基于树突状细胞的口蹄疫仿生纳米疫苗及其制备方法和应用

本发明涉及药物制剂领域与生物医药技术领域，具体来说涉及一种针对口蹄疫的仿生纳米疫苗及其制备方法。

背景技术：

口蹄疫（foot-and-mouth，fmd）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouthdisease，fmdv）引起猪、牛、羊等偶蹄兽发生的一种急性、烈性，高度接触性、可快速远距离传播的传染病，该病的暴发会给当地带来严重的经济损失，世界动物卫生组织（oie）将其列为必须通报的动物疫病。口蹄疫病毒粒子无囊膜，呈二十面体对称，有a、o、c、asia-1、sat-1、sat-2和sat3七个血清型，血清型间无交叉免疫保护。口蹄疫灭活疫苗在fmd防控和根除中发挥十分重要的作用，但生产灭活疫苗具有诸多缺点，如需要动用活病毒和高级别的生产车间，存在生物安全隐患；一些流行毒株难以适应细胞，无法制备疫苗；疫苗研发周期长，需要多次免疫维持长期免疫等。

近年研究表明，细胞膜可以作为独特的生物学材料在纳米医学发挥重要作用，生物膜仿生纳米颗粒既具有原生物膜的固有属性，不仅能够改善其生物相容性，显著延长其在机体内的循环存留时间，还能够发挥细胞膜表面的特异性功能。例如可以通过调整生物膜覆层的种类像红细胞膜、巨噬细胞膜、外泌体膜或树突状细胞膜来发挥不同的生物膜功能。而纳米颗粒核心不仅可以起到支撑作用，还可以通过调整负载物，例如不同种类的细胞因子、核酸或壳聚糖整合肝素包封蛋白制备新型核酸疫苗和亚单位疫苗。例如有研究学者以癌细胞膜为涂层，制备核-壳纳米结构，将从带有完整癌细胞膜抗原纳米颗粒与免疫佐剂偶联，证明所得制剂能够靶向癌细胞递送药物，并显示出肿瘤特异性免疫应答。还有学者开发了以巨噬细胞膜包被的纳米颗粒，用于响应肿瘤微环境刺激缓释药物的肿瘤靶向递送。

仿生纳米负载颗粒已经显现出它的优异效果，如今可以通过改造修饰得到不同需求的仿生纳米颗粒。

技术实现要素：

本发明的目的一在于提供一种树突状细胞膜囊泡包裹荷载细胞因子il-2的仿生纳米疫苗，目的二在于提供所述仿生纳米疫苗的制备方法，目的三在于提供所述仿生纳米疫苗在预防o型口蹄疫中的应用。

本发明所述口蹄疫仿生纳米疫苗为一种仿生纳米颗粒，通过颗粒表面树突状细胞膜携带的抗原信息，靶向递呈树突状细胞诱发特异性免疫应答反应，通过释放的细胞因子il-2，激发固有免疫反应，从而实现早期快速激发系统免疫反应，提供早期和持久的免疫保护。

本发明中，将荷载细胞因子il-2的纳米荷载颗粒和树突状细胞膜进行融合，获得由树突状细胞囊泡包裹的稳定仿生纳米疫苗，所述仿生纳米疫苗是以纳米荷载颗粒为核心、以树突状细胞膜作为外壳。

在本发明中，所述仿生纳米疫苗的粒径为100-200nm，所述纳米荷载颗粒的粒径为100-200nm。

本发明中，所述树突状细胞囊泡是通过口蹄疫灭活病毒抗原刺激树突状细胞制备，使得仿生纳米疫苗携带口蹄疫病毒抗原信息。进一步地，所述口蹄疫灭活病毒抗原为o型口蹄疫灭活病毒抗原。

