用于治疗视网膜疾病的组合物及方法与流程
本申请是申请日为2012年5月17日，发明名称为“用于治疗视网膜疾病的组合物及方法”的中国专利申请201280035828.x的分案申请。
本文所述的主题大体涉及干细胞生物学和再生医学领域。具体而言，本文公开的主题提供了组合物和方法，其用于通过施用视网膜祖细胞来治疗、缓解或者预防视网膜疾病或病症；改善明(日光)视觉，改善或者矫正视敏度，改善黄斑功能，改善视野，或者改善暗(夜)视觉。本文所述的主题还提供包含视网膜祖细胞的细胞群以及分离它们的方法。在备选的实施方案中，本发明提供了组合物和方法，其用于治疗、缓解或者预防视网膜疾病或者病症，例如，usher综合征(usher’sdisease)、视网膜色素变性(rp)、退行性视网膜病、年龄相关黄斑变性(amd)、湿性amd或者干性amd、地图样萎缩(geographicatrophy)、视网膜光感受器疾病、糖尿病视网膜病变、黄斑囊样水肿、葡萄膜炎、视网膜脱离、视网膜损伤、黄斑裂孔、黄斑毛细血管扩张症、外伤性或医源性视网膜损伤、神经节细胞或视神经细胞疾病、青光眼或者视神经病、缺血性视网膜疾病诸如早产儿视网膜病变、视网膜血管阻塞、或者缺血性视神经病；或者改善明(日光)视觉；或者用于改善矫正视敏度，或者改善黄斑功能，或者改善视野，或者改善暗(夜)视觉。在备选的实施方案中，本发明提供胎儿神经视网膜细胞的异质混合物以及产生和使用它们的方法及组合物(例如试剂盒，制剂等等)。
背景技术：
视网膜变性是导致视觉永久性丧失的一组混杂的眼疾病，影响全世界数百万的个体。虽然这些病症背后的分子机制不同，但是它们具有一个共同的终点：感光细胞的不可逆死亡。当前没有有效的治疗以恢复丧失的光感受器和视觉功能，并且大多数的治疗干预充其量只能延缓疾病的进展。
先前在视网膜变性的患者中进行的临床研究涉及使用胎儿视网膜片移植物。该移植策略依赖于未成熟的视网膜片延伸出细胞突并且与变性的宿主视网膜形成突触连接。背后的原理是宿主的内层视网膜神经元仍是完整的，并且因此仅仅需要恢复对于视觉功能所需的突触连接光感受器。研究患者中视网膜片移植的研究结果已经显示具有一些主观视觉改善，然而移植排斥、组织可用性和不可靠的临床功效阻碍这种方法成为可行的治疗选择。
干细胞和其它多能细胞(pluripotentcell)也已经被考虑用于治疗视网膜变性患者并且可以从诸多来源包括胚胎组织、成年脑、遗传操作的皮肤成纤维细胞以及甚至视网膜分离。然而，到目前为止胚胎细胞或者干细胞显示出，当被移植进入成年视网膜内时，几乎没有分化成视网膜表型的能力，除非首先将其预分化成胎儿样视网膜祖细胞群。此外，移植物植入的产率和效率低，并且被残留的形成肿瘤的多能细胞污染也是一个问题。当前在感光细胞置入领域的挑战涉及对指导细胞向光感受器分化的发育过程的理解，从而大量的这些细胞可以在最佳阶段被移植，同时引起免疫反应以及所植入细胞转化成致瘤表型的风险最低。
技术实现要素：
在备选的实施方案中，本发明提供了组合物和方法，其用于治疗、缓解或者预防视网膜疾病或病症，例如，usher综合征、视网膜色素变性(rp)、退行性视网膜病、年龄相关黄斑变性(amd)、湿性amd或干性amd、地图样萎缩、视网膜光感受器疾病、糖尿病视网膜病变、黄斑囊样水肿、葡萄膜炎、视网膜脱离、视网膜损伤、黄斑裂孔、黄斑毛细血管扩张症、外伤性或医源性视网膜损伤、神经节细胞或视神经细胞疾病、青光眼或者视神经病、缺血性视网膜疾病诸如早产儿视网膜病变、视网膜血管阻塞、或者缺血性视神经病；或者改善明(日光)视觉；或者用于改善矫正视敏度，或者改善黄斑功能，或者改善视野，或者改善暗(夜)视觉的组合物及方法。在备选的实施方案中，本发明提供胎儿神经视网膜细胞的异质混合物以及产生和使用它们的方法及组合物(例如试剂盒，制剂等等)。
在备选的实施方案中，本发明提供通过包含下列步骤的方法制造的、包含哺乳动物胎儿神经视网膜细胞的异质混合物的制剂，制造的产品或者组合物：
(a)从处于下述阶段的哺乳动物胎儿收集包含大量哺乳动物胎儿神经视网膜细胞的细胞样品：
(i)对于人，在大约17至18周孕龄，或者在大约16至19周孕龄，或者15至20周，或者14至26周，或者在大约14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或者26周孕龄；或者对于非人动物，任选猫，犬或猪的细胞，在大约3、4、5、6、7、8、9、10或11周，或者对于猫，在6至7周，或者对于猪细胞，在6至9周，或者
(ii)在该阶段之后哺乳动物视网膜明显形成但在光感受器外节完全形成并且视网膜血管形成基本完成或者完成之前的阶段，或者在类似的哺乳动物胎儿阶段，
其中任选地，所述细胞样品包括人细胞或者猫细胞或者犬细胞；
(b)将所收集的细胞样品酶解解离以产生解离的细胞和/或小尺寸和中尺寸细胞团的混悬物，
其中任选地，所收集的细胞和/或小细胞团的样品使用胰蛋白酶或者等效物，或者tryp-leexpresstm(trypletmexpress，invitrogen-lifetechnologies，carlsbadca)或者等效物酶解解离；和
(c)在包含无血清培养基或者有血清培养基、以及抗生素和抗真菌剂或者无抗生素或抗真菌剂的无菌环境中培养所述细胞和/或小细胞团，持续不超过大约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多代，
其中任选地，所述细胞和/或小细胞团在下述的培养基中培养，所述培养基包括dulbecco’smodifiedeagle培养基:营养混合物f-12tm(dmem/f12tm)培养基、或者高等dmem/f12tm培养基(gibco-invitrogen-lifetechnologies，carlsbadca))、或者ultraculturetm培养基(biowhittaker-lonzawalkersville，inc.，walkersville，md)，任选添加n2补充剂(invitrogen)或者b27或b27xenofree(invitrogen)、l-谷氨酰胺或者glutamax(invitrogen)，以及由egf和bfgf(invitrogen)组成的人重组生长因子或其他生长因子，
并且任选地，所述dmem/f12tm培养基用于人细胞，并且所述ultraculturetm培养基用于猫或犬细胞，
并且任选地，于低氧条件下，或者于接近或者密切模拟妊娠过程中使胎儿视网膜发育的氧水平的氧条件下，或者于大约2％、2.5％、3％、3.5％的氧下，培养所述细胞或使其生长，
并且任选地，所述培养基补充有维生素c，并且任选地，维生素c每1天或每2天添加，并且任选地，维生素c以具有大约0.1mg/ml或0.05mg/ml或者大约0.01mg/ml至大约0.5mg/ml的最初浓度的量添加，
并且任选地，所述培养基补充有白蛋白，或者人或猫或犬白蛋白或者重组白蛋白，或者白蛋白以具有大约1.0mg/ml的最初浓度的量添加，
并且任选地，针对病原体、细菌、内毒素、真菌、支原体、病毒、肝炎病毒或者hiv病毒的存在筛选所述细胞样品，
并且任选地，针对正常核型的存在筛选所述细胞样品，
并且任选地，所述细胞样品没有呈现出提高的端粒酶活性，
并且任选地，针对生存力筛选所述细胞样品，
任选地，针对致瘤性筛选所述细胞样品。
在制剂、制造的产品或者组合物的备选实施方案中，制造胎儿神经视网膜细胞的异质混合物的方法还包括：
(a)基于细胞的表面标志物或者遗传标志物选择胎儿神经视网膜细胞，任选地，在培养之前(预期性地)或者培养之后或者在培养之前和之后都选择所述细胞，
其中任选地，所述细胞的表面标志物或者遗传标志物包括cd15/lex/ssea1和/或gd2神经节苷脂；任选的cd9、cd81、cd133或aqp4、cxcr4；或者
