包含复合透明质酸的皮肤外用剂组合物的制作方法

[0001]
本发明涉及包含复合透明质酸作为有效成分的皮肤外用剂组合物，更详细地，涉及如下的皮肤外用剂组合物：包含透明质酸、透明质酸钠以及水解透明质酸作为有效成分，并且具有优异的消除活性氧效果、改善皱纹效果、保湿效果、缓解皮肤刺激效果、预防痤疮效果、改善过敏性效果及抗炎效果、防止毛发损伤效果、预防脱发及育发效果。


背景技术：

[0002]
皮肤老化可分为内因性老化(intrinsic，chronological)和光老化(phtoaging)两种(gilchrest ba：j.am.acad.dermatol.，21，610-613(1989))。内因性老化是由于人体生理性功能随着年龄的增长而下降的自然发生的老化现象(braverman im等：j.invest.dermatol.，78，434-443(1982))。光老化指因皮肤反复暴露于光照射下而改变皮肤的外表或功能的现象(ridder gm等：j.am.acad.dermatol.，25，751-760(1991))。并且，皮肤老化可能是因紫外线、疾病状态、环境因素、伤口、年龄增长而激活活性氧类所导致，当这种状态加剧时，会破坏人体内的抗氧化防御网，损伤细胞及组织，从而促进老人病及老化。更具体地，由于作为皮肤主要结构物质的脂质、蛋白质、多糖类以及核酸等被氧化而导致皮肤细胞及组织遭到破坏，从而产生皮肤老化现象。尤其，在蛋白质的氧化中，由于作为皮肤结合组织的胶原蛋白(collagen)、透明质酸(hyaluronic acid)、弹性蛋白(elastin)、蛋白聚糖(proteoglycan)、纤粘蛋白(fibronectin)等被切断，因而带来严重的过多炎症反应并干扰皮肤弹性，在更严重的情况下，因脱氧核糖核酸(dna)变异而导致突变、诱发癌症、免疫功能低下的局面。
[0003]
因此，通过消除在人体的代谢过程中产生的活性氧类或紫外线照射、炎症反应介导的活性氧类来保护细胞膜，对已受损的细胞还应通过活跃的新陈代谢来对其进行再生以增殖细胞，方可使皮肤迅速恢复并保持健康的皮肤。老化不仅参与活性氧类，还参与一种称为基质金属蛋白酶的酶，其虽能在人体内对诸如胶原蛋白之类的细胞外基质的合成和分解受到适当调节，但随着老化的进行，其合成减少，作为分解胶原蛋白的酶的基质金属蛋白酶(mmp)的表达得到促进，从而降低皮肤的弹性降低并形成皱纹。并且，这种分解酶也可以被紫外线的照射激活。因此，需要开发能够调节通过紫外线来在细胞内诱导活性化的基质金属蛋白酶的表达或能够抑制其活性的物质。但至今为止，用作化妆品原材料的大部分原料大多都只能抑制基质金属蛋白酶的活性。
[0004]
接下来，皮肤病是指在包括人在内的哺乳动物的毛发、手指甲、脚趾甲等所有皮肤出现的异常症状，在具有特异反应性过敏的人身上发生的特异反应性皮炎(atopic dermatitis)，是代表性疾病。到目前为止，特异反应性皮炎的病因尚未明确，但约70％的特异反应性皮炎患者有过敏病史，在过敏性体质的人群中经常发生，尤其，由于同时伴有过敏性鼻炎、哮喘等，因此被理解为遗传因素或免疫疾病之一。该病的特征如下：初期大部分患者因严重的瘙痒而抓挠皮肤，由此产生继发感染而加剧，以及尤其会根据患者的精神稳定性及情绪状态而加剧。患有特异反应性皮炎的人口很多，占全部人口的0.5％～1％，儿童中
的5％～10％饱受该疾病的痛苦。症状大约在产后2～6个月内发生，尤其多发于未满一岁的婴儿中，85％在满五岁之前发生。虽然特异反应性皮炎主要在婴幼儿期发生，但最近青春期后的患者在增加，其病史也变长。在特异反应性皮炎的治疗中，一直在使用可期待较高药理效果的肾上腺皮质激素等的药物。但是，这种肾上腺皮质激素具有副作用，使得患者在治疗期间暴露于副作用的危险中。此外，众所周知，由于终止使用肾上腺皮质激素，因此发生反弹(停药后发生的患处急性病情恶化)。作为这种副作用的对策，使用不包含肾上腺皮质激素等激素的非甾体类抗炎剂或抗组胺剂等，但难以痊愈。因此，迫切需要开发一种无副作用的能够减轻或治疗特异反应性皮炎的治疗剂。
[0005]
近来，为了减少基于各种化学物质的皮肤刺激，已将许多注意力集中到从天然物质中提取的具有抗氧化、缓解皱纹、美白、缓解瘙痒等功能的功能性化妆品(functional cosmetics)。天然原料不仅对皮肤的副作用小，而且由于近来消费者对使用天然原料的化妆品的呼声越来越高，因此作为化妆品原料的开发价值也在增加。例如，美国专利公报us 5,972,341号(专利文献1)记述了没药属(commiphora)植物，尤其印度没药(commiphora mukul)提取物的皱纹改善的效果。日本专利公开平09-67266记述了具有透明质酸酶(hyaluronidase)抑制效果的多种海藻类提取物。日本专利公开平01-85905记述了从裙带菜(wakame)中提取的岩藻依聚糖(fucoidan)的皮肤触感改善效果。日本专利公开平02-245087记述了马尾藻(sargassum)属提取物的抗氧化效果。日本专利公开平03-294384记述了从羊栖菜(hizikia)属提取的抗氧化组合物。日本专利公开平07-10769记述了具有收敛作用(astringent effect)的褐藻纲(phaeophyceae)提取物。韩国专利第0431076号(专利文献2)公开了包含白芨、紫苏、紫椎菊及发酵大豆提取物的过敏性皮肤的治愈改善用化妆品组合物，韩国专利第0511494号(专利文献3)公开了包含何首乌、眼叶、伊利石的用于治疗特异反应性皮炎的提取物及组合物，韩国专利申请公开第2004-0065126号(专利文献4)公开了包含从天然灵芝、榆根皮、甘草、白茯苓、白脂麻及百年草等获得的中药植物提取物的具有过敏性皮肤的治疗和预防效果的中药化妆品组合物。并且，韩国专利申请公开第2004-0011584号(专利文献5)公开了通过提纯并混合甘草、苍耳子、红花、豚脂(猪油)等的天然成分来形成的、对过敏性皮肤具有良好治疗效果的组合物。
[0006]