本发明中，所述树突状细胞囊泡包裹的仿生纳米载体，包括聚合物核心纳米颗粒和树突状细胞囊泡；其中，聚合物材料为plga，或pla，或磷脂材料等。

本发明中，所述纳米荷载颗粒的纳米载体材料为聚乳酸-羟基乙酸。

本发明中，所述纳米荷载颗粒为聚乳酸-羟基乙酸通过分散法制备的纳米粒。

本发明提供了所述仿生纳米疫苗的制备方法，其包括步骤：

(1)、制备由载体纳米粒包裹细胞因子il-2的纳米荷载颗粒；

(2)、制备经口蹄疫灭活病毒抗原处理的树突状细胞，提取树突状细胞囊泡后制备树突状细胞囊泡膜：

(3)、将步骤（1）制备的纳米荷载颗粒和步骤（2）制备的树突状细胞囊泡膜混合，树突状细胞膜囊泡包被于纳米荷载颗粒表面，通过碳酸酯膜过滤，获得具有细胞膜结构的纳米颗粒，即为口蹄疫仿生纳米疫苗。

本发明还提供所述仿生纳米疫苗在口蹄疫防控方面中的应用，如制备口蹄疫疫苗或其他抗口蹄疫病毒的药物。

本发明以o型口蹄疫病毒为例，通过试验证实了所制备o型口蹄疫仿生纳米疫苗能够在体内外激发细胞免疫应答，并通过中和试验证实，制备的o型口蹄疫仿生纳米疫苗产生的中和抗体能阻断o型口蹄疫病毒对bhk-21细胞的感染，具有高水平的中和抗体。

有益效果：本发明所述o型口蹄疫仿生纳米疫苗为一种具有核壳结构的纳米颗粒，仿生纳米颗粒的内核为聚乳酸-羟基乙酸共聚物包裹细胞因子il-2直径约为170nm的纳米颗粒，仿生纳米颗粒的外层为携带o型口蹄疫抗原信息的树突状细胞膜，该细胞膜取自经o型口蹄疫病毒灭活抗原刺激的c57/bl6小鼠骨髓来源的树突状细胞膜，完整纳米颗粒的直径约为190nm。该粒径的仿生纳米颗粒自由运输至淋巴结后，能被细胞高效识别捕获，释放细胞因子il-2激发固有免疫应答，仿生化树突状细胞膜递呈o型口蹄疫病毒抗原信息刺激免疫细胞产生特异性免疫应答，即产生保护性中和抗体。最终仿生纳米颗粒的两种组分通过协同效应提高免疫效果。研发的o型口蹄疫仿生纳米疫苗能够靶向运送至免疫系统，高效刺激免疫细胞快速产生高水平的保护性中和抗体，是一种免疫后能够早期产生中和抗体的新型疫苗，对通过疫苗免疫净化和根除口蹄疫具有十分重要的意义。

附图说明

图1为本发明所制备的纳米颗粒核心和仿生纳米疫苗颗粒的透射电镜图片（plga-np：纳米颗粒核心；minidc:仿生纳米颗粒）；

图2为本发明所制备的粒径分析图（plga-np：纳米颗粒核心；minidc:仿生纳米颗粒;bmdcvesicle:bmdc囊泡）；

图3为本发明仿生纳米颗粒的共聚焦图；

图4为sds-page图（bmdc：bmdc；minidc:仿生纳米颗粒;bmdcvesicle:bmdc囊泡）；

图5为westernblot图（bmdc：bmdc；minidc:仿生纳米颗粒;bmdcvesicle:bmdc囊泡）；

图6为验证仿生纳米颗粒上细胞膜的方向正确性。（bmdc：bmdc；minidc:仿生纳米颗粒）；

图7为体外t细胞激活试验流式结果图。（pbs：阴性对照；plga-np：纳米颗粒核心；bmdc：bmdc；minidc:仿生纳米颗粒;fmdv:口蹄疫灭活抗原）（下同）；

图8为体外t细胞增殖试验流式流式结果图；

图9为体外t细胞试验上清elisa检测结果；

图10和图11为动物试验脾细胞流式检测结果；

图12为动物试验血清细胞因子elisa检测结果；

图13为动物试验所得血清中和试验测试结果。

具体实施方式

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的进行详细地描述。

以下实施例采用的实验数据统计方法：所有数据用mean±sd或mean±sem，用graphpadprism6.0进行分析。两组间统计分析采用student'st检验，多组间统计分析采用单因素方差分析(onewayanova)。

