槐糖脂在制备抗痤疮丙酸杆菌及其生物膜的药物中的应用的制作方法

本发明涉及一种槐糖脂的药物用途，尤其涉及一种槐糖脂在制备抗痤疮丙酸杆菌及其生物膜的药物中的应用；属于生物制药技术领域。

背景技术：

槐糖脂是一种重要的生物表面活性剂，对于它的研究始于二十世纪五、六十年代，主要是通过微生物发酵获得。与化学合成的表面活性剂相比，槐糖脂具有表面性能优良、环境友好等许多优点。

近年来，关于槐糖脂抑菌作用的研究已经有所报道，申请人也曾对槐糖脂抑制细菌的作用进行了相关研究，其中“cn200710114796.3槐糖脂在制备抗皮肤癣菌药物中的应用”获得授权。然而，经文献和专利检索，利用微生物产生的槐糖脂生物表面活性剂用于制备抗痤疮丙酸杆菌及其生物膜的药物的文献还未见报道。

痤疮丙酸杆菌(propionibacteriumacnes)是痤疮的主要致病菌，它寄居于人体皮肤毛囊等处。在20世纪70年代中期人们发现局部外用抗生素对痤疮的治疗安全、有效、便利，随后以红霉素、克林霉素、甲硝唑为主的外用抗生素快速成为痤疮治疗的方式，尤其对于痤疮的炎性皮损，局部抗生素治疗至今仍然占有重要地位。但随着抗生素的大量使用，痤疮抗生素治疗疗效降低，抗生素治疗时间也延长。据研究发现，p.acnes生物膜的形成在耐药性的产生中可能扮演了重要的角色。细菌生物膜的存在使得细菌相互嵌入形成菌落，并在表面形成保护性的外骨架起到物理性屏障作用，故影响、阻止各种抗菌药物的治疗。基于此，研究和开发新型抗痤疮丙酸杆菌及其生物膜的药物以替代克林霉素及红霉素等常规易产生耐药性的抗菌药物具有重要意义和临床需求。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种槐糖脂在制备抗痤疮丙酸杆菌及其生物膜的药物中的应用。

本发明所述槐糖脂在制备抗痤疮丙酸杆菌及其生物膜的药物中的应用。

其中：所述槐糖脂以拟威克酵母变种(wickerhamielladomercqiaevar.sophorolipid)cgmccno.1576通过发酵方式制得；所述槐糖脂有效抑制痤疮丙酸杆菌的浓度为0.12g/l以上，所述槐糖脂有效抑制痤疮丙酸杆菌生物膜的浓度为2.0g/l以上。

一种抗痤疮丙酸杆菌及其生物膜的药物，其特征在于：所述药物是槐糖脂与药学上可接受的辅料或赋形剂制成的任何一种药剂学上所说的剂型。

一种抗痤疮丙酸杆菌及其生物膜的药物组合物，其特征在于：所述药物是槐糖脂为有效成分加入抑细菌药物组分和药学上可接受的辅料或赋形剂制成的任何一种药剂学上所说的剂型。

为了更好地理解本发明的实质，下面以槐糖脂的药理实验及结果来说明槐糖脂作为抗痤疮丙酸杆菌及其生物膜的药物的应用。

本发明所述槐糖脂的制备：

(1)菌种选择：拟威克酵母变种wickerhamielladomercqiaevar.sophorolipidcgmccno.1576；

(2)斜面培养：将菌种接种于基本无机盐培养基，其中添加质量体积比为1.5～2.0％的琼脂，25～35℃条件下，静止培养24～48小时；

(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于20～100ml含有质量体积比为4～14％的葡萄糖和1～8％的菜籽油的基本无机盐培养基中，25～35℃条件下，振荡培养24～48小时，制得种子液；

(4)扩大培养：以5～10％的体积比的接种量，将种子液接种于100～1000ml含有质量体积比为4～14％的葡萄糖和1～8％的菜籽油的基本无机盐培养基中，25～35℃条件下，振荡培养96～288小时；