并且，男性型脱发因取决于雄性激素，而与雄性激素的量有着直接关系，由此，近来报告了许多通过抑制雄性激素的活性来预防及治疗脱发的研究。另外，当皮脂腺的功能由于雄性激素分泌的增加而上升，则由于毛囊壁过度角化而导致过剩的皮脂腺滞留在毛囊内，从而形成的粉刺为痤疮的初期阶段。对于由雄性激素引起的脱发及痤疮的机理的说明如下：5α-还原酶存在于皮脂腺、毛囊、前列腺、附睾等的雄性激素反应性组织中，其作为雄性激素之一，是将睾酮(testosterone)代谢为双氢睾酮(dihydrotestosterone)的酶，在这个转换过程中需要还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)。并且，睾酮(testosterone)参与男性性冲动、骨骼肌的增加、男性外生殖器、阴囊的成长、精子的形成等，而双氢睾酮(dihydrotestosterone)参与痤疮、皮脂增加、脱发及前列腺肥大症等相关组织。尤其，青春期后雄性激素的过度分泌会诱发痤疮和脱发，为了通过5α-还原酶来抑制作为雄性激素的激活形态的双氢睾酮的过量生成，正在积极进行研究以开发出使用5α-还原酶抑制剂来防止脱发及防止痤疮的药物。
[0007]
为了解决这种皮肤问题，近来，开发了许多使用天然物的化妆品以减少由各种化
学物质引起的皮肤刺激。天然原料不仅对皮肤的副作用小，而且由于近来消费者对使用天然原料的化妆品的呼声越来越高，因此作为化妆品原料的开发价值也在增加。为此，本发明人在将已知的多种分子量透明质酸应用到化妆品中并进行研究的结果发现，与单一分子量的透明质酸相比，制备复合透明质酸组合物并对其消除活性氧效果、改善皱纹效果、保湿效果、缓解皮肤刺激效果、预防痤疮效果、改善过敏性效果及抗炎效果、防止毛发损伤效果、预防脱发效果及育发效果进行测定的结果表明，由于效果良好因而可以期待其作为化妆品的功效。
[0008]
已知透明质酸(hyaluronic acid)由n-乙酰葡糖胺和葡萄糖醛酸组成，存在于细胞外基质中，并参与保持皮肤中的水分、存储及扩散细胞成长因子及营养成分，并且由成纤维细胞和角化细胞合成。这种透明质酸防止皮肤的水分蒸发现象，用作薄且透明的水分保湿膜，并从外部的有害环境深入渗透到皮肤深层。
[0009]
现有技术文献
[0010]
专利文献
[0011]
专利文献1：us 5,972,341(1999年10月26日)
[0012]
专利文献2：kr 10-0431076(2004年04月29日)
[0013]
专利文献3：kr 10-0511494(2005年08月24日)
[0014]
专利文献4：kr 10-2004-0065126(2004年07月21日)
[0015]
专利文献4：kr 10-2004-0011584(2004年02月05日)


技术实现要素：

[0016]
本发明的目的在于，提供通过使用分子量大小不同的透明质酸(分子量；2000kda)、透明质酸钠(分子量；1300kda)以及水解透明质酸(分子量；7kda)的复合透明质酸来确认其作为皮肤外用剂的原料的效能并开发其使用方法，并且提供通过使用上述原料来制备具有优异的功能性的皮肤外用剂的方法。
[0017]
即，本发明的目的在于，提供能够应用于化妆品并且当其包含在化妆品中时能够表现出消除活性氧效果、减少基质金属蛋白酶-1生物合成以及促进i型前胶原蛋白生物合成效果、改善皮肤皱纹效果、抗炎效果等优异的抗老化效果的复合透明质酸组合物。
[0018]
并且，本发明的目的在于，提供如下的复合透明质酸组合物：当应用于化妆品时，表现出缓解基于炎症介质的皮肤刺激。
[0019]
并且，本发明的目的在于，提供如下的复合透明质酸组合物：当应用于化妆品时，表现出保湿效果及改善过敏性皮肤的效果。
[0020]
并且，本发明的目的在于，提供如下的复合透明质酸组合物：当应用于化妆品时，具有优异的防止毛发损伤效果、预防脱发效果、育发效果及预防痤疮效果。
[0021]
并且，本发明的目的在于，提供使用复合透明质酸组合物的化妆品的制备方法及其化妆品。
[0022]
为了解决上述问题，本发明的包含复合透明质酸的皮肤外用剂组合物的特征在于，相对于整体组合物，包含0.001重量百分比～3重量百分比的由透明质酸、透明质酸钠、水解透明质酸混合组成的复合透明质酸。
[0023]
在上述组成中，上述皮肤外用剂组合物的特征在于，具有抗衰老效果。
[0024]
并且，上述皮肤外用剂组合物的特征在于，具有缓解刺激的功能。
[0025]
并且，上述皮肤外用剂组合物的特征在于，具有改善过敏性皮肤改善的功能。
[0026]
进一步地，上述皮肤外用剂组合物的特征在于，具有缓解刺激的功能。
[0027]
如上所述，根据本发明的复合透明质酸表现出消除活性氧的效果、基质金属蛋白酶抑制效果和通过紫外线照射调节基质金属蛋白酶表达的效果、改善皮肤细纹效果等优异的抗衰老效果以及缓解紫外线照射后引起的皮肤刺激的效果。
[0028]
并且，复合透明质酸表现出缓解炎症介质引起的皮肤刺激以及改善过敏性的效果。
[0029]
并且，复合透明质酸表现出优异的防止毛发损伤及预防脱发效果、具有预防痤疮的效果的痤疮菌抗菌活性、以及5α-还原酶抑制效果。
[0030]
因此，可知包含这种复合透明质酸的化妆水、面霜、乳液、面膜、粉等的化妆品组合物具有消除活性氧的效果和调节胶原蛋白分解酶活性效果、改善皮肤细纹效果、保湿、防止毛发损伤、预防脱发、预防痤疮、改善皮肤过敏性效果、缓解皮肤刺激的效果等优异的皮肤外用剂效果。
具体实施方式
[0031]
为了实现上述目的，本发明的特征在于，相对于整体组合物，包含0.001重量百分比～3重量百分比的由透明质酸、透明质酸钠、水解透明质酸混合后组成的复合透明质酸组合物(以下，称之为“复合透明质酸”)。
[0032]
更具体地，复合透明质酸指在纯净水中混合分散分子量大小不同的透明质酸(分子量；2000kda)、透明质酸钠(分子量；1300kda)以及水解透明质酸(分子量；7kda)的组合物。
[0033]
复合透明质酸可由0.05重量百分比～2.0重量百分比的透明质酸、0.05重量百分比～2.0重量百分比的透明质酸钠以及0.05重量百分比～2.0重量百分比的水解透明质酸和剩余量的纯净水组成。
[0034]
此外，在皮肤外用剂组合物中上述复合透明质酸的含量小于0.001重量百分比的情况下，几乎没有改善皮肤的效果，在大于3.0重量百分比的情况下，由于相对于含量增加的效果增强效果微乎其微，因此不经济。
