本发明涉及材料和生物成像领域，具体涉及一种可同时用作光热治疗剂和光声成像造影剂的有机纳米肿瘤光热剂及其制法和应用。
背景技术：
据世界卫生组织报道，癌症是全球的第二大死因，近1/6的死亡由癌症造成。我国的癌症人口占世界总癌症人口的两成以上，癌症新发病率占全球的四成左右，发病率和死亡率居全球第一。传统的三大癌症治疗手段为手术、放射治疗和化学药物治疗。然而这些治疗方法都有很大的局限性，例如：手术需要准确定位肿瘤的位置，化疗和放疗在杀灭癌细胞的同时还会损害人体正常细胞。因此，亟须开发更加高效的肿瘤治疗方法。
光热疗法(ptt)是近年来备受关注的一种癌症非侵入治疗手段。光热疗法是利用光热剂可以将光的能量转化为热的特性杀灭肿瘤细胞，具有较好的精确性、可控性、高效性以及对正常组织的低毒副作用。已有多种光热材料被研究用于肿瘤光热治疗，尤其是无机纳米材料，例如：贵金属纳米结构、过渡金属硫化物、碳纳米管、石墨烯等等。然而，大多数无机材料的生物相容性差且具有长期毒性，限制了其在肿瘤治疗领域的应用。有机小分子染料具有良好的生物相容性和易于代谢的优势，比如吲哚菁绿(icg)已经得到了临床应用，但由于其光稳定性差的缺陷，进一步应用受到了限制。因此，需要研发一种具有高光热转换效率、高稳定性、良好生物相容性的纳米光热剂。光声成像(pai)与光热治疗有着相似的引发条件，是一种非侵入式的新型生物成像技术，聚集在肿瘤处的光热剂在激光激发下产生光声信号达到生物成像的目的。光声成像同时结合了光学成像高灵敏度和超声成像高空间分辨率的优势，有着良好的应用前景。因此，研发同时具有良好光热和光声性质的材料至关重要。
技术实现要素：
具有d-π-a结构的有机发色团分子可以通过调整电子给体和电子受体延伸吸收峰到近红外区域，同时由于分子间强的相互作用导致其荧光强度很弱从而产生很强的光热效应。然而，其应用在活体肿瘤治疗领域还面临着水溶性和靶向性的问题。纳米沉淀法构建纳米颗粒可以有效地解决上述问题，在疏水作用下，两亲性聚合物将有机发色团分子包覆成溶于水的球状纳米颗粒，同时纳米颗粒可以通过增强滞留和渗透(epr)效应聚集在肿瘤处实现肿瘤靶向。
本发明的目的之一是提供一种可同时用作光热治疗剂和光声成像造影剂的有机纳米肿瘤光热剂，其以d-π-a结构的有机发色团为内核，并在所述内核外包裹有一层两亲性分子。
本发明的目的之二是提供上述有机纳米肿瘤光热剂的制备方法，其通过纳米沉淀法将两亲性聚合物包覆上述有机发色团得到吸收波长接近红外区的纳米颗粒。
本发明的目的之三是提供上述有机纳米肿瘤光热剂在肿瘤光热治疗领域中的应用。该有机纳米肿瘤光热剂作为纳米肿瘤光热治疗剂，解决了现有肿瘤光热治疗剂生物相容性差、水溶性差、稳定性差的缺陷，可以有效的杀死肿瘤细胞，同时减少对正常细胞的毒副作用，具有优异的肿瘤光热治疗效果，应用于光声成像介导的肿瘤光热治疗具有良好的前景。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种有机纳米肿瘤光热剂，其以d-π-a结构的有机发色团为内核，并在所述内核外包裹有一层两亲性分子；所述有机发色团以n,n-二丁基苯胺衍生物为电子给体，以三氰基二氢呋喃衍生物作为电子受体，以噻吩为π电子桥，具体结构式为：
其中，所述x选自氢或or1，所述r1选自烷基、苄基、硅烷基或酰基；
所述r2选自甲基或三氟甲基；
所述r3选自甲基、苯基、噻吩基或羟烷基，所述苯基或噻吩基中的一个或多个氢可任选地被苯基取代。
优选的，上述有机纳米肿瘤光热剂中，所述烷基为c1-c10的烷基；所述硅烷基选自三甲基硅烷基、二甲基叔丁基硅烷基或二甲基苯基硅烷基；所述酰基选自c1-c10的脂肪族酰基或苯甲酰基。