(b)基于胎儿神经视网膜细胞的转录组(transcriptome)谱、蛋白质组谱和/或基因组谱选择胎儿神经视网膜细胞。
在备选的实施方案中，本发明的产生胎儿神经视网膜细胞的异质混合物的方法还包括：
在这样的条件下培养所述细胞，即引起所述细胞以最佳速度(或者接近最佳速度)增殖和/或表现胎儿神经视网膜细胞表型或者转录组谱，
其中任选地，所述胎儿神经视网膜细胞表型谱包括表达一定(任选中等)水平的ki67、p21和/或端粒酶和/或高水平的一种或者更多种与专能细胞(multipotentcell)而非多能细胞有关的干细胞标志物，
或者任选地，所述胎儿神经视网膜细胞表型谱包括巢蛋白、波形蛋白、ki-67、分化标志物、β3-微管蛋白、胶质原纤维酸性蛋白(gfap)和/或视紫红质，或其任意组合的(基因或信使)表达；
并且任选地，测量dach1、lhx2和/或pax6信使。
在备选的实施方案中，制剂、制造的产品或者组合物被配制成用于注射，或者注射到玻璃体腔或者视网膜下间隙内。
在备选的实施方案中，本发明提供用于治疗视网膜疾病或病症的方法，包括：
(a)提供本发明的制剂、制造的产品或者组合物；和
(b)注射(a)的制剂、制造的产品或者组合物到玻璃体腔或者视网膜下间隙内，
其中任选地，所述玻璃体腔或者视网膜下间隙是人或猫或犬玻璃体腔或者视网膜下间隙，
其中任选地，使用标准眼内注射操作，
其中任选地，所述方法还包括前房穿刺，由此改善操作安全性，
由此治疗所述视网膜疾病或病症。
在所述方法的备选实施方案中，所述视网膜疾病或病症包括usher综合征、视网膜色素变性(rp)、退行性视网膜病、年龄相关黄斑变性(amd)、湿性amd或干性amd、视网膜光感受器疾病、糖尿病视网膜病变、视网膜脱离、视网膜损伤、外伤性或医源性视网膜损伤、神经节细胞或视神经细胞疾病、青光眼或者视神经病。
在备选的实施方案中，本发明提供用于改善明(日光)视觉的方法，包括：
(a)提供本发明的制剂、制造的产品或者组合物；和
(b)注射(a)的制剂、制造的产品或者组合物到玻璃体腔或者视网膜下间隙内，
其中任选地，所述玻璃体腔或者视网膜下间隙是人或猫或犬玻璃体腔或者视网膜下间隙，
其中任选地，使用标准眼内注射操作，
其中任选地，所述方法还包括方法还包括前房穿刺，
由此改善明(日光)视觉。
在备选的实施方案中，本发明提供用于改善矫正视敏度、或者改善黄斑功能、或者改善视野、或者改善暗(夜)视觉的方法，包括：
(a)提供本发明的制剂、制造的产品或者组合物；和
(b)注射(a)的制剂、制造的产品或者组合物到玻璃体腔或者视网膜下间隙内，
其中任选地，所述玻璃体腔或者视网膜下间隙是人或猫或犬玻璃体腔或者视网膜下间隙，
其中任选地，使用标准眼内注射操作，
其中任选地，所述方法还包括前房穿刺，
由此矫正视敏度，或者改善黄斑功能，或者改善视野，或者改善暗(夜)视觉。
在备选的实施方案中，本发明提供用于产生胎儿神经视网膜细胞的异质混合物的方法，所述混合物由包括以下步骤的方法产生：
(a)对于人，在大约17至18周孕龄，或者在大约16至19周孕龄，或者15至20周，或者14至26周，或者在大约14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或者26周孕龄；或者对于非人动物，任选猫，犬或猪的细胞，在大约3、4、5、6、7、8、9、10或11周，或者对于猫，在6至7周，或者对于猪细胞，在6至9周，
其中任选地，所述细胞样品包括人细胞或者猫细胞或者犬细胞；
(b)将所收集的细胞样品酶解解离以产生解离的细胞和/或小尺寸和中尺寸细胞团的混悬物，
其中任选地，所收集的细胞样品使用胰蛋白酶或者等效物，或者tryp-leexpresstm(trypletmexpress，invitrogen-lifetechnologies，carlsbadca)或者等效物酶解解离；和
(c)在包含无血清培养基或者有血清培养基、和无抗生素或抗真菌剂的无菌环境下培养所述细胞，持续不超过大约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多代，
其中任选地，所述细胞在下述的培养基中培养，所述培养基包含dulbecco’smodifiedeagle培养基:营养混合物f-12tm(dmem/f12tm)培养基(gibco-invitrogen-lifetechnologies，carlsbadca)、或ultraculturetm培养基(biowhittaker-lonzawalkersville，inc.，walkersville，md)，
并且任选地，所述dmem/f12tm培养基用于人细胞，并且所述ultraculturetm培养基用于猫或犬细胞，
并且任选地，所述培养基补充有维生素c，并且任选地，维生素c每1天或每2天添加，并且任选地，维生素c以具有大约0.1mg/ml或0.05mg/ml或者大约0.01mg/ml至大约0.5mg/ml的最初浓度的量添加，
并且任选地，所述培养基补充有白蛋白，或者人或猫或犬白蛋白或重组白蛋白，或者白蛋白以具有大约1.0mg/ml的最初浓度的量添加，
并且任选地，针对病原体、细菌、内毒素、真菌、支原体、病毒、肝炎病毒或者hiv病毒的存在筛选所述细胞样品，
并且任选地，针对正常核型的存在筛选所述细胞样品，
并且任选地，所述细胞样品没有呈现出提高的端粒酶活性，
并且任选地，针对生存力筛选所述细胞样品，
任选地，针对致瘤性筛选所述细胞样品。
在备选的实施方案中，本发明提供用于治疗视网膜疾病或病症或者用于实施本发明方法的试剂盒，包括：
(a)本发明的制剂、制造的产品或者组合物；和/或
(b)通过本发明方法产生的胎儿神经视网膜细胞的异质混合物。
在备选的实施方案中，本发明提供包含表达选自巢蛋白、sox2、ki67、mhc类i、和fas/cd95的一种或更多种标志物的哺乳动物视网膜祖细胞的细胞群，其中所述细胞群中大于大约90％、或者大约95-99％的细胞表达巢蛋白，其中所述细胞群中大于大约80％、或者大约90-99％的细胞表达sox2，其中所述细胞群中大于大约30％、或者大约40-60％的细胞表达ki-67，其中所述细胞群中大于大约70％、或者大约90％的细胞表达mhci类，并且其中所述细胞群中大于大约30％、或者大约40-70％的细胞表达fas/cd95。在一些实施方案中，所述细胞来源于人或非人哺乳动物。
在某些实施方案中，所述细胞群中的哺乳动物视网膜祖细胞还表达选自波形蛋白、cd9、cd81、aqp4、cxcr4、cd15/lex/ssea1、gd2神经节苷脂、cd133、β3-微管蛋白map2、gfap、opn/spp1、ptn、kdr、和tek的一种或更多种标志物。
在另一个方面中，提供了用于分离一个哺乳动物视网膜祖细胞群的方法，包括收集处于下述阶段的哺乳动物胎儿视网膜组织，所述阶段即在该阶段之后视网膜形成但在光感受器外节在整个视网膜内完全形成之前并且在视网膜血管形成基本完成或者完成之前的阶段；使所收集的组织解离以产生解离的细胞和细胞团的混悬物；和培养解离的混悬物，持续大约10-30代，其中所述哺乳动物视网膜祖细胞表达选自巢蛋白、sox2、ki-67、β3-微管蛋白、map2、mhci类、和fas/cd95的一种或更多种标志物，其中所述细胞群中大于大约90％、或者大约95-99％的细胞表达巢蛋白，其中所述细胞群中大于大约80％、或者90-99％的细胞表达sox2，其中所述细胞群中大于大约30％、或者大约40-60％的细胞表达ki-67，其中所述细胞群中大于大约70％、或者大约90％的细胞表达mhci类，并且其中所述细胞群中大于大约30％、或者大约40-70％的细胞表达fas/cd95。在一些实施方案中，所述组织从人或者非人哺乳动物收集。在一些实施方案中，所述组织从大约12周至大约28周孕龄的人胎儿视网膜收集，或者从出生后或者新生儿视网膜组织收集。在另外的实施方案中，所述组织从大约3周至大约11周孕龄的非人胎儿视网膜收集。在另外的实施方案中，所述组织从大约3周至11周孕龄的非人哺乳动物收集，或者从出生后或者新生儿视网膜组织收集。所述细胞可以在大气氧水平下或者近似于妊娠过程中使胎儿视网膜发育的氧水平，诸如例如在大约0.5％至大约7％的低氧水平下培养，并且还可以在无血清或者减少血清的细胞培养基中培养，所述培养基可任选地包括额外的补充剂诸如例如，n2、b27、维生素c和白蛋白。