[0035]
并且，本发明提供包含复合透明质酸作为主要活性成分的皮肤外用剂组合物，上述皮肤外用剂组合物的特征在于，选自化妆水、凝胶、水溶性液体、霜剂、精油、水中油(o/w)型及油中水(w/o)型等剂型。
[0036]
不仅如此，本发明的特征在于，上述皮肤外用剂组合物为化妆品组合物或药学组合物。
[0037]
复合透明质酸可制剂化为胶囊剂、液剂、软膏剂、贴附剂或利用药学上可接受的载体的缓释剂等的药学组合物，并包含在药理学上可接受的机制、运载剂、赋形剂、粘合剂(例：淀粉、西黄蓍胶、明胶、糖蜜、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素以及羧甲基纤维素)、粉碎剂(例：琼脂、明胶粉、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、结晶纤维素、碳酸钙、碳酸氢钠、褐藻酸钠)、润滑剂(例：硬脂酸镁、滑石、氢化植物油)以及着色剂等。上述运载剂及赋形剂使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、土豆淀粉、
玉米淀粉、碳酸钙、磷酸钙以及纤维素等。
[0038]
除了上述之外，还可添加稳定剂、溶解辅助剂、经皮吸收促进剂等的辅助剂、芳香剂、防腐剂等添加剂。
[0039]
这样制备的药学组合物可根据症状每天一次或多次施用于皮肤，并根据症状的改善程度来进行调节。
[0040]
以下，通过实施例及实验例对本发明进行更为具体的说明。但是，这些实施例仅为本发明例示性的描述，本发明的范围不限于这些实施例。
[0041]
实施例1：复合透明质酸的制备
[0042]
在394.6g的纯净水中混合分子量大小不同的透明质酸粉，0.2g(0.05重量百分比)的透明质酸(分子量；2000kda)、0.2g(0.05重量百分比)的透明质酸钠(分子量；1300kda)以及5g(1.25重量百分比)的水解透明质酸(分子量；7kda)以制备复合透明质酸。
[0043]
实验例1：利用氮蓝四唑(nbt)法测定抗氧化效果的实验
[0044]
为了确认从实施例1获得的复合透明质酸的抗氧化效果，在实验室条件下，将单一分子量的透明质酸和公知的抗氧化剂二叔丁基对甲酚(bht，butylated hydroxytoluene)作为对照样品，利用氮蓝四唑(nbt，nitro blue tetrazolium)法测定抗氧化活性。
[0045]
为了测定抗氧化效果，通过氮蓝四唑(nbt)法测定由黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶生成的活性氧，并评价被检测物质对活性氧的消除效果，即，活性氧的消除效果。
[0046]
黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶生成活性氧，上述活性氧与氯化硝基四氮唑蓝反应，并在560nm的波长下测定由此生成的蓝色，以此测定了活性氧的消除率。
[0047]
作为测定方法，在拜耳瓶中加入2.4ml的0.05m na
2
co
3
、0.1ml的3mm黄嘌呤溶液、0.1ml的3mm乙二胺四乙酸(edta)溶液、0.1ml的牛血清蛋白(bsa)溶液、0.1ml的0.72mm氯化硝基四氮唑蓝(nbt)溶液，并将0.1ml的各试样溶液加入到其中后，在25℃的温度下放置十分钟。
[0048]
之后，加入0.1ml的黄嘌呤氧化酶溶液并进行快速搅拌后，在25℃的温度下培养20分钟，接下来加入0.1ml的6mm cucl
2
溶液，终止反应后，在560nm的条件下，测定吸光度st。
[0049]
在空白试验中，以与上述相同的方式通过使用蒸馏水来代替试样溶液以测定吸光度bt，同样的，试样溶液的空白(blank)以与上述相同的方式通过使用蒸馏水来代替黄嘌呤氧化酶，以测定吸光度bo。
[0050]
效果通过数学式1计算得出，并将其结果示于表1。
[0051]
数学式1
[0052]
抑制率(％)＝〔1-(st-so)/(bt-bo)〕
×
100
[0053]
st：试样溶液经酶反应后，在560nm下的吸光度
[0054]
bt：空白试验溶液经酶反应后，在560nm下的吸光度
[0055]
so：在未加入酶时的试样溶液反应前，在560nm下的吸光度
[0056]
bo：在未加入酶时的空白试验溶液反应前，在560nm下的吸光度
[0057]
表1
[0058][0059][0060]
如上述表1所示，可知，与单一分子量的透明质酸相比复合透明质酸具有更优异的抗氧化能力，并且证实了具有与二叔丁基对甲酚(bht)相似的抗氧化能力。
[0061]
实验例2：自由基消除活性的测定实验
[0062]
为了测定从实施例1获得的复合透明质酸的自由基消除活性，在实验室条件下，将单一分子量的透明质酸和二叔丁基对甲酚(bht)等的抗氧化剂作为比较样品，利用dpph法来测定自由基的消除活性。
[0063]
dpph法通过使用称为dpph(2，2-二(4-叔辛基苯基)-1-苦基肼自由基)(2,2-di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical)的自由基来测定基于还原力的自由基消除活性，对通过被检测物质dpph的被还原以降低吸光度程度与空白试验溶液吸光度进行比较，在560nm的波长下，测定自由基消除率。
[0064]
为了测定dpph自由基消除活性，准备0.1％浓度的各个试样。将上述浓度的试样分别放入96孔板中，并加入在100μm甲醇溶液中制备的dpph以使溶液总体积成为200μl。将其在37℃的温度下，放置30分钟后，在560nm下，测定吸光度。自由基消除率(％)由下数学式2计算得出。
[0065]
数学式2
[0066]
自由基消除率(％)＝100－(b/a)
×
100
[0067]
a：试样未经处理的对照组孔的吸光度
[0068]
b：试样经处理的实验组孔的吸光度
[0069]
数学式2中计算得出的自由基消除活性示于下表2。
[0070]
表2
[0071]