本发明还提供一种上述有机纳米肿瘤光热剂的制备方法，包括以下步骤：
将所述有机发色团与两亲性聚合物溶解于有机溶剂中，形成有机相，然后将有机相注入处于超声状态的水相中，除去有机溶剂。
优选的，上述制备方法中，所述两亲性聚合物选自单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸共聚物、peg-pla嵌段共聚物或dspe-peg中的一种或几种，优选的，所述单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸共聚物中乙二醇重复单元和乳酸羟基乙酸重复单元的聚合度均为500-2000。
优选的，上述制备方法中，所述有机发色团与两亲性聚合物的质量比为1:(5-15)，优选的，所述有机发色团与有机溶剂的质量体积比为1-3mg/ml。
优选的，上述制备方法中，将有机相注入处于超声状态的水相后，继续超声1-3min。
优选的，上述制备方法中，所述有机相与水相的体积比为1:(5-10)。
优选的，上述制备方法中，所述除去有机溶剂后，还包括过滤和透析，优选的，所述过滤用滤膜为孔径为200-220nm的水系滤膜。
优选的，上述制备方法中，所述透析用透析袋为3000截留分子量的透析袋，透析液为去离子水，每隔1-2h更换一次透析液，持续透析24-48h。
本发明还提供上述有机纳米肿瘤光热剂在肿瘤光热治疗领域中的应用，优选为在光声成像介导的肿瘤光热治疗领域中的应用。
本发明所取得的有益效果：
(1)本发明制备有机纳米肿瘤光热剂的方法简单易行；
(2)本发明的有机纳米肿瘤光热剂具有良好的水溶性、生物相容性、光热转换效率以及光热稳定性；
(3)本发明的有机纳米肿瘤光热剂作为肿瘤光热治疗剂，可以有效的杀死肿瘤细胞，同时减少对正常细胞的毒副作用，具有优异的肿瘤光热治疗效果，应用于光声成像介导的肿瘤光热治疗具有良好的前景。
附图说明
图1是实施例1中有机发色团ftc的质谱图。
图2是实施例1制备得到的有机纳米肿瘤光热剂ftc-nps的透射电子显微镜图。
图3是实施例1制备得到的有机纳米肿瘤光热剂ftc-nps的紫外可见光吸收光谱。
图4是实施例1制备得到的有机纳米肿瘤光热剂ftc-nps在不同溶液环境中的粒径稳定性。
图5是实施例1制备得到的有机纳米肿瘤光热剂ftc-nps在波长为635nm的激光照射下的升温曲线，其中ftc-nps的浓度固定为0.2毫克/毫升，使用不同功率的激光激发。
图6是实施例1制备得到的有机纳米肿瘤光热剂ftc-nps在波长为635nm的激光照射下的升温曲线，其中激光功率固定为0.8w，使用不同浓度的ftc-nps的水溶液以及纯水进行测试。
图7是实施例1制备得到的有机纳米肿瘤光热剂ftc-nps用于肿瘤细胞实验的光毒性和暗毒性效果。
图8是实施例1制备得到的有机纳米肿瘤光热剂ftc-nps的光声成像信号图。
图9是实施例1制备得到的有机纳米肿瘤光热剂ftc-nps用于活体肿瘤治疗后4组裸鼠的体重变化图。
图10是实施例1制备得到的有机纳米肿瘤光热剂ftc-nps用于活体肿瘤治疗后4组裸鼠的尺寸变化图。
图11是实施例2中有机发色团ftc-3f的质谱图。
图12是实施例2制备得到的有机纳米肿瘤光热剂ftc-3fnps的透射电子显微镜图。
图13是实施例2制备得到的有机纳米肿瘤光热剂ftc-3fnps的紫外可见光吸收光谱。
图14是实施例2制备得到的有机纳米肿瘤光热剂ftc-3fnps在不同溶液环境中的粒径稳定性。
