KRAS变体mRNA分子的制作方法

kras变体mrna分子
1.ras基因(因其在形成大鼠肉瘤中的作用而得名)是在人类癌细胞中鉴定的第一个致癌基因。三个ras基因编码188
‑
189个氨基酸的蛋白质，这些蛋白质具有82％至90％的氨基酸序列同一性，并且具有几乎相同的结构和生化性能。ras(大鼠肉瘤)蛋白家族成员是低分子量gtp结合蛋白，其在调节细胞分化、增殖和存活中发挥作用。ras家族有3个主要成员：hras、nras和kras，它们构成人类癌症中最常发生突变的癌基因家族，在大约25％至30％的人类癌症中发现ras中的突变(e santos、genes cancer 2011；2：344
‑
358)。
2.ras突变频率在美国三大癌症死亡原因(肺癌、结直肠癌和胰腺癌)中最高，导致非常努力地开发抗ras疗法(wang等人，j.med.chem.2013；56：5219
‑
5230；waters and der，cold spring harb perspect med.2018；8：a031435；和stephen等人，cancer cell.2014；25：272
‑
81，doi：10.1016/j.ccr.2014.02.017)。
3.kras是最常发生突变的ras亚型，并且显示在高达90％的胰腺癌、45％的结直肠癌和25％至35％的肺腺癌中发生突变(zeitouni d等人，cancers(basel)2016；8：45；tan c和x du，world j.gastroent.2012；18：5175
‑
5189；和kempf e，等人，eur.resp.rev.2016；25：71
‑
76)。在胰腺癌、结肠癌、小肠癌、胆管癌和肺癌肿瘤中观察到kras突变，在造血和皮肤癌中观察到nras突变(hunter jd等人，mol.cancer research 13：1325(2015))。在肾上腺、胆道、骨、乳腺、子宫颈、子宫内膜、淋巴、肾、大肠、肝、肺、食道、卵巢、胰腺、前列腺、唾液腺、皮肤、小肠、胃和睾丸的肿瘤中观察到ras突变，并且kras是ras最常突变的亚型，其存在于cosmic数据集中分析的22％的肿瘤中(prior ia等人，cancer research 71：2457(2012))。
4.然而，尽管经过三十多年的努力，有效的kras抑制剂尚未触及癌症患者，而kras驱动的癌症是最难治疗的癌症，有时被排除在治疗之外。ras蛋白被称为“不可成药”，主要是因为无法鉴定有效的化学抑制剂。
5.因此，对于具有kras突变肿瘤的患者的有效抗癌疗法仍然存在未满足的医学需求。
6.本发明提供了mrna分子，其包含编码氨基酸序列的mrna序列，所述氨基酸序列包含ctla4信号肽、kras变体肽、padre衍生的t辅助表位序列和ctla4跨膜结构域或其部分。在优选的实施方案中，kras变体肽包含kras变体肽序列的29个连续氨基酸残基。
7.在一个优选的实施方案中，本发明的mrna分子配制成例如在药物组合物中的脂质纳米颗粒。在另一个实施方案中，例如在药物组合物中的脂质纳米颗粒包含1个、2个、3个、4个或5个mrna分子，其配制为脂质纳米颗粒，其中各个单独mrna分子编码不同的kras变体肽。在另一个优选的实施方案中，例如在药物组合物中的脂质纳米颗粒包含5个mrna分子，其中各个单独mrna分子编码不同的kras变体肽。在另一个优选的实施方案中，例如在药物组合物中的脂质纳米颗粒包含4个mrna分子，其中各个单独mrna分子编码不同的kras变体肽。在另一个优选的实施方案中，例如在药物组合物中的脂质纳米颗粒包含3个mrna分子，其中各个单独mrna分子编码不同的kras变体肽。在另一个优选的实施方案中，例如在药物组合物中的脂质纳米颗粒包含2个mrna分子，其中各个单独mrna分子编码不同的kras变体肽。在另一个实施方案中，例如在药物组合物中的脂质纳米颗粒包含1个mrna分子。
8.在另一个优选的实施方案中，各自编码不同的kras变体肽的一个或多于一个单独mrna分子在配制为脂质纳米颗粒之前进行混合。在另一个优选的实施方案中，各自编码特定kras变体肽的1个、2个、3个、4个或5个单独mrna分子在配制为脂质纳米颗粒之前进行混合。在另一个优选的实施方案中，各自编码不同的kras变体肽的5个单独mrna分子在配制为脂质纳米颗粒之前混合在一起。
9.在一个优选的实施方案中，脂质纳米颗粒制剂包含本发明的一个或多于一个mrna分子、磷酸胆碱(例如，二硬脂酰磷酸胆碱(dspc)或1，2
‑
二硬脂酰
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸胆碱)、聚乙二醇化的脂质(例如，2
‑
mpeg2000
‑
n，n
‑
双十四烷基乙酰胺)、甾醇(例如，胆固醇)和衍生自本文的式(lnp
‑
iii)的阳离子脂质(例如，本文表4中的lnp iii
‑
3的脂质)。在另一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含本发明的一个或多于一个mrna分子、1，2
‑
二硬脂酰
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸胆碱(dspc)、2
‑
mpeg2000
‑
n，n
‑
双十四烷基乙酰胺、胆固醇和本文表4中的lnp iii
‑
3的脂质。
10.在另一个优选的实施方案中，kras变体肽包含kras g12c变体氨基酸残基、kras g12d变体氨基酸残基、kras g12v变体氨基酸残基、kras g12r变体氨基酸残基或kras g13d变体氨基酸残基。
11.在另一个优选的实施方案中，mrna分子还包含3
’‑
utr序列。在另一个实施方案中，mrna分子还包含5
’‑
utr序列和3
’‑
utr序列。
12.在另一个优选的实施方案中，mrna不包含编码任何其他功能元件的序列。在另一个优选的实施方案中，mrna不编码干扰素基因肽或多肽的刺激物(sting)。
13.在另一个优选的实施方案中，kras变体肽包含seq id no：8、seq id no：9、seq id no：10、seq id no：11或seq id no：12的氨基酸序列(表1)，这些氨基酸序列可优选由表1中第三列和第四列所述的核酸编码。
[0014][0015]
在另一个优选的实施方案中，mrna分子是表2中的序列标识符所述的mrna分子。
[0016]
[0017][0018]
在另一个优选的实施方案中，mrna分子是seq id no：63、seq id no：64、seq id no：65、seq id no：66或seq id no：67(表2)中所述的mrna分子。
[0019]
在另一个优选的实施方案中，mrna分子是seq id no：58、seq id no：59、seq id no：60、seq id no：61或seq id no：62(表2)中所述的mrna分子。
[0020]
在另一个优选的实施方案中，mrna分子编码seq id no：48、seq id no：49、seq id no：50、seq id no：51或seq id no：52(表3)中所述的kras变体肽或多肽。在另一个优选的实施方案中，分子如seq id no：53、seq id no：54、seq id no：55、seq id no：56或seq id no：57所限定。
[0021][0022][0023]
在另一个优选的实施方案中，mrna分子编码包含kras g12c变体肽的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，kras g12c变体肽是seq id no：8。在另一个优选的实施方案中，mrna分子编码包含seq id no：48的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，mrna分子编码包含seq id no：53的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，mrna分子包含seq id no：58。在另一个优选的实施方案中，mrna分子包含seq id no：63。
[0024]
在另一个优选的实施方案中，mrna分子编码包含kras g12d变体肽的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，kras g12d变体肽是seq id no：9。在另一个优选的实施方案中，mrna分子编码包含seq id no：49的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，mrna分子编码包含seq id no：54的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，mrna分子包含seq id no：59。在另一个优选的实施方案中，mrna分子包含seq id no：64。
[0025]
在另一个优选的实施方案中，mrna分子编码包含kras g12r变体肽的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，kras g12r变体肽是seq id no：10。在另一个优选的实施方案中，mrna分子编码包含seq id no：50的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，mrna分子编码包含seq id no：55的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，mrna分子包含seq id no：60。在另一个优选的实施方案中，mrna分子包含seq id no：65。
[0026]
在另一个优选的实施方案中，mrna分子编码包含kras g12v变体肽的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，kras g12v变体肽是seq id no：11。在另一个优选的实施方案中，mrna分子编码包含seq id no：51的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，mrna分子编码包含seq id no：56的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，mrna分子包含seq id no：61。在另一个优选的实施方案中，mrna分子包含seq id no：66。
[0027]
在另一个优选的实施方案中，mrna分子编码包含kras g13d变体肽的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，kras g13d变体肽是seq id no：12。在另一个优选的实施方案中，mrna分子编码包含seq id no：52的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，mrna分子编码包含seq id no：57的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，mrna分子包含seq id no：62。在另一个优选的实施方案中，mrna分子包含seq id no：67。
[0028]
根据特别优选的实施方案，mrna分子还包含至少一个5
’‑
序列和/或3
’‑
utr序列。
[0029]
本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的mrna分子，和一种或多于一种药学上可接受的载体或赋形剂。
[0030]
在优选的实施方案中，药物组合物包含1个、2个、3个、4个或5个不同的mrna分子，各个mrna分子编码不同的kras变体肽。
[0031]
在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码单个kras变体肽的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含2个不同的mrna分子，各个mrna分子编码不同的kras变体肽。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含3个mrna分子，各个mrna分子编码不同的kras变体肽。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含4个mrna分子，各个mrna分子编码不同的kras变体肽。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含5个mrna分子，各个mrna编码不同的kras变体肽。
[0032]
在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码包含kras g12c变体肽的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，kras g12c变体肽是seq id no：8。在另一个优选的实施方案中，mrna分子编码包含seq id no：48的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，mrna分子编码包含seq id no：53的氨基酸序列。
[0033]
在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码包含kras g12d变体的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，kras g12d变体肽是seq id no：9。在另一个优选的实施方案中，mrna分子编码包含seq id no：49的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，mrna分子编码包含seq id no：54的氨基酸序列。
[0034]
在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码包含kras g12r变体肽的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，kras g12r变体肽是seq id no：10。在另一个优选的实施方案中，mrna分子编码包含seq id no：50的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，mrna分子编码包含seq id no：55的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码包含kras g12v变体肽的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，kras g12v变体肽是seq id no：11。在另一个优选的实施方案中，mrna分子编码包含seq id no：51的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，mrna分子编码包含seq id no：56的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码包含kras g13d变体肽的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，kras g13d变体肽是seq id no：12。在另一个优选的实施方案中，mrna分子编码包含seq id no：52的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，mrna分子编码包含seq id no：57的氨基酸序列。
[0035]
在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码包含kras g12c变体肽的氨基酸序列的mrna分子和编码包含kras g12d变体肽的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，kras g12c变体肽是seq id no：8和kras g12d变体肽是seq id no：9。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：48的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：49的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：53的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：54的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：58的mrna分子和包含seq id no：59的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：63的mrna分子和包含seq id no：64的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括编码包含kras g12d变体肽的氨基酸序列的mrna分子和编码包含kras g12v变体肽的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，kras g12d变体肽是seq id no：9和kras g12v变体肽是seq id no：11。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：49的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：51的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：54的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：56的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：59的mrna分子和包含seq id no：61的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：64的mrna分子和包含seq id no：66的mrna分子。
[0036]