在另外的方面中，提供了用于治疗需要此种治疗的受试者的视网膜疾病或病症的方法，包括向所述受试者施用有效量包含哺乳动物视网膜祖细胞的组合物，其中所述哺乳动物视网膜祖细胞表达选自巢蛋白、sox2、ki-67、β3-微管蛋白、map2、mhci类、和fas/cd95的一种或更多种标志物，其中所述细胞群中大于大约90％、或者大约95-99％的细胞表达巢蛋白，其中所述细胞群中大于大约80％、或者大约90-99％的细胞表达sox2，其中所述细胞群中大于大约30％、或者40-60％的细胞表达ki-67，其中所述细胞群中大于大约70％、或者大约90％的细胞表达mhci类，并且其中所述细胞群中大于大约30％、或者大约40-70％的细胞表达fas/cd95，并且任选地，测量所述受试者的视觉改变，由此治疗视网膜疾病或病症。
在备选的实施方案中，所述受试者是人或者非人哺乳动物。在一些实施方案中，所述组合物被配制成用于注射到受试者的玻璃体腔或者视网膜下间隙内。视网膜疾病或病症包括视网膜色素变性(rp)、莱伯先天性黑朦(lca)、斯塔加特病(stargardtdisease)、乌斯赫尔氏综合征、无脉络膜、视杆-视锥或者视锥-视杆营养不良、纤毛病(ciliopathy)、线粒体病、进行性视网膜萎缩、退行性视网膜病、年龄相关黄斑变性(amd)、湿性amd、干性amd、地图样萎缩、家族性或者后天获得性黄斑病、视网膜光感受器疾病、基于视网膜色素上皮的疾病、糖尿病视网膜病变、黄斑囊样水肿、葡萄膜炎、视网膜脱离、外伤性视网膜损伤、医源性视网膜损伤、黄斑裂孔、黄斑毛细血管扩张症、神经节细胞疾病、视神经细胞疾病、青光眼、视神经病、缺血性视网膜疾病、早产儿视网膜病变、视网膜血管阻塞、家族性大动脉瘤、视网膜血管病、眼血管病、血管疾病、或者缺血性视神经病。
在附图和下面的说明书中描述本发明的一个或更多个实施方案的详细内容。根据说明书和附图并且根据权利要求书，本发明的其它特征、目标和优势是显而易见的。
为了所有目的，本文引用的所有公布、专利、专利申请清楚地通过参考并入本文。
附图说明
通过举例给出的、但不旨在将本文所述主题限制于所述特定实施方案的下列详细描述可以与附图一起进行理解，所述附图通过参考并入本文，其中：
图1举例说明猫视网膜衍生的祖细胞或者rpc的形态。形态在持续培养过程中的不同时间点得以维持。
图2是表示生长曲线的图，显示猫rpc在sm培养基与ul培养基中生长的差异。
图3显示人rpc(hrpc)随培养时间(第0天至第56天)的形态。
图4和5是显示hrpc随时间的生长动力学的图，其中图4中蓝色的供体在大约p5时在患者中使用，导致视觉改善。
图6a显示在补充有n2的高等dmem/f12与基础dmem/f12细胞培养基之间的生长条件的比较。
图6b举例说明比较hrpc在补充有n2或者b27的细胞培养基中生长的实验。
图7a总结测试在hrpc培养中补充维生素c的影响的实验。添加维生素c导致产生改善的hrpc生存力。
图7b和7c描述测试在hrpc培养中补充白蛋白的影响的实验。
图8反映测试不同的细胞培养基渗透浓度对hrpc生长和生存力的影响的比较实验。
图9-11表示实验结果，其中hrpc在大气氧条件下培养并且与在低氧条件下生长的相同细胞相比较。评价了生长动力学、形态和基因表达。图11显示用于产生工作细胞库的三个不同细胞样品的生长特性的可再现性。
图12显示在hrpc上开展的类固醇毒性测试结果。
图13a-13d是显示以前冷冻的hrpc的生存力和稳定性的图。
图14显示通过免疫细胞化学(icc)标志物巢蛋白、β3-微管蛋白、波形蛋白、视紫红质、ki-67、和gfap染色的猫rpc。
图15是显示使用巢蛋白、波形蛋白、gfap、和pkc-α标志物转录物的qpcr测量的随时间的猫rpc基因谱的图，d10＝1(作为对照)；内源性对照：β-肌动蛋白；时间点：d13(0.5个月)，31(1个月)，d52(2个月)，d97(3个月)d114(4个月)。
图16a是通过qpcr测量的、在ul与sm培养基条件下生长的rpc之间的基因表达差异的图解说明。
图16b是比较猫rpc与bpc的图。
图17显示猫rpc体内移植到营养不良埃塞俄比亚猫的视网膜下间隙内之后，rfp、波形蛋白、或者视蛋白、埃兹蛋白或pkc的细胞染色，其中具体地如下所示：
图18使用通过icc测量的标志物表达图解说明人细胞的形态。标志物包括：(a)巢蛋白；(b)波形蛋白；(c)sox2；(d)ssea-1(也称作cd15，lex)；(e)gd2-神经节苷脂；和(f)ki-67。
图19使用通过icc测量的标志物表达图解说明人细胞的形态。(a)显示β3-微管蛋白染色；(b)gfap染色；和(c)gdnf染色。
图20描述如通过定量pcr热作图所检测的rna水平的标志物表达。
图21a显示比较hrpc与人成纤维细胞(hfb)中基因表达水平的qpcr分析结果。图21b和21c表示来自另外的实验的qpcr(基因表达)数据。
图22是总结表，显示在不同供体之间表现出一致行为(在hrpc中相对于在hfb中)的一组11个基因(来自所使用的约26个基因的谱)。
图23显示在培养时间点通过qpcr(“实时”pcr)所检测的rna水平的标志物表达。
图24描述不同标志物(例如gdnf、膜联蛋白v、β3-微管蛋白、notch1、six6、ki-67、和cd133)在早期与晚期世代细胞中的表达水平的变化。
图25表示区分hrpc与神经干细胞(bpc)的微列阵数据总结。
图26显示用视黄酸(ra)分化后的标志物表达。
图27是从不同组织供体生长的hrpc的培养条件总结表。
图28a图解说明生长在sm条件下在不同培养时间点通过qpcr检测的基因表达；图28b图解说明生长在sm-ul(起初是ul，然后是sm)条件下在两个不同时间点通过qpcr检测的基因表达。
图29a图解说明生长在sm-fbs(起初的铺板条件是sm+5％fbs，然后换成单独的sm)条件下在不同时间点通过qpcr检测的基因表达。图29b图解说明在单独的sm条件下在2个不同时间点通过qpcr检测的基因表达。图29c图解说明在sm-hs(在起初的sm+人血清之后是sm)条件下在相同的2个时间点通过qpcr检测的基因表达。与先前结果一样，仅gdnf升高。
图30是图28和29中显示的时间点比较实验结果的总结表。在所有处理条件中显示出强烈一致趋势的基因用黄色突出显示。
图31描述从hprc得到的qpcr数据的热作图分析。
图32表示来自hprc的qpcr数据直方图。
图33a描述hrpc中血管发生相关基因的水平。图33b描述hrpc中wnt-途径相关基因的水平。
图34a是显示hrpc相对于组织和成纤维细胞之间的基因表达差异的主成分分析(pca)结果的总结图。图34b是显示在hrpc相对于在第0天从胎儿视网膜得到的组织之间的基因表达差异的另一个pca图。图34c是描述细胞样品群之间的总体相似性和差异的另一个pca图。
图35显示三个hrpc群(低氧的mcb，正常氧的mcb，和低氧的wcb)相对于胎儿视网膜组织的聚类分析。