图15是实施例2制备得到的有机纳米肿瘤光热剂ftc-3fnps在波长为721nm的激光照射下的升温曲线，其中ftc-3fnps的浓度固定为0.2毫克/毫升，使用不同功率的激光激发。
图16是实施例2制备得到的有机纳米肿瘤光热剂ftc-3fnps在波长为721nm的激光照射下的升温曲线，其中激光功率固定为1w，使用不同浓度的ftc-nps的水溶液以及纯水进行测试。
图17是实施例2制备得到的有机纳米肿瘤光热剂ftc-3fnps用于肿瘤细胞实验的光毒性和暗毒性效果。
图18是实施例2制备得到的有机纳米肿瘤光热剂ftc-3fnps的光声成像信号图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供了一种有机纳米肿瘤光热剂，其内核为具有d-π-a结构的有机发色团2-(3-氰基-4-((e)-2-(5-((e)-4-(二丁基氨基)苯乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-5,5-二甲基呋喃-2(5h)-亚丙基)丙二腈(即ftc，来源于中国科学院理化技术研究所，质谱如图1所示，(esi)m/z：522.1[m+h]+)，结构式如下：
以有机发色团ftc为核心构建有机纳米肿瘤光热剂：
1)分别称取1mg步骤1的有机发色团和15mg单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸共聚物(乙二醇和乳酸羟基乙酸的聚合度均为500)，共同溶解在0.5ml丙酮中；
2)取10ml去离子水，置于40khz频率的超声处理状态下，将上述丙酮溶液用注射器匀速注射到上述去离子水中后，继续超声3min；
3)取出上述混合后的溶液，减压蒸馏去除溶液中的丙酮，然后使用孔径为220纳米的水系滤膜过滤上述混合溶液，将滤液进一步使用3000分子量的透析袋透析处理，使用去离子水作为透析液，每隔2h更换一次透析液，连续透析36h，得到分散在水溶液中的有机纳米肿瘤光热剂颗粒ftc-nps。
图2是实施例1制备得到的有机纳米肿瘤光热剂ftc-nps的透射电子显微镜图，由图可知，有机纳米肿瘤光热剂ftc-nps的平均粒径约为50nm，其尺寸适合作为纳米肿瘤光热治疗剂。
图3是实施例1制备得到的有机纳米肿瘤光热剂ftc-nps水溶液的紫外可见光吸收光谱，由图可知，ftc-nps在550-750nm有着很宽的吸收峰。
图4是实施例1制备得到的有机纳米肿瘤光热剂ftc-nps分散在不同的溶液环境(水、pbs溶液、dmem溶液)下7天的粒径稳定性(激光粒度仪)，由图可知，7天内ftc-nps在三种溶液环境下都表现出了良好的尺寸稳定性。
试验例1测定ftc-nps的光热转换效率
取1ml不同浓度的ftc-nps的水溶液置于石英比色皿中，将热电偶温度记录仪的探头插入上述水溶液中记录实时的温度变化。使用波长为635nm的激光器作为激发光源以不同的功率持续照射上述水溶液10分钟，记录温度变化数据并绘制温度变化曲线。
图5是浓度为0.2毫克/毫升的ftc-nps的水溶液在不同功率的激光激发下10分钟的温度变化曲线，由图可知，ftc-nps的水溶液受激光照射10分钟时温度在55℃以上；图6是不同浓度的ftc-nps的水溶液(以及纯水)在0.8w功率的激光激发下10分钟的温度变化曲线，由图可知，相比纯水，ftc-nps的升温速度更快且升温速度与浓度正相关。由图5、图6可见，ftc-nps在激光激发下的升温幅度与ftc-nps的浓度、激光的功率有关，且ftc-nps的水溶液可以在较低的浓度和激光功率下实现较大的升温幅度，可以满足光热杀灭肿瘤细胞的需要。
试验例2ftc-nps的肿瘤细胞光热治疗实验