在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括编码包含kras g12d变体肽的氨基酸序列的mrna分子和编码包含kras g12r变体肽的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，kras g12d变体肽是seq id no：9和kras g12r变体肽是seq id no：10。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：49的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：50的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：54的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：55的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：59的mrna分子和包含seq id no：60的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：64的mrna分子和包含seq id no：65的mrna分子。
[0037]
在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括编码包含kras g12d变体肽的氨基酸序列的mrna分子和编码包含kras g13d变体肽的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选
的实施方案中，kras g12d变体肽是seq id no：9和kras g13d变体肽是seq id no：12。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：49的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：52的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：54的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：57的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：59的mrna分子和包含seq id no：62的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：64的mrna分子和包含seq id no：67的mrna分子。
[0038]
在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括编码包含kras g12c变体肽的氨基酸序列的mrna分子和编码包含kras g12v变体肽的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，kras g12c变体肽是seq id no：8和kras g12v变体肽是seq id no：11。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：48的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：51的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：53的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：56的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：58的mrna分子和包含seq id no：61的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：63的mrna分子和包含seq id no：66的mrna分子。
[0039]
在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括编码包含kras g12c变体肽的氨基酸序列的mrna分子和编码包含kras g12r变体肽的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，kras g12c变体肽是seq id no：8和kras g12r变体肽是seq id no：10。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：48的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：50的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：53的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：55的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：58的mrna分子和包含seq id no：60的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：63的mrna分子和包含seq id no：65的mrna分子。
[0040]
在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括编码包含kras g12c变体肽的氨基酸序列的mrna分子和编码包含kras g13d变体肽的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，kras g12c变体肽是seq id no：8和kras g13d变体肽是seq id no：12。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：48的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：52的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：53的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：57的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：58的mrna分子和包含seq id no：62的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：63的mrna分子和包含seq id no：67的mrna分子。
[0041]
在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括编码包含kras g12r变体肽的氨基酸序列的mrna分子和编码包含kras g12v变体肽的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，kras g12r变体肽是seq id no：10和kras g12v变体肽是seq id no：11。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：50的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：51的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包
含编码seq id no：55的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：56的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：60的mrna分子和包含seq id no：61的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：65的mrna分子和包含seq id no：66的mrna分子。
[0042]
在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括编码包含kras g12v变体肽的氨基酸序列的mrna分子和编码包含kras g13d变体肽的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，kras g12v变体肽是seq id no：11和kras g13d变体肽是seq id no：12。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：51的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：52的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：56的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：57的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：61的mrna分子和包含seq id no：62的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：66的mrna分子和包含seq id no：67的mrna分子。
[0043]
在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括编码包含kras g12r变体肽的氨基酸序列的mrna分子和编码包含kras g13d变体肽的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，kras g12r变体肽是seq id no：10和kras g13d变体肽是seq id no：12。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：50的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：52的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：55的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：57的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：60的mrna分子和包含seq id no：62的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：65的mrna分子和包含seq id no：67的mrna分子。
[0044]
在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括编码包含kras g12d变体肽的氨基酸序列的mrna分子、编码包含kras g12c变体肽的氨基酸序列的mrna分子和编码包含kras g12v变体肽的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，kras g12c变体肽是seq id no：8、kras g12d变体肽是seq id no：9和kras g12v变体肽是seq id no：11。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：48的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：49的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：51的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：53的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：54的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：56的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：58的mrna分子、包含seq id no：59的mrna分子和包含seq id no：61的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：63的mrna分子、包含seq id no：64的mrna分子和包含seq id no：66的mrna分子。
[0045]
在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括编码包含kras g12d变体肽的氨基酸序列的mrna分子、编码包含kras g12c变体肽的氨基酸序列的mrna分子和编码包含kras g12r变体肽的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，kras g12c变体肽是seq id no：8、kras g12d变体肽是seq id no：9和kras g12r变体肽是seq id no：10。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：48的氨基酸序列的mrna分子、编
码seq id no：49的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：50的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：53的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：54的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：55的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：58的mrna分子、包含seq id no：59的mrna分子和包含seq id no：60的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：63的mrna分子、包含seq id no：64的mrna分子和包含seq id no：65的mrna分子。
[0046]
在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括编码包含kras g12d变体肽的氨基酸序列的mrna分子、编码包含kras g12c变体肽的氨基酸序列的mrna分子和编码包含kras g13d变体肽的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，kras g12c变体肽是seq id no：8、kras g12d变体肽是seq id no：9和kras g13d变体肽是seq id no：12。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：48的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：49的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：52的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：53的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：54的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：57的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：58的mrna分子、包含seq id no：59的mrna分子和包含seq id no：62的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：63的mrna分子、包含seq id no：64的mrna分子和包含seq id no：67的mrna分子。
[0047]
在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括编码包含kras g12d变体肽的氨基酸序列的mrna分子、编码包含kras g12r变体肽的氨基酸序列的mrna分子和编码包含kras g12v变体肽的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，kras g12d变体肽是seq id no：9、kras g12r变体肽是seq id no：10和kras g12v变体肽是seq id no：11。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：49的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：50的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：51的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：54的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：55的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：56的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：59的mrna分子、包含seq id no：60的mrna分子和包含seq id no：61的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：64的mrna分子、包含seq id no：65的mrna分子和包含seq id no：66的mrna分子。
[0048]