1.实验材料

1.1动物、病毒和细胞

无特定病原体级实验动物（spf级动物）6-8周龄雌性c57bl/6小鼠购自兰州兽医研究所实验动物中心(中国兰州)。fmdvo型毒株o/mya98和纯化的灭活病毒来自中国oie/fmd国家参考实验室。fmdv的tcid50是用reed-meunch法计算的。仓鼠肾细胞(bhk-21)由本实验保存。

dc细胞的获取：从c57bl/6小鼠股骨和胫骨中分离骨髓细胞，用rpmi-1640培养基(gibco，invitrogencororation，ca)冲出骨髓细胞。通过300微米过滤器过滤后，在含有100units/ml青霉素，100μg/ml链霉素，20ng/mlrmgm-csf(peprotech，usa)和10ng/mlrmil-4(peprotech，usa)，10%灭活胎牛血清的rpmi-1640培养基中以1×10⁶个细胞/ml在37℃5%co2培养，每2天更换一半培养基。

脾淋巴细胞的获取：使用脾淋巴细胞分离试剂盒(中国达科为)按照说明书从雌性c57bl/6小鼠中分离脾淋巴细胞。

2.试验方法和结果

2.1同种异体混合淋巴细胞反应

为了检测bmdc激活t细胞的能力，我们使用了同种异体混合淋巴细胞反应。简而言之，将培养至第6天的bmdc接种在24孔板中1×10⁶cell/ml，用不同浓度的灭活fmdv抗原进行刺激、以脂多糖(sigma,usa)(1μg/毫升)和培养基为阳性阴性对照。24小时后，将bmdc在37℃下用10g/ml丝裂霉素处理1.5小时。用pbs洗两次。将t细胞接种在96孔u型底组织培养板(corning,usa)中，加入上述处理的bmdc在37℃5%co2中培养3天。用cck-8(ape×bio，美国德克萨斯州休斯顿)按照说明书进行细胞增殖测定。每组重复5孔，并重复三次,结果显示，10μg/ml的o型口蹄疫病毒灭活抗原刺激浓度为最佳。

2.2树突状细胞膜的获取

收集经抗原处理的bmdc，700g离心10分钟（4℃），用预冷的pbs洗涤三次。然后加入10毫升低渗裂解缓冲液（含有10mmoltris-hcl(ph7.5)、1mmol氯化钾、1mmol氯化镁和蛋白酶抑制剂），用匀浆器裂解细胞（冰浴）；待细胞完全破碎后，3500g离心5分钟（4℃)除去碎片。将上清液转移到新试管中，20000g离心25分钟（4℃）(贝克曼库尔特公司)；弃沉淀，上清予100000g离心50分钟（4℃)；弃上清，收集离心管底部的细胞膜。用bca蛋白检测试剂盒(takara)测膜蛋白含量。

2.3树突状细胞膜包覆纳米颗粒的制备

该仿生纳米颗粒采用两步法制造。首先，使用plga(50:50，美国西格玛德里奇)制备纳米核壳颗粒。简单地说，首先将plga溶解在浓度为10mg/ml的三氯甲烷中。然后将1毫升含2.5μg细胞因子溶液(peprotech,usa)快速加入4毫升含3%聚乙烯醇的水中。然后将这种双重乳液超声（200w，90s）处理，在水性表面活性剂中产生含有包封细胞因子的纳米级的氯仿液滴。然后将纳米粒子溶液在空气中搅拌3小时以除去有机溶剂。用超纯水洗涤纳米颗粒三次，并通过200nm的过滤碳酸酯膜得到纳米颗粒。将获得的树突状细胞膜与纳米核壳颗粒按1：2（w/w）混合，并通过200nm的碳酸酯膜过滤即得完整的o型口蹄疫仿生纳米疫苗。