图36是比较低氧的mcb相对于组织的基因表达差异的火山图。
图37a是显示随处理条件而异的hrpc组之间差异表达的基因数的venn图。图37b是显示随世代数和处理条件而异的、相对于组织进行了标准化的hrpc组之间差异表达的基因数的venn图。
图38a和38b是比较不同hrpc相对于来源组织的火山图。
图39a和39b是比较低氧的hrpc相对于正常氧的hrpc的火山图。
图40是对于猫rpc设计的时间点的总结表：比较了供体和处理条件的表(在ul-d76处的红色划线对应于细胞生长曲线中明显的上拐，即可能的自发永生化)。
图41a图解说明在ul培养基中生长的猫crpc在所标明的时间点通过qpcr检测的基因表达。图41b包括在图41a中未显示的另外的标志物。
图42-44全部表示来自如图41中所示相同实验的另外的数据。
图45是显示猫crpc表达模式随时间点和培养条件而变化的辐射图(radialgraph)。
图46是总结从不同供体和培养条件下的猫rpc获得的qpcr数据的图表。
图47显示表征在正常氧和低氧条件下培养的hrpc的elisa实验结果。检测的标志物包括opn、vegf、sdf-1、bdnf、和gdnf。
图48显示在正常氧和低氧条件下培养的hrpc的facs分析结果。感兴趣的标志物包括巢蛋白、sox2、ki-67、gfap、mhci和ii类、fas/cd95、cxcr4、cd15、和gd2神经节苷脂。
图49图解说明将hrpc体内移植进入遗传性光感受器变性模型的营养不良rcs大鼠眼睛内的本发明方法的概念的证据。hrpc对营养不良视网膜内感光细胞的广泛的持续的拯救。
图50和51显示视网膜下注射hrpc之后大鼠视网膜染色的照片。
图50视网膜祖细胞(rpc)视网膜下注射至rcs大鼠(在p21开展，在p100观察)：左蒙太奇图像是结晶紫染色切片。图50a.框a’中的放大图，显示注射部位(星)，供体细胞(箭头)和onl保护，显著的局部拯救(深蓝色层＝cnl中的细胞核；箭头指所移植的细胞)；图50b.框b’中的放大图，显示远离移植物区域中的onl单层，远离注射部位没有拯救(仅在onl中有散在的细胞核，空心箭头)。
图51将媒介物视网膜下注射(假治疗)至rcs大鼠，在p100观察：左蒙太奇图像是结晶紫染色切片。a.框a’中的放大图，显示注射部位(星)和区域化的onl拯救，还显示局部拯救(中等)；b.框b’中的放大图，显示远离注射部位的onl单层(箭头)，远离部位没有拯救。
图52和53是显示玻璃体内注射hrpc之后大鼠视网膜染色的照片。
图52：rpc玻璃体内注射至rcs大鼠，在p100观察。左蒙太奇图像是结晶紫染色切片，显示整个视网膜上的onl拯救；a.框a’中的放大图，显示5-6层的onl，显著的全视网膜拯救。b.框b’中的放大图，显示onl保护，各处均得到拯救，甚至在视网膜最快速变形的部分中。
图53：媒介物的玻璃体注射(假治疗)：将运载介质玻璃体内注射至rcs大鼠，在p100观察。左蒙太奇图像是结晶紫染色切片。a.没有可辨别的拯救*；b.*在最初的针头进入点通常存在非特异的效果。
图54是显示注射hrpc到大鼠视网膜内之后的rcs全片(wholemounts)的免疫细胞化学染色的照片。a和b：假治疗；c和d：治疗的。红色：视紫红质；绿色：m-视锥视蛋白；蓝色：pna(m-视锥鞘和s视锥鞘)。
图55是显示在接受hrpc治疗的患者的视敏度改善的图。箭头为提供的解释性临床联系。
具体实施方式
在本说明书通篇所述的特征、结构或者特性可以在一个或更多个实施方案中以任何适宜的方式相组合。例如，在本说明书通篇中，短语“示例性实施方案”、“实例实施方案”、“一些实施方案”、或者另外的相似语言的使用指这样的事实，即与某个实施方案有关的所描述的特定特征、结构或者特性可以包括在本文所述的至少一个实施方案中。因此，在本说明书通篇中，短语“示例性实施方案”、“实例实施方案”、“在一些实施方案中”、“在另外的实施方案中”或者另外的相似语言的出现不必然全部指相同组的实施方案，并且所描述的特征、结构或者特性可以在一个或更多个实施方案中以任何适宜的方式相组合。
为了便于理解本公开，在下面定义许多个术语。本文定义的术语具有与本文所述主题相关领域的普通技术人员所通常理解的含义。术语诸如“a/an(一)”和“所述”不旨在仅指单数的实体，而且还包括一般种类，其具体实例可以用于例证。本文的术语用于描述本文所述主题的特定实施方案，但是它们的使用没有限定主题，除非在权利要求书中概述。
本发明提供包含或者使用胎儿神经视网膜细胞的异质混合物的组合物和方法，其用于治疗、缓解或者预防视网膜疾病或者病症，例如usher综合征、视网膜色素变性(rp)、退行性视网膜病、年龄相关黄斑变性(amd)、湿性amd或干性amd、视网膜光感受器疾病、糖尿病视网膜病变、视网膜脱离、视网膜损伤、外伤性或医源性视网膜损伤、神经节细胞或视神经细胞疾病、青光眼或者视神经病；或者改善明(日光)视觉；或者用于改善矫正视敏度，或者改善黄斑功能，或者改善视野，或者改善暗(夜)视觉。在备选的实施方案中，本发明提供胎儿神经视网膜细胞的异质混合物以及用于制造和使用它们的方法及组合物(例如试剂盒、制剂等等)。
在备选的实施方案中，本发明提供了培养的视网膜祖细胞被制备为细胞混悬物并作为同种异体移植物使用被注射到具有视网膜疾病的患者的玻璃体腔内的方法和用途。在备选的实施方案中，本发明提供基于细胞的治疗法，包括使用所培养的来自未成熟哺乳动物例如人的视网膜的异质细胞群，或者由其组成。
在备选的实施方案中，将来自供体组织的哺乳动物例如人的增殖中的视网膜细胞进行培养、开展鉴定，并且在局表麻醉(topicalanesthesia)下将细胞直接注射入玻璃体腔内，而没有必要对受体例如患者进行全身免疫抑制。
在备选的实施方案中，本发明的组合物和方法用于治疗、预防或者缓解视网膜疾病，例如视网膜变性，例如视网膜色素变性(rp)。
虽然本发明不受任何特定作用机制所限制，但是在一个实施方案中，供体胎儿视网膜细胞为宿主视网膜特别是包括宿主视锥提供了营养方面的影响。这种营养性影响不但是神经保护性的，并且还对残留的宿主视网膜细胞具有快速复活作用，如通过视觉功能改善所测定。在一个实施方案中，供体细胞能够整合入视网膜内并且通过细胞分化替换光感受器(其可以是有限数量)。总体效果是既快速又持续地恢复和维持有临床意义程度的视网膜的视觉功能，否则视觉功能注定会完全丧失，导致患者完全失明。因此，在一个实施方案中，本发明的组合物和方法可以快速且持续地恢复和维持有临床意义程度的哺乳动物例如人视网膜的视觉功能。
在备选的实施方案中，本发明的方法包括制造和使用解离的胎儿视网膜细胞例如人视网膜祖细胞(hrpc)的混悬物，并且任选地，不包括组织或骨架。在备选的实施方案中，这些细胞被注射入玻璃体腔内；其中任选地不需要玻璃体切割术或者视网膜下手术。在一个实施方案中，细胞可以被有效地植入(例如注射入)到视网膜下间隙内，或者使用任何标准眼内注射操作例如使用皮下或者斜角插入途径将它们有效地植入(例如注射入)到眼睛内。在备选的实施方案中，不需要视网膜切开术或者眼内充填用气体或硅油。
在备选的实施方案中，还可以开展前房穿刺，也可以不开展前房穿刺，这取决于具体情况，如通过本领域技术人员所确定。在备选的实施方案中，在操作过程中和/或操作之后不需要眼球缝合。在备选的实施方案中，仅使用局表麻醉，例如不使用局部、部位、全身麻醉。
在备选的实施方案中，不使用抗炎和/或免疫抑制；但是任选地可以包括抗炎和/或免疫抑制治疗剂作为术后滴剂。在备选的实施方案中，不需要对移植物的组织分型和与患者的配型。
在备选的实施方案中，不强制术后卧床休息和/或不需要“面朝下”体位。在备选的实施方案中，本发明的方法在门诊过程中开展，并且任选地，不需要任何过夜住院期。
