载体似乎是惰性的。单独的流体凝胶的治疗效力可能是由于在受损角膜中形成了允许的微环境，在其中凝胶带的闭塞作用(缠绕以在伤口周围形成屏障)提供了两个关键作用。首先，治疗性绷带防止由得溃疡的眼上的眨眼造成的生物力学创伤，并且其次，将类固醇和庆大霉素隔离在其结构内，增强了治疗物质在眼表的保留，并且从而类似于生态系统的假体置换(prose
(tm)
装置)提高生物利用度，但具有可吸收的附加优点。在视力保护方面，这样的角膜混浊降低将有益于患者
[45]
。
[0320]
愈合阶段的一个重要方面涵盖分层的非角化上皮的恢复。与泪膜一起，顶端黏膜(由脂质、黏蛋白和水性层构成)为眼表提供营养和润滑，并且是眼第一道防线的基础。经hrdecorin处理的眼表现出对正常解剖的最大改善的恢复，基质水肿、厚度和胞外基质沉积降低，外加上皮形态得到改善。先前已在许多动物模型中证明了hrdecorin对纤维化标志物的降低；调节一系列生长因子(例如vegf、igf
‑
1、egf、pdgf)及其受体，特别是通过smad 2和3途径的tgfβ信号传导，防止角膜成纤维细胞的分化。另外，它对基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，mmp)和金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinase，timp)的调节导致纤维溶解和瘢痕形成减弱
[29,46
‑
48]
。
[0321]
已通过引入流体凝胶载体，改善在眼表上的保留时间增强了hrdecorin帮助愈合并且特别是降低瘢痕形成的固有能力。已在体内清楚地证明了该流体凝胶制剂的益处，其在物理上(角膜混浊降低)和药理学上(与降低的纤维化标志物有关)二者均观察到。然而，由于立法限制，在本研究中生成的数据限于16天的时间点。然而，在未来的研究中检查随后时间点将是有意义的。
[0322]
单独的流体凝胶对受损角膜表面的作用表明对内源性生长因子的影响，这是通过添加hrdecorin而增强的一种作用。流体凝胶可通过数种机制帮助角膜愈合：首先，流体凝胶的独特黏弹性特性作为液体，其在眼表上进行自结构化以形成半固体封闭治疗敷料，用于进行不受干扰的愈合；其次，在流体凝胶的凝胶化期间形成的螺旋结构域可为内源性饰胶蛋白聚糖提供模拟支架以结合、隔离关键生长因子，例如和/或外源递送的hrdecorin；第三，主要由水(99.1％)组成的流体凝胶基质产生细胞因子远离伤口部位的梯度驱动扩散，再次导致防止纤维化所需的自然平衡的恢复。
[0323]
总之，本发明人已证明，在与细菌性角膜炎相关的纤维化的临床相关鼠模型中，新的滴眼剂技术可用于提供抗纤维化药物如hrdecorin向角膜的持续表面递送。滴眼剂使得hrdecorin能够在足够长时间内并以足够的滴度与眼表面保持接触以显著降低角膜瘢痕形成。此外，该研究表明，未载有的流体凝胶本身也具有愈合作用，这表明该作用是通过其固有的材料微观结构和随后的特性产生的。滴眼剂的材料特性不仅提高了抗瘢痕形成药物保留时间，而且该滴剂的使用者友好性质也会受到患者的欢迎，为预防在角膜感染之后普遍存在的瘢痕形成病理提供了简单的治疗。当与当前的标准护理相比时，已证明该技术成功降低了角膜混浊并降低了通常指示瘢痕形成过程的标志物，为患有微生物性角膜炎的患者提供了理想的治疗选择，降低了视觉上显著的角膜混浊的发生并且潜在地消除了矫正手术干预的需要。鉴于在发展中国家移植可用性和手术干预的设施通常不可用，我们认为该技术将来可帮助挽救许多患者的视力。
[0324]
材料和方法
[0325]
研究设计
[0326]
本研究的目的是探索新的流体凝胶用于将饰胶蛋白聚糖递送至眼表以降低角膜混浊和细菌性角膜炎后的瘢痕形成的用途。该研究分为三个评价阶段：(i)与滴眼剂施加的难易程度相关的材料特性，(ii)配制的hrdecorin的生物活性的体外评估，以及(iii)具有/不具有hrdecorin的流体凝胶的体内抗瘢痕形成效力，与当前的标准护理相比，使用假单胞菌角膜炎的小鼠模型(一旦感染之后对眼进行灭菌)。因为效应量未知，因此样本量(每个实验组n＝6)基于资源方程。所有分析均由对实验分组不知情的观察者进行，并且小鼠被随机分配到处理组和对照组二者。
[0327]
材料
[0328]
流体凝胶(fg)和hrdecorin流体凝胶(decfg)产生
[0329]
流体凝胶滴眼剂的制备
[0330]
通过首先将低酰基结冷胶(kelco gel cg la,azelis,uk)溶解在去离子水中来产生流体凝胶。在环境温度下以正确的比例将结冷胶粉末添加至去离子水以得到1％(w/v)溶液。在配备有磁力搅拌器的加热板上在搅拌下将溶胶加热至70℃，直至所有聚合物溶解。一旦溶解，将结冷胶溶胶添加至配备有杯和叶片几何形状(杯：直径35mm，叶片：直径28mm)的
旋转流变仪(ar
‑
g2,tainstruments,uk)的杯。然后将系统冷却至40℃。然后添加pbs(4.76mg/ml)和氯化钠水溶液(0.2m)中的hrdecorin(galacorin
tm
；catalent,usa)以得到最终浓度为0.9％(w/v)结冷胶、0.24mg/ml hrdecorin和10mm nacl。在此之后，将混合物在剪切(450/秒)下以1℃/分钟的速率冷却至20℃的最终温度。然后移出样品并在4℃下储存直至进一步使用。在不具有hrdecorin的流体凝胶的情况下，调整比例以使最终滴眼剂的组成为0.9％(w/v)结冷胶、10mm nacl。
[0331]
流体凝胶滴眼剂的材料表征
[0332]
显微术：对于透射显微术样品，首先使用聚乙二醇400(peg400)以1:4(滴眼剂与peg400)的比例稀释。在此之后，使用olympus fv3000分析样品。使用imagej(http://imagej.nih.gov/ij/；由国立卫生研究院(national institutes of health),bethesda,md,usa在公共领域提供)处理图像。
[0333]
对于扫描电子显微术样品，首先通过以与透射显微术相同的方式将结冷胶在去离子水中稀释至1:9的比例来制备冻干样品。然后使用液氮快速冷冻样品并放置在冷冻干燥器中过夜以留下粉末。然后将干燥的样品附着到碳桩(stub)上并使用sem分析。
[0334]
流变学：使用配备有喷砂平行板(40mm，1mm间隙高度)的ar
‑
g2(tainstruments,uk)流变仪在20℃下获得黏度谱。使用2分钟的平衡以确保恒定的测试温度。在此之后，施加0.1至600/秒(扫描时间为3分钟)的时间依赖性的斜升(ramp up)和斜降(ramp down)。使用相同的设备在单频率下获得恢复谱。通过以600/秒剪切10秒使样品恢复活力。在此之后，在1hz、0.5％应变下监测储能和损耗(分别为g’、g”)。交叉点被用作样品开始像黏弹性固体一样起作用的点。
[0335]
hrdecorin从流体凝胶中释放
[0336]
通过将1ml含hrdecorin的流体凝胶放置在6孔板中，累积测定从凝胶中释放hrdecorin的水平。然后将2ml dmem放置在样品上，并将板在37℃下孵育。在每个时间点，移除培养基用于测量hrdecorin并用新鲜的培养基更换。使用对人饰胶蛋白聚糖(r&d systems,minneapolis,usa)具有特异性的elisa根据制造商的方案对饰胶蛋白聚糖释放进行量化。
[0337]
体外hrdecorin生物活性测定
[0338]
胶原蛋白原纤维生成：对于剂量响应曲线，将添加至保持在冰上的96孔板的每个孔。通过向第一孔添加400μg/ml的hrdecorin并随后在整个板中连续稀释(2倍稀释)来制备不同的hrdecorin剂量。稀释后，向每个孔添加另外的150μl pbs缓冲液。然后，将75μl的i型胶原蛋白(鼠尾；corning,uk)(800μg/ml)添加至每个孔，并在37℃下孵育2小时。使用405nm读板仪读取后续的吸光度读数。每个测定由一式两份空白对照和一式三份标准稀释物接着是一式三份样品稀释物组成。如下确定原纤维形成的动力学：使用与剂量响应类似的设置而不进行连续稀释；在读板仪内孵育样品，并且每2分钟采集数据点。
[0339]
假单胞菌角膜炎模型和体内立体显微术
[0340]
体内假单胞菌模型的处理施用方案在图6中示出。在第2天采集的初始未受损伤的组和感染的角膜组也包括在实验计划中。由于效应量未知，因此每个对照或处理组的n＝6的样本量基于资源方程
[49]
。在感染假单胞菌之前，小鼠被随机分配到每个处理组和对照组。每个处理程序和样本量在下面进一步详细描述。对于体内研究，由对实验组不知情的研
究者进行分析。
[0341]
假单胞菌角膜炎的体内鼠模型
[0342]
将铜绿假单胞菌pao1菌株在高盐lb(每升为10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和11.7g nacl，补充有10mm mgcl2和0.5mm cacl2)中在37℃下培养18小时。亚培养物在光密度(optic density，od)为0.2(od650nm，约1
×
108cfu/ml)时获得。将铜绿假单胞菌在pbs中洗涤(
×
3)，以300rpm离心5分钟并以1
×
105cfu/2.5μl的密度重悬于pbs中。c57bl/6小鼠(jackson实验室,ca,usa)被饲养在无病原体的条件下，自由获得食物和水，并且根据arrive指南、关于在眼科和视力研究中使用动物的arvo声明进行供养并且还遵守由加州大学欧文分校(the university of california,irvine)制定的指南。对于接种，将小鼠麻醉并且使用26g针以3