2.4仿生纳米疫苗尺寸和形态的表征

用醋酸双氧铀对仿生纳米颗粒负染，通过透射电子显微镜分析纳米粒子形态如图1所示。通过动态光散射测量纳米颗粒、仿生纳米和bmdc囊泡的流体动力学尺寸（图2）。为了进一步证实纳米颗粒被细胞膜成功包被，用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)测定bmdc裂解物、bmdc囊泡和迷你dc的总蛋白含量，并用考马斯亮蓝染色进行成像（图3）。通过蛋白质印迹（图4）检测bmdc、bmdc囊泡和迷你dc的特异性表面标记，如小鼠cd11c(boster，中国)、cd86(boster，中国)和cd40(boster，中国)，结果证明仿生纳米颗粒保留关键膜蛋白。为了评估仿生纳米与bmdc有相同方向的细胞膜，在冰上用mhcⅱ荧光抗体(biolegend，ca)染色20分钟，然后通过流式细胞仪(beckmancoulter)测定平均荧光强度（图5）。最后，利用激光共聚焦进行共定位分析（图6）。简而言之，使用0.01%聚赖氨酸(sigma-aldrich，美国)溶液浸泡共聚焦皿(nestbiotechnology，中国)，并在摇床上摇动30分钟。然后用三蒸水清洗并风干。将共焦皿储存在干燥和密封的环境中，4℃避光，加入仿生纳米颗粒，并在37℃放置30分钟。轻吸上清液，用温水浴pbs洗两次。用200μl4%多聚甲醛(solarbio，中国)固定，37℃放置1小时。用温水浴pbs轻洗3次。加入100μl5%牛血清白蛋白(索拉博，中国)，室温下静置30分钟。轻轻吸去上清液，用温水浴pbs轻轻冲洗两次，然后加入anti-cd40抗体(1:300；boster，中国)，室温下90分钟。轻轻吸去上清液，用温水浴pbs轻轻冲洗3次。加入荧光标记二抗(proteintech,usa)后，室温50分钟，用pbs温水浴洗涤3次，然后用hoechst33342(beyotime,china)和did(beyotime,china)染色、洗涤，并在共聚焦扫描显微镜(徕卡)下观察。

2.5体外t细胞活化和增殖研究

将t细胞以每孔2×10⁵的密度接种到96孔细胞培养板中，然后每孔分别加入pbs、含2×104个bmdc的pbs、含等量细胞膜的仿生纳米疫苗、等量的核心纳米颗粒、o性fmdv灭活抗原，各50μl，重复三孔，37℃、5%c02共培养。24小时后，收集t细胞并用抗cd8-apc(biolegend，ca)和抗cd69-fitc(biolegend，ca)染色，洗涤后用流式细胞术分析。结果如图7所示，证明所制备仿生纳米颗粒能够显著激活t细胞应答。

对于t细胞增殖试验，根据制造商的说明，将t细胞预先用cfse染色并与上述制剂共培养3天，用流式细胞仪分析收集的t细胞，结果如图8所示，仿生纳米颗粒能够对t细胞产生最大增殖。收集上清液，用酶联免疫吸附法（elisa）测定分泌的干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α的浓度。结果如图9所示，经仿生纳米颗粒刺激后，t细胞能够显著产生ctl应答关键标志物。

2.6动物体内免疫试验

为了检测仿生纳米颗粒诱导的体内t细胞反应，每组5只6-8周龄的雌性c57bl/6小鼠分别接种10μgo性fmdv灭活抗原、1×10⁶bmdc，和等量的仿生纳米疫苗、核心纳米颗粒、并以pbs作为阴性对照，制为100μl制剂，并每周皮下注射两次，持续3周。最后一次接种后三天，收集外周血分离血清，用elisa测定血清中干扰素和肿瘤坏死因子的水平。将脾分离成单细胞悬液，将脾分离制为单细胞悬液，并使用小鼠抗cd4-pe(biolegend，ca)、抗cd25-brilliantviolet421™(biolegend，ca)、抗foxp3-alexafluor647(biolegend，ca)、抗ifnγ-pe(biolegend，ca)、抗cd3-fitc(biolegend，ca)、抗cd8-apc(biolegend，ca)确定脾细胞中t细胞种类，如teff和treg所占比例，进而判断免疫应答方式。

结果如图10-12所示，经仿生纳米颗粒免疫的小鼠比其他组产生了更多的cd8+ifn-γ+效应t细胞（teff），发挥ctl效应，与之前体外试验结果相符。

2.7微量血清中和试验

在p3生物实验室，将分离的血清在56℃灭活30分钟，然后将血清倍比稀释，每孔50μl，并在96孔板中四次重复，然后将毒病稀释至200tcid50，按每孔50μl，加入96孔板，在37℃和5%co2培养箱中孵育1小时，加入稀释好的bhk-21，设置阳性阴性对照，并在培养箱中培养，72小时后观察结果。结果如图13所示，经仿生纳米颗粒免疫小鼠的血清具有中和效应，具有应用潜力。

需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。