选取hela细胞进行细胞实验测试ftc-nps的暗毒性和光毒性。具体实验步骤如下：hela细胞接种在96孔培养板上，使用dmem溶液作为培养液，37℃下培养24h使其贴壁生长。将实施例1制备得到的ftc-nps分散在dmem溶液中，移除上述96孔板中的旧培养液，用pbs溶液清洗数次后，加入200ml上述ftc-nps的dmem溶液，然后放入培养箱孵育6小时。然后将含有ftc-nps的培养液移除，加入新鲜培养液，一组不做光照处理；另一组使用波长为635nm的激光器以1w的功率照射10分钟。两组细胞继续孵育24h，然后用mtt比色法测定细胞活性。96孔板每孔添加20微升mtt溶液(5ml/mg)孵育4小时，移除培养液后，加入150微升dmso溶解孔内的晶体，然后使用酶标仪测定吸收峰为570nm的吸收值。
图7是将不同浓度的分散有ftc-nps的dmem溶液用于细胞光热治疗实验的暗毒性和光毒性效果。由图可知，ftc-nps在激光激发下可以有效地杀死肿瘤细胞，同时在黑暗状态下毒性不明显。随着ftc-nps浓度的增加，光毒性组和暗毒性组的细胞存活率(即细胞活性)都有下降，在0.05ml/mg的浓度下，细胞在激光照射后存活率低于50％。
试验例3ftc-nps的体外光声成像实验
将不同浓度的ftc-nps水溶液置于核磁管中，插入琼脂糖假体，然后用小动物光声成像仪进行测试。
图8是将ftc-nps用于体外光声成像的光声信号强度与ftc-nps浓度的关系，由图可知，光声信号随着浓度的增加呈现线性增长。
试验例4ftc-nps的活体肿瘤光热治疗实验
选取4周大的品系为balb/c的雌性裸鼠作为活体模型，在裸鼠后腿部注射hela细胞形成肿瘤。当肿瘤体积为40-100mm3时可以使用。将裸鼠随机分为4组(每组5只)，第一组和第二组尾静脉注射100微升pbs溶液，第三组和第四组注射100微升浓度为500微克/毫升的ftc-nps的pbs溶液。6h后，第二组和第四组使用激光器(635nm，1w/cm2)辐射10min，第一组和第三组不进行激光辐射。治疗实验完成后，每隔两天测量一次裸鼠的肿瘤尺寸和体重，持续14天。
图9是4组裸鼠的体重变化图，由图可知，第四组的小鼠体重随时间增加而增加，而其他三组小鼠的体重继续随时间增加而减少。图10是4组裸鼠的尺寸变化图，由图可知，第四组在治疗后肿瘤基本消除，而其他三组肿瘤随时间增加而变大。
实施例2
本实施例提供了一种有机纳米肿瘤光热剂，其内核为具有d-π-a结构的有机发色团2-(3-氰基-4-((e)-2-(5-((e)-4-(二丁基氨基)苯乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-5-(5-苯基噻吩-2-基)-5-(三氟甲基)呋喃-2(5h)-亚烷基)丙二腈(即ftc-3f，来源于中国科学院理化技术研究所，质谱如图11所示，(esi)m/z：720.22[m+h]+)，结构式如下：
以有机发色团ftc-3f为核心构建有机纳米肿瘤光热剂：
1)分别称取1mg步骤1的有机发色团和15mg单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸共聚物(乙二醇和乳酸羟基乙酸的聚合度均为1000)，共同溶解在0.5ml丙酮中；
2)取10ml去离子水，置于40khz频率的超声处理状态下，将上述丙酮溶液用注射器匀速注射到上述去离子水中后，继续超声3min；
3)取出上述混合后的溶液，减压蒸馏去除溶液中的丙酮，然后使用孔径为220纳米的水系滤膜过滤上述混合溶液，将滤液进一步使用3000分子量的透析袋透析处理，使用去离子水作为透析液，每隔2h更换一次透析液，连续透析36h，得到分散在水溶液中的有机纳米肿瘤光热剂颗粒ftc-3fnps。