×
1mm平行划痕擦伤一个角膜上皮，并接种2.5μl铜绿假单胞菌(1
×
105cfu)(菌株pao1)
64,65
。小鼠在接种后保持镇静2小时以允许感染渗透到眼中，并置于恢复中。在24小时之后，每2小时用5μl庆大霉素(1.5％,qehb pharmacy,birmingham,uk)处理清醒小鼠，持续12小时以对感染进行灭菌。在另外12小时之后，根据其以下处理组，在上午8点至晚上8点之间每4小时向小鼠施用滴眼剂(每种化合物5μl)，持续另外13天：(1)庆大霉素+泼尼松龙(0.5％,qehb pharmacy)，(2)庆大霉素+泼尼松龙+流体凝胶，或(3)庆大霉素+泼尼松龙+具有hrdecorin的流体凝胶。检查小鼠的角膜混浊、溃疡和穿孔。用与leica mzf iii立体显微镜连接的spot rtke相机(诊断仪器)捕获角膜的正面24位彩色照片。第16天在麻醉下通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死，并将眼摘出并放置在pbs中的4％pfa中进行免疫组织化学处理。
[0343]
混浊量化
[0344]
使用imagej，两名不知情的独立眼科医生以相同的随机顺序(该顺序由独立统计学家提供)分析所有照片的混浊面积。在观察者开始图像分析之前，就角膜混浊化、适当和不适当的图像的限定达成一致。测量以mm2±
sem记录。随机顺序规定测量区域内不应该有时间趋势。
[0345]
用于上皮再形成和ecm的组织处理和免疫组织化学
[0346]
将用于ihc的摘出的眼通过浸入在pbs中的4％pfa中在4℃下过夜进行后固定，然后使用pbs中的提高浓度的蔗糖(10％、20％和30％；sigma)各自在4℃下冷冻保护24小时。然后将眼嵌入剥离模具容器(agar scientific,essex,uk)中的最佳切割温度(optimal cutting temperature，oct)包埋介质(thermo shandon,runcorn,uk)中，并随后使用恒冷箱切片机(bright,huntingdon,uk)在
‑
22℃下在旁矢状平面中以15μm的厚度切片，并放置在superfrost载片(fisher scientific,usa)上。将中央切片(在视神经平面中)用于所有ihc研究并储存在
‑
80℃下。将冷冻切片解冻30分钟，然后在pbs中洗涤3
×
5分钟，接着是用0.1％triton x
‑
100(sigma)透化20分钟。使用pbs中的0.5％bsa、0.3％吐温
‑
20(均来自sigma)和15％正常山羊血清(vector实验室,peterborough,uk)将组织切片中的非特异性抗体结合位点封闭30分钟，然后在一抗(αsma、层黏连蛋白和纤连蛋白；1:200；均来自sigma)中在4℃下再次孵育过夜，接着是洗涤3
×
5分钟，并在室温下与二抗(山羊抗小鼠alexa fluor 488 1:500，山羊抗小鼠alexa fluor 594 1:500,molecular probes,paisley,uk)一起孵育1小时。然后将切片洗涤3
×
5分钟并在含dapi(vector实验室)的vectorshield封固剂(mounting medium)中封固。与单独的二抗一起孵育的对照组织切片
均呈阴性染色。
[0347]
免疫组织化学成像和量化
[0348]
在ihc之后，将切片在zeiss axioscanner荧光显微镜(axio scan.z1,carl zeiss ltd.)上以
×
20成像，每种抗体使用相同的曝光时间。根据先前描述的方法
61
，通过测量像素强度来量化ihc染色。简言之，用于量化ecm ir的目的区域由对基质内的所有眼/处理具有相同规定尺寸的目的区域限定。每个基质取总共30个单独的强度测量(目的区域)以覆盖整个区域。在这些限定的目的区域内量化ecm沉积，并使用imagej计算高于来自未受损伤的角膜的标准化背景阈值的ir像素的百分比。对于每种抗体，基质区域中的亮度阈值水平使用未受损伤的未经处理角膜设定，以限定用于测试组分析的参考水平。图像被分配随机文件名，以确保评估者对处理组不知情。
[0349]
统计分析
[0350]
所有统计分析均使用spss 20(ibm,chicago,il,usa)进行。进行正态分布检验以确定最合适的统计分析来比较处理。统计显著性确定为p<0.05。对于混浊测量，使用具有tukey事后检验的anova对角膜宽度、上皮厚度、αsma、纤连蛋白和层黏连蛋白数据进行分析。对于上皮细胞层数的dapi测量，由于数据不是正态分布的，因此使用了kruskal
‑
wallis检验。
[0351]
表1
[0352]
表1.处理组的表。突出向每组施用(+)或未向每组施用(
‑
)的治疗剂
[0353]
组合的表，n＝6。
[0354][0355]
另一些技术信息
[0356]
1.生物聚合物列表：
[0357]
[0358][0359]
表2：基于多糖和蛋白质二者的生物聚合物的表，所述生物聚合物具有使用剪切技术加工成微凝胶混悬剂的潜能。已给出了电荷、蛋白质的等电点(isoelectric point，pi)、凝胶化机制和光学清晰度的附加信息
‑
如果凝胶是透明的，则其在眼科设备中具有潜在的应用，但这不限于此。
[0360]
1.“流体凝胶”(微粒混悬剂)材料特性：
[0361]
黏度/流动行为
[0362]
通过两种主要方法寻求最佳滴眼剂黏度：当前商业滴眼剂/软膏剂的流变学表征和咨询眼科临床医生。商业眼用产品的表征突出了用于医学病症例如干眼症的跨越滴眼剂和眼用软膏剂二者的大范围黏度；其中需要最佳长保留时间。在1s
‑
1时收集并比较黏度(选择作为剪切稀化初始阶段内的值，以避免设备的人为因素)(表2和图6(a.1.部分))，突出了产品之间的相似黏度作为主要由以下制成的聚合物的函数：基于石蜡、卡波姆和生物聚合物。
[0363]
·
表1：市售滴眼剂/软膏剂在1s
‑1时得出的黏度的表。
[0364][0365]
在基于石蜡和卡波姆二者的眼用产品的情况下，说明书中给出了警告以告知患者由于该滴剂可能导致模糊和不适。因此，制剂黏度的外部限制是基于针对这些产品获得的值确定的：
[0366]
最大
‑
200pa.s；并且最小4pa.s
[0367]
在其中测试所有制剂的所有情况下，这些值均未被超过。因此，用结冷胶作为用于凝胶化的生物聚合物制备的所有制剂均可在这些限制内使用。然而，在临床建议的帮助下，缩小了在黏度方面更优化的制剂。
[0368]
在制备了一组不同的制剂后，需要临床医生对产品进行操纵并关于合理的滴眼剂产品对它们进行评级。从该数据发现，在以下黏度范围内的滴眼剂更容易施加：
[0369]
5至50pa.s，
[0370]
具有良好的保留，具有最佳滴：
[0371]
约10至20pa.s。
[0372]
此外，系统应表现出剪切稀化行为。
[0373]
1.1.1.限定的参数
[0374]
·
表2：在1s
‑1(20℃)时发现的滴眼剂制剂的潜在黏度的总结。
[0375][0376][0377]
弹性
[0378]
静止时的弹性在产品使用中发挥很大的作用，以受控的方式保留和递送活性物(active)。认为微凝胶混悬剂在静止时产生弱弹性网络的能力驱动了与产品相关的高保留时间。同样，这些限制是基于市售滴眼剂和软膏剂的表征(图3(a.1.部分))。如针对黏度所见，在多种产品之间观察到类似的相关性，其中将产品分组为聚合物类型(表4)。
[0379]
·
表3：使用市售滴眼剂/软膏剂的振幅扫描得出的储能(弹性模量)的表。
[0380][0381]
同样，与黏度类似，对于所有测试的制剂，没有超过针对当前产品获得的值。因此，用结冷胶作为用于凝胶化的生物聚合物制备的所有制剂均可在这些限制内使用。
[0382]
最大
‑
20000pa；并且最小1pa
[0383]
然而，当由临床医生分析时，这被缩小至
[0384]
1至250pa，
[0385]
其中最佳制剂介于
[0386]
20至40pa。
[0387]
1.1.2.限定的参数
[0388]
·
表4：在1hz(20℃)时使用滴眼剂制剂的应变扫描在线性黏弹区(lvr)内发现的潜在弹性模量的总结。
[0389][0390]
ph
[0391]
由于生物聚合物的化学组成以及沿其各自骨架的不同化学部分，它们具有不同的天然ph。与眼表接触的产品的ph是重要的，因为许多化学损伤在ph<4和ph>10的范围内形成，正常生理接近7.11
±
1.5。因此，将滴眼剂配制成在该范围(4至10)之间，其中一些产品降低低至ph 3.5(盐酸丙美卡因溶液)1。因此，基于来自文献的该数据，滴眼剂制剂的ph应在以下范围内：
[0392]
3.5至8.6。
[0393]
然而，包含蛋白质的许多活性物的递送要求制剂是中性的。在这些情况下，可将pbs(磷酸盐缓冲盐水)添加至滴眼剂，将ph限制为中性酸度。因此，在制剂中已缩小至以下ph：
[0394]
6.5到7.5，
[0395]
其中优化的制剂为：
[0396]
7.4。
[0397]
1.1.3.限定的参数
[0398]
·
表5：滴眼剂制剂的潜在ph值的总结。
[0399][0400]
2.“流体凝胶”(微粒混悬剂)制剂：
[0401]
生物聚合物浓度
[0402]
(参见实验记录(write
‑
up)a.1.)