在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括编码包含kras g12d变体肽的氨基酸序列的mrna分子、编码包含kras g12v变体肽的氨基酸序列的mrna分子和编码包含kras g13d变体肽的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，kras g12d变体肽是seq id no：9、kras g12v变体肽是seq id no：11和kras g13d变体肽是seq id no：12。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：49的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：51的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：52的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：54的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：56的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：57的氨基酸序列的mrna
id no：67的mrna分子。
[0052]
在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括编码包含kras g12c变体肽的氨基酸序列的mrna分子、编码包含kras g12r变体肽的氨基酸序列的mrna分子和编码包含kras g13d变体肽的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，kras g12c变体肽是seq id no：8、kras g12r变体肽是seq id no：10和kras g13d变体肽是seq id no：12。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：48的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：50的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：52的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：53的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：55的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：57的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：58的mrna分子、包含seq id no：60的mrna分子和包含seq id no：62的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：63的mrna分子、包含seq id no：65的mrna分子和包含seq id no：67的mrna分子。
[0053]
在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括编码包含kras g12r变体肽的氨基酸序列的mrna分子、编码包含kras g12v变体肽的氨基酸序列的mrna分子和编码包含kras g13d变体肽的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，kras g12r变体肽是seq id no：10、kras g12v变体肽是seq id no：11和kras g13d变体肽是seq id no：12。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：50的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：51的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：52的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：55的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：56的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：57的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：60的mrna分子、包含seq id no：61的mrna分子和包含seq id no：62的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：65的mrna分子、包含seq id no：66的mrna分子和包含seq id no：67的mrna分子。
[0054]
在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括编码包含kras g12c变体肽的氨基酸序列的mrna分子、编码包含kras g12d变体肽的氨基酸序列的mrna分子、编码包含kras g12r变体肽的氨基酸序列的mrna分子和编码包含kras g12v变体肽的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，kras g12c变体肽是seq id no：8、kras g12d变体肽是seq id no：9、kras g12r变体肽是seq id no：10和kras g12v变体肽是seq id no：11。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：48的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：49的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：50的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：51的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：53的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：54的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：55的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：56的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：58的mrna分子、包含seq id no：59的mrna分子、包含seq id no：60的mrna分子和包含seq id no：61的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：63的mrna分子、包含seq id no：64的mrna分子、包含seq id no：65的mrna分子和包含seq id no：66的mrna分子。
[0055]
在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括编码包含kras g12c变体肽的氨基酸序列的mrna分子、编码包含kras g12d变体肽的氨基酸序列的mrna分子、编码包含kras g12v变体肽的氨基酸序列的mrna分子和编码包含kras g13d变体肽的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，kras g12c变体肽是seq id no：8、kras g12d变体肽是seq id no：9、kras g12v变体肽是seq id no：11和kras g13d变体肽是seq id no：12。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：48的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：49的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：51的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：52的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：53的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：54的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：56的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：57的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：58的mrna分子、包含seq id no：59的mrna分子、包含seq id no：61的mrna分子和包含seq id no：62的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：63的mrna分子、包含seq id no：64的mrna分子、包含seq id no：66的mrna分子和包含seq id no：67的mrna分子。
[0056]
在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括编码包含kras g12c变体肽的氨基酸序列的mrna分子、编码包含kras g12d变体肽的氨基酸序列的mrna分子、编码包含kras g12r变体肽的氨基酸序列的mrna分子和编码包含kras g13d变体肽的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，kras g12c变体肽是seq id no：8、kras g12d变体肽是seq id no：9、kras g12r变体肽是seq id no：10和kras g13d变体肽是seq id no：12。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：48的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：49的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：50的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：52的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：53的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：54的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：55的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：57的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：58的mrna分子、包含seq id no：59的mrna分子、包含seq id no：60的mrna分子和包含seq id no：62的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：63的mrna分子、包含seq id no：64的mrna分子、包含seq id no：65的mrna分子和包含seq id no：67的mrna分子。
[0057]
在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括编码包含kras g12d变体肽的氨基酸序列的mrna分子、编码包含kras g12v变体肽的氨基酸序列的mrna分子、编码包含kras g12r变体肽的氨基酸序列的mrna分子和编码包含kras g13d变体肽的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，kras g12d变体肽是seq id no：9、kras g12r变体肽是seq id no：10、kras g12v变体肽是seq id no：11和kras g13d变体肽是seq id no：12。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：49的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：50的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：51的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：52的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：54的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：55的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：56的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：57的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：59的mrna分子、包含
seq id no：60的mrna分子、包含seq id no：61的mrna分子和包含seq id no：62的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：64的mrna分子、包含seq id no：65的mrna分子、包含seq id no：66的mrna分子、和包含seq id no：67的mrna分子。
[0058]
在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括编码包含kras g12c变体肽的氨基酸序列的mrna分子、编码包含kras g12v变体肽的氨基酸序列的mrna分子、编码包含kras g12r变体肽的氨基酸序列的mrna分子和编码包含kras g13d变体肽的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，kras g12c变体肽是seq id no：8、kras g12r变体肽是seq id no：10、kras g12v变体肽是seq id no：11和kras g13d变体肽是seq id no：12。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：48的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：50的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：51的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：52的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：53的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：55的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：56的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：57的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：58的mrna分子、包含seq id no：60的mrna分子、包含seq id no：61的mrna分子和包含seq id no：62的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：63的mrna分子、包含seq id no：65的mrna分子、包含seq id no：66的mrna分子和包含seq id no：67的mrna分子。
[0059]
在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括编码包含kras g12c变体肽的氨基酸序列的mrna分子、编码包含kras g12d变体肽的氨基酸序列的mrna分子、编码包含kras g12r变体肽的氨基酸序列的mrna分子、编码包含kras g12v变体肽的氨基酸序列的mrna分子和编码包含kras g13d变体肽的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，kras g12c变体肽是seq id no：8、kras g12d变体肽是seq id no：9、kras g12r变体肽是seq id no：10、kras g12v变体肽是seq id no：11和kras g13d变体肽是seq id no：12。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：48的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：49的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：50的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：51的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：52的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含编码seq id no：53的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：54的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：55的氨基酸序列的mrna分子、编码seq id no：56的氨基酸序列的mrna分子和编码seq id no：57的氨基酸序列的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：58的mrna分子、包含seq id no：59的mrna分子、包含seq id no：60的mrna分子、包含seq id no：61的mrna分子和包含seq id no：62的mrna分子。在另一个优选的实施方案中，药物组合物包括包含seq id no：63的mrna分子、包含seq id no：64的mrna分子、包含seq id no：65的mrna分子、包含seq id no：66的mrna分子和包含seq id no：67的mrna分子。