在备选的实施方案中，本发明的组合物及方法用于预防、缓解和/或治疗视网膜色素变性(rp)、usher综合征、或者任何退行性视网膜病，例如amd，或者视网膜光感受器疾病诸如视网膜脱离，或者视网膜疾病诸如糖尿病视网膜病变，或者神经节细胞/视神经疾病诸如青光眼或者视神经病。
在备选的实施方案中，本发明组合物及方法的使用或者实施导致：改善的明(日光)视觉，任选提供快速的效果；增加的最佳矫正的视敏度；改善的黄斑功能，具有保持或者恢复中心注视的可能性；改善的视野；暗(夜)视觉随时间的改善；在乌斯赫尔氏综合征中伴有听力损失的情况下，报导对声音的敏感性提高(改善)；和/或对于具有lp视觉(仅光感)的患者，在所治疗研究具有有限的改善的情况下，在对侧眼睛中提供了视敏度的明显改善。
在备选的实施方案中，使用或者实施本发明的组合物以及方法导致产生多种全身性益处，例如：在治疗个体中可能由于身体的改善而导致的外表变化，这可能与光对昼夜节奏、垂体功能、激素释放、血管紧张度等的影响有关；改善的视觉能力感觉；改善的走动独立性；改善的健康感；和/或改善的日常生活活动。
在备选的实施方案中，使用或者实施本发明的组合物以及方法不会导致：发生不需要的细胞生长，例如肿瘤；感染，例如没有眼内炎——任何眼内操作的一种风险；疾病的传播，然而朊病毒或者疯牛病可能难以排除；葡萄膜炎和/或急性移植排斥；升高的眼内压力；闭角；张力减退；视网膜脱离和/或新生血管形成。
在备选的实施方案中，本发明的组合物以及方法使用视网膜祖细胞培养物，所述的视网膜祖细胞培养物包含从胎儿哺乳动物视网膜得到的未成熟视网膜细胞的异质培养物，或者由从胎儿哺乳动物视网膜得到的未成熟视网膜细胞的异种培养物组成，其任选地未进行克隆选择，而是任选地是混杂的。在备选的实施方案中，细胞表达祖细胞标志物和视网膜标志物。在备选的实施方案中，细胞在用于临床用途的无动物产品(xeno-free)条件下培养，因为动物产品污染可能是一个安全性问题。在备选的实施方案中，细胞在完全无血清条件下生长，或者，必要时，细胞在含血清条件下生长。
在备选的实施方案中，细胞不是永生化的，也不允许它们永生化或者强迫它们永生化。在备选的实施方案中，细胞不无限增殖。对于给定的组织供体，本发明的示例性的细胞培养方法可以改善速度和持续时间，并且可以显著改善供体细胞得率。
在备选的实施方案中，细胞本质上不是干细胞，相反，它们是不成熟的和/或可塑的，并且任选地，不满足对真正干细胞的定义。
在备选的实施方案中，用于实施本发明的细胞从哺乳动物胎儿组织得到，并且任选地，不在有机体的一生中持续存在。在备选的实施方案中，用于实施本发明的细胞不能(在缺乏额外处理的情况下)产生胚层，或者不能(在缺乏额外处理的情况下)产生所有三(3)个胚层；任选地，它们被预先特化以产生视网膜组织或者细胞。
在备选的实施方案中，用于实施本发明的细胞是密切相关的细胞群，而不是分离的单一细胞类型。在备选的实施方案中，用于实施本发明的细胞不是多能性的，并且任选地，可以表现出专能性的。在备选的实施方案中，用于实施本发明的细胞从未以多能性状态培养过；因此它们是较安全的。在备选的实施方案中，用于实施本发明的细胞没有进行遗传修饰，或者备选地，它们经过了遗传修饰(例如稳定或者瞬时或者可诱导转化的)。
在备选的实施方案中，本发明的组合物以及方法对患病视网膜提供有临床意义的营养性影响，或者对黄斑和/或暗视觉功能提供再生性影响。
在备选的实施方案中，用于实施本发明的细胞当被置入到眼睛内，或者眼睛的玻璃体腔内，或者视网膜下间隙内时，具有低免疫原性，例如作为同种异体移植物。
在备选的实施方案中，用于实施本发明的细胞是与神经祖细胞和/或神经干细胞(nsc)相区别的视网膜祖细胞(rpc)。在备选的实施方案中，用于实施本发明的哺乳动物胎儿视网膜或者rpc细胞是专能的，但是不是nsc的等效物。在备选的实施方案中，用于实施本发明的哺乳动物胎儿视网膜或rpc细胞不是来自脑，而是来自视网膜。在备选的实施方案中，用于实施本发明的哺乳动物胎儿视网膜或rpc细胞产生光感受器(脑衍生的祖细胞在这一点上较差)。在备选的实施方案中，用于实施本发明的哺乳动物胎儿视网膜或rpc细胞是专能的，但是不(在缺乏额外处理的情况下)产生少突胶质细胞(这与nsc不同)。
在备选的实施方案中，用于实施本发明的哺乳动物胎儿视网膜或rpc细胞表达例如如本文所述的有数量差异的基因谱；或者它们表达有数量差异的可溶性因子谱；或者它们表达有数量差异的表面标志物谱。
在备选的实施方案中，用于实施本发明的哺乳动物胎儿视网膜或rpc细胞来自哺乳动物胎儿神经视网膜，不是来自睫状缘，睫状体上皮，也不是来自rpe。在备选的实施方案中，用于实施本发明的哺乳动物胎儿视网膜或rpc细胞不来自分化的mueller神经胶质，它们本质上不是有丝分裂后的前体细胞，它们本质上不是干细胞，和/或它们本质上不是单一的分离的细胞类型。
在备选的实施方案中，用于实施本发明的哺乳动物胎儿视网膜细胞或rpc细胞具有不是固定的、恒定的或者永久不变的基因谱；或者它们具有在数量上随培养时间而动态变化的基因谱。
在备选的实施方案中，用于实施本发明的哺乳动物胎儿视网膜细胞或rpc细胞不存在于早期胚胎，例如胚泡中。在备选的实施方案中，用于实施本发明的哺乳动物胎儿视网膜细胞或rpc细胞不以任何有用的丰度存在于正常的成熟哺乳动物，例如人中。在备选的实施方案中，用于实施本发明的哺乳动物胎儿视网膜细胞或rpc细胞以它们天然的丰度存在于正在发育中的(胎儿)哺乳动物例如人的视网膜中。在备选的实施方案中，用于实施本发明的哺乳动物胎儿视网膜细胞或rpc细胞正常情况下不存在于骨髓中，也不衍生自骨髓。
在备选的实施方案中，用于实施本发明的哺乳动物胎儿视网膜细胞或rpc细胞当在增殖条件下生长时大部分是有丝分裂的，任选地与少数的有丝分裂后的细胞的混合物在一起。在备选的实施方案中，用于实施本发明的哺乳动物胎儿视网膜细胞或rpc细胞人工地衍生自多能细胞系，虽然任选地不包含残留的多能细胞类型的细胞群。
在备选的实施方案中，用于实施本发明的哺乳动物胎儿视网膜细胞或rpc细胞产生(分化成)视网膜细胞，包括光感受器，但是不产生少突胶质细胞。
在备选的实施方案中，用于实施本发明的哺乳动物胎儿视网膜细胞或rpc细胞作为不相关哺乳动物例如人中的眼睛同种异体移植物是免疫耐受的。在备选的实施方案中，用于实施本发明的哺乳动物胎儿视网膜细胞或rpc细胞被移植到玻璃体腔内，用于哺乳动物或者人的视觉或者视网膜疾病的治疗或者预防性治疗。
在备选的实施方案中，用于实施本发明的哺乳动物胎儿视网膜细胞或rpc细胞不带来任何或者相当大的肿瘤形成或者其它不必要的细胞生长的风险。
在备选的实施方案中，用于实施本发明的哺乳动物胎儿视网膜细胞或rpc细胞被培育成为球形或者粘附单层，或者先成为球形然后成为单层，或者成为球形和单层的组合。在备选的实施方案中，球形是不需要的，或者细胞作为解离的细胞(而不是作为球形)或者作为两者的混合物被移植。在备选的实施方案中，用于实施本发明的哺乳动物胎儿视网膜细胞或rpc细胞包括在玻璃体内融合并且任选地可以变成球形的所移植细胞。
虽然本发明不被任何特定作用机制所限，但是示例性的作用机制是可扩散的和/或营养有关的；证据与对垂死的宿主视锥进行营养性重新编程的观点一致，导致从细胞凋亡轨迹转变成光处理能力的再生。这可以是直接的或者间接的。不排除其它眼睛组织的参与。该机制允许将本发明的胎儿神经视网膜细胞的异质混合物移植物置入到玻璃体或者视网膜下间隙内。在一个方面中，放置到玻璃体内增强了基于扩散的治疗效果。该机制使得可以将本发明的胎儿神经视网膜细胞的异质混合物移植物放置在视轴之外，但仍能治疗患者的黄斑。