[0403]
最终，制剂的材料特性取决于产品中初始聚合物的浓度。因此，材料特性的上限和下限用于评价材料制剂，提供聚合物浓度的上限和下限。由于所有系统均表现出剪切稀化行为，因此限制仅基于满足静止时黏度(在1s
‑1时)和弹性行为二者的标准。因此，已针对滴眼剂制剂设定最大范围：
[0404]
0.5至2.5％(w/v)，
[0405]
其中值在针对市售产品发现的那些内。这已缩小至落入临床医生的建议内：
[0406]
0.5至1.5％(w/v)，
[0407]
其中优化的制剂由以下组成：
[0408]
0.9％(w/v)。
[0409]
2.1.1.限定的参数
[0410]
·
表6：滴眼剂制剂的潜在ph的总结。
[0411][0412]
交联剂浓度
[0413]
(参见实验记录a.2.)
[0414]
从结冷胶制剂的表征获得的数据表明，盐含量不影响系统的黏度，但是，它确实对静止时凝胶的弹性响应具有影响。同样，配制的系统都没有超过由商业产品设定的上限和下限，因为这样的上限和下限浓度已被限定为：
[0415]
5至40mm。
[0416]
然而，力学谱表明，在较高的盐浓度下，当在线性黏弹区外变形时，形成了弹性网络的显著降低。这表明较低的盐浓度导致更多的塑性行为，这被认为对患者将是更舒适的。因此，已将制剂的缩小的限制调整为；
[0417]
5至20mm，
[0418]
其中优化的制剂为：10mm。
[0419]
2.1.2.pbs
[0420]
添加pbs可用于操纵系统的ph。在这些情况下，添加5％v/v(5％被确定为与治疗性饰胶蛋白聚糖一起添加的量，因此尚未在该领域中进行进一步研究)，将影响系统内盐的水平。已计算pbs中单价离子的浓度并列于表8中。
[0421]
表7：突出pbs的成分和浓度的表
[0422][0423]
因此，已改变交联剂的范围(表9)，降低了下限，因为pbs中的离子含量足以驱动凝胶化过程。
[0424]
2.1.3.限定的参数
[0425]
·
表8：具有和不具有pbs的滴眼剂的交联剂浓度的总结。
[0426][0427]
3、“流体凝胶”(微粒混悬剂)处理参数：
[0428]
热处理
[0429]
制造中的热处理是凝胶形成的关键。通常来说，热参数分为两部分：处理温度和冷却速率。
[0430]
4.1.1.处理温度
[0431]
入口和出口是确保聚合物在处理前处于溶胶中并在低于凝胶化转变的温度下离开的关键。由于在较高温度下蛋白质活性变性，因此最初将入口温度设定为尽可能接近凝胶化温度。因此，将其设定为40℃。然而，这不是必需的，入口温度的关键方面是保持其高于凝胶化温度，以防止早期凝胶化和堵塞。出口温度的作用是确保在储存之前已完成聚合物的排序/结构化。这防止了阶段和异质混悬剂形成期间的聚集。因此，对于结冷胶，已将该温度限定为20℃，使得聚合物能够通过凝胶化过程。因此，出口温度由磨机的夹套控制，该夹套设定为在处理期间提供足够的冷却。这可被改变，从而导致不同的冷却速率。
[0432]
4.1.2.冷却速率(参见实验记录a.3.)
[0433]
已知溶胶
‑
凝胶转变期间的冷却速率对于最终材料特性非常重要；因为较高的冷却速率导致结构的快速形成和较弱的整体模量。然而，对于微凝胶混悬剂，这仅在较高聚合物浓度下观察到。观察到对于最佳滴眼剂制剂，未观察到材料特性的变化，这表明可使用大范围的参数：
[0434]
0.1至6℃/分钟，
[0435]
而在1.8％w/v聚合物下，它更依赖于所需的弹性结构。
[0436]
4.1.3.限定的参数
[0437]
·
表9：结冷胶滴眼剂制剂的冷却速率的总结。
[0438][0439]
4.2剪切速率(参见实验记录a.3.)
[0440]
处理期间的剪切速率显示出与冷却速率非常类似的结果，其中优化的聚合物浓度不受处理剪切的影响。同样，较高的浓度显示出依赖性。因此，对于优化的制剂，可施加非常宽范围的剪切：
[0441]
50至2000rpm(设备极限)，
[0442]
其可缩小至：
[0443]
500至1500rpm，
[0444]
其中优化的设置：
[0445]
1000rpm(以防止对处理设备的压力)
[0446]
4.2.1.限定的参数
[0447]
表10：结冷胶滴眼剂制剂的处理速率的总结
[0448][0449]
5.混悬剂参数的总结：
[0450]
表11：滴眼剂制剂的潜在ph的总结。
[0451][0452]
另一些实验数据
[0453]
a.1.实验
‑
结冷胶浓度：聚合物浓度对所得流体凝胶材料响应的影响
[0454]
目的：
[0455]
·
了解在加工成微凝胶混悬剂后，聚合物浓度如何影响最主要的材料特性(黏度和弹性)。
[0456]
·
缩小合适滴眼剂制剂的聚合物浓度容差(tolerance)。
[0457]
材料和方法：
[0458]
材料：
[0459]
·
结冷胶(kelco,)
[0460]
·
nacl(fisher chemicals，批号：1665066)
[0461]
结冷胶微凝胶混悬剂(microgel suspension，ms)的制备：
[0462]
储备溶液的制备：
[0463]
nacl溶液的制备：
[0464]
通过使用容量瓶将干燥晶体(1.16g)添加至去离子水(100ml)来制备nacl(0.2m)。然后使用倒置技术使nacl溶解以帮助该过程。一旦完全溶解，将溶液保持在环境条件下直至进一步使用。
[0465]
结冷胶溶胶的制备：
[0466]
通过将粉末状聚合物以不同比例溶解在水/nacl溶液中来制备结冷胶溶胶，使得处理后的最终浓度等于0.5、0.9、1.35、1.8和2.35％(w/v)。简言之，称取结冷胶粉末(2.5、4.5、6.75、9.0和11.75g)并添加至450ml去离子水。允许在搅拌下将混合物加热至95℃，使得聚合物溶解。一旦完全溶解，将25ml nacl储备溶液(0.2m)添加至该溶液中，得到10mm的处理后浓度。然后在处理之前使溶胶在95℃下达到热平衡。
[0467]
结冷胶ms的处理：
[0468]
使用设定为20℃的夹套针磨机(jacketed pin mill)制备ms。使用蠕动泵(peristaltic pump)将结冷胶溶胶以3ml/分钟泵入到针磨机中，以便其进入40℃的处理室。在使用注射器和注射泵进入之前，将水泵入到结冷胶流(以0.16ml/分钟的速度)中以便它们撞击，将结冷胶溶胶稀释至最终浓度(0.5、0.9、1.35、1.8和2.35％(w/v)，10mm nacl)。然后使混合物在其通过研磨单元(milling unit)时在剪切(500rpm或1000rpm)下冷却。在离开时，在20℃下，将凝胶包装并储存在4℃下直至进一步测试。
[0469]
材料分析：
[0470]
流变学：
[0471]
使用配备有喷砂平行板(直径40mm，间隙高度1mm)的流变仪(ta，ar
‑
g2)在20℃下测试所有样品。结果在图7至图9中示出。
[0472]
振幅扫描(amplitude sweep)：
[0473]
振幅扫描是在0.1％至100.0％的范围内以应变控制模式获得的。将样品装载到仪器中并降低上部几何形状。一旦经修整，使样品在测试前在20℃下保持平衡。以对数方式在1hz下获得测量值。
[0474]
流动谱：
[0475]
样品的黏度谱是使用连续斜坡获得的。将样品装载到仪器中并降低上部几何形状。一旦经修整，使样品在测试前在20℃下保持平衡。在3分钟的斜坡内，在0.1至600s
‑1之间以速率控制模式对样品施加提高的剪切，其中以对数方式获得数据点。
[0476]
结果：
[0477]
小变形流变学：参见图7至图9和以上讨论。
[0478]
大变形流变学：参见图10至12和以上讨论。
[0479]
讨论：
[0480]
可观察到聚合物浓度对它们的弹性性质和黏度二者的影响，其中两种特性均显示出相同的趋势；提高直至在高于1.8％(w/v)的浓度下达到平稳时期(图2和3)。这样的观察
源于微凝胶颗粒的形成，其中通过在聚合物系统的整个凝胶化中施加剪切，限制阻止了连续网络形式的形成。该过程的主要结果意味着凝胶实体分散在非凝胶介质中，类似于w1/w2乳剂。因此，混悬剂的流变学也与乳剂的流变学密切相关；其中提高液滴或颗粒的相体积(在该情况下)导致更接近并提高系统的弹性性质(g’)和黏度二者。在该情况下，提高聚合物浓度导致更大数目的颗粒，直至达到最大填充分数(packing fraction)。高于此，看不到材料特性的进一步变化。