样品名自由基消除活性(％)0.1重量百分比的实施例185.2％0.1重量百分比的透明质酸(2000kda)75.4％0.1重量百分比的透明质酸钠(1300kda)78.6％0.1重量百分比的水解透明质酸(7kda)34.7％0.1重量百分比的二叔丁基对甲酚(bht)81％
[0072]
如上述表2所示，可知，与单一分子量的透明质酸和被广泛用作作为抗氧化剂的二叔丁基对甲酚(bht)相比，复合透明质酸具有更优异的自由基消除性能。
[0073]
实验例3：细胞内活性氧的消除效果
[0074]
为了确定从实施例1获得的复合透明质酸对通过紫外线在细胞内生成的活性氧的生成抑制效果，即，活性氧消除效果，将单一分子量的透明质酸和表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)作为对照样品，利用荧光物质进行如下实验。
[0075]
实验中使用的细胞株为从德国癌症研究中心福森因格博士(dr.fusenig)获得的人角化细胞hacat细胞株(human keratinocytes hacat cell line)，将其按每孔2.0
×
10
4
个分株到荧光测定用96孔黑板(well black plate)，使用添加有青霉素/链霉素(penicillin/streptomycin)的达尔伯克氏改良伊格尔氏(dmem，dulbeccos modification of eagles medium，fbs 10％，gibco，美国)培养基，在37℃的温度下，以5％的co
2
的条件培养一天后，以0.01％的浓度处理试样。
[0076]
在加入试验试样并培养24小时后，使用hepes缓冲控制盐溶液(hcss，hepes-buffered control salt solution)进行洗涤以去除剩余的培养基，在hepes缓冲控制盐溶液中加入以20μm制备的100μl的2'，7'-二氢二氯荧光黄双乙酸酯(dcfh-da，2'，7'-dichlorodihydro-fluorescein diacetate，molecular probes，美国)，在37℃的温度下，以5％的co
2
条件培养20分钟后，用hepes缓冲控制盐溶液进行洗涤。之后，在加入100μl的按照浓度处理的hepes缓冲控制盐溶液后，使用荧光读板机(ex；485nm，em；530nm)测定初期被活性氧氧化的二氯荧光黄(dcf，dichlorofluorescein)的荧光度。之后，照射户外紫外线(uvb)(20mj/cm
2
)，处理试样后，使用荧光读板机(ex；485nm，em；530nm)测定荧光度。
[0077]
如表3所示，可知，对于活性氧消除效果，复合透明质酸具有与广泛用作比较试样的表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)相似的优异的活性氧消除效果。
[0078]
表3
[0079]
实验例4：体外基质金属蛋白酶-1(in vitro mmp-1)活性抑制实验
[0080]
为了测定基质金属蛋白酶-1(mmp-1)抑制效果，使用了荧光分析法。在实验中所使用的基质为标记有荧光物质的dq-胶原蛋白(dq-collagen)，胶原酶(collagenase)使用molecular probe公司(eugene，俄勒冈州，美国)销售的产品，反应缓冲液(0.5m的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(tris-hcl)，1.5m的氯化钠(nacl)，50mm的氯化钙(cacl
2
)，2mm的叠氮化钠
(sodium azide)，ph 7.6)是在10倍稀释后使用。在100μl的缓冲液中加入以0.25mg/ml的浓度在反应缓冲液中溶解的20μl的dq胶原蛋白和40μl的试样(0.02重量百分比)，并加入以0.5单位(unit)稀释的40μl胶原酶。在暗处、室温下，经过20分钟后，使用荧光分光光度计(perkin elmer，英国)在495nm的吸收波长、515nm的释放波长下测定荧光值，作为对照组，通过添加与酶相同量的反应缓冲液代替酶溶液来测定荧光值，并测定试样自身的荧光值，以在计算时进行修改。
[0081]
结果如表4所示，当处理0.02％的复合透明质酸时，将梭菌胶原酶的胶原蛋白降解活性抑制了79％，这优于绿茶提取物的抑制效果。
[0082]
表4
[0083]
样品名抑制率(％)0.02重量百分比的实施例1790.02重量百分比的透明质酸(2000kda)640.02重量百分比的透明质酸钠(1300kda)580.02重量百分比的水解透明质酸(7kda)210.02重量百分比的绿茶提取物72
[0084]
实验例5：紫外线照射后基于复合透明质酸的基质金属蛋白酶-1的表达抑制的评价
[0085]
在本实验例中，为了测定从实施例1获得的复合透明质酸在照射紫外线及加入试样后的基质金属蛋白酶-1的浓度，进行了酶联免疫吸附法(elisa)。
[0086]
使用紫外线室以6.3j/cm
2
的强度对人真皮成纤维细胞照射户外紫外线。通过预备实验确定了紫外线照射量和培养时间，以使成纤维细胞中基质金属蛋白酶的表达量最大化。用锡箔纸包裹阴性对照组并在户外紫外线环境下保持相同时间。使用紫外线辐射计测定了户外紫外线的释放量。在户外紫外线照射期间，细胞保持之前被分株的培养基，在照射户外紫外线后，用加入样品的培养进行交换并培养24小时后，回收并涂敷到96孔中。处理第一抗体(基质金属蛋白酶-1(ab-5)单一克隆抗体)后，在37℃的温度下，反应60分钟。使作为第二抗体的抗小鼠免疫球蛋白g(igg，整只小鼠，碱性磷酸酶结合物(whole mouse，alkaline phosphatase conjugated))再反应60分钟后，在常温下，使碱性磷酸酶基质溶液(1mg/ml的二乙醇胺中的对硝基苯基磷酸酯(ρ-nitrophenyl phosphate in diethanolamine)缓冲溶液)反应30分钟，使用酶标仪在405nm条件下测定吸光度。作为对照组使用未加入试样的样品。
[0087]
对于照射紫外线时诱导表达的基质金属蛋白酶-1，与未处理试样的对照组相比，复合透明质酸显示出37％以上的抑制率，这显示出与用作对照组的视黄醇相似的抑制率。
[0088]
表5
[0089][0090]