[0060]
在另一个优选的实施方案中，药物组合物还包含阳离子脂质、甾醇、中性脂质和peg脂质。
[0061]
在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含：如seq id no：63
‑
67所限定的一种或多于一种mrna分子；胆固醇；2
‑
mpeg2000
‑
n，n
‑
双十四烷基乙酰胺；1，2
‑
二硬脂酰
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸胆碱(dspc)；和阳离子脂质
[0062][0063]
在另一个优选的实施方案中，阳离子脂质∶dspc∶胆固醇∶peg
‑
脂质的摩尔比为约50∶10∶38.5∶1.5、47.5∶10∶40.8∶1.7或47.4∶10∶40.9∶1.7摩尔％。
[0064]
在另一个优选的实施方案中，药物组合物包含如seq id no：58
‑
62所限定的一种或多于一种mrna分子；胆固醇；2
‑
mpeg2000
‑
n，n
‑
双十四烷基乙酰胺；1，2
‑
二硬脂酰
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸胆碱(dspc)；和阳离子脂质
[0065][0066]
在另一个优选的实施方案中，阳离子脂质∶dspc∶胆固醇∶peg
‑
脂质的摩尔比为约50∶10∶38.5∶1.5、47.5∶10∶40.8∶1.7或优选47.4∶10∶40.9∶1.7摩尔％。
[0067]
本发明还提供了试剂盒，其包含根据权利要求1至16中任一项所述的mrna分子和任选地具有mrna分子的施用和剂量信息的说明书。
[0068]
在一个优选的实施方案中，本发明提供了本发明的mrna分子或本发明的药物组合物，其用于向人施用。
[0069]
根据另一方面，本发明涉及本发明的mrna分子或药物组合物，其用于治疗癌症。因此，本发明提供了治疗癌症的方法，包括向有需要的对象施用有效量的本发明的一种或多于一种mrna分子。在一个实施方案中，癌症是实体瘤癌症，即膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、头颈癌、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌或子宫癌。
[0070]
在特别优选的实施方案中，癌症是非小细胞肺癌(nsclc)、结直肠癌(crc)或胰腺癌。
[0071]
在另一个优选的实施方案中，肺癌是非小细胞肺癌。在另一个优选的实施方案中，非小细胞肺癌是鳞状细胞癌、大细胞癌或腺癌。在另一个优选的实施方案中，非小细胞肺癌是晚期和/或转移性非小细胞肺癌，甚至更优选不可切除和/或晚期非小细胞肺癌。在另一个优选的实施方案中，非小细胞肺癌是晚期的和/或标准护理治疗难以治愈的转移性非小细胞肺癌。在另一个优选的实施方案中，非小细胞肺癌是非转移性可切除的非小细胞肺癌，或手术切除后无残留病灶迹象的非小细胞肺癌，或适合放化疗的非小细胞肺癌，其中放化疗后无残留病灶迹象。
[0072]
在另一个优选的实施方案中，结直肠癌是结肠癌或直肠癌。在另一个优选的实施方案中，结直肠癌是晚期和/或转移性结直肠癌，甚至更优选晚期和/或转移性超突变癌，其具有微卫星不稳定性(msi)或非超突变的微卫星稳定性(mss)。在另一个优选的实施方案
中，结直肠癌是可切除的结直肠癌、适合放化疗的直肠癌或适合手术切除的结直肠癌，其中在放化疗或手术切除后不残留具有微卫星不稳定性(msi)或非超突变微卫星稳定性(mss)的病灶迹象。
[0073]
在另一个优选的实施方案中，结直肠癌是可切除的结直肠癌、适合放化疗的直肠癌或适合手术切除的结直肠癌，其中在放化疗或手术切除后不残留具有微卫星不稳定性(msi)或非超突变微卫星稳定性(mss)的病灶迹象。
[0074]
在另一个优选的实施方案中，胰腺癌是胰腺癌。在另一个优选的实施方案中，胰腺癌是晚期和/或转移性胰腺癌。在另一个优选的实施方案中，胰腺癌是可切除的胰腺癌，或适合放化疗或手术切除的胰腺癌，其中放化疗和手术切除后无残留病灶迹象。
[0075]
在另一个优选的实施方案中，对施用mrna分子的对象进行肿瘤分型。在一个实施方案中，对象是kras g12d、g12c、g12r、g12v或g13d突变中的一种或多于一种的肿瘤分型。在另一个优选的实施方案中，对施用mrna的对象进行hla分型。在另一个优选的实施方案中，对施用mrna的对象均进行肿瘤分型和hla分型。
[0076]
在另一个优选的实施方案中，对mrna分子的给药对象不进行肿瘤分型。在一个实施方案中，对象是kras g12d、g12c、g12r、g12v或g13d突变中的一种或多于一种的肿瘤分型。在另一个优选的实施方案中，对mrna的给药对象不进行hla分型。在另一个优选的实施方案中，对mrna的给药对象不进行肿瘤分型或hla分型。
[0077]
本发明的mrna分子或药物组合物可以胃肠外，例如皮下、静脉内、肌内、皮内、结内(intranodally)或腹膜内给药。在另一个实施方案中，mrna分子进行肌肉注射。
[0078]
根据另一方面，本发明因此涉及本发明的mrna分子或药物组合物，其用作药物特别用于治疗癌症。在一个优选的实施方案中，mrna分子进行肌肉注射。在另一个优选的实施方案中，mrna分子进行皮下给药。
[0079]
本发明还涉及本发明的mrna分子或药物组合物在制备治疗癌症的药物中的用途。
[0080]
在另一个优选的实施方案中，本发明提供治疗癌症的方法，其包括将有效量的本发明的mrna分子与一种或多于一种抗肿瘤剂同时、分开或顺序组合给药。抗肿瘤剂的非限制性实例包括雷莫芦单抗、耐昔妥珠单抗、奥拉单抗、戈鲁尼色特(galunisertib)、abemaciclib、瑞戈非尼、厄洛替尼、克唑替尼、顺铂、卡铂、达卡巴嗪、脂质体多柔比星、多西紫杉醇、环磷酰胺和阿霉素、诺维本、艾日布林、紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇(nab
‑
paclitaxel)、注射混悬液用紫杉醇蛋白结合颗粒、伊沙匹隆、卡培他滨、folfox(亚叶酸、氟尿嘧啶和奥沙利铂)、folfiri(亚叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康)、folfirinox(亚叶酸、氟尿嘧啶、奥沙利铂和伊立替康)、培美曲塞、吉西他滨、西妥昔单抗、egfr抑制剂、raf抑制剂、b
‑
raf抑制剂、cdk4/6抑制剂、吲哚胺2，3
‑
双加氧酶抑制剂、tgfβ抑制剂和tgfβ受体抑制剂。
[0081]
在另一个优选的实施方案中，本发明提供治疗癌症的方法，其包括将有效量的本发明的mrna分子与一种或多于一种免疫肿瘤药物同时、分开或顺序组合给药。免疫肿瘤药物的非限制性实例包括纳武单抗、易普利姆玛、匹地利珠单抗、派姆单抗、替西木单抗、乌瑞芦单抗、利瑞鲁单抗、阿特珠单抗、得瓦鲁单抗、阿维单抗和抗pd
‑
l1抗体ly3300054(其重链和轻链序列在wo 2017/034916和us 2017/0058033中分别阐述为seq id no：10和11)。
[0082]
在另一个优选的实施方案中，本发明提供治疗癌症的方法，其包括给药有效量的本发明的mrna分子而不与一种或多于一种免疫肿瘤药物同时、单独或顺序组合给药。
[0083]
在另一个优选的实施方案中，本发明提供治疗癌症的方法，其包括将有效量的本发明的mrna分子与放射疗法同时、分开或顺序组合给药。
[0084]
在另一个优选的实施方案中，本发明提供治疗癌症的方法，其包括将有效量的本发明的mrna分子与手术同时、分开或顺序组合给药。
[0085]
本发明还提供本发明的mrna分子用于治疗。
[0086]
本发明还提供本发明的mrna分子用于治疗癌症。在一个优选的实施方案中，癌症是实体瘤癌症，即膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、头颈癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌或尿路上皮癌。在另一个实施方案中，肺癌是非小细胞肺癌。
[0087]
本发明还提供本发明的mrna分子在制造用于治疗癌症的药物。在一个优选的实施方案中，癌症是实体瘤癌症，即膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、头颈癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌或尿路上皮癌。在另一个实施方案中，肺癌是非小细胞肺癌。
[0088]
在一个实施方案中，根据本发明给药mrna分子或药物组合物的对象可以是患有选自如下的肿瘤或癌症的对象：
[0089]
‑
非小细胞肺癌(nsclc)，优选地晚期和/或转移性nsclc，甚至更优选地不可切除的和/或晚期nsclc；
[0090]
‑
结直肠癌(crc)，优选地晚期和/或转移性crc，甚至更优选地晚期和/或转移性超突变癌，具有微卫星不稳定性(msi)或非超突变微卫星稳定性(mss)；或
[0091]
‑
胰腺癌，优选地晚期和/或转移性胰腺癌，甚至更优选地不可切除的和/或晚期胰腺癌。
[0092]
在一个实施方案中，根据本发明的mrna分子或药物组合物的给药对象可以是患有优选地本文定义的肿瘤或癌症疾病、更优选地选自如下的疾病的对象：非小细胞肺癌(nsclc)、优选地晚期和/或转移性nsclc、甚至更优选地不可切除的和/或晚期nsclc，结直肠癌(crc)、优选地结肠癌和直肠癌、甚至更优选地晚期和/或转移性超突变癌，具有微卫星不稳定性(msi)或非超突变微卫星稳定性(mss)，或胰腺癌、优选地胰腺腺癌，所述对象已接受或接受化疗(例如一线或二线化疗)、放疗、放化疗(化疗与放疗组合)、激酶抑制剂、抗体治疗和/或检查点调节剂(例如ctla4抑制剂、pd
‑
1通路抑制剂)；或在接受一种或多于一种上述治疗后获得完全反应、部分反应、疾病稳定的对象。
[0093]
在一些实施方案中，根据本发明的mrna分子或药物组合物的给药对象可以是患有优选地本文定义的肿瘤或癌症疾病、更优选地选自如下的疾病的对象：非小细胞肺癌(nsclc)、优选地晚期和/或转移性nsclc、甚至更优选地不可切除的和/或晚期nsclc，结直肠癌(crc)、优选地结肠癌和直肠癌，或胰腺癌、优选地胰腺腺癌，所述对象已接受或接受常规用于本文所述的任何这些疾病的化合物。
[0094]
在一些实施方案中，根据本发明的mrna分子或药物组合物的给药对象可以是如下对象，其患有肿瘤或癌症疾病、优选地nsclc、更优选地晚期和/或转移性nsclc，接受或已经接受以下治疗中的至少一种：
[0095]
‑
术前(新辅助化疗)和/或术后(辅助)化疗；
[0096]
‑
手术或优选地原发肿瘤的初始手术；
[0097]
‑
放疗；
[0098]
‑
检查点调节剂单药治疗，优选地靶向ctla4、pd1(例如帕博利珠单抗)或pd
‑
l1(例如ly3300054)；
[0099]
‑
与白细胞介素例如il
‑
10或聚乙二醇化il
‑
10的组合治疗；
[0100]
‑
优选地靶向ctla4、pd1(例如帕博利珠治疗)或pd
‑
l1(例如ly3300054)的检查点调节剂和化疗的组合治疗；
[0101]
‑
使用化合物例如顺铂或卡铂、优选地与培美曲塞或吉西他滨组合的基于铂的化疗；
[0102]
‑
靶向egfr信号通路的化合物，例如抗体西妥昔单抗或酪氨酸激酶抑制剂，例如厄洛替尼、吉非替尼、阿法替尼或奥希替尼；
[0103]
‑
用作alk(间变性淋巴瘤激酶)和ros1(c
‑
ros癌基因1)抑制剂的化合物，使用化合物例如克唑替尼；或
[0104]
‑
靶向血管内皮生长因子(vegf)的化合物，例如抗体贝伐珠单抗。
[0105]
在一些实施方案中，根据本发明的mrna分子或药物组合物的给药对象可以是如下对象，其患有肿瘤或癌症疾病、优选地crc(结直肠癌)、更优选地晚期和/或转移性超突变癌具有微卫星不稳定性(msi)或非超突变、微卫星稳定(mss)癌症，接受或已经接受以下治疗中的至少一种：
[0106]
‑
手术或优选地原发肿瘤的初始手术；
[0107]
‑
化疗；
[0108]
‑
放疗；
[0109]
‑
靶向治疗；
[0110]
‑
免疫疗法；
[0111]
‑
手术、放疗、化疗、靶向治疗和免疫疗法中的两种或更多种的组合；
[0112]
‑
术前(新辅助化疗)和/或术后(辅助)化疗；
[0113]
‑
化学疗法，使用化合物例如氟尿嘧啶(5
‑
fu，adrucil)、卡培他滨(希罗达)、伊立替康(开普拓)、奥沙利铂(乐沙定)、曲氟尿苷/替吡拉西(tas
‑
102，lonsurf)；
[0114]
‑
停止或减少血管生成的化合物，例如贝伐单抗(阿瓦斯汀)；
[0115]
‑
抑制表皮生长因子受体(egfr)的化合物，例如西妥昔单抗(爱必妥)或帕尼单抗(维克替比)；或
[0116]
‑
靶向免疫检查点、优选地ctla4、pd1或pd
‑
l1的化合物，例如靶向pd
‑
1受体的帕博利珠单抗(keytruda)，纳武单抗(opdivo)或抗pd
‑
l1抗体ly3300054；
[0117]
‑
纳武单抗和易普利单抗(yervoy)的组合；
[0118]
在一些实施方案中，根据本发明的mrna分子或药物组合物的给药对象可以是如下对象，其患有肿瘤或癌症疾病、优选地胰腺癌、更优选地晚期和/或转移性胰腺癌、更优选地胰腺腺癌，接受或已经接受以下治疗中的至少一种：
[0119]
‑
手术或优选地原发肿瘤的初始手术；
[0120]
‑
放疗；
[0121]
‑
化疗；
[0122]
‑
手术、放疗和化疗的组合；
[0123]
‑
与白细胞介素例如il
‑
10或聚乙二醇化il
‑
10的组合治疗；
[0124]
‑
术前(新辅助)和/或术后(辅助)化疗；
[0125]
‑
化疗，使用化合物例如吉西他滨或氟尿嘧啶(5
‑
fu)、伊立替康、奥沙利铂或白蛋白结合型紫杉醇；
[0126]
‑
靶向egfr信号通路的化合物，使用化合物例如厄洛替尼；
[0127]
‑
吉西他滨与厄洛替尼的组合；
[0128]
‑
支持消化系统的化合物，使用化合物例如质子泵抑制剂、h2拮抗剂或甲氧氯普胺；或
[0129]
‑
靶向免疫检查点的化合物，例如帕博利珠单抗、纳武单抗、易普利单抗或ly3300054。
[0130]
本发明的mrna分子或药物组合物或试剂盒可以通过本领域技术人员确定临床上合适的方案给药于有需要的对象。
[0131]
在一个实施方案中，本发明的一种或多于一种mrna分子以以下剂量给药于对象：约1、5、10、20、30、40、100、300或1000μg。在另一个实施方案中，本发明的一种或多于一种mrna分子以约1μg剂量给药于对象。在另一个实施方案中，本发明的一种或多于一种mrna分子以约5μg剂量给药于对象。在另一个实施方案中，本发明的一种或多于一种mrna分子以约10μg剂量给药于对象。在另一个实施方案中，本发明的一种或多于一种mrna分子以约20μg剂量给药于对象。在另一个实施方案中，本发明的一种或多于一种mrna分子以约40μg剂量给药于对象：。在另一个实施方案中，本发明的一种或多于一种mrna分子以约100μg剂量给药于对象。在另一个实施方案中，本发明的一种或多于一种mrna分子以约300μg剂量给药于对象。在另一个实施方案中，本发明的一种或多于一种mrna分子以约1000μg剂量给药于对象。在另一个实施方案中，本发明的一种或多于一种mrna分子与免疫肿瘤药物，例如抗pd
‑
1抗体、抗pd
‑
l1抗体(例如ly3300054)或聚乙二醇化il
‑
10分子组合给药。
[0132]
在一个实施方案中，将本发明的一种或多于一种mrna分子给药于对象的持续时间是3、4、5、6、12、18或24个月。在另一个实施方案中，将本发明的一种或多于一种mrna分子给药于对象的持续时间是3个月。在另一个实施方案中，将本发明的一种或多于一种mrna分子给药于对象的持续时间是4个月。在另一个实施方案中，将本发明的一种或多于一种mrna分子给药于对象的持续时间是5个月。在另一个实施方案中，将本发明的一种或多于一种mrna分子给药于对象长达6个月。在另一个实施方案中，本发明的一种或多于一种mrna分子与免疫肿瘤药物，例如抗pd
‑
1抗体、抗pd
‑
l1抗体(ly3300054)或聚乙二醇化il
‑
10分子组合给药。
[0133]
在另一个实施方案中，本发明的一种或多于一种mrna分子以以下剂量给药于对象：约1、5、10、20、30、40、100、300或1000μg，并且在持续时间是3、4、5或6个月。
[0134]
本发明还提供编码包含ctla4信号肽、kras变体肽、padre衍生的t辅助表位序列和ctla4免疫反应激活信号转导蛋白序列的氨基酸序列的mrna分子特别优选地用作药物。在一个优选的实施方案中，kras变体肽包含kras变体肽序列的29个相邻氨基酸残基。
[0135]
本发明还提供包含编码包含ctla4信号肽、kras变体肽、padre衍生的t辅助表位序列和ctla4免疫反应激活信号转导蛋白序列的氨基酸序列的mrna序列的mrna分子用于治疗癌症，其中癌症优选地是实体瘤癌症，特别优选地选自膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、
子宫内膜癌、头颈癌、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌或子宫癌。在一个优选的实施方案中，kras变体肽包含kras变体肽序列的29个相邻氨基酸残基。
[0136]
在一个进一步优选的方面，本发明提供试剂盒，其包含本发明的mrna分子或药物组合物，和任选的液体载体和/或任选的技术说明书，技术说明书具有mrna分子或组合物的适当给药和剂量的信息。
[0137]
尽管下面详细描述本发明，但应当理解，本发明不限于本文描述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解，本文中使用的术语并非旨在限制本发明的范围。除非本文另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解的相同含义。
[0138]
在本说明书和随后的权利要求中，除非上下文另有要求，否则术语“包含(comprise)”和变体例如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将理解为隐含包括陈述的成员、整数或步骤，但不包括排除任何其他未陈述的成员、整数或步骤。术语“由......组成”是术语“包含”的特定实施方案，其中不包括任何其他未陈述的成员、整数或步骤。在本发明的上下文中，术语“包含”涵盖术语“由......组成”。因此，术语“包含”涵盖“包括”以及“由......组成”，例如，组合物“包含”x可排他地仅由x组成或可包括另外物质。