[0481]
将多种混悬剂的弹性(储能模量，g’)和黏度与针对当前滴眼剂/软膏剂收集的数据进行比较，遍及一系列材料：基于石蜡、卡波姆和生物聚合物的系统(图3和6)。观察到所有结冷胶系统均表现出在当前商业眼用产品的阈值内的g’和黏度，表明所有系统均适用，而不管聚合物浓度如何。然而，为了便于施加(从一次性施加器)和舒适(如通过包装描述的视力模糊)，最接近基于卡波姆和生物聚合物的滴剂的值是最佳的。因此，在0.5至1.35％(w/v)范围内的结冷胶浓度是最合适的。另外，针对眼应用，咨询独立临床医生得出0.9％(w/v)，最接近地模拟临床医生限定的特性。
[0482]
混悬剂的屈服行为也非常重要，特别是在用于递送的保留机制中，因为快速屈服系统导致了快速清除。反之亦然，在系统根本不屈服的情况下，材料不容易从身体消除。线性黏弹区(lvr)是混悬剂屈服行为的良好指示，当系统离开该线性区域时，微弱的颗粒间相互作用开始分解，并且系统流动。观察到lvr的长度是聚合物浓度的函数，显示出与结冷胶含量的反比关系(图1)。在此，在较低的聚合物浓度下，混悬剂可在分解之前在较高的应变下操纵，在身体的动态区域中提供了变得缓慢吸收的封闭的屏障。在0.5％至1.35％(w/v)的范围内观察到类似的lvr，表明它们的表现类似。
[0483]
随后的屈服剪切稀化行为对于施加和消除二者也是至关重要的，允许混悬剂在液化后容易流动。无论聚合物浓度如何，在所有系统中均观察到剪切稀化(图4)。通过颗粒间相互作用的破坏和流动排列而产生的高度剪切稀化使系统容易地通过喷嘴(注射器、一次性施加器等)施加；其中小压力导致高水平的剪切。
[0484]
结论：
[0485]
总之，表明聚合物浓度在结冷胶微凝胶混悬剂的所得材料特性中发挥关键作用。发现材料特性，例如弹性(由材料固有g’值表示)和黏度是聚合物浓度的函数，提高直至在1.8％(w/v)下形成平稳时期。实际上，这意味着所有系统均适用于在眼环境内施加或注射，与已有的市售产品进行了密切比较，并表现出了通过小孔口挤出所需的强剪切稀化行为。此外，通过与商业产品进行比较并通过与独立临床医生的交谈，0.5至1.35％(w/v)的聚合物范围被缩小，其中证明0.9％(w/v)对于最终制剂最佳。
[0486]
a.2.实验
‑
交联剂(nacl)浓度：交联剂浓度对所得流体凝胶材料响应的影响。
[0487]
目的：
[0488]
·
了解在加工成微凝胶混悬剂后，交联剂浓度如何影响最主要的材料特性(黏度和弹性)。
[0489]
·
缩小合适滴眼剂制剂的交联剂浓度容差。
[0490]
材料和方法：
[0491]
·
结冷胶(kelco,)
[0492]
·
nacl(fisher chemicals，批号：1665066)
[0493]
结冷胶微凝胶混悬剂(ms)的制备：
[0494]
储备溶液的制备：
[0495]
nacl溶液的制备：
[0496]
通过使用容量瓶将干燥晶体(0.58、1.16、2.32和4.64g)添加至去离子水(100ml)来制备nacl(0.1、0.2、0.4和0.8m)。然后使用倒置技术使nacl溶解以帮助该过程。一旦完全溶解，将溶液保持在环境条件下直至进一步使用。
[0497]
结冷胶溶胶的制备：
[0498]
通过将粉末状聚合物溶解在水/nacl溶液中来制备结冷胶溶液，使得处理后的最终浓度等于0.9％和1.8％(w/v)。简言之，称取结冷胶粉末(4.5g、9.0g)并添加至450ml的去离子水。允许在搅拌下将混合物加热至95℃，使得聚合物溶解。一旦完全溶解，将25ml nacl储备溶液(0.1、0.2、0.4和0.8m中任一者)添加至溶液，得到5、10、20或40mm的处理后浓度。然后在处理之前使溶胶在95℃下达到热平衡。
[0499]
结冷胶ms的处理：
[0500]
使用设定为20℃的夹套针磨机制备ms。使用蠕动泵将结冷胶溶胶以3ml/分钟泵入到针磨机中，以便其进入40℃的处理室。在使用注射器和注射泵进入之前，将水泵入到结冷胶流(以0.16ml/分钟的速率)中以便它们撞击，将结冷胶溶胶稀释至最终浓度(0.9％和1.8％(w/v)；5、10、20或40mm nacl)。然后使混合物在其通过研磨单元时在剪切(1000rpm)下冷却。在离开时，在20℃下，将凝胶包装并储存在4℃下直至进一步测试。
[0501]
材料分析：
[0502]
流变学：
[0503]
使用配备有喷砂平行板(直径40mm，间隙高度1mm)的流变仪(ta，ar
‑
g2)在20℃下测试所有样品。
[0504]
振幅扫描：
[0505]
振幅扫描是在0.1％至100.0％的范围内以应变控制模式获得的。将样品装载到仪器中并降低上部几何形状。一旦经修整，使样品在测试前在20℃下保持平衡。以对数方式在1hz下获得测量值。
[0506]
流动谱：
[0507]
样品的黏度谱是使用连续斜坡获得的。将样品装载到仪器中并降低上部几何形状。一旦经修整，使样品在测试前在20℃下保持平衡。在3分钟的斜坡内，在0.1至600s
‑1之间以速率控制模式对样品施加提高的剪切，其中以对数方式获得数据点。
[0508]
结果：
[0509]
小变形流变学
‑
参见图13至14
[0510]
大变形流变学
‑
参见图15至16
[0511]
讨论：
[0512]
从机理上讲，盐在许多聚合物包括结冷胶的凝胶化中发挥至关重要的作用。盐的类型，特别是化合价(单价、二价、三价等)是所得凝胶特性的关键；通常来说，化合价的提高提高了凝胶强度，因为在聚合物之间形成了更多的桥。然而，在结冷胶的情况下，二价离子例如ca
2+
导致所得凝胶发浑(浊度提高)。因此，单价离子例如na
+
可用于强化螺旋之间的连接位点，形成3
‑
维凝胶结构。因此，所得凝胶强度是添加的盐(也称为交联剂)浓度的函数。
交联剂浓度对通过剪切凝胶化形成的微凝胶混悬剂(“流体凝胶”)的形成以及所得微凝胶混悬剂(“流体凝胶”)的影响可在图1和2中清楚地看出。在此，对于所研究的两种聚合物浓度可观察到nacl浓度和弹性(g’)响应之间的相关性，与已知的凝胶化机制(对于较高的交联剂浓度，强度提高)相对应(图2)。此外，力学谱(图1)突出了材料屈服特性的变化。观察到在最高盐浓度(40mm)下，材料应变依赖性提高，表明在离开lvr(线性黏弹区)时g’的下降更快。这样的观察结果与典型的材料响应紧密吻合，当凝胶变得更强时其变得更脆。在这些情况下，认为随着系统变得更密集地交联，材料在其达到临界应变时表现得更接近破裂，这与塑性变形相反。尽管较高的浓度是可扩散的，但增强的应变依赖性降低了它们在例如眼的应用中的使用，其中提高变形的可塑性导致更光滑的表面，并预期提高敏锐度和舒适度。
[0513]
还测试了盐浓度对滴眼剂黏度的影响。在所有系统中几乎没有观察到变化(图2)，其中所有制剂均显示出明显的剪切稀化行为且总体黏度最终取决于生物聚合物浓度。然而，观察到在0.9％(w/v)结冷胶和最高盐浓度(40mm)下，混悬剂的整体黏度较低。这样的观察伴随着误差的提高，可能是由一定程度的脱水收缩(syneresis)(水的排出)引起的，其中交联密度提高将聚合物拉得更近，导致聚合物不足以构建水相。因此，这些系统的稳定性潜在地受到损害，从而随时间导致异构系统。
[0514]
结论：
[0515]
总之，向生物聚合物系统添加盐导致对最终产品强度的操纵。提高盐浓度最终提高了系统中的交联数目和最终的材料弹性行为。另外，未看到这样的影响使得黏度剧烈变化，然而，在较低的聚合物浓度下，过多的交联会导致形成异质混悬剂和差的稳定性。使用应变扫描来探测弹性结构允许分析混悬剂的屈服行为，突出了在40mm制剂时的较高应变依赖性。预期在眼应用中，塑性性质的降低将引起患者的不适，因此，建议交联剂的上限为20mm。
[0516]
a.3.实验
‑
冷却速率：处理期间应用的冷却速率对于结冷胶微凝胶混悬剂(“流体凝胶”)的制备的影响。
[0517]
目的：
[0518]
·
了解冷却速率对结冷胶微凝胶混悬剂的所得材料特性(黏度和弹性)发挥的作用。
[0519]
·
将冷却速率缩小至适合滴眼剂处理的容差。
[0520]
材料和方法：
[0521]
·
结冷胶(kelco,)
[0522]
·
nacl(fisher chemicals，批号：1665066)
[0523]
结冷胶微凝胶混悬剂(ms)的制备：
[0524]
储备溶液的制备：
[0525]