实验例6：i型前胶原蛋白生物合成促进效果
[0091]
在本实验例中，为了确认在添加从实施例1获得的复合透明质酸后的作为皮肤基质成分的i型前胶原蛋白的生物合成促进效果，通过如下方法进行了前胶原蛋白分析(procollagen assay)。
[0092]
从新生儿报批组织分离的人真皮成纤维细胞(human dermal fibroblast)购自modern tissue technology(mtt，韩国)，并在dmem/f-12(3：1)培养基中，添加10％的胎牛血清(fbs)，以1
×
10
4
cell/cm
2
的浓度进行培养。当成长到70％～80％左右时，以1：3的比率分株并继代培养，将3～4次继代培养的细胞用于实验。
[0093]
为了进行测定前胶原蛋白的量的实验，在48孔板(well plate)中培养90％以上的成纤维细胞后，以0.02％的浓度分别加入复合透明质酸和单一分子量的透明质酸，24小时后，使用前胶原蛋白分析1型c-肽酶免疫试剂盒(procollagen type-1 c-peptide eia kit)(mk101，takara，日本)测定培养基中游离的前胶原蛋白的量。
[0094]
结果如表6所示，当以0.02％的浓度处理复合透明质酸时，前胶原蛋白的生物合成被促进了30％，这显示出与用作细胞信号传递物质的转化生长因子-β(tgf-β)相似的效果。
[0095]
表6
[0096][0097]
实验例7：复合透明质酸的弹性蛋白生成促进效果
[0098]
为了确认复合透明质酸的弹性蛋白生成促进效果，对直接从人体采取的或通过商业途径购入的人类成纤维细胞处理从实施例1获得的复合透明质酸，并通过如下实验来测定弹性蛋白酶(elastase)活性的抑制效果。
[0099]
首先，将人成纤维细胞放入培养用烧瓶中并培养到约70％～80％。之后，用复合透明质酸处理1天后，收集细胞培养液，使用市售中的弹性蛋白测定仪器测定弹性蛋白的生成程度[bieth j：biochem med.，11，350-357(1974)，schwartz de：j.invest dermatol.，86，63-68(1986)]。即，使用作为弹性蛋白酶基质的suc-(ala)3na测定na分解时产生的颜色变化，并使用吸光度测定弹性蛋白酶的活性。在这种情况下，将未处理复合透明质酸的组用作对照组。
[0100]
如表7所示，可知，与对照组相比，复合透明质酸可极好地抑制弹性蛋白酶的活性，并且可以确认复合透明质酸的浓度越高，活性抑制率越高。由此，可知，复合透明质酸显示出优异的抗衰老及增强弹力的效果。
[0101]
表7
[0102]
试样名物质活性抑制率(％)0.02重量百分比的实施例126％实施例1，0.01重量百分比17％实施例1，0.005重量百分比7.8％对照组0％
[0103]
实验例8：基于紫外线照射的细胞毒性的缓解效果
[0104]
本实验用于评价从实施例1获得的复合透明质酸的基于紫外线照射的细胞毒性的缓解效果。在24孔试验板中，分别放入1
×
10
5
个成纤维细胞(fibroblast)，并附着24小时。使用磷酸缓冲盐溶液(pbs)洗涤一次，并向各孔加入500μl的磷酸缓冲盐溶液。使用紫外线b(uvb)灯(型号：f15t8，uvb 15w，sankyo dennki公司，日本)以10mj/cm
2
的强度照射上述成纤维细胞后，去除磷酸缓冲盐溶液，加入1ml的细胞培养基(dmem中加入10％的牛胎血清)。处理待评价的复合透明质酸后，培养24小时。24小时后，去除培养基，在各孔中加入500μl的
培养基和60μl的mtt溶液(2.5mg/ml)后，在37℃的温度下，在co
2
培养基培养2小时。去除培养基，分别加入500μl的盐酸异丙醇(0.04n)。震荡5分钟以溶解细胞，分别将100μl上清液转移到96孔试验板后，在酶标仪中测定565nm吸光度。通过数学式3测定细胞生存率(％)，通过数学式4计算出基于紫外线的细胞毒性缓解率。
[0105]
数学式3
[0106]
细胞生存率(％)＝〔(st－bo)/(bt－bo)〕
×
100
[0107]
bo：仅发色反应出细胞培养基的孔的565nm吸光度
[0108]
bt：发色反应出未处理试样的孔的565nm吸光度
[0109]
st：发色反应出处理试样的孔的565nm吸光度
[0110]
数学式4
[0111]
基于紫外线的细胞毒性缓解率(％)＝〔1－(st－bo)/(bt－bo)〕
×
100
[0112]
bo：未照射紫外线且未处理试样的孔的细胞生存率
[0113]
bt：照射紫外线且未处理试样的孔的细胞生存率
[0114]
st：照射紫外线且处理试样的孔的细胞生存率
[0115]
计算结果如下表8所示。
[0116]
表8
[0117][0118][0119]
如表8所示，通过实验结果可知，复合透明质酸在0.02％的浓度下缓解30.6％的基于紫外线的细胞毒性，从而有效防御基于紫外线的细胞毒性。
[0120]
即，通过上述实验可知，在低浓度下有效防御基于紫外线的细胞损伤。
[0121]
实验例9：基于紫外线照射的炎症性细胞因子表达的抑制效果
[0122]
在本实验例中，为了评价从实施例1获得的复合透明质酸对基于紫外线照射的炎症性细胞因子的表达的抑制效果，在24孔试验板中，分别放入5
×
10
4
个从人表皮组织分离的成纤维细胞(fibroblast)并附着24小时。使用磷酸缓冲盐溶液洗涤一次，并向各孔加入500μl的磷酸缓冲盐溶液。使用紫外线b(uvb)灯(型号：f15t8，uvb 15w，sankyo dennki公司，日本)以10mj/cm
2
的强度照射上述成纤维细胞后，去除磷酸缓冲盐溶液，加入350μl的细胞培养基(dmem中加入10％的牛胎血清)。处理待评价的复合透明质酸后，培养5小时。取150μl的培养上层液以定量白介素1α(il-1α)，以判断复合透明质酸的炎症性细胞因子表达抑制效果。使用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay)对白介素1α的量进行定量化，白介素1α的生成率由数学式5计算得出。
[0123]
数学式5
[0124]