[0139]
除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用的术语“一个”和“一种”和“所述”以及类似参考将解释为涵盖单数和复数。此处对值范围的引用仅旨在用作单独提及落入该范围内的各个单独值的速记方法。除非在本文中另有说明，否则各个单独值均并入说明书中，就如它在本文中单独引用那样。说明书中的任何语言均不应解释为表示对本发明的实践必不可少的任何未要求保护的元素。
[0140]
与数值x相关的术语“约”是指x
±
10％。
[0141]
在本发明中，如果没有另外说明，则替代方案和实施方案的不同特征可相互组合。
[0142]
术语“hla”是指人类白细胞抗原，它是一种细胞表面分子，可将变体肽呈递给t细胞受体。术语“hla分型对象”是指已确定此对象中人类白细胞抗原谱的对象。确定hla类型的方法是本领域技术人员众所周知的，例如rajalingam r，等人，molecular diagnostics，techniques and applications for the clinical laboratory 2010，pages 367
‑
379、academic press；和choo sy，yonsei medical journal 48：11(2007)中所示。确定hla类型的非限制性方法包括细胞分型、基因测序、表型分析和单体型分析。术语“hla分型对象”和“人类白细胞抗原分型对象”是同义词。
[0143]
肽或多肽是通常是氨基酸单体的聚合物，通过肽键连接。它通常包含少于50个单体单元。然而，术语肽并不是具有多于50个单体单元的分子的弃权声明。长肽也称为多肽，通常具有50个至600个单体单元。
[0144]
如本文所用，rna是指核糖核酸，mrna是指信使rna。本发明的mrna可以使用本领域已知的任何方法制备，包括化学合成，例如固相rna合成以及体外方法例如rna体外转录反应。在一个优选的实施方案中，人工rna、优选地mrna通过rna体外转录获得。因此，在一个实施方案中，本发明的rna是体外转录的rna、优选地体外转录的mrna。
[0145]
术语“肿瘤分型对象”是指已确定对象肿瘤表现出的kras突变类型的对象。在一个
实施方案中，对象是kras g12d、g12c、g12r、g12v或g13d突变中的一种或多于一种的肿瘤分型。kras肿瘤分型方法是本领域技术人员已知的，例如参见hunter jd，等人，mol.cancer research 13：1325(2015)；prior ia，等人，cancer research 71：2457(2012)；tan c and d xiang，world j.gastroenterol.18：5171(2012)。
[0146]
术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”疾病包括防止或预防疾病(即，使临床症状不发生)；抑制疾病(即阻止或抑制临床症状的发展；和/或缓解疾病(即，导致临床症状消退)。
[0147]
在一个优选的实施方案中，术语“对象”是指人类。
[0148]
本发明部分基于如下发现：可摄取编码kras突变肽的mrna，并且可将编码的肽通过抗原呈递细胞(apc)以足以被预先存在的t细胞识别的水平来加工和呈递，其可区分突变型和野生型ras序列。t细胞相互作用导致突变ras特异性t细胞群的扩增，其随后可寻找并且杀死ras突变的肿瘤细胞。本发明使用来自“靶向”蛋白的信号序列，例如细胞毒性t淋巴细胞蛋白4(ctla4)，其称为“快速循环”蛋白，容易地和反复地内化以进入与mhc i类相交的内体通路并且在特定的mhc ii类通路中。通过将kras衍生的抗原与“靶向”序列融合，抗原可被路由到mhc i类和mhc ii类加工区室，其独立于靶细胞类型，并且影响它们在mhc i和特别地mhc ii中的表达和呈递。
[0149]
为此，编码kras衍生的抗原/表位的mrna分子融合到编码合适“靶向”序列的核酸序列中。“靶向”序列通常包括如下物质或由如下物质组成：蛋白质的全长周围序列或优选地其跨膜(和任选的细胞质)结构域，优选地连同合适信号肽。通过将编码kras衍生的抗原的核酸序列融合到此类“靶向”序列中，kras衍生的抗原/表位优选地定位于质膜，并且循环到细胞区室，在细胞区室中进行mhc i类和ii类加工和加载，如内质网、内体或溶酶体。本文提出的靶向策略利用由位于免疫细胞质膜中的免疫反应激活信号转导(irst
epm
)蛋白组衍生的氨基酸序列(特别是跨膜域)赋予的快速循环特性。通过有效地将变体肽或蛋白质路由到质膜并且实施它们在其中的锚定，然后通过融合的irst
epm
衍生的蛋白结构域循环到与mhc加工和加载途径相交的细胞区室，优选地增加通过mhc i类和mhc ii类进行编码抗原/表位在受体细胞中的呈递，和因此通过基于核酸的疫苗针对免疫原性表位或全抗原的抗原特异性免疫反应的诱导。因此，本文提出的靶向方法利用膜结合的irst
epm
蛋白快速循环的常见途径而不是使用最先进的方法，通过不同贩运序列的融合将翻译的变体蛋白或肽直接导向内体/溶酶体室。
[0150]
术语“免疫反应激活信号转导”是指信号与受体相互作用，导致第二信使或其他下游靶标的水平或活性发生变化，并且最终导致激活或持续免疫反应的级联过程。
[0151]
如本文所用，术语“(蛋白/氨基酸序列)变体”通常是指“序列变体”，即包含与来自参考(或“亲本”)蛋白或(多)肽的参考(或“亲本”)氨基酸序列的至少一个氨基酸残基不同的氨基酸序列的蛋白或(多)肽。“变体”蛋白/(多)肽包括，在它们的氨基酸序列中，与其相应的参考序列相比，至少一个氨基酸突变、替换、插入或删除。
[0152]
术语“kras衍生的变体肽或蛋白质”是指包含能够提供至少一个(功能性)kras表位或新表位的(多)肽。kras变体肽或蛋白质是与野生型kras肽或蛋白质序列相比，表现出至少一个氨基酸残基突变的那种。kras g12c、g12d、g12v、g12r和g13d变体是kras变体的实例，可在kras变体肽中发现。
[0153]
kras衍生的变体肽与衍生自快速循环免疫反应激活信号转导蛋白ctla4的选定结构域或全长蛋白质相连。可以包括信号肽和跨膜结构域以优化向质膜外部位点的转运和锚定。此外，可以包括合适接头以促进由mhc i类和ii类分子呈递免疫原性肽。可以包括t辅助细胞表位以增加针对编码的kras衍生表位的抗原特异性免疫反应的诱导。
[0154]
术语“表位”“新表位”是指免疫系统识别的变体肽或蛋白质(抗原)的一部分或片段。新表位可用作疾病特异性靶标，患病组织不可能容易地逃脱免疫监视，在癌症的情况下，其将导致增强肿瘤控制。表位可包含约5个至约20个或甚至更多个氨基酸。表位可以是“构象的”(或“不连续的”)，即由它们衍生自但在例如mhc复合体的三维结构中聚集在一起的变体肽或蛋白质的氨基酸的不连续序列组成；或可以是“线性的”，即由它们衍生自的变体肽或蛋白质的氨基酸的连续序列组成。
[0155]
根据本发明的一个优选实施方案，kras衍生的变体或蛋白质包含突变体kras变体或由突变体kras变体组成，突变体kras变体包含突变体kras衍生的新表位。特别优选衍生自突变体kras变体g12c、g12d、g12v、g12r和g13d中的一种或多于一种的新表位。
[0156]
根据本发明的一个特别优选的实施方案，mrna分子还编码至少一个信号肽，其特别优选来自ctla4、特别是ctla4(nm_005214.4)氨基酸残基1
‑
35(seq id no：3)，其可由seq id no：4、5、6或7的核酸序列中的任一个编码。
[0157]
因此，本发明的mrna分子优选地编码至少一个信号肽，其优选地包含如下物质或由如下物质组成：由seq id no：3定义的氨基酸序列或其片段、衍生物或变体。优选地，mrna序列编码ctla4衍生的信号肽，其包含如下物质或由如下物质组成：如seq id no：4、5、6或7的任一个所限定的核酸序列，其中特别优选seq id no.5。
[0158]
根据本发明的一个特别优选的实施方案，mrna分子还编码至少一个跨膜结构域或其一部分，其特别优选来自ctla4、特别是ctla4氨基酸残基162
‑
223(seq id no：42，其可由seq id nosno：43、44、45、46或47的核酸序列的任一个编码。根据优选的实施方案，根据本发明的mrna分子的至少一个编码区还编码至少一个接头。
[0159]
术语“接头”是指肽接头，即通常短的(即包含1
‑
150个氨基酸、优选地1
‑
50个氨基酸、更优选地1至20个氨基酸和甚至更优选地15个氨基酸)、线性氨基酸序列从而连接或联接两个多肽序列。优选地，接头是非免疫原性的，即不触发免疫反应。接头可用于连接或联接由本发明的mrna分子编码的变体融合蛋白的至少两个组分。根据本发明的mrna分子的编码区可编码至少一个接头或多个至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个相同或不同的接头，如本文所述。在多个接头由mrna分子编码的情况下，特别优选接头在其氨基酸序列和/或编码相应接头的核酸序列方面是不同的。
[0160]
接头的非限制性实例公开于wo 2002/014478、wo 2001/008636、wo 2013/171505、wo 2008/017517和wo 1997/047648中。
[0161]
根据优选的实施方案，本发明的mrna分子编码在其至少一个编码区中的至少一个接头，其优选是非免疫原性接头，优选地包含根据seq id no：35的氨基酸序列或由根据seq id no：35的氨基酸序列组成。
[0162]
因此，本发明的mrna分子优选地包含在其至少一个编码区中的至少一个核酸序列，其包含如下物质或由如下物质组成：根据seq id no：36、37、38、39、40或41的任一个、优选地seq id no：37、38或39的任一个的核酸序列。
[0163]
在本发明的一个优选实施方案中，mrna分子还编码至少一个t辅助表位。术语“t辅助表位”是指能够与mhc分子、优选地mhc ii类分子结合，从而由cd4
+
t辅助(th)细胞识别的变体决定簇。因此，t辅助表位可有利地用于诱导或增强cd4
+
th细胞反应、ctl反应(优选地包括增加细胞介导的免疫和增强例如抗肿瘤免疫反应)。
[0164]
在wo 95/07707和alexander j等人，1994，immunity 1：751
‑
761中描述的在c
‑
和n
‑
末端带有或不带有d
‑
氨基酸的“padre”(泛dr表位肽”)是本发明上下文中优选的t辅助表位。
[0165]
根据优选的实施方案，本发明的mrna分子编码在其至少一个编码区中的至少一个t辅助表位、优选地seq id no：33，并且优选地由seq id no：34的rna编码。
[0166]
根据本发明的mrna分子可以是单顺反子、双顺反子或多顺反子。“双或多顺反子”rna通常包含两个(双顺反子)或更多个(多顺反子)开放阅读框(orf)。
[0167]
根据优选的实施方案，本发明的mrna分子可以是“序列修饰的”，即可包含至少一个序列修饰，如下所述。
[0168]
根据优选的实施方案，本发明的mrna分子可以是修饰的并且因此稳定的，通过修改其鸟嘌呤/胞嘧啶(g/c)含量，优选地通过修改至少一个编码序列的g/c含量。
[0169]
在一个优选的实施方案中，与其各自野生型mrna在核糖体结合位点环境中的a/u含量相比，本发明的mrna分子在核糖体结合位点环境中的a/u含量增加。这种修饰(增加核糖体结合位点周围的a/u含量)可提高核糖体与mrna分子的结合效率。核糖体与核糖体结合位点(kozak序列)的有效结合进而具有有效翻译本发明的mrna分子的效果。
[0170]
在一个优选的实施方案中，本发明的mrna分子可关于潜在去稳定序列元件进行修饰。特别地，与相应野生型mrna(或其他野生型核酸)相比，mrna分子的编码序列和/或5
′
和/或3
′
非翻译区可以是修饰的使得其不包含去稳定序列元件，与其相应野生型mrna相比，修饰的mrna分子的编码氨基酸序列优选不被修饰。
[0171]
在一个优选的实施方案中，本文中定义的mrna分子可通过添加所谓的“5
′
帽”结构来定义，其优选地稳定体内mrna分子，如本文所述。此外，包含帽结构的mrna的特征在于提高体内翻译效率和减少先天免疫刺激。“5
′‑
帽”是实体、通常是修饰的核苷酸实体，其通常“盖住”成熟mrna的5
′‑
末端。5
′‑
帽通常可由修饰的核苷酸形成，特别是由鸟嘌呤核苷酸的衍生物形成。优选地，5
′‑
帽通过5
′‑5′‑
三磷酸键连接到5
′‑
末端。5
′‑
帽可被甲基化，例如m7gpppn，其中n是携带5
′‑
帽的核酸的末端5
′
核苷酸，通常是mrna的5
′‑
末端。5
’‑
帽结构(例如m7gpppn)是5
’‑
帽结构，其天然存在于由聚合酶ii转录的mrn中，因此在此上下文中优选地不认为包含在“修饰的”mrna中的修饰。因此，术语“修饰的”mrna分子可包含m7gpppn、arca cap、cap1为5
’‑
帽结构和另外的至少一个进一步的修饰，如本文定义。
[0172]
可以使用5
′‑5′‑
三磷酸键(例如下划线的三磷酸键：m7gpppn)添加5
′‑
帽。5
′
帽结构的进一步实例包括甘油、反向脱氧脱碱基残基(部分)、4
′
，5
′
亚甲基核苷酸、1
‑
(β
‑
d
‑
赤呋喃糖基)核苷酸、4
′‑
硫代核苷酸、碳环核苷酸、1，5
‑
脱水己糖醇核苷酸、l
‑
核苷酸、α
‑
核苷酸、修饰碱基核苷酸、苏氨酸戊糖基核苷酸、非环3
′
，4
′‑
断链核苷酸、非环3，4
‑
二羟基丁基核苷酸、非环3，5
‑
二羟基戊基核苷酸、3
′‑3′‑
反向核苷酸部分、3
′‑3′‑
反向脱碱基部分、3
′‑2′‑
反向核苷酸部分、3
′‑2′‑
反向脱碱基部分、1，4
‑
丁二醇磷酸酯、3
′‑
磷酰胺、磷酸己酯、氨基己基磷酸酯、3
′‑
磷酸酯、3
′‑
硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或桥接或非桥接甲基膦酸酯部
分、cap1(m7g相邻核苷酸的核糖甲基化)、cap2(m7g下游第二个核苷酸的核糖的额外甲基化)、cap3(m7g下游第三个核苷酸的核糖的额外甲基化)、cap4(m7g下游第四个核苷酸的核糖的额外甲基化)、arca(抗反向帽类似物、修饰的arca(例如硫代磷酸酯修饰的arca)、肌苷、n1
‑
甲基
‑
鸟苷、2
′‑
氟
‑
鸟苷、7
‑
脱氮
‑
鸟苷、8
‑
氧代鸟苷、2
‑
氨基鸟苷、lna
‑
鸟苷和2
‑
叠氮基鸟苷。在本发明的上下文中，这些修饰的5
’‑
帽结构可视为至少一个“修饰”。
[0173]
因此，在优选的实施方案中，本发明的mrna可包含5
’‑
帽结构或修饰的5’帽结构。优选地，mrna分子可包含选自m7gpppn、arca cap或cap1的5
’‑
帽结构。
[0174]
在优选的实施方案中，可使用如本文定义的帽类似物在rna中在如本文定义的体外转录反应中适合地共转录添加5
’‑
帽结构。本发明上下文中优选的帽类似物是m7g(5’)ppp(5’)g(m7g)或3
′‑
o
‑
me
‑
m7g(5
′
)ppp(5
′
)g。本发明上下文中进一步优选的帽类似物是m7g(5
′
)ppp(5
′
)(2
′
omea)pg或m7g(5
′
)ppp(5
′
)(2
′
omeg)pg以共转录生成cap1结构(例如)。
[0175]
在一个优选的实施方案中，mrna分子包含cap1结构，其中cap1结构是通过共转录加帽获得的。在本发明的上下文中，包含mrna的cap1结构具有若干有利特征，包括增加翻译效率和减少对先天免疫系统的刺激。
[0176]
根据进一步优选的实施方案，本发明的mrna分子可包含poly(a)序列。“poly(a)序列”，也称为“poly(a)尾”或“3
′‑
poly(a)尾”，通常理解为如下的序列：腺苷核苷酸，例如最多约400个腺苷核苷酸、例如约20个至约400个、优选约50个至约400个、更优选约50个至约300个、甚至更优选约50个至约250个、最优选约60个至约250个腺苷核苷酸。如本文所用，poly(a)序列还可包含约10个至200个腺苷核苷酸、优选约10个至100个腺苷核苷酸、更优选约40个至80个腺苷核苷酸或甚至更优选约50个至70个腺苷核苷酸。poly(a)序列通常位于rna、特别是mrna的3’末端。
[0177]
在一个优选的实施方案中，本发明的mrna分子可在其3
′
末端包含如下的poly(a)尾：通常约10个至200个腺苷核苷酸、优选约10个至100个腺苷核苷酸、更优选约40个至80个腺苷核苷酸或甚至更优选约50个至70个腺苷核苷酸。
[0178]
在优选的实施方案中，适合地位于3
′
末端(例如3’utr的下游，如本文定义)的poly(a)序列包含10个至500个腺苷核苷酸、10个至200个腺苷核苷酸、40个至200个腺苷核苷酸、40个至150个腺苷核苷酸或30个至150个腺苷核苷酸。在特别优选的实施方案中，poly(a)序列包含约64个腺苷核苷酸。在进一步特别优选的实施方案中，poly(a)序列包含约75个腺苷核苷酸。在另一个优选的实施方案中，poly(a)序列包含约100个腺苷核苷酸。
[0179]
根据优选的实施方案，本发明的mrna分子可包含在3’末端上的如下的poly(c)尾：通常约10个至200个胞嘧啶核苷酸、优选约10个至100个胞嘧啶核苷酸、更优选约20个至70个胞嘧啶核苷酸或甚至更优选约20个至60个或甚至10个至40个胞嘧啶核苷酸。在特别优选的实施方案中，poly(c)序列包含约30个胞嘧啶核苷酸。
[0180]
如本文所用的术语“poly(c)序列”将由本领域技术人员认识和理解，并且例如旨在是通常位于rna的3
’‑
末端、最多约200个胞嘧啶核苷酸的胞嘧啶核苷酸序列。在本发明的上下文中，poly(c)序列可位于mrna或任何其他核酸分子内，其例如在以dna作为模板而生成的rna、优选mrn中，例如通过转录dna模板(例如，质粒dna或pcr产物)而生成的mrn中。
[0181]
在特别优选的实施方案中，本发明的编码rna不包含如本文定义的poly(a)序列，
优选地(正好)位于3’末端的100个腺苷核苷酸，并且不包含poly(c)序列。
[0182]
根据一个优选的实施方案，本发明的mrna分子可包含至少一个5
’‑
和/或3
’‑
utr元件。“utr元件”包含核酸序列或由核酸序列组成，核酸序列衍生自任何天然存在的基因的5
’‑
或3
’‑
utr或衍生自基因的5
′‑
或3
′‑
utr的片段、同源物或变体。
[0183]
在一个优选的实施方案中，根据本发明的mrna分子的编码区可以位于如本文定义的5’utr元件的下游和/或如本文定义的3’utr元件的上游。优选地，如果根据本发明的mrna分子包含至少一个3’utr元件和至少一个5’utr元件，则编码区可以位于至少一个5’utr元件和至少一个3’utr元件之间。
[0184]
优选地，本发明的mrna分子可包含3’utr元件，其衍生自基因、优选地α
‑
珠蛋白基因。特别优选是seq id no：1的3’utr元件。