nacl溶液的制备：
[0526]
通过使用容量瓶将干燥晶体(1.16g)添加至去离子水(100ml)来制备nacl(0.2m)。然后使用倒置技术使nacl溶解以帮助该过程。一旦完全溶解，将溶液保持在环境条件下直至进一步使用。
[0527]
结冷胶溶胶的制备：
[0528]
通过将粉末状聚合物溶解在水/nacl溶液中来制备结冷胶溶液，使得处理后的最
终浓度等于0.9％和1.8％(w/v)。简言之，称取结冷胶粉末(4.5g、9.0g)并添加至475ml的去离子水。允许在搅拌下将混合物加热至95℃，使得聚合物溶解。一旦完全溶解，将25ml nacl储备溶液(0.2m)添加至结冷胶溶胶，得到10mm的最终浓度。然后在处理之前使溶胶在95℃下达到热平衡。
[0529]
结冷胶ms的处理：
[0530]
使用夹套针磨机制备ms，由此改变夹套温度和磨机内的滞留时间，导致冷却速率为1、3和6℃/分钟。作为实例：夹套设定为5℃，并且流量为20ml/分钟，入口处流体温度为46，且出口为16，在该速率下的滞留时间为5分钟，因此冷却速率等于6℃/分钟。在离开时，将凝胶包装并储存在4℃下直至进一步测试。
[0531]
材料分析：
[0532]
流变学：
[0533]
使用配备有喷砂平行板(直径40mm，间隙高度1mm)的流变仪(ta，ar
‑
g2)在20℃下测试所有样品。
[0534]
振幅扫描：
[0535]
振幅扫描是在0.1％至100.0％的范围内以应变控制模式获得的。将样品装载到仪器中并降低上部几何形状。一旦经修整，使样品在测试前在20℃下保持平衡。以对数方式在1hz下获得测量值。
[0536]
流动谱：
[0537]
样品的黏度谱是使用连续斜坡获得的。将样品装载到仪器中并降低上部几何形状。一旦经修整，使样品在测试前在20℃下保持平衡。在3分钟的斜坡内，在0.1至600s
‑1之间以速率控制模式对样品施加提高的剪切，其中以对数方式获得数据点。
[0538]
结果：
[0539]
小变形流变学：参见图17和18
[0540]
大变形流变学：参见图19和20
[0541]
讨论：
[0542]
冷却在结冷胶水凝胶的形成中发挥关键作用，其迫使聚合物通过无规卷曲向螺旋转变。研究了冷却速率对流体凝胶形成的影响，以评价材料响应的相关变化。观察到在较低的聚合物浓度(0.9％(w/v))下，冷却速率对系统内的弹性程度和整体黏度二者几乎没有影响。然而，在较高浓度(1.8％(w/v))下，冷却速率对弹性模量(g’)具有多得多的显著影响(图2)。认为在较高聚合物浓度下，颗粒保持更接近得多，因此受颗粒变形的影响多得多。较慢的冷却速率使颗粒形成缓慢得多，导致更有序、更坚固的结构。然而，几乎没有观察到对黏度的影响，表明颗粒彼此间的相互作用程度类似，其中当颗粒彼此“挤压”通过时，在微观尺度上表征颗粒。
[0543]
获得的数据表明在较高聚合物浓度下对材料特性的额外控制程度。能够在不改变整体黏度的情况下改造系统的特定弹性特性。这在身体多个部位的递送系统内是重要的，允许将半固体样结构放置在原位，提供屏障或延长保留。此外，能够保持相同的黏度意指即使它在静止时表现得更固体样，系统仍可注射。
[0544]
结论：
[0545]
发现冷却速率的影响取决于聚合物浓度，发现优化的滴眼剂制剂不依赖于所应用
的冷却速率。然而，在较高浓度下，弹性结构可被精细地调整，而不影响黏度谱。因此，当系统处于静止时，可操纵固体性程度，但在较大变形时仍保持可流动(可注射)。
[0546]
a.4.实验
‑
处理时应用的混合速度：处理期间应用的混合速度对于结冷胶微凝胶混悬剂(“流体凝胶”)的制剂的影响。
[0547]
目的：
[0548]
·
了解处理期间的混合速度对结冷胶微凝胶混悬剂的所得材料特性(黏度和弹性)发挥的作用。
[0549]
·
将处理期间的混合速度缩小至适合滴眼剂制剂的容差。
[0550]
材料和方法：
[0551]
·
结冷胶(kelco,)
[0552]
·
nacl(fisher chemicals，批号：1665066)
[0553]
结冷胶微凝胶混悬剂(ms)的制备：
[0554]
储备溶液的制备：
[0555]
nacl溶液的制备：
[0556]
通过使用容量瓶将干燥晶体(1.16g)添加至去离子水(100ml)来制备nacl(0.2m)。然后使用倒置技术使nacl溶解以帮助该过程。一旦完全溶解，将溶液保持在环境条件下直至进一步使用。
[0557]
结冷胶溶胶的制备：
[0558]
通过将粉末状聚合物溶解在水/nacl溶液中来制备结冷胶溶液，使得处理后的最终浓度等于0.9％和1.8％(w/v)。简言之，称取结冷胶粉末(4.5g、9.0g)并添加至450ml的去离子水。允许在搅拌下将混合物加热至95℃，使得聚合物溶解。一旦完全溶解，将25ml nacl储备溶液(0.2m)添加至溶液，得到10mm的处理后浓度。然后在处理之前使溶胶在95℃下达到热平衡。
[0559]
结冷胶ms的处理：
[0560]
使用设定为20℃的夹套针磨机制备ms。使用蠕动泵将结冷胶溶胶以3ml/分钟泵入到针磨机中，以便其进入40℃的处理室。在使用注射器和注射泵进入之前，将水泵入到结冷胶流(以0.16ml/分钟的速率)中以便它们撞击，将结冷胶溶胶稀释至最终浓度(0.9％和1.8％(w/v)，10mm nacl)。然后使混合物在其通过研磨单元时在剪切(100、500、1000和2000rpm)下冷却。在离开时，在20℃下，将凝胶包装并储存在4℃下直至进一步测试。
[0561]
材料分析：
[0562]
流变学：
[0563]
使用配备有喷砂平行板(直径40mm，间隙高度1mm)的流变仪(ta，ar
‑
g2)在20℃下测试所有样品。
[0564]
振幅扫描：
[0565]
振幅扫描是在0.1％至100.0％的范围内以应变控制模式获得的。将样品装载到仪器中并降低上部几何形状。一旦经修整，使样品在测试前在20℃下保持平衡。以对数方式在1hz下获得测量值。
[0566]
流动谱：
[0567]
样品的黏度谱是使用连续斜坡获得的。将样品装载到仪器中并降低上部几何形
状。一旦经修整，使样品在测试前在20℃下保持平衡。在3分钟的斜坡内，在0.1至600s
‑1之间以速率控制模式对样品施加提高的剪切，其中以对数方式获得数据点。
[0568]
结果：
[0569]
小变形流变学：参见图21和22
[0570]
大变形流变学：参见图23和24
[0571]
讨论：
[0572]
在0.9％(w/v)和1.8％(w/v)两种浓度下研究了在结冷胶生物聚合物的整个溶胶
‑
凝胶转变中施加的剪切程度。在较低的聚合物浓度下，弹性(由g’定义的)和黏度二者不依赖于整个凝胶化谱中所经历的剪切程度。在所有情况下，所得材料表现出在大变形期间的剪切稀化和静止时的固体样行为，然而，这样的观察的振幅没有改变(图2和图4)。对于1.8％(w/v)系统的黏度谱发现了相同的情况，其中尽管与0.9％(w/v)系统相比观察到黏度升高，但它们不依赖于处理期间所施加的剪切。然而，静止时系统的弹性性质确实显示出依赖性，随着剪切提高，最终储能模量(g’)降低。认为在凝胶化过程期间提高所施加的混合直接影响单独颗粒的微观结构，且限制水平的提高阻止了更刚性颗粒的生长。作为结果，颗粒更易变形且g’更低。
[0573]
结论：
[0574]
总之，在处理期间改变混合速度对具有低聚合物浓度的微凝胶混悬剂的最终材料特性没有发挥大的作用。因此，可在不改变滴眼剂制剂的最终特性的情况下施加广泛的处理剪切。然而，对于用于“乳膏样”可分散系统的较高浓度，剪切处理在静止时的固体样行为程度中发挥更重要的作用。在这些情况下，可针对预期用途操纵弹性程度。
[0575]
另一些实验信息：流体凝胶形成和特性
[0576]
目的：
[0577]
·
显示从在不同浓度下具有不同的凝胶化机制的多种起始生物聚合物(结冷胶、κ
‑
卡拉胶、藻酸盐、琼脂)制备流体凝胶的能力。
[0578]
·
展示这些流体凝胶的材料特性。
[0579]
材料和方法：
[0580]
流体凝胶的制备：
[0581]
如下制备流体凝胶：
[0582]
结冷胶(热凝胶化)：
[0583]
·
将结冷胶粉末添加至具有5％pbs的水以形成0.5％至2％的聚合物溶液。
[0584]
·
将溶液加热至高于胶凝点。
[0585]
·
添加交联剂(氯化钠(10mm最终浓度))
[0586]
·
在不断剪切的同时使溶液冷却至胶凝点(约38℃)。