在备选的实施方案中，玻璃体内放置用于极大地简化治疗。这种示例性的治疗可以提高对全世界贫困患者的可用性；玻璃体内放置因远离脉管系统而可能对免疫耐受有帮助。虽然本发明不受任何特定作用机制的限制，但在相对无细胞的空间里，在几乎没有天然抗原呈递细胞的情况下，本发明的示例性玻璃体内放置避免了视网膜下手术的潜在并发症，避免全身麻醉的风险，不需要在视网膜上开孔(视网膜切开术)(这产生视网膜脱离、出血的风险)，和/或不需要患者的视网膜经历病灶脱离(focaldetachement)(病灶脱离可导致流泪、出血、眼球脱离；在rp中，患病的视网膜脱离将是困难的/有危险的过程)。
在备选的实施方案中，视觉益处是快速的并且可以在治疗后第一周内出现。在备选的实施方案中，在较长的阶段内出现渐增的益处。
在备选的实施方案中，视网膜细胞置换是可能的，但是对于临床功效不是必须的；供体细胞迁移进入视网膜内是可能的，但是对于临床功效不是必须的。在备选的实施方案中，供体细胞整合进入视网膜回路内是可能的，但是对于功效不是必须的；供体细胞整合进入宿主视网膜外核层/黄斑内是可能的，但是对于功效不是必须的。在备选的实施方案中，供体细胞整合进入视网膜内是可能的，但是对于持续的移植物存活不是必须的。
在备选的实施方案中，供体细胞在无抗生素的情况下培养；这可以避免改变细胞；并且在无抗生素的情况下，使用传代次数极少的细胞是可能的，因为可以排除隐蔽的微生物污染。在备选的实施方案中，使用传代次数少的细胞具有低的转化和/或肿瘤形成的风险；并且，使用传代次数少的细胞最接近于正在发育中的视网膜中存在的天然细胞。
在备选的实施方案中，基于dmem/f12的培养基或者等效物对于使人rpc生长是优选的；并且基于ultraculture的培养基或等效物对于使猫祖细胞生长是优选的。
本文公开的主题涉及包含哺乳动物视网膜祖细胞的细胞群，所述哺乳动物视网膜祖细胞根据确定的细胞培养方法分离并且表达特征性的标志物。所述细胞群可以是从哺乳动物分离的并且体外生长的细胞培养物。例如，所述培养物可以包括在培养板、皿、瓶或生物反应器内培养的细胞悬浮液或者粘附细胞。样品可以是同质的或者异质的，其可以通过如本文所确定的一种或者更多种标志物的表达确定。在一些实施方案中，本文公开的细胞群是混杂的细胞群并且可以包含未分化细胞和分化细胞的混合物。本文所定义的视网膜祖细胞的特征性标志物的相对表达水平在细胞群内的细胞之间可变化。
在备选的实施方案中，术语“纯化的”或“富集的”指细胞或者细胞群与其正常组织环境分离并且以与正常组织环境相比更高的浓度存在。因此，“纯化的”或者“富集的”细胞群还可包括除视网膜祖细胞之外的细胞类型并且可以包括另外的组织成分，并且术语“纯化的”或者“富集的”不必然指仅存在祖细胞或者排除另外的细胞类型的存在。
在备选的实施方案中，本文公开的视网膜祖细胞细胞群可以是至少5％纯度、至少10％纯度、至少15％纯度、至少20％纯度、至少25％纯度、至少30％纯度、至少35％纯度、至少40％纯度、至少45％纯度、至少50％纯度、至少55％纯度、至少60％纯度、至少65％纯度、至少70％纯度、至少75％纯度、至少80％纯度、至少85％纯度、至少90％纯度、至少95％纯度、至少96％纯度、至少97％纯度、至少98％纯度、至少99％纯度、或者5％和99％纯度之间的任意增量。
在备选的实施方案中，“标志物”指可以观察或者检测的任何分子。例如，标志物可以包括，但不限于，核酸诸如特定基因的转录物、基因的多肽产物、非基因产物多肽、糖蛋白、糖、糖脂、脂质、脂蛋白或者小分子(例如分子量小于10,000道尔顿的分子)。在备选的实施方案中，视网膜祖细胞可以通过一种或更多种标志物的存在表征，所述的标志物可以表达于细胞群内细胞的表面上(“细胞表面标志物”)，细胞群内细胞的内部(即，在细胞的细胞核或者细胞质内)，和/或作为“遗传”标志物在rna或者蛋白质水平表达。
在备选的实施方案中，术语“表达”和“表达的”如本文所使用指核酸序列在宿主细胞内的转录和/或翻译。所希望的感兴趣的产物/蛋白质在宿主细胞内的表达水平可以基于细胞内存在的相应mrna的量、或者由本发明实施例中所选择序列编码的所希望的感兴趣的多肽/蛋白质的量来确定或“筛选”。例如，从所选择的序列转录的mrna可以通过northern印迹杂交、核糖核酸酶rna保护、与细胞rna的原位杂交、微列阵分析、或者通过反转录聚合酶链式反应(rt-pcr)定量或检测。由所选择序列编码的蛋白质可以通过多种基于抗体的方法，例如通过elisa、通过western印迹、通过放射免疫测定、通过免疫沉淀、通过蛋白质生物学活性测定、通过蛋白质免疫染色(包括例如免疫组织化学和免疫细胞化学)、通过流式细胞术或者荧光激活细胞分选(“facs”)分析、或者通过均相时间分辨荧光(htrf)测定法检测或定量。
视网膜祖细胞可以通过它们对分子标志物(包括细胞表面标志物和非表面(“遗传”)标志物)的表达表征。虽然本领域通常将细胞称为特定标志物“阳性的”或者“阴性的”，但是还是在数量上确定了实际表达水平。细胞表面上(或位于别处)的分子数可以数个log级变化，然而仍然可以表征为“阳性的”。本领域技术人员还理解，染色阴性的细胞，即没有检测到标志物特异性试剂的结合水平与对照(如同种型匹配对照)具有差异的细胞，可表达少量的标志物。对标记(“染色”)水平的表征使得可以敏锐地区别细胞群。细胞的染色强度可以通过流式细胞术监测，其中激光检测荧光染料的定量水平(该水平与由特定试剂例如抗体结合的细胞表面标志物的量成比例)。流式细胞术或者facs也可以用于基于与特定试剂的结合强度、以及其它参数诸如细胞大小和光散射分离细胞群。虽然染色的绝对水平会随着特定的荧光染料和试剂制剂的不同而不同，但是数据可以相对于对照进行标准化。
为了将分布相对于对照进行标准化，将每一细胞记录为具有特定染色强度的数据点。这些数据点可以按照log标度显示，其中量度单位是任意染色强度。例如，样品中染色最亮的细胞可以是未染色的细胞的强度的4个log值。当以该方式显示时，处于最高log染色强度内的细胞是明亮的，而处于最低强度内的那些细胞是阴性的。“低”阳性染色细胞具有高于同种型匹配对照亮度的染色水平，但是不及细胞群中正常存在的最亮染色细胞的强度。低阳性细胞具有区别于样品中阴性细胞和明亮染色阳性细胞的独特特性。备选的对照可以利用在其表面上具有确定的标志物强度的底物，例如制造的小珠或细胞系，其提供强度的阳性对照。
在衍生视网膜祖细胞和细胞群的视网膜组织的培养过程中，标志物的表达可能会经历变化。例如，标志物表达的差异可能受培养条件诸如氧水平(即，大气氧条件，或者“正常氧”条件；或者低的氧条件，也称作“低氧”条件)的影响。本领域普通技术人员会意识到，视网膜祖细胞和细胞群的标志物表达不是固定的，并且会随一种或更多种培养条件即培养基、氧水平、传代次数、培养时间等而变化。
所述视网膜祖细胞和细胞群可表达1种或更多种、2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、11种或更多种、12种或更多种、13种或更多种、14种或更多种、15种或更多种、16种或更多种、17种或更多种、18种或更多种、19种或更多种、20种或更多种、25种或更多种、30种或更多种本文定义的标志物，或者其间的任何增量，高达50种或更多种标志物。