(5)收集发酵产物：将步骤(4)所得的发酵液静置，使其自然沉降，收集沉积在摇瓶底部的浅黄色粘稠液体，之后以4000～7000转/分钟将所述粘稠物质离心，收集沉淀部分，即为槐糖脂粗提物；

(6)减压蒸馏：将步骤(5)所得槐糖脂粗提物，在温度50～70℃，压力0.2～0.8kg/cm²，真空度为0.02～0.08mpa的条件下进行减压蒸馏，蒸发去除其中的水分；

(7)收集物干燥：将上述收集的减压蒸馏残渣，在50～100℃，真空度0.02～0.08mpa条件下，真空干燥12～24小时，制得固体槐糖脂。

痤疮丙酸杆菌的菌体制备：将p.acnesatcc6919菌种的冻干粉，用无菌水0.1～0.2ml溶解菌粉，吸取全部菌粉，接种于已经倒有厌氧培养基的厌氧培养皿里，均匀涂布，静置30min，倒置于厌氧袋中，放入厌氧发生剂，密封袋口，放于37℃厌氧培养箱中静置培养，直到看到菌落出现。然后用接种针挑取单个菌落接种于液体厌氧培养基中，轻轻摇晃，将单菌落散开，放入厌氧袋中，37℃静置培养72～120小时。吸取菌悬液，用培养基稀释,用血细胞计数板计数，将菌悬液调整为1×10⁶-10⁷cfu/ml，备用。

槐糖脂对痤疮丙酸杆菌的抑菌试验：将本发明方法制得的槐糖脂以二甲亚砜溶解制成母液，备用。

将槐糖脂母液加入到厌氧培养基试管中，使其终浓度为0.12、0.24、0.48、0.72g/l。以只加菌液和只加dmso溶液分别作为阳性和阴性对照，同时为排除lacsls本身的颜色影响，以只加不同浓度的样液不加菌液作为第三种对照。37℃培养。

槐糖脂对痤疮丙酸杆菌的生物膜抑制试验：

(1)取保藏的p.acnes菌株，平板划线，在厌氧袋里培养36小时(平板为无抗厌氧培养基平板)。取出平板，挑取单菌落，用移液枪枪尖挑取菌落后，直接把枪尖放入装有5mltsb培养基的试管进行接种，在厌氧袋里培养30h。(2)将tsb培养基转移到96孔板里，(3)加入含不同浓度槐糖脂的培养基，每组至少5个平行转入96孔板中，每孔150μl30℃静置培养10-12h。(4)将孔内液体吸出，后用ddh2o冲洗三次，每孔200μl。(5)0.1％结晶紫染色，37℃静置10min,每孔200μl。将结晶紫吸出，用ddh2o冲洗三次，每孔200μl，最后一次将液体吸完不能有剩余。各孔加入30％乙酸(200μl)溶解菌体，反复轻轻吹吸至完全溶解，减少误差。(6)在560nm处测定光吸收值。

上述液体厌氧培养基(用于厌氧菌培养)的配方是：胰蛋白胨10g/l，牛肉膏10.0g/l，葡萄糖5.0g/l，氯化钠5.0g/l，酵母膏3.0g/l，乙酸钠3.0g/l，可溶性淀粉1.0g/l，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，ph6.6-7.0。

上述固体厌氧培养基(用于厌氧菌菌体制备)的配方是：胰蛋白胨10g/l，牛肉膏10.0g/l，葡萄糖5.0g/l，氯化钠5.0g/l，酵母膏3.0g/l，乙酸钠3.0g/l，可溶性淀粉1.0g/l，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，琼脂20g/l，ph6.6-7.0。

上述tsb培养基(用于细菌增菌)的配方是：胰蛋白胨17.0g/l，大豆蛋白胨3.0g/l，氯化钠5.0g/l，磷酸氢二钾2.5g/l，葡萄糖2.5g/l，ph值7.3±0.2。