[0587]
κ
‑
卡拉胶(热凝胶化)：
[0588]
·
将结冷胶粉末添加至具有5％pbs的水以形成0.5％至2％的聚合物溶液。
[0589]
·
将溶液加热至高于胶凝点。
[0590]
·
添加交联剂(氯化钾(10mm最终浓度))
[0591]
·
在不断剪切的同时使溶液冷却至胶凝点(约40℃)。
[0592]
藻酸盐(离子凝胶化)：
[0593]
·
将藻酸盐粉末添加至具有5％pbs的水以形成0.5％至1％的聚合物溶液。
[0594]
·
使聚合物充分水合。(如果通过加热帮助，则允许冷却至室温)
[0595]
·
在不断剪切的同时使用注射器和针缓慢添加交联剂(添加氯化钙(10mm最终浓度))。
[0596]
琼脂(具有滞后的热凝胶化(熔点和胶凝点不相同))：
[0597]
·
将琼脂粉添加至具有5％pbs的水以形成0.5％至2％的聚合物溶液。
[0598]
·
将溶液加热至高于胶凝点(高于90℃)。
[0599]
·
添加交联剂(添加氯化钠(10mm最终浓度))
[0600]
·
在不断剪切的同时使溶液冷却至胶凝点(约36℃)。
[0601]
流变测试：
[0602]
使用配备有锯齿状平行板(直径40mm，间隙高度1mm)的流变仪在20℃下测试所有样品。
[0603]
振幅扫描(图26)：
[0604]
·
振幅扫描是在0.1％至500.0％的范围内以应变控制模式获得的。
[0605]
·
一旦装载，使样品在测试前在20℃下保持平衡。
[0606]
·
以对数方式在1hz下获得测量值。
[0607]
频率扫描(图27)：
[0608]
·
频率扫描是在振幅扫描的线性黏弹区内在应变下进行的。
[0609]
·
一旦装载，使样品在测试前在20℃下保持平衡。
[0610]
·
以对数方式在0.01和10hz之间测试样品。
[0611]
流动谱(图28)：
[0612]
·
样品的黏度谱是使用连续斜坡获得的。
[0613]
·
将样品装载到仪器中并使其在测试前在20℃下保持平衡。
[0614]
·
在3分钟的斜坡内，在0.1至600s
‑1之间以速率控制模式对样品施加提高的剪切，其中以对数方式获得数据点。
[0615]
结果：
[0616]
图26至28示出了针对琼脂、结冷胶、κ卡拉胶和藻酸盐获得的振幅扫描、频率扫描和黏度扫描的数据。
[0617]
讨论：
[0618]
获得的数据表明：
[0619]
·
所有系统均显示出通常与流体凝胶相关的机械特性：静止时的弱固体样行为(频率扫描)；在施加应变的情况下固体行为的破坏，屈服(振幅扫描)；和剪切稀化行为(黏度谱)。
[0620]
·
数据显示流体凝胶可使用一系列不同的生物聚合物包括结冷胶来制备。
[0621]
·
数据表明可使用多种凝胶化机制来制造流体凝胶：
[0622]
a.热驱动过程(结冷胶、琼脂、κ
‑
卡拉胶)；
[0623]
b.离子凝胶化
‑
经由离子物质(无热)通过交联而凝胶化(藻酸盐)。
[0624]
·
此外，在热驱动过程的情况下，其表明可使用多种离子物质(na
+
和k
+
)。
[0625]
·
凝胶的机械响应均可依据先前专利中报道的材料特性进行分类。(在外部限制
内或者在被声明作为更优化的缩小窗内)。
[0626]
结论：
[0627]
总之，该数据表明可从一系列聚合物制造流体凝胶。这已使用一系列具有以下不同凝胶化机制的生物聚合物得到证明：热、具有滞后的热、离子和自由基。这些广泛的实例说明了制造流体凝胶的全面手段，使得等于或高于临界凝胶化浓度的任何生物聚合物溶液均可用于制造流体凝胶，所述生物聚合物溶液在适当的剪切下被迫通过其溶胶
‑
凝胶转变(热的、离子的、自由基诱导的
……
)以防止形成完整连续的凝胶网络。
[0628]
另一些实验信息
‑
多种流体凝胶的活性物的释放
[0629]
目的：
[0630]
显示从由多种起始聚合物(特别是结冷胶和藻酸盐)制造的流体凝胶基质中释放一系列不同适应证(抗纤维化、抗感染、疼痛缓解、抗炎、ecm调节、基膜调节和促纤维化)的多种活性物的能力。
[0631]
材料和方法：
[0632]
流体凝胶的制备：
[0633]
流体凝胶通过以下制备：
[0634]
结冷胶(热凝胶化)：
[0635]
·
将结冷胶粉末添加至具有5％pbs的水以形成0.5％至2％的聚合物溶液。
[0636]
·
将溶液加热至高于胶凝点。
[0637]
·
添加交联剂(氯化钠(10mm最终浓度))
[0638]
·
在不断剪切的同时使溶液冷却至胶凝点(约38℃)。
[0639]
藻酸盐(离子凝胶化)：
[0640]
·
将藻酸盐粉末添加至具有5％pbs的水以形成0.5％至1％的聚合物溶液。
[0641]
·
使聚合物充分水合。(如果通过加热帮助，则允许冷却至室温)
[0642]
·
在不断剪切的同时使用注射器和针缓慢添加交联剂(添加氯化钙(10mm最终浓度))。
[0643]
活性物的制备：
[0644]
·
将活性物等分：青霉素
‑
链霉素(0.1ml)、地塞米松(50mg)、蛋白酶k(10mg)、布洛芬(200mg)、葡聚糖(300mg)、葡聚糖蓝(100mg)、万古霉素(50mg)、galacorin
tm
(饰胶蛋白聚糖)(2.4mg/ml)
[0645]
·
将活性物添加至pbs以使总体积为1ml。
[0646]
·
在涡旋混合器上充分混合直至溶解
[0647]
载有活性物的凝胶的制备：
[0648]
·
将0.9ml凝胶添加至eppendorf。
[0649]
·
向每种凝胶添加0.1ml的在pbs中的活性物。
[0650]
·
使用涡旋混合器充分混合。
[0651]
·
在测试之前冷藏24小时。
[0652]
标准曲线的确定：
[0653]
·
制备pbs中标准浓度的活性物。
[0654]
·
将标准品移入石英比色皿(1mm通路长度)中。
[0655]
·
使用紫外/可见光谱测量200至700nm波长之间的吸光度。
[0656]
·
绘制曲线并用于确定用于确定浓度的标准曲线。
[0657]
(在galacorin
tm
的情况下，使用现成的elisa试剂盒根据试剂盒说明来确定饰胶蛋白聚糖浓度)
[0658]
释放测定：
[0659]
·
将0.5ml pbs添加至24孔板的孔。
[0660]
·
将pbs在37℃下孵育至平衡。
[0661]
·
将0.1ml含活性物的流体凝胶放置在跨孔插入物中。
[0662]
·
将跨孔插入物放置在含pbs的孔中。
[0663]
·
在给定的时间段之后，将跨孔插入物移出并放置在新鲜的pbs孔中。
[0664]
·
然后移出释放介质并使用紫外/可见光谱进行分析。
[0665]
·
从标准曲线得出浓度并将累积释放绘制为时间的函数。
[0666]
结果：
[0667]
图29举例说明了关于并入了以下活性剂的根据本发明的剪切稀化水凝胶组合物获得的标准曲线：青霉素
‑
链霉素；地塞米松；蛋白酶k；布洛芬；葡聚糖和葡聚糖蓝。
[0668]
图30举例说明了关于并入了以下活性剂的根据本发明的剪切稀化水凝胶组合物获得的曲线：青霉素
‑
链霉素；地塞米松；蛋白酶k；布洛芬；葡聚糖和葡聚糖蓝。
[0669]
讨论：
[0670]
以上结果中获得的数据表明：
[0671]
·
无论生物聚合物(结冷胶、藻酸盐)或聚合物机理如何，都可从所有流体凝胶基质中实现活性物的装载和释放。
[0672]
·
无论凝胶化机制(热凝胶化、离子凝胶化或自由基诱导的凝胶化)如何，都可从所有流体凝胶基质中实现活性物的装载和释放。
[0673]
·
流体凝胶可释放小分子(布洛芬、地塞米松、青霉素
‑
链霉素)和大分子(葡聚糖、葡聚糖蓝、蛋白酶k、galacorin
tm
(饰胶蛋白聚糖))二者。
[0674]
·
流体凝胶可用于以下适应证的控制递送：
[0675]
ο抗纤维化
‑
galacroin
tm
(饰胶蛋白聚糖)、葡聚糖
[0676]
ο抗感染
‑
万古霉素、青霉素
‑
链霉素
[0677]
ο疼痛缓解
‑
布洛芬
[0678]
ο抗炎
‑
布洛芬、地塞米松
[0679]
οecm调节
‑
蛋白酶k
[0680]
ο基膜调节
‑
蛋白酶k
[0681]
ο促纤维化
‑
葡聚糖
[0682]
结论：
[0683]
由一系列聚合物并使用多种凝胶化技术制成的根据本发明的剪切稀化水凝胶组合物(流体凝胶)可用于递送广泛的治疗剂、大分子和小分子二者。这表明在这些情况下可递送广泛的治疗剂。用于通过该方法递送的治疗剂的适用性显示出不受分子尺寸或类型(蛋白质或多糖)的控制，但(在本研究中)取决于药剂的水溶性。这已针对适用于治疗广泛适应证的活性剂的示例进行了说明。