[0185]
在优选的实施方案中，本发明第一方面的mrna分子包含至少一个组蛋白茎环。
[0186]
如本文所用的术语“组蛋白茎环”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如旨在是指主要在组蛋白mrna中发现的核酸序列。特别优选组蛋白茎环序列由seq id no：2编码。在一个优选的实施方案中，本发明的mrna分子包含如下物质或由如下物质组成：如seq id no：58
‑
72的任一个所限定的rna序列。在特别优选的实施方案中，本发明的mrna分子包含如下物质或由如下物质组成：如seq id no：63、64、65、66或67的任一个所限定的rna序列。在实施方案中，本发明的编码rna包含3
’‑
末端序列元件。所述3
’‑
末端序列元件包含poly(a)序列和组蛋白茎环序列，其中所述序列元件位于本发明rna的3’末端(正好在3’末端)。在特别优选的实施方案中，本发明的mrna分子包含如下物质或由如下物质组成：如seq id no：73
‑
112的任一个所限定的rna序列。
[0187]
根据优选的实施方案，本发明的mrna分子可以“裸”的形式提供，即不与任何其他载体、转染或复合剂结合，以提高mrna分子或任何其他核酸的转染效率和/或免疫刺激性能。
[0188]
在一个优选的实施方案中，本发明的mrna分子可在组合物中提供。在进一步的方面，本发明因此提供组合物，其包含根据本发明的至少一个mrna分子和任选的载体。其中，至少一个mrna分子可以与合适的载体、转染或复合剂结合，以提高mrna分子的转染效率和/或免疫刺激性能。任选地，组合物可以是药物组合物，如下文进一步详细描述。
[0189]
本发明的mrna分子可以与一种或多于一种(聚)阳离子化合物，优选地与(聚)阳离子聚合物、(聚)阳离子肽或蛋白质，例如鱼精蛋白、(聚)阳离子多糖和/或[(聚)阳离子]脂质复合或结合。如本文所述的其他核酸还可与脂质复合，从而形成阳离子脂质体(阳离子脂质体/dna复合物)、脂质体或优选地脂质纳米颗粒(lnp)。
[0190]
根据优选的实施方案，药物组合物的mrna分子可以与一种或多于一种脂质复合，从而形成阳离子脂质体、脂质体或优选地脂质纳米颗粒(lnp)。
[0191]
药物组合物的mrna分子因此可以基于脂质的制剂形式提供。术语“脂质纳米颗粒”，也称为“lnp”不限于任何特定形态，并且包括当阳离子脂质和任选的一种或多于一种其他脂质例如在水性环境中和/或在rna的存在下组合时生成的任何形态。优选地，术语脂质纳米颗粒(lnp)理解为包含术语“脂质体”，“脂质复合物”和“阳离子脂质体/dna复合物(lipoplex)”。
[0192]
还预想到在本发明的上下文中，如本文所述任何其他核酸例如免疫刺激核酸等，
可以与一种或多于一种脂质复合，从而形成阳离子脂质体、脂质体或优选地脂质纳米颗粒(lnp)，如本发明的上下文中所述。此外，阳离子脂质体、脂质体或优选地脂质纳米颗粒(lnp)可包含本发明的mrna分子和进一步的任何其他核酸，如本文所述。
[0193]
药物组合物的mrna分子可以与脂质(特别是阳离子和/或中性脂质)复合或结合以形成一种或多于一种脂质纳米颗粒。优选地，脂质纳米颗粒(lnp)包含：(a)本发明的至少一个mrna分子，(b)阳离子脂质，(c)聚集减少剂(例如聚乙二醇(peg)脂质或peg
‑
修饰的脂质)，(d)任选地非阳离子脂质(例如中性脂质)，和(e)任选地甾醇。特别地，除了本发明的至少一个mrna分子以外，lnp还可包含(i)至少一个阳离子脂质；(ii)中性脂质；(iii)甾醇，例如胆固醇；和(iv)peg
‑
修饰的脂质，优选地摩尔比是约20
‑
60％阳离子脂质：5
‑
25％中性脂质：25
‑
55％甾醇；0.5
‑
15％peg
‑
脂质。
[0194]
lnp通常包含阳离子脂质和一种或多于一种赋形剂，其选自中性脂质、带电脂质、类固醇和聚合物共轭脂质(例如聚乙二醇化脂质)。本发明的mrna分子可以包封在lnp的脂质部分或由lnp的一些或整个脂质部分包裹的水性空间中。本发明的mrna分子还可与lnp结合或复合。lnp可包含能够形成核酸连接至其或一种或多于一种核酸包封其中的颗粒的任何脂质。优选地，lnp包含一种或多于一种阳离子脂质和一种或多于一种稳定脂质。稳定脂质包括中性脂质和聚乙二醇化脂质。
[0195]
lnp的阳离子脂质可以是阳离子型的(cationisable)，即当ph降低到低于脂质的离子化基团的pk时，它变得质子化，但在较高的ph值下逐渐变得更中性。在ph值低于pk时，脂质然后能够与带负电荷的核酸结合。在某些实施方案中，阳离子脂质包含ph值降低时呈现正电荷的两性脂质。
[0196]
(i)阳离子脂质
[0197]
lnp可包括适于形成脂质纳米颗粒的任何阳离子脂质。优选地，阳离子脂质在约生理ph下带净正电荷。
[0198]
阳离子脂质可以是氨基脂质。如本文所用，术语
″
氨基脂质
″
意指包括具有一种或两种脂肪酸或脂肪烷基链和氨基头基(包括烷基氨基或二烷基氨基)的那些脂质，可以在生理ph下可质子化以形成阳离子脂质。
[0199]
阳离子脂质可以是例如，n，n
‑
二油基
‑
n，n
‑
二甲基氯化铵(dodac)、n，n
‑
二硬脂基
‑
n，n
‑
二甲基溴化铵(ddab)、1，2
‑
二油酰三甲基丙烷氯化铵(dotap)(也称为n
‑
(2，3
‑
二油酰氧基)丙基)
‑
n，n，n
‑
三甲基氯化铵和1，2
‑
二油基氧基
‑3‑
三甲基氨基丙烷氯化物盐)、n
‑
(1
‑
(2，3
‑
二油基氧基)丙基)
‑
n，n，n
‑
三甲基氯化铵(dotma)、n，n
‑
二甲基
‑
2，3
‑
二油基氧基)丙胺(dodma)、1，2
‑
二亚油酰基氧基
‑
n，n
‑
二甲基氨基丙烷(dlindma)、1，2
‑
二亚麻油基氧基
‑
n，n
‑
二甲基氨基丙烷(dlendma)、1，2
‑
二亚麻基氧基
‑
n，n
‑
二甲基氨基丙烷(γ
‑
dlendma)、1，2
‑
二亚油酰基氨基甲酰氧基
‑3‑
二甲基氨基丙烷(dlin
‑
c
‑
dap)、1，2
‑
二亚油基氧基
‑3‑
(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(dlin
‑
dac)、1，2
‑
二亚油基氧基
‑3‑
吗啉代丙烷(dlin
‑
ma)、1，2
‑
二亚油酰基
‑3‑
二甲基氨基丙烷(dlindap)、1，2
‑
二亚油酰基硫代
‑3‑
二甲基氨基丙烷(dlin
‑
s
‑
dma)、1
‑
亚油酰基
‑2‑
亚油基氧基
‑3‑
二甲基氨基丙烷(dlin
‑2‑
dmap)、1，2
‑
二亚油酰基氧基
‑3‑
三甲基氨基丙烷氯化物盐(dlin
‑
tma.cl)、1，2
‑
二亚油酰基
‑3‑
三甲基
‑
氨基丙烷氯化物盐(dlin
‑
tap.cl)、1，2
‑
二亚油酰基氧基
‑3‑
(n
‑
甲基哌嗪)丙烷(dlin
‑
mpz)或3
‑
(n，n
‑
二亚油酰基氨基)
‑
1，2
‑
丙二醇(dlinap)、3
‑
(n，n
‑
二油基氨基)
‑
1，2
‑
丙二醇(doap)、
1，2
‑
二亚油酰基氧代
‑3‑
(2
‑
n，n
‑
二甲基氨基)乙氧基丙烷(dlin
‑
eg
‑
dma)、2，2
‑
二亚油酰基
‑4‑
二甲基氨基甲基
‑
[1，3]
‑
二氧杂环戊烷(dlin
‑
k
‑
dma)或其类似物、(3ar，5s，6as)
‑
n，n
‑
二甲基
‑
2，2
‑
二((9z，12z)
‑
十八烷
‑
9，12
‑
二烯基)四氢
‑
3ah
‑
环戊并
‑
[d][1，3]二噁茂
‑5‑
胺、(6z，9z，28z，31z)
‑
三十七
‑
6，9，28，31
‑
四烯
‑
19
‑
基4
‑
(二甲基氨基)丁酸酯(mc3)、1，1
′‑
(2
‑
(4
‑
(2
‑
((2
‑
(双(2
‑
羟基十二烷基)氨基)乙基)(2
‑
羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪
‑1‑
基)乙基氮亚烷二基)
‑
二十二烷
‑2‑
醇(c12
‑
200)、2，2
‑
二亚油酰基
‑4‑
(2
‑
二甲基氨基乙基)
‑
[1，3]
‑
二氧杂环戊烷(dlin
‑
k
‑
c2
‑
dma)、2，2
‑
二亚油酰基
‑4‑
二甲基氨基甲基
‑
[1，3]
‑
二氧杂环戊烷(dlin
‑
k
‑
dma)、(6z，9z，28z，31z)
‑
三十七
‑
6，9，28，31
‑
四烯
‑
19
‑
基4
‑
(二甲基氨基)丁酸酯(dlin
‑
m
‑
c3
‑
dma)、3
‑
((6z，9z，28z，31z)
‑
三十七
‑
6，9，28，31
‑
四烯
‑
19
‑
基氧基)
‑
n，n
‑
二甲基丙烷
‑1‑
胺(mc3ether)、4
‑
((6z，9z，28z，31z)
‑
三十七
‑
6，9，28，31
‑
四烯
‑
19
‑
基氧基)
‑
n，n
‑
二甲基
‑
丁烷
‑1‑
胺(mc4ether)或前述任一个的任何组合。
[0200]
其他阳离子脂质包括但不限于，n，n
‑
二硬脂基
‑
n，n
‑
二甲基溴化铵(ddab)、3p
‑
(n
‑
(n
′
，n
′‑
二甲基氨基乙烷)
‑
氨基甲酰)胆固醇(dc
‑
chol)、n
‑
(1
‑
(2，3
‑
二油基氧基)丙基)
‑
n
‑2‑
(精胺甲酰氨基)乙基)
‑
n，n
‑
二甲基三氟乙酸铵(dospa)、双十八烷基氨基甘氨酰羧基精胺(dogs)、1，2
‑
二油酰基
‑
sn
‑3‑
磷酸乙醇胺(dope)、1，2
‑
二油酰
‑3‑
二甲基铵丙烷(dodap)、n
‑
(1，2
‑
二肉豆蔻氧基丙
‑3‑
基)
‑
n，n
‑
二甲基
‑
n
‑
羟基乙基溴化铵(dmrie)和2，2
‑
二亚油酰基
‑4‑
二甲基氨基乙基
‑
[1，3]
‑
二氧杂环戊烷(xtc)。另外，可使用阳离子脂质的商业制剂，例如，lipofectin(包括dotma和dope，可得自gibco/brl)和lipofectamine(包含dospa和dope，可得自gibco/brl)。
[0201]
其他合适阳离子脂质公开于如下中：国际公布no.wo 09/086558、wo 09/127060、wo 10/048536、wo 10/054406、wo 10/088537、wo 10/129709和wo 2011/153493；美国专利公布no.2011/0256175、2012/0128760和2012/0027803；美国专利no.8,158,601；和love等人，pnas，107(5)，1864
‑
69、2010。
[0202]
在一些实施方案中，脂质选自98n12
‑
5、c12
‑
200和ckk
‑
e12。
[0203]
在一个实施方案中，其他阳离子脂质是氨基脂质。代表性的氨基脂质包括但不限于1，2
‑
二亚油基氧基
‑3‑
(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(dlin
‑
dac)、1，2
‑
二亚油基氧基
‑3‑
吗啉代丙烷(dlin
‑
ma)、1，2
‑
二亚油酰基
‑3‑
二甲基氨基丙烷(dlindap)、1，2
‑
二亚油酰基硫代
‑3‑
二甲基氨基丙烷(dlin
‑
s
‑
dma)、1
‑
亚油酰基
‑2‑
亚油基氧基
‑3‑
二甲基氨基丙烷(dlin
‑2‑
dmap)、1，2
‑
二亚油酰基氧基
‑3‑
三甲基氨基丙烷氯化物盐(dlin
‑
tma.cl)、1，2
‑
二亚油酰基
‑3‑
三甲基氨基丙烷氯化物盐(dlin
‑
tap.cl)、1，2
‑
二亚油酰基氧基
‑3‑
(n
‑
甲基哌嗪)丙烷(dlin
‑
mpz)、3
‑
(n，n
‑
二亚油酰基氨基)
‑
1，2
‑
丙二醇(dlinap)、3
‑
(n，n
‑
二油基氨基)
‑
1，2
‑
丙二醇(doap)、1，2
‑
二亚油酰基氧代
‑3‑
(2
‑
n，n
‑
二甲基氨基)乙氧基丙烷(dlin
‑
eg
‑
dma)和2，2
‑
二亚油酰基
‑4‑
二甲基氨基甲基
‑
[1，3]
‑
二氧杂环戊烷(dlin
‑
k
‑
dma)、2，2
‑
二亚油酰基
‑4‑
(2
‑
二甲基氨基乙基)
‑
[1，3]
‑
二氧杂环戊烷(dlin
‑
kc2
‑
dma)；二亚油酰基
‑
甲基
‑4‑
二甲基氨基丁酸酯(dlin
‑
mc3
‑
dma)；mc3(us20100324120)。
[0204]
在一个实施方案中，至少一个mrna分子可配制在氨基醇类脂质中。可用于本发明的氨基醇类脂质可通过美国专利no.8450298中所述的方法制备。合适的(可电离的)脂质还可以是wo 2017/075531a1的表1、表2和表3和权利要求1至24中所定义的化合物。
[0205]
在另一个实施方案中，可电离的脂质还可以是如下中公开的化合物：wo2015/
074085a1(即atx
‑
001至atx
‑
032或权利要求1至26中所述的化合物)、美国申请no.61/905724和15/614499或美国专利no.9593077和9567296。
[0206]
在这种情况下，可以适合地使用衍生自通式(lnp
‑
i)的任何脂质
[0207][0208]
其中，r1和r2相同或不同，各自是由1个至9个碳组成的直链或带支链的烷基、由2个至11个碳组成的烯基或炔基，l1和l2相同或不同，各自是由5个至18个碳组成的线性亚烷基或亚烯基，或形成具有n的杂环，x1是键或是
‑
co
‑
o
‑
从而形成
‑
l2‑
co
‑
o
‑
r2，x2是s或o，l3是键或由1个至6个碳组成的直链或带支链的亚烷基，或形成具有n的杂环，r3是由1个至6个碳组成的直链或带支链的亚烷基，和r4和r5相同或不同，各自是氢或由1个至6个碳组成的直链或带支链的烷基；或其药学上可接受的盐。
[0209]
在其他实施方案中，合适的阳离子脂质还可以是如wo 2017/117530a1中公开的化合物(即脂质13、14、15、16、17、18、19、20或权利要求中所述的化合物)。
[0210]
在这种情况下，可以适合地使用衍生自通式(lnp
‑
ii)的任何脂质
[0211][0212]
其中
[0213]
x是直链或带支链的亚烷基或亚烯基，单环、双环或三环芳烃或杂芳烃；
[0214]
y是键、次乙基或未经取代或经取代的芳香环或杂芳香环；z是s或o；
[0215]
l是1个至6个碳的直链或带支链的亚烷基；
[0216]
r3和r4独立地是1个至6个碳的直链或带支链的烷基；
[0217]
r1和r2独立地是1个至20个碳的直链或带支链的烷基或烯基；r是0至6；和
[0218]
m、n、p和q独立地是1至18；
[0219]
其中当n＝q、m＝p和r1＝r2时，x和y不同；
[0220]
其中当x＝y、n＝q、m＝p时，r1和r2不同；
[0221]
其中当x＝y、n＝q和r1＝r2时，m和p不同；和
[0222]
其中当x＝y、m＝p和r1＝r2时，n和q不同；
[0223]
或其药学上可接受的盐。
[0224]
在优选的实施方案中，可使用衍生自式(lnp
‑
ii)的脂质，其中，x是键、直链或带支链的亚烷基、亚烯基或单环、双环或三环芳烃或杂芳烃；y是单环、双环或三环芳烃或杂芳
烃；z是s或o；l是1个至6个碳的直链或带支链的亚烷基；r3和r4独立地是1个至6个碳的直链或带支链的烷基；r1和r2独立地是1个至20个碳的直链或带支链的烷基或烯基；r是0至6；和m、n、p和q独立地是1至18；或其药学上可接受的盐。
[0225]
在优选的实施方案中，可电离的脂质还可选自pct申请pct/ep2017/077517中公开的脂质化合物(即pct/ep2017/077517的衍生自式i、式ii和式iii的脂质化合物，或pct/ep2017/077517的权利要求1至12中所述的脂质化合物)、pct/ep2017/077517的公开内容。在这种情况下，pct/ep2017/077517的表7中公开的脂质化合物(例如衍生自式i
‑
1至式i
‑
41的脂质化合物)和pct/ep2017/077517的表8中公开的脂质化合物(例如衍生自式ii
‑
1至式ii
‑
36的脂质化合物)可以适用于本发明的上下文中。因此，pct/ep2017/077517的式i
‑
1至式i
‑
41和式ii
‑
1至式ii
‑
36和具体公开内容与之相关。
[0226]
在特别优选的实施方案中，合适脂质可以是根据式(lnp
‑
iii)的阳离子脂质
[0227][0228]
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中，r1、r2、r3、l1、l2、g1、g2和g3如下。
[0229]
式(lnp
‑
iii)进一步定义为：
[0230]
l1或l2中的一个是
‑
o(c＝o)
‑
、
‑
(c＝o)o
‑
、
‑
c(＝o)
‑
、
‑
o
‑
、
‑
s(o)
x
‑
、
‑
s
‑
s
‑
、
‑
c(＝o)s
‑
、sc(＝o)
‑
、
‑
nr
a
c(＝o)
‑
、
‑
c(＝o)nr
a
‑
、
‑
nr
a
c(＝o)nr
a
‑
、
‑
oc(＝o)nr
a
‑
或
‑
nr
a
c(＝o)o
‑
，l1或l2中的另一个是
‑
o(c＝o)
‑
、
‑
(c＝o)o
‑
、
‑
c(＝o)
‑
、
‑
o
‑
、
‑
s(o)
x
‑
、
‑
s
‑
s
‑
、
‑
c(＝o)s
‑
、sc(＝o)
‑
、
‑
nr
a
c(＝o)
‑
、
‑
c(＝o)nr
a
‑
、
‑
nr
a
c(＝o)nr
a
‑
、
‑
oc(＝o)nr
a
‑
或
‑
nr
a
c(＝o)o
‑
或直接键合；
[0231]
g1和g2各自独立地是未经取代的c1‑
c
12
亚烷基或c1‑
c
12
亚烯基；
[0232]
g3是c1‑
c
24
亚烷基、c1‑
c
24
亚烯基、c3‑
c8亚环烷基、c3‑
c8亚环烯基；
[0233]
r
a
是h或c1‑
c
12
烷基；
[0234]
r1和r2各自独立地是c6‑
c
24
烷基或c6‑
c
24
烯基；
[0235]
r3是h、or5、cn、
‑
c(＝o)or4、
‑
oc(＝o)r4或
‑
nr5c(＝o)r4；
[0236]
r4是c1‑
c
12
烷基；
[0237]
r5是h或c1‑
c6烷基；和
[0238]
x是0、1或2。
[0239]
在式(lnp
‑
iii)的一些前述实施方案中，脂质具有以下结构(lnp
‑
iiia)或(lnp
‑
iiib)中的一种：
[0240][0241]
其中：
[0242]
a是3至8元环烷基或亚环烷基环；r6在每次出现时独立地是h、oh或c1‑
c
24
烷基；n是
1至15的整数。
[0243]
在式(lnp
‑
iii)的一些前述实施方案中，脂质具有结构(lnp
‑
iiia)，在其他实施方案中，脂质具有结构(lnp
‑
iiib)。
[0244]
在式(lnp
‑
iii)的其他实施方案中，脂质具有以下结构(lnp
‑
iiic)或(lnp
‑
iiid)中的一种：
[0245][0246]
其中y和z各自独立地是1至12的整数。
[0247]
在式(lnp
‑