炎症性细胞因子表达抑制率(％)＝〔1－(st－bo)/(bt/bo)〕
×
100
[0125]
bo：未照射紫外线且未处理试样的孔的白介素1α的生成量
[0126]
bt：照射紫外线且未处理试样的孔的白介素1α的生成量
[0127]
st：照射紫外线且处理试样的孔的白介素1α的生成量
[0128]
根据上述数学式5的实验结果如下表9所示。
[0129]
表9
[0130][0131]
如表9所示，可知，复合透明质酸在0.02％的浓度下抑制27％的基于紫外线的炎症性细胞因子白介素1α的生成，从而在低的浓度下有效防御基于紫外线的炎症的产生。
[0132]
实验例10：基于紫外线的前列腺素生物合成抑制效果
[0133]
在本实验例中，为了评价从实施例1获得的复合透明质酸的前列腺素生物合成抑制效果，在24孔试验板中，分别放入5
×
10
4
个从人表皮组织分离的角化细胞(keratinocyte)并附着24小时。用不含磷酸缓冲盐溶液的培养基替换，并培养18小时后，处理乙酰水杨酸(aspirin)以使上述角化细胞的最终浓度达到50um，并去除存在于角化细胞中的前列腺生物合成酶(前列腺素e
2
合成酶(prostaglandin e
2 synthetase)，或环氧化酶(cyclooxygenase)，以下称之为cox)的活性。处理乙酰水杨酸2小时后，用磷酸缓冲盐溶液洗涤各个含有角化细胞的孔两次，并在各孔中加入100μl的磷酸缓冲盐溶液。使用紫外线b(uvb)灯(型号：f15t8，uvb 15w，sankyo dennki公司，日本)以30mj/cm
2
的强度照射上述角化细胞后，去除磷酸缓冲盐溶液，并在各孔中添加250μl的角化细胞培养液(keratinocyte growth media，clonetics，biowhittacker公司，马里兰州，美国)。处理待评价的复合透明质酸后，培养16小时。取适量培养的上层液以定量生物合成的前列腺素e
2
(pge
2
，prostaglandin e
2
)16小时，以判断复合透明质酸的前列腺素抑制效果。使用酶免疫分析法(enzyme immunoassay)定量前列腺素e
2
，实验结果示于表10。
[0134]
表10
[0135][0136]
如上表10所示，可知，复合透明质酸能够有效抑制基于紫外线的前列腺素的生成。尤其，已知前列腺素e
2
主要由cox-2酶生成，因此通过上述实验可知复合透明质酸能够抑制cox-2酶的诱导作用或活性。
[0137]
实验例11：复合透明质酸的5α-还原酶活性的抑制能力评价实验
[0138]
在5α-还原酶活性抑制能力实验中使用的5α-还原酶为生成由包皮衍生的成纤维细胞的酶。
[0139]
将成纤维细胞接种并培养，以使每个微板孔(microplate hole)有1
×
10
4
个细胞。在各孔中添加用
3
h(氚)放射线标记(radio labelling)的0.1.mμ.ci的睾酮后，进行培养，以测定成纤维细胞是否使用了它。将未加入复合透明质酸的组用作对照组。培养24小时后，获得上层液，用1ml的乙酸乙酯(ethyl acetate)-环己烷(cyclohexane)(1：1)的提取溶剂获得类固醇(steroids)。将获得的类固醇放置在薄膜色谱分析板上，并用氯仿/甲醇混合液(98/2(v/v))显影。使用密度计测定对应于睾酮和双氢睾酮的点的放射活性以计算转化率，并将其结果与对照组(未添加提取物时的转化率)进行比较，通过以下数学式6评价5α-还原酶抑制率。
[0140]
数学式6
[0141]
抑制率评价方法
[0142]
抑制率(％)＝[a－b]/[a]
×
100
[0143]
a＝由睾酮到双氢睾酮的转化率(未添加提取物时)
[0144]
b＝由睾酮到双氢睾酮的转化率(添加提取物时)
[0145]
将通过上述数学式6计算的结果示于表下11。
[0146]
表11
[0147]
实施例1的浓度(％)0.020.010.005抑制率(％)32.514.79.1
[0148]
观察表11，可知复合透明质酸具有5α-还原酶抑制效果。
[0149]
实验例12：基于复合物(compound)48/80的诱导特异反应性皮炎后复合透明质酸的抗炎症实验
[0150]
向每只白变种实验室小鼠(balb/c)(5周龄，雄性)的后颈部皮肤的真皮内注射30μl的复合物(compound)48/80(西格玛公司，1mg/ml in saline)后，放入笼中，观察小鼠抓挠后颈部的行为60分钟。为了检测复合透明质酸的抗炎治疗效果，在注射复合物48/80五天前开始以250μl/ml浓度对每只小鼠后颈部涂敷了100μl的复合透明质酸。涂敷方法如下：在小鼠后颈部涂敷5天，每日两次，总计10次，以进行预处理后，注射复合物(compound)48/80后，每隔5分钟测定小鼠抓挠后颈部的时间总计1小时，以测定瘙痒程度。
[0151]
将于实验结果示于表12。
[0152]
表12
[0153][0154]
如上述表12所示，在使用复合透明质酸的情况下，显示出抑制基于复合物(compound)48/80的诱发特异反应性皮炎(皮肤瘙痒症)的效果。
[0155]
实验例13：水分吸湿性实验
[0156]
为了实验复合透明质酸的水分吸湿性，将实施例1的复合透明质酸和蒸馏水分别饱和吸收到直接从人采取的或商业购买的人的干燥表皮细胞并测定吸收的水的量后，测定干燥48小时后的质量变化。从各个测定的质量的变化来对每个皮肤细胞单位质量吸收的水的量进行比较。这种实验作为对被表皮细胞吸收的水的量进行比较的方法，并对实际人的皮肤也用作可预测其保湿效果的一种方法。
[0157]
具体地，在干燥人的表皮细胞以使每单位质量的包含的水分的量恒定之后，使用凯撒法(kaiser method)测定各个表皮细胞试样的重量和所含的水的量。将测定了水的含量的表皮细胞分别浸泡在复合透明质酸(a)、纯净水(b)24小时并饱和及吸收后，取出细胞内饱和吸收水的表皮细胞并称重，取一部分并用kaiser水分测定仪来测定每单位质量所含水分的量。之后，再进行48小时的减压干燥，称重后，取一部分并用凯撒法(kaiser method)来测定水分的量，以测定每单位质量所含水分的量。
[0158]
实验结果，将于对于表皮细胞的水分供给能力(水分mg/表皮细胞质量g)示于表13。