[0684]
另一些实验信息：抗感染分子从本发明的凝胶组合物中的体外释放和作用
[0685]
目的：
[0686]
显示抗感染治疗剂(通过万古霉素和青霉素
‑
链霉素示例)在从根据本发明的剪切稀化水凝胶组合物中释放时的效力。
[0687]
材料和方法：
[0688]
流体凝胶的制备：
[0689]
流体凝胶通过以下制备：
[0690]
结冷胶
[0691]
·
将结冷胶粉末添加至具有5％pbs的水以形成1％的聚合物溶液。
[0692]
·
将溶液加热至高于胶凝点。
[0693]
·
添加交联剂(添加氯化钠(10mm最终浓度))
[0694]
·
在不断剪切的同时使溶液冷却至胶凝点。
[0695]
藻酸盐
[0696]
·
将藻酸盐粉末添加至具有5％pbs的水以形成0.5％的聚合物溶液。
[0697]
·
使聚合物充分水合。(如果通过加热帮助，则允许冷却至室温)
[0698]
·
在不断剪切的同时使用注射器和针缓慢添加交联剂(添加氯化钙(10mm最终浓度))。
[0699]
活性物的制备：
[0700]
·
将活性物等分：青霉素
‑
链霉素(100ml)和万古霉素(50mg)。
[0701]
·
将活性物添加至pbs以使总体积为1ml。
[0702]
·
在涡旋混合器上充分混合直至溶解
[0703]
载有活性物的凝胶的制备：
[0704]
·
将0.9ml凝胶添加至eppendorf。
[0705]
·
向每种凝胶添加0.1ml的在pbs中的活性物。
[0706]
·
使用涡旋混合器充分混合。
[0707]
·
在测试之前冷藏24小时。
[0708]
微生物的制备：
[0709]
·
通过将tsa溶解在水中、通过高压釜灭菌并投入90mm培养皿中来制备tsa板。
[0710]
·
使板冷却。
[0711]
·
培养微生物(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)并平板接种。
[0712]
·
使微生物形成“菌苔”。
[0713]
·
在凝胶中钻孔并移除以提供孔。
[0714]
抑菌圈测定：
[0715]
·
将0.25ml含活性物的流体凝胶添加至每个板的孔。
[0716]
·
将pbs中的抗感染剂添加至对照板。
[0717]
·
盖板并且对于青霉素
‑
链霉素孵育24小时，对于万古霉素孵育多至14小时。
[0718]
·
测量其中已去除微生物培养物的区域。
[0719]
结果：
[0720]
图31示出了举例说明使用根据本发明的剪切稀化水凝胶组合物进行的抑菌圈测
定结果的照片，所述组合物包含与抗感染剂(青霉素
‑
链霉素)组合的聚合物藻酸盐或结冷胶。这些结果证明了对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的有效性。结果的总结也在附表中提供。
[0721]
图31还包括举例说明了使用根据本发明的剪切稀化水凝胶组合物进行的抑菌圈测定结果的图，所述组合物包含与替代抗感染剂(万古霉素)组合的藻酸盐。测试了针对mrsa的抗微生物有效性。
[0722]
讨论：
[0723]
数据显示：
[0724]
·
无论聚合物类型、凝胶化机制或活性如何，抗感染剂的释放和活性发生在所有系统中。
[0725]
结论：
[0726]
由一系列聚合物并使用多种凝胶化技术制成的流体凝胶可用于递送抗感染剂而不使其活性受损。这些结果说明本发明的剪切稀化凝胶组合物适合递送多种抗感染剂以用于需要这样的药剂的治疗。
[0727]
另一些实验信息：从流体凝胶中释放的蛋白酶k的体外作用
[0728]
目的：
[0729]
显示胞外基质重塑剂蛋白酶k在从根据本发明的剪切稀化水凝胶组合物中释放之后保留生物活性。
[0730]
材料和方法：
[0731]
流体凝胶的制备：
[0732]
流体凝胶通过以下制备：
[0733]
结冷胶
[0734]
·
将结冷胶粉末添加至具有5％pbs的水以形成1％的聚合物溶液。
[0735]
·
将溶液加热至高于胶凝点。
[0736]
·
添加交联剂(添加氯化钠(10mm最终浓度))
[0737]
·
在不断剪切的同时使溶液冷却至胶凝点。
[0738]
藻酸盐
[0739]
·
将藻酸盐粉末添加至具有5％pbs的水以形成0.5％的聚合物溶液。
[0740]
·
使聚合物充分水合。(如果通过加热帮助，则允许冷却至室温)
[0741]
·
在不断剪切的同时使用注射器和针缓慢添加交联剂(添加氯化钙(10mm最终浓度))。
[0742]
活性物的制备：
[0743]
·
将活性物等分：蛋白酶k(10mg)
[0744]
·
将活性物添加至pbs以使总体积为1ml。
[0745]
·
在涡旋混合器上充分混合直至溶解
[0746]
载有活性物的凝胶的制备：
[0747]
·
将0.9ml凝胶添加至eppendorf。
[0748]
·
向每种凝胶添加0.1ml的在pbs中的活性物。
[0749]
·
使用涡旋混合器充分混合。
[0750]
·
在测试之前冷藏24小时。
[0751]
基质分解测定：
[0752]
·
在24孔板的孔中形成0.5ml纤维蛋白凝胶(8.5mg/ml)。
[0753]
·
向每孔添加0.5ml pbs。
[0754]
·
将0.1ml的具有活性物的凝胶添加至跨孔插入物并放置在纤维蛋白凝胶上。
[0755]
·
将样品在60℃下孵育以活化蛋白酶k。
[0756]
·
在多个时间点拍摄图像，并与对照纤维蛋白凝胶(仅pbs)和添加了蛋白酶k而没有流体凝胶载体的纤维蛋白凝胶进行比较。
[0757]
结果：
[0758]
图32示出了展示示例性ecm分子纤维蛋白(在照片中显示为白色凝胶)在从根据本发明的藻酸盐或结冷胶剪切稀化水凝胶组合物释放的活性剂蛋白酶k的作用下随时间分解的照片。
[0759]
讨论：
[0760]
数据显示：
[0761]
ο除对照组之外，在所有情况下都发生了纤维蛋白凝胶的分解。
[0762]
ο在仅蛋白酶k组中的纤维蛋白凝胶分解更快。
[0763]
ο在从凝胶中释放之后活性物仍是强效的。
[0764]
结论：
[0765]
根据本发明的剪切稀化水凝胶组合物能够释放细胞外重塑活性剂(蛋白酶k)，这保留了其调节ecm的能力。这证明了本发明的组合物能够递送该类别的治疗性分子。
[0766]
另一些实验信息：在根据本发明的结冷胶剪切稀化水凝胶组合物中制备的galacorin
tm
(饰胶蛋白聚糖)的体外作用
[0767]
目的：
[0768]
显示抗纤维化治疗剂(通过市售的人重组饰胶蛋白聚糖产品galacorin
tm
示例)在从本发明的剪切稀化水凝胶组合物中释放时的效力。
[0769]
材料和方法：
[0770]
流体凝胶的制备：
[0771]
流体凝胶通过以下制备：
[0772]
结冷胶
[0773]
·
将结冷胶粉末添加至具有5％pbs的水以形成1％的聚合物溶液。
[0774]
·
将溶液加热至高于胶凝点。
[0775]
·
添加交联剂(添加氯化钠(10mm最终浓度))
[0776]
·
在恒定剪切下将溶液冷却至40℃并添加galacorin
tm
(最终浓度为240μg/ml)
[0777]
·
在持续剪切的同时继续冷却至胶凝点。
[0778]
胶原蛋白原纤维生成测定：
[0779]
·
通过混合磷酸钠和氯化钠并将ph调节至7.4来制备稀释剂和反应缓冲液。
[0780]
·
将样品(结冷胶流体凝胶+galacorin
tm
、仅galacorin和仅结冷胶)添加至96孔板，并使用稀释缓冲液在板的行中进行连续稀释。
[0781]
·
在冰上，通过与冷水混合至浓度为0.8mg/ml来制备胶原蛋白。
[0782]
·
将胶原蛋白添加至所有孔。
[0783]
·
向所有孔添加反应缓冲液并混合。
[0784]
·
在37℃下孵育2小时。
[0785]
·
使用读板仪在405nm处读取
[0786]
结果：
[0787]
图33是举例说明了该研究的结果并比较了以下情况在405nm处的吸光度(y轴)的图：单独的胶原蛋白(“仅胶原蛋白”)、或与单独的饰胶蛋白聚糖“hrdecorin”)一起孵育的胶原蛋白、或与提高浓度的具有(“decfg”)或不具有(“fg”)人重组饰胶蛋白聚糖(galacorin
tm