iii)的任何前述实施方案中，l1或l2中的一个是
‑
o(c＝o)
‑
。例如，在一些实施方案中，l1和l2各自是
‑
o(c＝o)
‑
。在任何前述的不同实施方案中，l1和l2各自独立地是
‑
(c＝o)o
‑
或
‑
o(c＝o)
‑
。例如，在一些实施方案中，l1和l2各自是
‑
(c＝o)o
‑
。
[0248]
在优选的实施方案中，lnp的阳离子脂质是式(lnp
‑
iii)的化合物，其中：
[0249]
l1和l2各自独立地是
‑
o(c＝o)
‑
或(c＝o)
‑
o
‑
；
[0250]
g3是c1‑
c
24
亚烷基或c1‑
c
24
亚烯基；和
[0251]
r3是h或or5。
[0252]
在式(lnp
‑
iii)的一些不同实施方案中，脂质具有以下结构(lnp
‑
iiie)或(lnp
‑
iiif)中的一种：
[0253][0254]
在式(lnp
‑
iii)的一些前述实施方案中，脂质具有以下结构(lnp
‑
iiig)、(lnp
‑
iiih)、(lnp
‑
iiii)或(lnp
‑
iiij)中的一种：
[0255][0256]
在式(lnp
‑
iii)的一些前述实施方案中，n是2至12、例如2至8或2至4的整数。在一些实施方案中，n是3、4、5或6。在一些实施方案中，n是3。在一些实施方案中，n是4。在一些实施方案中，n是5。在一些实施方案中，n是6。在式(lnp
‑
iii)的一些其他前述实施方案中，y和
z各自独立地是2至10的整数。例如，在一些实施方案中，y和z各自独立地是4至9或4至6的整数。在式(lnp
‑
iii)的一些前述实施方案中，r6是h。在其他的前述实施方案中，r6是c1‑
c
24
烷基。在其他实施方案中，r6是oh。在式(lnp
‑
iii)的一些实施方案中，g3是未经取代的。在其他实施方案中，g3是经取代的。在各种不同实施方案中，g3是直链c1‑
c
24
亚烷基或直链c1‑
c
24
亚烯基。在式(lnp
‑
iii)的一些其他前述实施方案中，r1或r2或两者是c6‑
c
24
烯基。例如，在一些实施方案中，r1和r2各自独立地具有以下结构：
[0257][0258]
其中：
[0259]
r
7a
和r
7b
在每次出现时独立地是h或c1‑
c
12
烷基；和a是2至12的整数，其中各自选择r
7a
、r
7b
和a使得r1和r2各自独立地包含6至20个碳原子。例如，在一些实施方案中，a是5至9或8至12的整数。在式(lnp
‑
iii)的一些前述实施方案中，至少一个出现的r
7a
是h。例如，在一些实施方案中，r
7a
在每次出现时是h。在前述的其他不同实施方案中，至少一个出现的r
7b
是c1‑
c8烷基。例如，在一些实施方案中，c1‑
c8烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。
[0260]
在式(lnp
‑
iii)的不同实施方案中，r1或r2或两者具有以下结构中的一种：
[0261][0262]
在优选的实施方案中，lnp的阳离子脂质是式(lnp
‑
iii)的化合物，其中：
[0263]
l1和l2各自独立地是
‑
o(c＝o)
‑
或(c＝o)
‑
o
‑
；和
[0264]
r1和r2各自独立地具有以下结构中的一种：
[0265][0266]
在式(lnp
‑
iii)的一些前述实施方案中，r3是oh、cn、
‑
c(＝o)or4、
‑
oc(＝o)r4或
‑
nhc(＝o)r4。在一些实施方案中，r4是甲基或乙基。
[0267]
在优选的实施方案中，lnp的阳离子脂质是式(lnp
‑
iii)的化合物，其中r3是oh。
[0268]
在特别优选的实施方案中，本发明的mrna与一种或多于一种脂质复合从而形成脂质纳米颗粒(lnp)，其中lnp选自结构(lnp
‑
iii
‑
1)至(lnp
‑
iii
‑
36)(本文中的表4)。
[0269]
[0270]
[0271]
[0272]
[0273]
[0274][0275]
在一个优选的实施方案中，lnp包含式(lnp
‑
iii)的脂质、本发明的至少一个mrna分子和一种或多于一种赋形剂，其优选地选自中性脂质、类固醇和聚乙二醇化脂质。在特别优选的实施方案中，式(lnp
‑
iii)的脂质是化合物(lnp
‑
iii
‑
3)。在一些实施方案中，式
(lnp
‑
iii)的脂质是化合物(lnp
‑
iii
‑
7)。
[0276]
在另一个优选的实施方案中，lnp包含选自如下的阳离子脂质：
[0277][0278]
在一个特别优选的实施方案中，本发明的mrna与一种或多于一种脂质复合从而形成脂质纳米颗粒(lnp)，其中lnp包含以下阳离子脂质(根据表4的式lnp
‑
iii
‑
3的脂质：
[0279][0280]
在一个优选的实施方案中，阳离子脂质如本文定义，优选地如表4中公开，更优选地阳离子脂质化合物lnp
‑
iii
‑
3以相对于lnp的总脂质含量为约30至约95摩尔％的量存在于lnp中。如果多于一种阳离子脂质并入lnp内，则这种百分比适用于组合的阳离子脂质。
[0281]
在另一个优选的实施方案中，阳离子脂质在lnp中以约30至约70摩尔％的量存在。
在一个实施方案中，阳离子脂质在lnp中以约40至约60摩尔％的量存在，例如分别是约40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60摩尔％。在实施方案中，阳离子脂质在lnp中以约47至约48摩尔％的量存在，例如分别是约47.0、47.1、47.2、47.3、47.4、47.5、47.6、47.7、47.8、47.9、50.0摩尔％，其中特别优选47.7摩尔％。
[0282]
阳离子脂质可以如下比率存在：lnp中存在的总脂质的约20摩尔％至约70摩尔％或75摩尔％或约45摩尔％至约65摩尔％或约20摩尔％、25摩尔％、30摩尔％、35摩尔％、40摩尔％、45摩尔％、50摩尔％、55摩尔％、60摩尔％、65摩尔％或约70摩尔％。在进一步的实施方案中，lnp包含(基于脂质纳米颗粒中的100％总摩尔数的脂质)约25摩尔％％至约75摩尔％％，例如，约20摩尔％至约70摩尔％、约35摩尔％至约65摩尔％、约45摩尔％至约65摩尔％、约60摩尔％、约57.5摩尔％、约57.1摩尔％、约50摩尔％或约40摩尔％的阳离子脂质。在一些实施方案中，阳离子脂质与核酸、优选本发明的mrna的比率为约3至约15，例如约5至约13或约7至约11。在一个优选的实施方案中，阳离子脂质与核酸、优选地本发明的mrna的比率为约6。
[0283]
在一个优选的实施方案中，lnp包含上述任何脂质的组合或混合物。
[0284]
在一个优选的实施方案中，如本文定义的氨基或阳离子脂质具有至少一个可质子化或去质子化基团，使得脂质在处于或低于生理ph(例如ph 7.4)的ph时带正电荷，并且在第二ph、优选地处于或高于生理ph时呈中性。当然，将会理解，作为ph的函数的质子的增加或去除是平衡过程，并且提到带电荷或中性脂质是指主要物种的性质，而不需要所有脂质必须以带电或中性形式存在。具有多于一个可质子化或去质子化基团或是两性离子的脂质并不予以排除，并且在本发明的上下文中同样可以是合适的。
[0285]
在一个优选的实施方案中，可质子化脂质具有可质子化基团的pka是约4至约11，例如pka是约5至约7。
[0286]
lnp可包含两种或更多种(不同)阳离子脂质。可以选择阳离子脂质以贡献不同的有利性能。例如，可在lnp中使用如下性能不同的阳离子脂质：例如胺pka、化学稳定性、循环半衰期、组织半衰期、组织净积累或毒性。特别地，阳离子脂质可选择为使得混合lnp的性能比单独脂质的单一lnp的性能是更期望的。
[0287]
可以考虑核酸货物的量来选择永久阳离子脂质或类脂质的量。在一个实施方案中，这些量选择为例如导致纳米颗粒或组合物的n/p比率是约0.1至约20。在这种情况下，n/p比率定义为脂质或类脂质的碱性含氮基团的氮原子(“n”)与用作货物的rna的磷酸酯基团(“p”)的摩尔比。n/p比率可基于如下计算：例如，1μg rna通常包含约3nmol磷酸酯残基，前提是rna表现出碱基的统计分布。脂质或类脂质的“n”值可基于如下计算：其分子量和永久阳离子(如果存在阳离子型基团)的相对含量。
[0288]
lnp的体内特性和行为可以通过向lnp表面添加亲水性聚合物涂层、例如聚乙二醇(peg)以赋予空间稳定性来修饰。此外，此外，lnp可通过将配体(例如抗体、肽和碳水化合物)连接到其表面或连接到所连接peg链的末端(例如通过聚乙二醇化脂质或聚乙二醇化胆固醇)用于特异性靶向。
[0289]
在一个优选的实施方案中，lnp包含聚合物共轭脂质。术语“聚合物共轭脂质”是指均包含脂质部分和聚合物部分的分子。聚合物共轭脂质的实例是聚乙二醇化脂质或peg
‑
修饰的脂质。术语“聚乙二醇化脂质或peg
‑
修饰的脂质”是指均包含脂质部分和聚乙二醇部分
的分子。聚乙二醇化脂质在本领域中是已知的，并且包括1
‑
(单甲氧基
‑
聚乙二醇)
‑
2，3
‑
二肉豆蔻酰甘油(peg
‑
s
‑
dmg)等。在这种情况下，2
‑
mpeg2000
‑
n，n
‑
双十四烷基乙酰胺特别优选用作聚乙二醇化脂质。
[0290]
其他合适的氨基脂质包括具有交替的脂肪酸基团和其他二烷基氨基的那些，包括其中烷基取代基不同的那些(例如，n
‑
乙基
‑
n
‑
甲基氨基
‑
和n
‑
丙基
‑
n
‑
乙基氨基
‑
)。一般而言，具有较少饱和酰基链的氨基脂质更容易分级，特别是当复合物必须分级低于约0.3微米时，以用于过滤器灭菌。可以使用包含碳链长度为c14至c22的不饱和脂肪酸的氨基脂质。其他scaffolds还可用于分离氨基脂质的氨基和脂肪酸或脂肪烷基部分。
[0291]
氨基或阳离子脂质可具有至少一个可质子化或去质子化基团，使得脂质在处于或低于生理ph(例如ph 7.4)的ph时带正电荷，并且在第二ph、优选地处于或高于生理ph时呈中性。当然，将会理解，作为ph的函数的质子的增加或去除是平衡过程，并且提到带电荷或中性脂质是指主要物种的性质，而不需要所有脂质必须以带电或中性形式存在。具有多于一个可质子化或去质子化基团或是两性离子的脂质并不排除在本发明中使用。
[0292]
可质子化脂质可具有可质子化基团的pka是约4至约11、例如，pka是约5至约7。在一个优选的实施方案中，可质子化脂质可具有可质子化基团的pka是约6.09。
[0293]
lnp可包括两种或更多种阳离子脂质。阳离子脂质可以选择以贡献不同的有利性能。例如，可在lnp中使用如下性能不同的阳离子脂质：例如胺pka、化学稳定性、循环半衰期、组织半衰期、组织净积累或毒性。特别地，阳离子脂质可选择为使得混合lnp的性能比单独脂质的单一lnp的性能是更期望的。
[0294]
阳离子脂质可以如下比率存在：lnp中存在的总脂质的约20摩尔％至约70摩尔％或75摩尔％或约45摩尔％至约65摩尔％或约20摩尔％、25摩尔％、30摩尔％、35摩尔％、40摩尔％、45摩尔％、50摩尔％、55摩尔％、60摩尔％、65摩尔％或约70摩尔％。lnp可包含(基于脂质纳米颗粒中的100％总摩尔数的脂质)约25摩尔％至约75摩尔％的阳离子脂质，例如约20摩尔％至约70摩尔％、约35摩尔％至约65摩尔％、约45摩尔％至约65摩尔％、约60摩尔％、约50摩尔％或约40摩尔％。阳离子脂质与核酸的比率可以为约3至约15，例如约5至约13或约7至约11。具体地，脂质体具有的阳离子脂质中的氮原子与rna中的磷酸酯的摩尔比(n∶p比率)为1∶1至20∶1，如国际公布no.wo 2013/006825a1中所述。或者，脂质体可具有n∶p比率为大于20∶1或小于1∶1。
[0295]
(ii)中性和非阳离子脂质
[0296]
非阳离子脂质可以是中性脂质、阴离子脂质或两亲脂质。中性脂质，当存在时，可以选择在生理ph下以不带电或中性两性离子形式存在的多种脂质种类中的任一种。这种脂质包括例如二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂和脑苷脂。用于本文描述的颗粒中的中性脂质的选择通常通过考虑例如血流中lnp的lnp大小和稳定性来指导。优选地，中性脂质是具有两个酰基的脂质(例如，二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰乙醇胺)。
[0297]
中性脂质可含有碳链长度为c
10
至c
20
的饱和脂肪酸。在其他实施方案中，使用具有碳链长度为c
10
至c
20
的单不饱和脂肪酸或双不饱和脂肪酸的中性脂质。另外或替代地，可以使用具有饱和和不饱和脂肪酸链的混合物的中性脂质。
[0298]
合适的中性脂质包括但不限于，二硬脂酰磷酸胆碱(dspc)、二油酰磷脂酰胆碱
(dopc)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、二油酰磷脂酰甘油(dopg)、二棕榈酰磷脂酰甘油(dppg)、二油酰
‑
磷脂酰乙醇胺(dope)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(popc)、棕榈酰油酰
‑
磷脂酰乙醇胺(pope)、二油酰
‑
磷脂酰乙醇胺4
‑
(n
‑
马来酰亚胺甲基)
‑
环己烷
‑1‑
羧酸酯(dope
‑
mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(dppe)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(dmpe)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dmpc)、二硬脂酰
‑
磷脂酰
‑
乙醇胺(dspe)、sm、16
‑0‑
单甲基pe、16
‑
o
‑
二甲基pe、18
‑1‑
反式pe、1
‑
硬脂酰
‑2‑
油酰
‑
磷脂酰乙醇胺(sope)、胆固醇或其混合物。合适用于lnp的阴离子脂质包括但不限于，磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基
‑
磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、n
‑
十二烷酰基磷脂酰乙醇胺、n
‑
琥珀酰磷脂酰
‑
乙醇胺、n
‑
戊二酰磷脂酰乙醇胺、赖氨酰磷脂酰甘油和连接至中性脂质的其他阴离子修饰基团。在这种情况下，使用二硬脂酰磷酸胆碱(dspc)作为中性脂质是特别优选的。
[0299]
两亲脂质是指任何合适的物质，其中脂质物质的疏水部分朝向疏水相，而亲水部分朝向水相。这种化合物包括但不限于，磷脂、氨基脂质和鞘脂。代表性磷脂包括鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰
‑
油酰磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷酸胆碱或二亚油酰基磷脂酰胆碱。也可以使用其他不含磷的化合物，例如鞘脂、鞘糖脂家族、二酰基甘油和β
‑
酰氧基酸。
[0300]
在一些实施方案中，lnp包含选自dspc、dppc、dmpc、dopc、popc、dope和sm的中性脂质。在各种实施方案中，阳离子脂质与中性脂质的摩尔比是约2∶1至约8∶1。在一个优选的实施方案中，阳离子脂质与中性脂质的摩尔比是约4∶1至约5∶1。
[0301]
在优选的实施方案中，中性脂质是1，2
‑
二硬脂酰
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸胆碱(dspc)。阳离子脂质与dspc的摩尔比可以是约2∶1至8∶1。在一个优选的实施方案中，阳离子脂质与中性脂质的摩尔比是约4∶1至约5∶1。
[0302]
非阳离子脂质可以如下比率存在：lnp中存在的总脂质的约5摩尔％至约90摩尔％、约5摩尔％至约10摩尔％、约5摩尔％、10摩尔％、15摩尔％、20摩尔％、25摩尔％、30摩尔％、35摩尔％、40摩尔％、45摩尔％、50摩尔％、55摩尔％、60摩尔％、65摩尔％、70摩尔％、75摩尔％、80摩尔％、85摩尔％或约90摩尔％。
[0303]
lnp可包含约0摩尔％至约15摩尔％或45摩尔％，例如约3摩尔％至约12摩尔％或约5摩尔％至约10摩尔％的中性脂质。例如，lnp可包含(基于lnp中100％的总摩尔数的脂质)约15摩尔％、约10摩尔％、约7.5摩尔％或约7.1摩尔％的中性脂质。特别优选10摩尔％的dspc作为中性脂质。
[0304]
(iii)甾醇
[0305]
甾醇可优选为胆固醇。
[0306]
甾醇可以如下比率存在：lnp的约10摩尔％至约60摩尔％或约25摩尔％至约40摩尔％。甾醇可以如下比率存在：lnp中存在的总脂质的约10摩尔％、15摩尔％、20摩尔％、25摩尔％、30摩尔％、35摩尔％、40摩尔％、45摩尔％、50摩尔％、55摩尔％或约60摩尔％。lnp可包含(基于lnp中100％的总摩尔数的脂质)约5摩尔％至约50摩尔％的甾醇，例如，约15摩尔％至约45摩尔％、约20摩尔％至约40摩尔％、约48摩尔％、约40摩尔％、约38.5摩尔％、约35摩尔％、约34.4摩尔％、约31.5摩尔％或约31摩尔％。在这种情况下，40.9摩尔％的胆固醇是特别优选的。
[0307]
(iv)聚集减少剂
[0308]
聚集减少剂可以是能够减少聚集的脂质。
[0309]
这种脂质的实例包括但不限于，聚乙二醇(peg)
‑
修饰的脂质、单唾液酸神经节苷脂gml和聚酰胺低聚物(pao)，例如美国专利no.6320017中所述的那些。其他具有不带电荷、亲水性、空间阻隔部分的化合物，如peg、gml或atta也可以与脂质偶联，这些化合物可防止在配制过程中聚集。atta
‑
脂质描述于例如美国专利no.6320017中，peg
‑
脂质共轭物描述于例如美国专利no.5820873、5534499和5885613中。
[0310]
聚集减少剂可以例如选自聚乙二醇(peg)
‑
脂质，包括而不限于peg
‑
二酰基甘油(dag)、peg
‑
二烷基甘油、peg
‑
二烷基氧基丙基(daa)、peg
‑
磷脂、peg
‑
神经酰胺(cer)或其混合物(例如peg
‑
cer
14
或peg
‑
cer
20
)。peg
‑
daa共轭物可以是例如peg
‑
二月桂基氧基丙基(c
12
)、peg
‑
二肉豆蔻基氧基丙基(c
14
)、peg
‑
二棕榈基氧基丙基(c
16
)或peg
‑
二硬脂基氧基丙基(c
18
)。其他聚乙二醇化
‑
脂质包括但不限于，聚乙二醇
‑
二肉豆蔻酰基甘油(c
14
‑
peg或peg
‑
c
14
，其中peg具有2000da的平均分子量)(peg
‑
dmg)；(r)
‑
2，3
‑
双(十八烷基氧基)丙基
‑1‑
(甲氧基聚(乙二醇)2000)丙基氨基甲酸酯)(peg
‑
dsg)；peg
‑
氨基甲酰
‑
1，2
‑
二肉豆蔻基氧基丙胺，其中peg具有2000da的平均分子量(peg
‑
cdma)；n
‑
乙酰半乳糖胺
‑
((r)
‑
2，3
‑
双(十八烷基氧基)丙基
‑1‑
(甲氧基聚(乙二醇)2000)丙基氨基甲酸酯))(galnac
‑
peg
‑
dsg)；mpeg(mw2000)
‑
二硬脂酰磷脂酰