[0159]
表13
[0160][0161]
如上表13所示，可以确认，使用复合透明质酸进行饱和吸湿的表皮细胞在由纯净水饱和吸湿的表皮细胞的再干燥过程中包含比纯净水更多的水，据此可以确认复合透明质酸的优异的皮肤吸湿性。由此可知，复合透明质酸显示出优异的保湿效果。
[0162]
实验例14：复合透明质酸与人类毛发蛋白结合效果
[0163]
向50μg的人类毛发角质蛋白分别加入0.02重量百分比、0.01重量百分比、0.005重量百分比的试验实验浓度的复合透明质酸，在常温下反应30分钟后，用6％的过氧化氢与0.5％的氨的1：1混合溶液处理并反应30分钟。根据laemmli方法，在10％的sds-聚丙烯酰胺凝胶中电泳反应液，将凝胶中的角质蛋白在0.1％的考马斯亮蓝((coomassie brilliant blue r 250)、10％的冰醋酸以及40％的乙醇的混合溶液中染色1小时，然后在10％的冰醋酸以及40％的乙醇的混合溶液中脱色并确认了角质蛋白的条带。用imagemaster软件(imagemaster software，amersham pharmacia biotech.)，将仅电泳50μg的人毛发角质蛋白时表现出的角质蛋白条带作为100％，将未处理复合透明质酸的组作为对照组进行比较，以百分比将角质蛋白结合效果示于下表14。
[0164]
表14
[0165][0166]
如上述表14所示，可知随着复合透明质酸含量的增加，与毛发角质蛋白的结合能力也增加。
[0167]
实验例15：复合透明质酸对基于碱和过氧化氢处理的角质蛋白溶出的保护效果
[0168]
3g的毛发添加到10ml的过氧化氢(6％)和氨(1.68％)的1：1的混合溶液中，并分别以0.02重量百分比、0.01重量百分比、0.005重量百分比的实验浓度加入复合透明质酸后，在常温下处理30分钟。用蛋白质快速浓缩试剂盒(rapid-con protein concentration kit)(elpis biotech.)浓缩0.5ml的反应液，根据laemmli方法，在10％的sds-聚丙烯酰胺凝胶中电泳浓缩液，之后将凝胶中的角质蛋白在0.1％的考马斯亮蓝(coomassie brilliant blue r 250)、10％的冰醋酸以及40％的乙醇的混合溶液中染色1小时，然后在10％的冰醋酸以及40％的乙醇的混合溶液脱色并确认角质蛋白的条带。用imagemaster软件(amersham pharmacia biotech.)，将仅电泳50μg的人毛发角质蛋白时表现出的角质蛋
白条带作为100％，将未处理复合透明质酸的组作为对照组进行比较，以百分比将角质蛋白结合效果示于下表15。
[0169]
表15
[0170][0171]
如上述表15所示，可知随着复合透明质酸含量的增加，从毛发溶出的角质蛋白含量减少。
[0172]
实验例16：复合透明质酸对基于碱和过氧化氢处理的毛发拉伸强度和伸长率的效果
[0173]
将3g的毛发放入10ml的过氧化氢(6％)和氨(1.68％)的1：1的混合溶液中，各以0.02重量百分比、0.01重量百分比.0.005重量百分比的实验浓度加入复合透明质酸后，在常温下进行30分钟的处理。用水洗涤进行通风干燥后，使用autograph试验仪测定其拉伸强度(gf)以及伸长率(％)。下表16列出了经处理的毛发的拉伸强度及伸长率。
[0174]
表16
[0175]
实施例1纯净水0.02％0.01％0.005％拉伸强度(gf)113121116113伸长率(％)4549.147.744.5
[0176]
如上述表16所示，可以看出，在处理脱色剂30分钟的情况下，随着复合透明质酸添加量的增加，毛发强度的下降得到抑制。由此，在实施脱色剂处理的情况下，可以期待基于复合透明质酸的毛发保护效果。
[0177]
实验例17：实施例2的制备及皮肤弹性改善效果和皱纹改善效果的比较实验。
[0178]
实施例2是由包含从实施例1获得的复合透明质酸的化妆品制备而成，以人作为对象，与比较例1进行皮肤弹性改善效果及皱纹改善效果的比较实验，并进行评价。
[0179]
在比较实验中使用的化妆品为乳霜形式，其组成如表17所示。首先，对表17的乙)相加热并在70℃的温度下保存。将甲)相加入其中，进行预备乳化后，使用均质搅拌机均匀的乳化后，逐渐冷却以制备乳霜(实施例2、比较例1)。将20名实验者(20岁至35岁女性)作为实验对象，在面部右侧部位每天涂敷两次实施例2中制备的乳霜，并在面部左侧部位每天涂敷两次比较例1中制备的乳霜，持续两个月。
[0180]
表17
[0181]
[0182][0183]
(单位：重量百分比)
[0184]
实验结束后，用皮肤弹性测定仪(cutometer sem 575，c+kelectronic co.，德国)进行测定，以确认使用产品前和使用两个月后的皮肤弹性改善效果，实验结果在下表18中以cutometer sem 575的
△
r7值描述，
△
r7值表示皮肤的粘弹性(viscoelasticity)的性质。
[0185]
表18
[0186]
实验产品皮肤弹性效果(
△
r7)备注实施例20.36 比较例10.12 [0187]
n＝20，p＜0.05
[0188]
如表18所示，可知，涂敷包含复合透明质酸的乳霜的实验者的皮肤弹性改善效果优异。
[0189]
进一步地，将20名实验者(20岁至35岁女性)作为实验对象，在面部右侧部位每天涂敷两次实施例2中制备的乳霜，并在面部左侧部位每天涂敷两次比较例1中制备的乳霜，持续两个月。
[0190]
实验结束后，制作硅材质的复制板(replica)，用作为画像分析仪的能见度仪(visiometer：sv60，c+k electronic co.，德国)测定指定部位的皱纹状态，以确认使用产品前和使用两个月后的皱纹改善效果。
[0191]
其结果如下表19所示，上述结果为从使用两个月后的各个参数(parameter)值中
减去两个前的各参数值后的平均值。即，上述值越是出现负值，就越说明皱纹改善效果高。
[0192]
表19
[0193][0194]
如上述表19所示，可以确认，包含复合透明质酸的实施例2的皮肤皱纹改善效果大大增强。