)的本发明结冷胶流体凝胶剪切稀化水凝胶组合物一起孵育的胶原蛋白。
[0788]
讨论：
[0789]
数据显示：
[0790]
·
与仅胶原蛋白对照相比，结冷胶流体凝胶对胶原蛋白原纤维形成没有影响。
[0791]
·
结冷胶流体凝胶中或结冷胶流体凝胶外的galacorin
tm
对胶原蛋白原纤维生成具有相同的作用。
[0792]
结论：
[0793]
胶原蛋白原纤维生成可用作瘢痕形成的指示性测定。因此，作为差的胶原蛋白微观结构(与瘢痕组织相当)的结果的高吸光度表明受试组合物对瘢痕形成没有影响。相比之下，吸光度的降低表明了胶原蛋白微观结构更有序，这与更好的体内愈合相当。在此已证明装载至结冷胶流体凝胶中的galacorin
tm
(饰胶蛋白聚糖)与直接添加至胶原蛋白的galacorin
tm
具有相同的作用。因此，这在体外证明了根据本发明的结冷胶剪切稀化水凝胶组合物可释放治疗性抗纤维化剂，并且其在释放后保持其活性。
[0794]
另一些实验信息：来自本发明的结冷胶剪切稀化水凝胶组合物的galacorin
tm
(饰胶蛋白聚糖)的体内作用
[0795]
目的：
[0796]
显示在微生物性角膜炎的体内小鼠模型中抗纤维化治疗剂(galacorin
tm
)在从流体凝胶载体中释放时的效力。
[0797]
材料和方法：
[0798]
流体凝胶的制备：
[0799]
流体凝胶通过以下制备：
[0800]
结冷胶
[0801]
·
将结冷胶粉末添加至具有5％pbs的水以形成1％的聚合物溶液。
[0802]
·
将溶液加热至高于胶凝点。
[0803]
·
添加交联剂(添加氯化钠(10mm最终浓度))
[0804]
·
在恒定剪切下将溶液冷却至40℃并添加galacorintm(最终浓度为240μg/ml)
[0805]
·
在持续剪切的同时继续冷却至胶凝点。
[0806]
小鼠模型：
[0807]
本研究中使用的代表性小鼠模型在图34中示出。简言之，这表明该模型通过三个阶段进行：细菌性角膜炎模型的开发、灭菌阶段和愈合阶段。使用的终点是体内立体显微术(用于评估第2、3、9、12和16天的混浊)和组织切片的免疫组织化学分析，以研究ecm蛋白的表达和上皮再形成的程度。
[0808]
混浊量化：
[0809]
·
两名眼科医生作为不知情的独立观察者以相同的随机顺序(由独立统计学家提供的顺序)分析所有照片。
[0810]
·
使用fiji(基于imagej的开源图像处理软件包)测量混浊面积。
[0811]
·
使用ggplot2以r绘制测量值(以mm2计)，并且拟合平滑器(loess smoother)符合每个评估者的时序数列。
[0812]
上皮再形成、αsma、lam和fn的组织处理和ihc：
[0813]
·
将眼固定在pbs中的4％pfa中。
[0814]
·
然后将眼在oct中快速冷冻，并在
‑
22℃下在旁矢状平面中以15μm的厚度切片。
[0815]
·
将切片封固在带正电的载玻片(superfrost plus；fisher scientific,pittsburgh,pa,usa)上。
[0816]
·
将中央切片(在视神经平面中)用于所有ihc研究。
[0817]
·
将切片解冻30分钟，然后在pbs中洗涤，接着是用0.1％triton x
‑
100(sigma)进行透化。
[0818]
·
将组织切片中的非特异性抗体结合位点用0.5％bsa、0.3％吐温
‑
20和15％正常山羊血清封闭。
[0819]
·
添加一抗αsma、层黏连蛋白和纤连蛋白(1:200的稀释)，接着是在pbs中洗涤。
[0820]
·
然后进行在rt下与二抗(山羊抗小鼠alexa flour 488 1:500，山羊抗小鼠alexa flour 594 1:500)一起孵育1小时。
[0821]
·
然后将切片在pbs中洗涤并在含dapi的vectorshield封固剂中封固。
[0822]
·
与单独的二抗一起孵育的对照组织切片均呈阴性染色(未示出)。
[0823]
ihc成像和量化：
[0824]
·
通过测量像素强度来量化ihc染色。
[0825]
·
用于量化ecm ir的目的区域由对基质内的所有眼/处理具有相同规定尺寸的目的区域限定，每个基质取总共30个单独的强度测量(目的区域)以覆盖基质的整个区域。
[0826]
·
在基质内的这些限定的目的区域内量化胞外基质沉积，并且使用imagej软件计算高于标准化背景阈值的免疫荧光像素的百分比。
[0827]
·
对于每种抗体，使用未受损伤的未经处理眼切片设定基质区域中亮度的阈值水平，以限定用于像素强度的测试组分析的参考水平。
[0828]
结果：
[0829]
研究结果在图35中示出，图35列出了示出了以下的图：在不同时间点与不同处理相关的混浊面积、所研究的多个对照组和处理组的高于阈值的α
‑
平滑肌肌动蛋白像素的百分比、所研究的多个对照组和处理组的高于阈值的纤连蛋白像素的百分比，以及所研究的多个对照组和处理组的高于阈值的层黏连蛋白像素的百分比。
[0830]
讨论：
[0831]
数据显示：
[0832]
·
与标准护理(仅庆大霉素+泼尼松龙)相比，包含galacorin
tm
的根据本发明的结冷胶剪切稀化水凝胶(流体凝胶)组合物在16天内降低了混浊面积。
[0833]
·
与单独的标准护理相比，包含galacorin
tm
的根据本发明的结冷胶剪切稀化水凝
胶(流体凝胶)组合物显著降低了纤维化的所有三种受试标志物。
[0834]
结论：
[0835]
在根据本发明的结冷胶剪切稀化水凝胶(流体凝胶)组合物中应用抗纤维化剂降低了体内瘢痕形成。这种瘢痕形成的降低是通过混浊面积(瘢痕形成)的降低和通常与纤维化和瘢痕形成相关的标志物表达的降低二者证明的。
[0836]
另一些实验信息：根据本发明的剪切稀化水凝胶组合物降低了眼内压
[0837]
目的
[0838]
该研究旨在研究不具有活性剂的剪切稀化水凝胶组合物在高血压大鼠(青光眼的动物模型)中降低眼内压的潜力。
[0839]
材料和方法
[0840]
在大鼠中通过每周两次前房内注射tgf
‑
1来诱导高血压。
[0841]
在不进行处理的高血压大鼠(n＝9)中和在接受每天两次由结冷胶制成的本发明剪切稀化水凝胶组合物滴眼剂制剂的大鼠中测定眼内压的净变化。
[0842]
结果
[0843]
结果在图36中示出，其中经处理的大鼠以虚线示出，并且未经处理的对照以实黑线示出。结果用双因素anova和sidak多重比较检验进行分析，并且显示在高眼压大鼠中，本发明的组合物与对照相比到d28时显著降低了眼内压(p<0.05)。
[0844]
结论
[0845]
所获得的结果表明本发明的剪切稀化水凝胶制剂能够降低眼内高压(表明能够预防或治疗青光眼)。出乎意料地，该活性即使在没有活性剂的情况下配制组合物时也能观察到。
[0846]
在本说明书的描述和权利要求书通篇，词语“包含/包括”和“包含/含有”及其变化形式意指“包括但不限于”，并且它们不旨在(并且不)排除其他部分、添加物、组分、整数或步骤。在本说明书的描述和权利要求书通篇，除非上下文另有要求，否则单数形式涵盖复数形式。特别地，在使用没有数量词修饰的名词的情况下，除非上下文另外要求，否则本说明书应理解为表示一个/种或更多个/种。
[0847]
除非与其不相容，否则结合本发明的特定方面、实施方案或实例描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团将被理解为可适用于本文中所述的任何其他方面、实施方案或实例。本说明书(包括任何随附权利要求书、摘要和附图)中所公开的所有特征和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤均可以以任何组合形式进行组合，其中这样的特征和/或步骤中的至少一些为不相容的组合除外。本发明不限于任何前述实施方案的细节。本发明扩展到本说明书(包括任何随附权利要求书、摘要和附图)中所公开的特征中的任一新特征或任何新组合，或如此公开的任何方法或过程的步骤中的任一新步骤或任何新组合。
[0848]
将读者的注意力引导至与本技术有关的与本说明书同时或在本说明书之前提交并且与本说明书一起公开以供公众查看的所有文件和文献，并且所有这样的文件和文献的内容均通过引用并入本文。
[0849]
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