在备选的实施方案中，所述视网膜祖细胞和包含视网膜祖细胞的细胞群通过一种或更多种标志物表征或筛选，所述标志物诸如，例如，巢蛋白、波形蛋白、sox2、ki67、mhci类、fas/cd95、map2、cd9、cd81、aqp4、cxcr4、cd15/lex/ssea1、gd2神经节苷脂、cd133、β3-微管蛋白、gfap、opn/spp1、ptn、kdr、和tek。在某些实施方案中，所述视网膜祖细胞和细胞群表达选自巢蛋白、sox2、ki-67、mhci类、和fas/cd95的一种或更多种标志物，其中所述细胞群中大于90％、或95-99％的细胞表达巢蛋白，其中所述细胞群中大于80％、或90-99％的细胞表达sox2，其中所述细胞群中大于30％、或40-60％的细胞(即，正常氧/大气氧条件下生长的细胞的60-85％，低氧条件下生长的细胞的80-90％)表达ki-67，其中所述细胞群中大于70％或90％的细胞表达mhci类，并且其中所述细胞群中大于30％、或40-70％的细胞表达fas/cd95。在一些实施方案中，所述视网膜祖细胞和细胞群还表达选自波形蛋白、cd9、cd81、aqp4、cxcr4、cd15/lexa/ssea1、gd2神经节苷脂、cd133、β3-微管蛋白、map2、gfap、opn/spp1、ptn、kdr、和tek的一种或更多种标志物。在所述细胞群中5-10％的细胞可以表达gfap。所述细胞群中1-3％的细胞可以表达mhcii类。在大气氧条件下生长的细胞中5-30％可以表达cxcr4，但是在低氧条件下生长的细胞中90％可以表达cxcr4。所述细胞群中4-35％的细胞可以表达cd15，即，在大气氧条件下生长的细胞中4-8％的细胞可以表达cd15，在低氧条件下生长的细胞中15-35％的细胞可以表达cd15。所述细胞群中2-15％的细胞可以表达gd2，即，在大气氧条件下生长的细胞中2-4％的细胞可以表达gd2，在低氧条件下生长的细胞中15％的细胞可以表达gd2。
在备选的实施方案中，针对以下一种或者更多种标志物的低表达、微量表达、阴性表达或降低的表达来表征或筛选视网膜祖细胞和细胞群：abca4、aipl1、akt3、apc2、bsn、ccng2cdhr1、crx、cd24、密蛋白(claudin)11、cntf、cntfr、dach1、dapl1、dcx、dlg2和4、dll4、epha7、eys、flt1、fstl5、fzd5、fgf9,10和14、gadd45g、gria2、hes5和6、hey2、heyl、hgf、hif3a、impg1和2、jak2和3、klf4、map6、髓磷脂碱性蛋白(mbp)、mycn、nanog、nbl1、nefl、nefm、neurod1、neurod4、neurog1、neurog2、notch1,2和3、nrl、nrcam、nrsn、nrxn1,2和3、oct4、olig2、opn1mw1和2、opn1sw、otx2、par4、pax6、prph2、rax1和2、rbp3、rcvrn、reln、rgr、视紫红质、rictor、rp1、rrh、rxrg、six3和6、sox8、slc25a27、stat1、stat3、syp、syt4、wif1、vsx2、和vsx1和2。这些标志物的表达模式可用于区分视网膜祖细胞或细胞群与来源组织，例如新鲜分离的视网膜组织。
在备选的实施方案中，其表达比来源组织增加的其它标志物包括但不限于，adm、angpt1、angptl2和4、atp5d、bhlhe40、ccl2、ccnb1、ccnd2、和ccnde1、cd44、cdkn2a、密蛋白1,4和6、cpa4、ctgf、cxcl12、dkk2、emp1、foxc2、fzd6、gadd45b、hes1、hif1a、hoxb4、igf1、igfbp3,5和7、il1a、il1r、il1rap、il4r、il7r、il11、il18、jag1、lif、lox、bdnf、egf、egfr、fgf1,2,5和9、klf4,5和12、mitf、mmp1、myc、ncan、nefh、nog、ntf3、ntrk2、nrp1和2、osmr(il31ra)、otx1、pax8、pdgfa,b和c、plau、prrx1、rpe65、sdf-1、sfrp1和4、six1和4、slc25a1,19和20、tek/tie1、thbs1和2、tlr4、vegfa、vegfcwnt5a、和wnt7b。
在备选的实施方案中，所述视网膜祖细胞和细胞群区别于其它中枢神经系统祖细胞类型(如脑祖细胞和神经干细胞)和衍生自胎儿cns组织诸如脑和脊髓的其它细胞类型。相对于其它cns祖细胞可以被增加的标志物包括但不限于arr3(抑制蛋白c)、cdf10、cdkn2a、ctgf、cxcl12/sdf1、bhlhe41、bmp2、dkk1、egfr、ephb2、fn1、fosl1和2、foxd1、gabbr1、gas1和6、gbx2、hhex、hoxb2、igfbp5和7、inhba、jag1、kdr、klf10lhx9、lhx2、lif、met、neurod1、ntf3、ntrk2、optn(optineurin)、rcvrn、sag(s-抑制蛋白)、serpinf1(pedf)、sfrp1、sox3、tbx3、tgfb、wif、wnt5a、和wnt5b。相对于其它cns祖细胞可以被降低的标志物包括但不限于aqp4、asll1、cldn11、cdkn1b、ccl2、ccng2、cxcr4(sdf1受体)、dcx、dlx2和5、emx2、epha3,4和7、fabp7、foxg1、gria1,2和3、hgf、il2、klf4、lifr、mnx1、ngf、nkx2-2、notch1、npy、npy2r、olig2、omg、pbx1、pdgfra、rtn1、scgn、sox11、tfap2b、tnfrsf21、和wnt7a。
在备选的实施方案中，细胞群可从健康受试者(即，不具有视网膜疾病的个体)收集，从患病受试者收集，并且可以不仅包括新鲜的视网膜细胞群，而且还包括冷冻的视网膜细胞群。来源包括但不限于，整个眼睛、或者视网膜组织、或者从胚胎、胎儿、儿童或成年组织得到的其它来源。所述方法还可以包括富集或纯化过程或步骤，用于通过针对其它视网膜祖细胞特异性标志物的阳性选择而进行细胞分离。所述视网膜祖细胞和细胞群可以从任何哺乳动物种或者受试者例如人、灵长类、马、牛、猪、犬、猫、雪貂、兔、啮齿类例如小鼠、大鼠、仓鼠等得到或者收集。
在脊椎动物胚胎发育中，视网膜和视神经最初是发育中的脑的长出物，因此认为视网膜是中枢神经系统(cns)的一部分并且事实上是脑组织。视网膜是层状的结构，具有数层通过突触相互连接的神经元。从最接近玻璃体至距玻璃体最远，即从最接近头前部外表向头的内部和后部，视网膜层包括：由müller细胞脚板构成的内界膜；包含神经节细胞的细胞核轴突的神经纤维层；神经节细胞层，其包含神经节细胞的细胞核，其轴突变成视神经纤维；包含在双极细胞轴突与神经节和无长突细胞的树突之间的突触的内网层；内核层，其包含双极细胞的细胞核和周围的细胞体(核周体)；外网层，包含分别结束于视杆小球和视锥小足的视杆和视锥的突出物；外核层，其包含视杆和视锥的细胞体；外界膜，其分隔开光感受器的内节部分与它们的细胞核；光感受器层；和视网膜色素上皮(rpe)，其是立方细胞单层。直接对光敏感的神经元是感光细胞，主要由两种类型构成：视杆和视锥。视杆主要在暗光中起作用并且提供黑白视觉，而视锥支持白天视觉并且感知颜色。第三种类型的光感受器是光敏神经节细胞，其对于明亮日光的反射反应是重要的。
在一些实施方案中，细胞从处于下述阶段的哺乳动物胎儿视网膜收集，所述阶段即在该阶段之后视网膜形成但在光感受器外节在整个视网膜内完全形成之前并且在视网膜血管形成已经完成或者基本完成之前的阶段。所述阶段有代表性地在人胎儿大约12周至大约28周的胎儿孕龄。对于来自较大哺乳动物的非人细胞，诸如猫或猪视网膜祖细胞，所述阶段有代表性地是在大约3周至大约11周之间的胎儿孕龄。参见例如，anand-apte,b.和hollyfield,j.g.“developmentalanatomyoftheretinalandchoroidalvasculature.”在theretinaanditsdisorders,besharse,j.和bok,d.,academicpress,(2001)中。然而，本文公开的主题还包括从出生后或者新生儿哺乳动物组织收集细胞。