[0195]
实验例18：实施例3的制备及特异反应性皮炎改善效果的比较实验
[0196]
实施例3是由包含从实施例1获得的复合透明质酸的化妆品制备而成，以人作为对象，与比较例2进行特异反应性皮炎改善效果的比较实验，并进行评价。
[0197]
在比较实验中使用的化妆品为乳霜形式，其组成如表20所示。首先，对表20的乙)相加热并在70℃的温度下保存。将甲)加入其中，进行预备乳化后，使用均质搅拌机均匀的乳化后，逐渐冷却以制备乳霜(实施例3、比较例2)。
[0198]
表20
[0199][0200][0201]
为了确认过敏性皮肤的改善效果，进行如下的临床实验。在5岁至30岁的过敏性患者中，对30名患有两年以上特异反应性皮炎的患者调查特异反应性皮炎的改善效果。对同一个人的左手涂敷实施例3的乳霜、右手涂敷比较例2的乳霜，每晚洗净后，每天涂敷一次，持续60天，并测定特异反应性皮炎状态的改善程度。测定是通过基于问卷调查的感官评价来实施。并将其结果示于表21。
[0202]
表21
[0203] 非常好好没有好转实施例370％(21名)30％(9名)-比较例210％(3名)20％(6名)70％(21名)
[0204]
如上述表21所示，可知，通过添加复合透明质酸制备的实施例3的乳霜具有优于不添加复合透明质酸的比较剂型例的化妆品的过敏性皮肤改善效果。
[0205]
实验例19：基于月桂基硫酸钠(sls)的皮肤刺激缓解效果实验
[0206]
在本实验例中，通过人体斑贴实验来评价包含从实施例1获得的复合透明质酸的
化妆品的刺激缓解效果。
[0207]
将一般化妆品处方(乳霜、乳液、护肤水、精油)与引起刺激的1％的月桂基硫酸钠(sls，sodium lauryl sulfate)和实施例3中制备的产品混用，并贴附24小时、48小时、72小时，基于刺激诱发指数，评价了刺激缓解效果。
[0208]
用芬兰斑试器(芬兰)在50名20岁至50岁的健康男性及女性上臂部位贴附0.3mg的各个产品，24小时后评价急性刺激指数。在评价后，再次对同一部位贴附相同量的产品，并评价48小时、72小时后的延迟性刺激指数。
[0209]
试验结果示出，单独贴附月桂基硫酸钠的部分从24小时后开始在皮肤上呈现红色的刺激，而贴附包含复合透明质酸的产品24小时、48小时、72小时后，也没有发生任何皮肤发作。
[0210]
该评价结果表明，当复合透明质酸与化妆品混用时，具有可以减少能够诱发刺激的基材(表面活性剂、香料、酒精)导致的皮肤刺激的显著效果。
[0211]
以下，示出其他实施例。即，在实施例4至实施例6中制备包含从实施例1获得的复合透明质酸的化妆水、乳液及美容液。这些包含复合透明质酸的化妆水、乳液及美容液显出抗氧化效果、胶原蛋白合成促进效果、皮肤细纹改善效果、保湿效果、缓解皮肤刺激的效果、预防痤疮的效果、过敏性的改善效果及抗炎效果、防止毛发损伤的效果、预防脱发以及育发效果等的优异的皮肤改善效果。
[0212]
实施例4：包含从实施例1获得的复合透明质酸的化妆水的制备
[0213]
在8g的95％乙醇中，混合溶解0.05g的聚吡咯烷酮、0.1g的油醇、0.2g的聚氧乙烯单油酸酯、0.2g的香料、0.1g的对羟基苯甲酸甲酯、少量的抗氧化剂、少量的色素。将从实施例1获得的0.05g的复合透明质酸、0.5g的丙三醇溶解在85.33g的纯净水中，并将上述混合液加入其中后，进行搅拌以获得具有皮肤改善效果的化妆水。
[0214]
实施例5：包含从实施例1获得的复合透明质酸的乳液的制备
[0215]
在70℃的温度下，加热溶解1.2g的鲸蜡醇、10g的角鲨烷、2g的凡士林、0.2g的对氧苯甲酸乙酯、1g的硬酯酸单甘油酯、1g的聚氧乙烯(25摩尔加成)单油酸酯以及0.1g香料，将从实施例1获得的0.5g的复合透明质酸、5g的二丙二醇、2g的聚乙二醇-1500、0.2g的三乙醇胺、76.2g的纯净水加热到75℃以使其溶解。将两种混合物混合并乳化后，进行冷却，获得水中油(o/w)型的具有皮肤改善效果乳液。
[0216]
实施例6：包含从实施例1获得的复合透明质酸的美容液的制备
[0217]
将5g的95％乙醇与1.2g的聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯、0.3g的壳多糖纤维素(chitulose)、0.2g的透明质酸钠、0.2g的醋酸维生素e、0.2g的甘草酸钠、0.1g的对氧苯甲酸乙酯、从实施例1获得的1g的复合透明质酸及适量的色素混合，以获得具有皮肤改善效果的美容液。
[0218]
实验例20：实施例7的制备及驱蚊效果的实验
[0219]
在8g的95％乙醇中，混合溶解0.05g的聚吡咯烷酮、0.1g的油醇、0.2g的聚氧乙烯单油酸酯、0.2g的香料、0.1g的对羟基苯甲酸甲酯、少量的防氧化剂、少量的色素。将从实施例1获得的0.05g的复合透明质酸、0.03g的粉红紫芒发酵液、0.5g的丙三醇溶解在85.33g的纯净水中，并将上述混合液加入其中后，进行搅拌以获得具有驱蚊效果的化妆水。
[0220]
粉红紫芒为被称为粉红芒草、西洋紫芒等的禾本科植物，学名为粉黛乱子草
(muhlenbergia capillaris)。
[0221]
已知粉红紫芒原产于美国西部或中部的温暖平原地带，在韩国的济州岛、庆州等地作为景观广为种植。
[0222]
目前为止尚无使用粉红紫芒作为化妆水原料的事例的报告。
[0223]
粉红紫芒发酵液如下：在获取粉红紫芒的叶后，以1：1：2的比率混合粉红紫芒的叶、盐、食用醋后，发酵15天，获得仅分离固体的上清液。
[0224]
同时，使用上述实施例4和实施例7的化妆水来进行驱蚊效果的实验。
[0225]
在自发参与实验的健康成年男性手指与肘之间均匀涂敷实施例4和实施例7的试样后，自然干燥2分钟。
[0226]
将实验者们经处理试样的手臂和未涂敷任何物质的实验者的手臂同时放入套有网的50
×
50
×
50cm
3
的生物测定笼中，在上述生物测定笼中装有100只雌性淡色库蚊，每隔30分钟记录3分钟内从手臂吸血的蚊子的数量。将其结果示于表22。
[0227]
表22
[0228][0229]
如上述表22所示，涂敷有根据实施例7的化妆水的实验者的手臂总体上显出卓越的驱蚊效果。