‑
乙醇胺(peg
‑
dspe)；和聚乙二醇
‑
二棕榈酰甘油(peg
‑
dpg)。
[0311]
优选地，聚集减少剂可选自peg
‑
dmg或peg
‑
c
‑
dma。
[0312]
在优选的实施方案中，本发明的mrna与一种或多于一种脂质复合从而形成脂质纳米颗粒(lnp)，其中lnp另外包含具有式(lnp
‑
iv)的聚乙二醇化的脂质：
[0313][0314]
或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中r8和r9各自独立地是含有10个至30个碳原子的直链或带支链、饱和或不饱和的烷基链，其中烷基链任选地被一个或多于一个酯键间断；和w具有30至60的平均值。
[0315]
在根据式(lnp
‑
iv)的聚乙二醇化脂质的一些前述实施方案中，当w为42时，r8和r9不都是正十八烷基。在一些其他实施方案中，r8和r9各自独立地是包含10个至18个碳原子的直链或带支链、饱和或不饱和的烷基链。在一些实施方案中，r8和r9各自独立地是包含12个至16个碳原子的直链或带支链、饱和或不饱和的烷基链。在一些实施方案中，r8和r9各自独立地是包含12个碳原子的直链或带支链、饱和或不饱和的烷基链。在一些实施方案中，r8和r9各自独立地是包含14个碳原子的直链或带支链、饱和或不饱和的烷基链。在其他实施方案中，r8和r9各自独立地是包含16个碳原子的直链或带支链、饱和或不饱和的烷基链。在更多实施方案中，r8和r9各自独立地是包含18个碳原子的直链或带支链、饱和或不饱和的烷基链。在其他实施方案中，r8是包含12个碳原子的直链或带支链、饱和或不饱和的烷基链和r9是包含14个碳原子的直链或带支链、饱和或不饱和的烷基链。
[0316]
在各种实施方案中，w跨越选择的范围，使得根据式(lnp
‑
iv)的聚乙二醇化的脂质
的peg部分具有约400g/mol至约6000g/mol的平均分子量。在一些实施方案中，平均w为约50。
[0317]
在优选的实施方案中，根据式(lnp
‑
iv)的聚乙二醇化的脂质的r8和r9是饱和烷基链。
[0318]
在特别优选的实施方案中，本发明的mrna分子与一种或多于一种脂质复合从而形成脂质纳米颗粒(lnp)，其中lnp另外包含聚乙二醇化的脂质，其中peg脂质具有式(lnp
‑
iva)
[0319][0320]
其中n具有30至60的平均值，例如约28至约32、约30至约34、32至约36、约34至约38、36至约40、约38至约42、40至约44、约42至约46、44至约48、约46至约50、48至约52、约50至约54、52至约56、约54至约58、56至约60、约58至约62。在优选的实施方案中，n是约45、46、47、48、49、50、51、52、53、54。在最优选的实施方案中，n具有49的平均值。在这种情况下，特别优选2
‑
mpeg2000
‑
n，n
‑
双十四烷基乙酰胺。在这种情况下，特别优选2
‑
mpeg2000
‑
n，n
‑
双十四烷基乙酰胺。
[0321]
在其他实施方案中，聚乙二醇化脂质具有以下结构中的一种：
[0322][0323]
其中n是选择的整数，使得聚乙二醇化的脂质的平均分子量为约2500g/mol，最优选n为约49。
[0324]
us 20150376115 a1和wo 201519995中提供了适用于此上下文的peg
‑
脂质的进一步实例。
[0325]
在一些实施方案中，lnp包括基于lnp中的总摩尔数的脂质小于约3摩尔％、2摩尔％或1摩尔％的peg或peg
‑
修饰的脂质。在进一步的实施方案中，lnp包含(基于lnp中的100％总摩尔数的脂质)约0.1摩尔％至约20摩尔％的peg
‑
修饰的脂质，例如约0.5摩尔％至约10摩尔％、约0.5摩尔％至约5摩尔％、约10摩尔％、约5摩尔％、约3.5摩尔％、约3摩尔％、约2.5摩尔％、约2摩尔％、约1.5摩尔％、约1摩尔％、约0.5摩尔％或约0.3摩尔％。在优选的实施方案中，lnp包含(基于lnp中的100％总摩尔数的脂质)约1.0摩尔％至约2.0摩尔％的peg
‑
修饰的脂质，例如约1.2摩尔％至约1.9摩尔％、约1.2摩尔％至约1.8摩尔％、约1.3摩
尔％至约1.8摩尔％、约1.4摩尔％至约1.8摩尔％、约1.5摩尔％至约1.8摩尔％、约1.6摩尔％至约1.8摩尔％，特别是约1.4摩尔％、约1.5摩尔％、约1.6摩尔％、约1.7摩尔％、约1.8摩尔％、约1.9摩尔％，最优选1.7％。在这种情况下，1.7摩尔％的2
‑
mpeg2000
‑
n，n
‑
双十四烷基乙酰胺作为peg
‑
修饰的脂质是特别优选的。
[0326]
在各种实施方案中，阳离子脂质与聚乙二醇化脂质的摩尔比为约100∶1至约25∶1。
[0327]
lnp组合物可特别受到阳离子脂质成分的选择、阳离子脂质饱和度、聚乙二醇化的性质、所有成分的比例和生物物理参数(例如其大小)的影响。在semple等人的一个实施例中(semple等人，nature biotech.2010 28：172
‑
176，lnp组合物由57.1％的阳离子脂质、7.1％的二棕榈酰磷脂酰胆碱、34.3％的胆固醇和1.4％的peg
‑
c
‑
dma组成(basha等人，mol ther.2011 19：2186
‑
2200)。
[0328]
lnp可包含约35％至约45％的阳离子脂质、约40％至约50％的阳离子脂质、约50％至约60％的阳离子脂质和/或约55％至约65％的阳离子脂质。脂质与核酸的比率可以为约5∶1至约20∶1、约10∶1至约25∶1、约15∶1至约30∶1和/或至少30∶1。
[0329]
peg
‑
修饰的脂质中的peg部分的平均分子量可以为约500道尔顿至约8000道尔顿(例如，约1000道尔顿至约4000道尔顿)。在一个优选的实施方案中，peg部分的平均分子量为约2000道尔顿。
[0330]
基于lnp中100％总摩尔数的脂质，聚集减少剂的浓度可以为约0.1摩尔％至约15摩尔％。在一些实施方案中，基于lnp中的总摩尔数的脂质，lnp包含小于约3摩尔％、2摩尔％或1摩尔％的peg或peg
‑
修饰的脂质。在进一步的实施方案中，lnp包含(基于lnp中的100％总摩尔数的脂质)约0.1摩尔％至约20摩尔％的peg
‑
修饰的脂质，例如约0.5摩尔％至约10摩尔％、约0.5摩尔％至约5摩尔％、约10摩尔％、约5摩尔％、约3.5摩尔％、约1.5摩尔％、约0.5摩尔％或约0.3摩尔％。
[0331]
不同的lnp具有不同摩尔比的阳离子脂质、非阳离子(或中性)脂质、甾醇(例如，胆固醇)和聚集减少剂(例如peg
‑
修饰的脂质)(基于脂质纳米颗粒中的总摩尔数的脂质)，如下表5中所述。在优选的实施方案中，本发明的脂质纳米颗粒制剂基本上由脂质混合物组成，所述脂质混合物的摩尔比为约20％至70％的阳离子脂质：5％至45％的中性脂质：20％至55％的胆固醇：0.5％至15％的peg
‑
修饰的脂质，更优选地摩尔比为约20％至60％的阳离子脂质：5％至25％的中性脂质：25％至55％的胆固醇：0.5％至15％的peg
‑
修饰的脂质。
[0332]
表5：基于脂质的制剂
[0333]
脂质的摩尔比
[0334]
(基于脂质纳米颗粒中的100％总摩尔数的脂质)
[0335][0336]
lnp可以脂质体或阳离子脂质体/dna复合物的形式出现，如下文更详细描述。
[0337]
优选地，脂质纳米颗粒(lnp)包含：(a)至少一个mrna、(b)阳离子脂质、(c)聚集减少剂(例如聚乙二醇(peg)脂质或peg
‑
修饰的脂质)、(d)任选的非阳离子脂质(例如中性脂质)和(e)任选的甾醇。
[0338]
在一些实施方案中，lnp包含式(lnp
‑
iii)的脂质、如上定义的mrna、中性脂质、类固醇和聚乙二醇化的脂质。在优选的实施方案中，式(lnp
‑
iii)的脂质是脂质化合物(lnp
‑
iii
‑
3)，中性脂质是dspc，类固醇是胆固醇，和聚乙二醇化脂质是式(lnp
‑
iva)的化合物，例如2
‑
mpeg2000
‑
n，n
‑
双十四烷基乙酰胺。
[0339]
在优选的实施方案中，lnp基本上由如下物质组成：(i)至少一个阳离子脂质；(ii)中性脂质；(iii)甾醇，例如胆固醇；和(iv)peg
‑
脂质，例如peg
‑
dmg或peg
‑
cdma，摩尔比为约20％至60％的阳离子脂质：5％至25％的中性脂质：25％至55％的甾醇：0.5％至15％的peg
‑
脂质。
[0340]
在特别优选的实施方案中，本发明的mrna与一种或多于一种脂质复合从而形成脂质纳米颗粒(lnp)，其中lnp基本上由如下物质组成
[0341]
(i)如本文定义的至少一个阳离子脂质，优选式(lnp
‑
iii)的脂质，更优选脂质(lnp
‑
iii
‑
3)；
[0342]
(ii)如本文定义的中性脂质，优选1，2
‑
二硬脂酰
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸胆碱(dspc)；
[0343]
(iii)如本文定义的类固醇或类固醇类似物，优选地胆固醇；和
[0344]
(iv)如本文定义的peg
‑
脂质，例如peg
‑
dmg或peg
‑
cdma，优选式(lnp
‑
iva)的聚乙
二醇化的脂质，例如2
‑
mpeg2000
‑
n，n
‑
双十四烷基乙酰胺，
[0345]
其中(i)至(iv)的摩尔比为约20％至60％的阳离子脂质：5％至25％的中性脂质：25％至55％的甾醇：0.5％至15％的peg
‑
脂质，最优选摩尔比为47.7％的阳离子脂质：10％的中性脂质：40.9％的甾醇：1.7％的peg
‑
脂质。
[0346]
在一个优选的实施方案中，脂质纳米颗粒包含：具有式(lnp
‑
iii)的阳离子脂质和/或具有式(lnp
‑
iv)的peg脂质，任选的中性脂质，优选1，2
‑
二硬脂酰
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸胆碱(dspc)，和任选的类固醇，优选胆固醇，其中阳离子脂质与dspc的摩尔比任选地为约2∶1至8∶1，其中阳离子脂质与胆固醇的摩尔比任选地为约2∶1至1∶1。
[0347]
在特定优选的实施方案中，脂质纳米颗粒(lnp)的摩尔比为约50∶10∶38.5∶1.5，优选47.5∶10∶40.8∶1.7或更优选47.4∶10∶40.9∶1.7(即阳离子脂质(优选地脂质lnp
‑
iii
‑
3)、dspc、胆固醇和peg
‑
脂质((优选式(lnp
‑
iva)的peg
‑
脂质，其中n＝49)的比例(摩尔％)；可溶于乙醇)。
[0348]
脂质纳米颗粒中mrna的总量可变化，并且取决于例如rna与总脂质w/w的比率而定义。在本发明的一个实施方案中，mrna与总脂质的比率为小于0.06w/w，优选0.03w/w至0.04w/w。
[0349]
lnp大小
[0350]
根据一些实施方案，lnp的中值直径大小为约50nm至约300nm，例如约50nm至约250nm，例如约50nm至约200nm。
[0351]
根据一些实施方案，可使用较小的lnp。这种颗粒可包含的直径为低于0.1μm至100nm，例如但不限于小于0.1μm、小于1.0μm、小于5μm、小于10μm、小于15μm、小于20μm、小于25μm、小于30μm、小于35μm、小于40μm、小于50μm、小于55μm、小于60μm、小于65μm、小于70μm、小于75μm、小于80μm、小于85μm、小于90μm、小于95μm、小于100μm、小于125μm、小于150μm、小于175μm、小于200μm、小于225μm、小于250μm、小于275μm、小于300μm、小于325μm、小于350μm、小于375μm、小于400μm、小于425μm、小于450μm、小于475μm、小于500μm、小于525μm、小于550μm、小于575μm、小于600μm、小于625μm、小于650μm、小于675μm、小于700μm、小于725μm、小于750μm、小于775μm、小于800μm、小于825μm、小于850μm、小于875μm、小于900μm、小于925μm、小于950μm、小于975μm。在另一个实施方案中，核酸可使用较小的lnp递送，lnp可包含的直径为约1nm至约100nm、约1nm至约10nm、约1nm至约20nm、约1nm至约30nm、约1nm至约40nm、约1nm至约50nm、约1nm至约60nm、约1nm至约70nm、约1nm至约80nm、约1nm至约90nm、约5nm至约100nm、约5nm至约10nm、约5nm至约20nm、约5nm至约30nm、约5nm至约40nm、约5nm至约50nm、约5nm至约60nm、约5nm至约70nm、约5nm至约80nm、约5nm至约90nm、约10至约50nm、约20至约50nm、约30至约50nm、约40至约50nm、约20至约60nm、约30至约60nm、约40至约60nm、约20至约70nm、约30至约70nm、约40至约70nm、约50至约70nm、约60至约70nm、约20至约80nm、约30至约80nm、约40至约80nm、约50至约80nm、约60至约80nm、约20至约90nm、约30至约90nm、约40至约90nm、约50至约90nm、约60至约90nm和/或约70至约90nm。
[0352]
如本文所用，平均直径可由如本领域公知的动态光散射所确定的z
‑
平均值表示。
[0353]
根据一些实施方案，lnp可具有的直径为大于100nm、大于150nm、大于200nm、大于250nm、大于300nm、大于350nm、大于400nm、大于450nm、大于500nm、大于550nm、大于600nm、大于650nm、大于700nm、大于750nm、大于800nm、大于850nm、大于900nm、大于950nm或大于
1000nm。
[0354]
在本发明的另一个优选实施方案中，脂质纳米颗粒的流体动力学直径分别为约50nm至约300nm或约60nm至约250nm、约60nm至约150nm或约60nm至约120nm。
[0355]
根据其他实施方案，lnp具有单模粒径分布(即，它们不是双模或多模的)。
[0356]
除了上述那些之外，lnp还可包含一种或多于一种脂质和/或其他成分。其他脂质可包括在脂质体组合物中用于各种目的，例如防止脂质氧化或将配体附接在脂质体表面上。lnp中可存在许多脂质中的任一种，包括两亲性、中性、阳离子和阴离子脂质。这种脂质可以单独使用或组合使用。
[0357]
可存在于lnp中的另外成分包括双层稳定成分，例如聚酰胺低聚物(参见例如，美国专利no.6320017、肽、蛋白质和洗涤剂)。
[0358]
在一个实施方案中，本发明的mrna分子配制为脂质纳米颗粒。
[0359]
在另一个实施方案中，编码不同的突变体kras变体肽的各个单独mrna分子单独配制于脂质纳米颗粒中。在另一个实施方案中，各自编码不同的突变体kras变体肽的一个或多于一个单独mrna分子单独配制为脂质纳米颗粒。在另一个实施方案中，各自编码不同的kras变体肽的1个、2个、3个、4个或5个单独mrna分子单独配制为脂质纳米颗粒。在另一个实施方案中，各自编码不同的kras变体肽的5个单独mrna分子单独配制为脂质纳米颗粒。
[0360]
在另一个实施方案中，各自编码不同的kras变体肽的一个或多于一个单独mrna分子在配制为脂质纳米颗粒之前进行混合。在另一个实施方案中，各自编码特定kras变体肽的1个、2个、3个、4个或5个单独mrna分子在配制为脂质纳米颗粒之前进行混合。在另一个实施方案中，各自编码不同的kras变体肽的5个单独mrna分子在配制为脂质纳米颗粒之前进行混合。
[0361]
在一个实施方案中，脂质纳米颗粒制剂包含本发明的一种或多于一种人工核酸分子、阳离子脂质、磷酸胆碱(例如，二硬脂酰磷酸胆碱)、聚乙二醇化脂质(例如，2
‑
mpeg2000
‑
n，n
‑
双十四烷基乙酰胺)、甾醇(例如，胆固醇)和衍生自本文式(lnp
‑
iii)的脂质(例如，本文表4中的lnp iii
‑
3的脂质)。在另一个实施方案中，脂质纳米颗粒制剂包含本发明的一种或多于一种人工核酸分子、二硬脂酰磷酸胆碱、2
‑
mpeg2000
‑
n，n
‑
双十四烷基乙酰胺、胆固醇和本文表4中的lnp iii
‑
3的脂质。
[0362]
在其他方面，本发明提供了药物组合物，其包含根据本发明的mrna分子和/或组合物、至少一种药学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或其他成分。
[0363]
根据本发明的药物组合物以“安全并且治疗有效的量”包含至少一个mrna分子和/或本发明的组合物。
[0364]
此外，“治疗有效量”将根据如下而变化：待治疗的特定病况以及待治疗患者的年龄、身体状况、体重、性别和饮食、病况的严重性、治疗的持续时间、伴随治疗的性质、使用的特定药学上可接受的载体和/或赋形剂、治疗方案和类似因素。它还可根据采用的mrna分子是单顺反子、双顺反子或甚至多顺反子而变化。
[0365]
如本文所述，本发明的药物组合物还可包含至少一种药学上可接受的赋形剂、载体、佐剂或其他成分(例如另外活性剂等)。
[0366]
优选地，根据本发明的药物组合物包含至少一种药学上可接受的载体和/或赋形剂。术语“药学上可接受的”是指与一种或多于一种活性剂(此处：mrna分子和/或组合物)相
容并且不干扰和/或显著降低它们的药学活性的化合物或试剂。药学上可接受的载体和/或赋形剂优选具有足够高的纯度和足够低的毒性以使其适合给药于待治疗的对象。合适的药用赋形剂和载体是本领域技术人员已知的，非限制性实例可发现于remington：the science and practice of pharmacy，22
nd
ed.(2012)，a.loyd等人，pharmaceutical press)。
[0367]
根据其他实施方案，本发明的药物组合物还可包含至少一种佐剂。合适的佐剂是本领域技术人员已知的，非限制性实例可发现于remington：the science and practice of pharmacy，22
nd ed.(2012)，a.loyd等人，pharmaceutical press)。
[0368]
最广泛意义上的“佐剂”或“佐剂成分”通常是可修饰的药理学和/或免疫学试剂，例如，增强其他活性剂例如治疗剂或疫苗的作用。在这种情况下，“佐剂”可以理解为适合支持根据本发明的组合物的给药和递送的任何化合物。具体地，佐剂可优选地增强添加至其的药物组合物的免疫刺激性能。此外，这种佐剂可在不与其结合的情况下引发或增加先天免疫系统的免疫反应，即非特异性免疫反应。
[0369]“佐剂”通常不引发适应性免疫反应。就此而言，“佐剂”不符合抗原的条件。换言之，当施用时，药物组合物通常由于由药物组合物中所含的mrna分子的至少一个编码序列编码的变体肽或蛋白质而引发适应性免疫反应。另外，药物组合物中存在的佐剂可产生(支持性)先天免疫反应。
[0370]
在优选的实施方案中，本发明的药物组合物不包含佐剂。
[0371]
[0372]
[0373]
[0374]
[0375]
[0376]
[0377]
[0378]
[0379]
[0380]
[0381]
[0382]
[0383]
[0384]
[0385]