抑菌试验结果显示：当添加的槐糖脂的浓度在0.12g/l以上时，在较长的培养时间(120h)内，痤疮丙酸杆菌的生长被完全抑制(见图1)。

对于痤疮丙酸杆菌生物膜的抑制结果显示：在添加了一定剂量的槐糖脂(>2.0g/l)之后，其生物膜即可以被完全抑制(见图2)。

本发明所述槐糖脂在制备抗痤疮丙酸杆菌及其生物膜的药物的应用中，槐糖脂是利用拟威克酵母变种发酵生产获得，具有工艺方法简便、成本低、纯度高的特点，因此用于制备药物价格低廉，且用量少；同时实验证实本发明所述的槐糖脂抑菌效果显著，对人体无任何毒副作用，可以在某些方面作为替代治疗后易复发感染及易产生耐药性的常规抗生素药物。将其作为治疗痤疮丙酸杆菌感染造成的青春痘、脓疱等药物，开发为外用洗液、软膏剂等药物剂型，可以在某些方面作为替代易产生耐药性的常规抗痤疮丙酸杆菌的药物，具有极大的应用前景。

附图说明

图1不同浓度的槐糖脂对痤疮丙酸杆菌生长的抑制结果统计图

统计结果显示：槐糖脂浓度在0.12g/l以上时，能够完全抑制红色毛癣菌的生长。

图2对痤疮丙酸杆菌生物膜的抑制结果统计图

统计结果显示：槐糖脂浓度达到2.0g/l以上时，能够完全破坏痤疮丙酸杆菌的生物膜。

具体实施方式

下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

下述实施例中，所使用的材料、试剂、p.acnes菌株等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。拟威克酵母变种wickerhamielladomercqiaevar.sophorolipidcgmccno.1576菌株是申请人先前申请专利时保藏的菌株，其已多次在公开的文献(包括专利cn200710114796.3槐糖脂在制备抗皮肤癣菌药物中的应用)中记载。

实施例1：槐糖脂的制备

(1)菌种选择：拟威克酵母变种(wickerhamielladomercqiaevar.sophorolipid)cgmccno.1576；

(2)斜面培养：将菌种接种于基本无机盐培养基，其中添加质量体积比为1.6％的琼脂，25℃条件下，静止培养24小时；

(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于20ml含有质量体积比为4％的葡萄糖和1％的菜籽油的培养基中，25℃条件下，振荡培养24小时，制得种子液；

(4)扩大培养：以5％的体积比的接种量，将种子液接种于100ml含有质量体积比为1％的菜籽油的培养基中，25℃条件下，振荡培养96小时；

(5)收集发酵产物：将步骤(4)所得的发酵液静置，使其自然沉降，收集沉积在摇瓶底部的浅黄色粘稠液体，之后以5000转/分钟将上述粘稠物质离心，收集固态部分，即为槐糖脂粗提物。

(6)减压蒸馏：将步骤(5)所得槐糖脂粗提物，在温度60℃，压力0.4kg/cm²，真空度为0.04mpa的条件下进行减压蒸馏，蒸发去除其中的水分；

(7)收集物干燥：将上述收集的减压蒸馏残渣，在70℃，真空度0.04mpa条件下，真空干燥16小时；制得固体槐糖脂。

实施例2：槐糖脂的制备

(1)菌种选择：拟威克酵母变种(wickerhamielladomercqiaevar.sophorolipid)cgmccno.1576；

(2)斜面培养：将菌种接种于基本无机盐培养基，其中添加质量体积比为1.6％的琼脂，30℃条件下，静止培养30小时；

(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于50ml含有质量体积比为8％的葡萄糖和3％的菜籽油的培养基中，30℃条件下，振荡培养30小时，制得种子液；

(4)扩大培养：以7％的体积比的接种量，将种子液接种于500ml含有质量体积比为3％的菜籽油的培养基中，30℃条件下，振荡培养120小时；

(5)收集发酵产物：将步骤(4)所得的发酵液静置，使其自然沉降，收集沉积在摇瓶底部的浅黄色粘稠液体，之后以6000转/分钟将上述粘稠物质离心，收集固态部分，为槐糖脂粗提物。