图12是实施例2制备得到的有机纳米肿瘤光热剂ftc-3fnps的透射电子显微镜图，由图可知，ftc-3fnps是较为均一的球状纳米颗粒，粒径在200nm以内。
图13是实施例2制备得到的有机纳米肿瘤光热剂ftc-3fnps水溶液的紫外可见光吸收光谱，由图可知，与实施例1相比，ftc-3fnps水溶液的吸收峰值在720nm附近，已经达到了近红外区域。处于近红外区域的光可以更有效地穿透组织和皮肤，有效地降低生物体内自发荧光的干扰，大大减少光受组织的吸收和散射，即所谓的“生物窗口”。
图14是实施例2制备得到的有机纳米肿瘤光热剂ftc-3fnps分散在不同的溶液环境(水、pbs溶液、dmem溶液)下7天的粒径稳定性(激光粒度仪)，由图可知，7天内ftc-3fnps在三种溶液环境下都表现出了良好的尺寸稳定性。
试验例5测定ftc-3fnps的光热转换效率
取1ml不同浓度的ftc-3fnps的水溶液置于石英比色皿中，将热电偶温度记录仪的探头插入上述水溶液中记录实时的温度变化。使用波长为721nm的激光器作为激发光源以不同的功率持续照射上述水溶液10分钟，记录温度变化数据并绘制温度变化曲线。
图15是浓度为0.2毫克/毫升的ftc-3fnps的水溶液在不同功率的激光激发下10分钟的温度变化曲线；图16是不同浓度的ftc-3fnps的水溶液(以及纯水)在1w功率的激光激发下10分钟的温度变化曲线，由图可知，相比纯水，ftc-3fnps的升温速度更快且升温速度与浓度正相关。由图15、图16可见，ftc-3fnps在激光激发下的升温幅度与ftc-3fnps的浓度、激光的功率有关，且ftc-3fnps的水溶液可以在较低的浓度和激光功率下实现较大的升温幅度，可以满足光热杀灭肿瘤细胞的需要。
试验例6ftc-3fnps的肿瘤细胞光热治疗实验
选取hela细胞进行细胞实验测试ftc-3fnps的暗毒性和光毒性。具体实验步骤如下：hela细胞接种在96孔培养板上，使用dmem溶液作为培养液，37℃下培养24h使其贴壁生长。将实施例2制备得到的不同浓度的ftc-3fnps分散在dmem溶液中，移除上述96孔板中的旧培养液，用pbs溶液清洗数次后，加入200ml上述ftc-3fnps的dmem溶液，然后放入培养箱孵育6小时。然后将含有ftc-3fnps的培养液移除，加入新鲜培养液，一组不做光照处理；另一组使用波长为721nm的激光器以1w的功率照射10分钟。两组细胞继续孵育24h，然后用mtt比色法测定细胞活性。96孔板每孔添加20微升mtt溶液(5ml/mg)孵育4小时，移除培养液后，加入150微升dmso溶解孔内的晶体，然后使用酶标仪测定吸收峰为570nm的吸收值。
图17是将不同浓度的分散有ftc-3fnps的dmem溶液用于细胞光热治疗实验的暗毒性和光毒性效果。由图可知，随着ftc-3fnps浓度的增加，光毒性组和暗毒性组的细胞存活率(即细胞活性)都有下降。
试验例7ftc-3fnps的体外光声成像实验
将不同浓度的ftc-3fnps水溶液置于核磁管中，插入琼脂糖假体，然后用小动物光声成像仪进行测试。
图18是将ftc-3fnps用于体外光声成像的光声信号强度与ftc-3fnps浓度的关系，由图可知，光声信号随着浓度的增加呈现线性增长。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对其作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。