(6)减压蒸馏：将步骤(5)所得槐糖脂粗提物，在温度65℃，压力0.8kg/cm²，真空度为0.08mpa的条件下进行减压蒸馏，蒸发去除其中的水分；

(7)收集物干燥：将上述收集的减压蒸馏残渣，在100℃，真空度0.08mpa条件下，真空干燥24小时；制得固体槐糖脂。

实施例3：槐糖脂作为抗痤疮丙酸杆菌药物的应用

痤疮丙酸杆菌的菌体制备：将斜面保存的痤疮丙酸杆菌取一接种环转接到液体厌氧培养基中，在厌氧培养袋中37℃下培养36小时，制得痤疮丙酸杆菌菌悬液，稀释使菌悬液浓度为1×10⁶-10⁷cfu/ml。

将实施例1制得的槐糖脂以二甲亚砜(dmso)溶解制成母液，备用。

取槐糖脂母液分别按梯度稀释到不同的浓度，然后分别加到制备好的痤疮丙酸杆菌菌悬液中(1×10⁶-10⁷cfu/ml)

以未添加槐糖脂的培养基和仅添加了二甲亚砜的平板作为对照。

上述液体厌氧培养基(用于厌氧菌培养)的配方是：胰蛋白胨10g/l，牛肉膏10.0g/l，葡萄糖5.0g/l，氯化钠5.0g/l，酵母膏3.0g/l，乙酸钠3.0g/l，可溶性淀粉1.0g/l，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，ph6.6-7.0

抑菌试验结果显示：

未添加槐糖脂和仅添加了二甲亚砜的的平板在120h内，菌体生长不受抑制，当添加槐糖脂的浓度达到0.12g/l以上时，痤疮丙酸杆菌的生长被完全抑制(见图1)。

实施例4：槐糖脂作为抗痤疮丙酸杆菌生物膜药物的应用

痤疮丙酸杆菌生物膜的制备：(1)取保藏的p.acnes菌株，平板划线，在厌氧袋里培养36小时(平板为无抗厌氧培养基平板)。取出平板，挑取单菌落，用移液枪枪尖挑取菌落后，直接把枪尖放入装有5ml液体tsb培养基的试管进行接种，在厌氧袋里培养30h。(2)将培养有痤疮丙酸杆菌的tsb培养基转移到96孔板里，制得生物膜。

将实施例1制得的槐糖脂以二甲亚砜溶解制成母液，备用。

将槐糖脂母液用液体厌氧培养基稀释，并使其终浓度为0.1～2.0g/l，加入到制备的痤疮丙酸杆菌生物膜样品孔中，每孔150μl，每组至少5个平行。在厌氧袋里30℃静置培养24-36h。然后将孔内液体吸出，后用ddh2o冲洗三次，每孔200μl。0.1％结晶紫染色，37℃静置10min,每孔200μl。将结晶紫吸出，用ddh2o冲洗三次，每孔200μl，最后一次将液体吸完不能有剩余。各孔加入30％乙酸(200μl)溶解菌体，反复轻轻吹吸至完全溶解，减少误差。最后在560nm处测定光吸收值。以不加槐糖脂的孔作为对照。

上述液体厌氧培养基(用于厌氧菌培养)的配方是：胰蛋白胨10g/l，牛肉膏10.0g/l，葡萄糖5.0g/l，氯化钠5.0g/l，酵母膏3.0g/l，乙酸钠3.0g/l，可溶性淀粉1.0g/l，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，ph6.6-7.0。

上述tsb培养基(用于细菌增菌)的配方是：胰蛋白胨17.0g/l，大豆蛋白胨3.0g/l，氯化钠5.0g/l，磷酸氢二钾2.5g/l，葡萄糖2.5g/l，ph值7.3±0.2。

抑菌试验结果显示：

显示槐糖脂浓度达到2.0g/l以上时，能够完全破坏痤疮丙酸杆菌的生物膜(见图2)。