在备选的实施方案中，在处理组织样品之后或者同时从其它组织成分纯化视网膜祖细胞。在一个实施方案中，在组织样品已经于适宜细胞生长的条件下培养且持续达足以使得细胞粘附至培养皿的时间之后，从其它细胞和组织成分纯化祖细胞。在某些实施方案中，细胞的纯化包括得到在培养过程中从组织样品移行出来、并且存在于培养基中的或者松散地粘附于纤连蛋白或其它基质或者饲养细胞层的细胞。这些细胞可以通过常规方法得到，诸如移出培养基并离心以将其中的细胞沉淀成块，和用溶液诸如磷酸缓冲盐(pbs)或hanks平衡盐溶液洗涤留在培养皿内的细胞，以去除作为粘附细胞层松散附着的那些细胞。然后也将该洗涤溶液离心得到细胞。在一些实施方案中，视网膜祖细胞和细胞群的纯化可以还包括分离细胞和某些不可溶解的组织成分，包括残留的组织材料诸如脂质。可通过本领域已知且可用的任何手段将细胞与其它组织成分分离，所述手段包括例如使用密度梯度、离心、通过流式细胞术或者磁性细胞分离(macs)的分选和过滤或其组合。纯化细胞的具体方法的实例在本领域内是已知的，且描述于例如美国专利号6,777,231中。在某些实施方案中，采用负分离方法以去除一种或更多种特定类型的细胞。
在某些实施方案中，组织被处理或者“被解离”。解离可通过物理解离和/或暴露于促进细胞从其它组织成分释放的酶制剂下实现，以产生细胞和/或细胞团的“解离混悬物”。此类酶的实例包括基质金属蛋白酶、梭菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶样酶、胃蛋白酶、胃蛋白酶样酶、中性蛋白酶类型酶和胶原酶。适宜的蛋白水解酶类描述于美国专利号5,079,160；6,589,728；5,422,261；5,424,208；和5,322,790中。在一些实施方案中，酶制剂包括单独的或者与一种或更多种另外的酶组合的胰蛋白酶。酶解解离可与物理解离例如切碎、移液器吹吸、砍碎、匀浆、研磨、冻融、渗透冲击一起进行，以去除不需要的细胞或结缔组织，并且最终产生单细胞培养物，或者可以包含可通过尺寸即“小”、“中”和“大”定义的细胞团。细胞团大小是主观的并且可以在实施本文所公开主题时变化。
细胞培养描述了这样的一个过程，即通过该过程细胞在受控条件下、通常在其天然环境之外生长。在备选的实施方案中，细胞群生长于或者被培养于本领域已知的任何细胞培养基中。在备选的实施方案中，本发明中使用的“基础培养基”指可支持细胞生长的任何培养基。基础培养基提供标准的无机盐类诸如锌、铁、镁、钙和钾、维生素类、葡萄糖、缓冲系统和关键氨基酸。可以在本发明中使用的基础培养基包括，但不限于，极限必需培养基eagle、adc-1、lpm(无牛血清白蛋白)、f10(ham)、f12(ham)、dccm1、dccm2、rpmi1640、bgj培养基(具有和不具有fitton-jackson改良)、基础培养基eagle(bme-添加earle盐源(saltbase))、dulbecco改良eagle培养基(dmem-无血清)、yamane、imem-20、glasgow改良eagle培养基(gmem)、leibovitzl-15培养基、mccoy's5a培养基、培养基m199(m199e-含earle盐源)、培养基m199(m199h-含hank盐源)、极限必需培养基eagle(mem-e-含earle盐源)、极限必需培养基eagle(mem-h-含hank盐源)和极限必需培养基eagle(mem-naa，含非必需氨基酸)，尤其包括培养基199、cmrl1415、cmrl1969、cmrl1066、nctc135、mb75261、mab8713、dm145、williams'g、neuman&tytell、higuchi、mcdb301、mcdb202、mcdb501、mcdb401、mcdb411、mdbc153、和ultraculture。用于培养本文所公开视网膜祖细胞的优选培养基是高等dmem/f12和ultraculture。许多这样的培养基总结于methodsinenzymology,第lviii卷,"cellculture,"第62-72页中。
在备选的实施方案中，“条件培养基(conditionedmedium)”指与基本或基础培养基相比改变了的培养基。例如，对培养基的条件化可以导致诸如营养素和/或生长因子的分子被添加至基础培养基或者使所述分子从其在基础培养基中存在的最初水平减少。在一些实施方案中，通过允许某些类型细胞于某些条件下在培养基中生长或者维持达某一时间阶段来使培养基条件化。例如，可以通过允许视网膜祖细胞在组成确定的培养基中于确定的温度下扩增、分化或维持达确定的小时数来使培养基条件化。本领域技术人员会意识到，可以使用细胞、培养基类型、持续时间和环境条件的诸多组合产生几乎极大量的条件培养基。
细胞培养补充剂或添加剂的实例包括但不限于，部分或者全部替代血清在支持细胞存活或生长中的作用的成分。在备选的实施方案中，所述补充剂或添加剂包括胰岛素、转金属蛋白(transmetalloprotein)、微量元素、维生素或者其它因子。这些因子一般不包含于基础培养基中，而是通过在培养细胞中通常使用的血清中提供。补充剂或添加剂可包括支持细胞生长的下列成分中的至少一种或更多种：一种或更多种胰岛素或其替代物、一种或更多种转金属蛋白或其替代物、一种或更多种微量元素(例如硒、铁、锌、铜、钴、铬、碘、氟、锰、钼、钒、镍、锡)、一种或更多种维生素(例如维生素c、维生素e、维生素a、维生素b族)、一种或更多种盐(例如钠盐、镁盐、钙盐、或磷酸盐)、一种或更多种缓冲液(例如磷酸缓冲盐水、hepes缓冲液)、一种或更多种氨基酸(例如l-谷氨酰胺)、一种或更多种激素、激素样化合物或生长因子(诸如例如转铁蛋白、egf、ngf、ecgf、pdgf、fgf、igf、lif、白细胞介素、干扰素、tgf、和/或vegf、胰高血糖素、皮质类固醇、加压素、前列腺素)、血清白蛋白或其替代物、一种或更多种糖(葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、核糖、糖酵解代谢物)、一种或更多种抗生素和/或抗真菌剂(例如青霉素、链霉素、两性霉素b)、和一种或更多种脂质(例如游离脂肪酸、与蛋白质结合的脂肪酸、甘油三酯、磷脂、胆固醇、乙醇胺)。许多商品化的血清替代添加剂诸如knockout血清替代物(kosr)、n2、b27、stempro、胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂(its)和g5是本领域技术人员周知的并且可以容易地获得。这些添加剂的特征为成分非常确定，因此其成分的浓度可以基于其在培养基中的比例确定。
在备选的实施方案中，哺乳动物视网膜祖细胞的培养物可以在包含减少的血清或者不含血清的培养基中产生。血清的实例包括胎牛血清、小牛血清、新生牛血清、山羊血清、马血清、人血清、兔血清、大鼠血清、小鼠血清等等。在某些培养条件下，血清浓度范围可以为从大约0.05％体积/体积至大约20％体积/体积。例如，在一些分化过程，培养基中的血清浓度可以小于大约0.05％(体积/体积)、小于大约0.1％(体积/体积)、小于大约0.2％(体积/体积)、小于大约0.3％(体积/体积)、小于大约0.4％(体积/体积)、小于大约0.5％(体积/体积)、小于大约0.6％(体积/体积)、小于大约0.7％(体积/体积)、小于大约0.8％(体积/体积)、小于大约0.9％(体积/体积)、小于大约1％(体积/体积)、小于大约2％(体积/体积)、小于大约3％(体积/体积)、小于大约4％(体积/体积)、小于大约5％(体积/体积)、小于大约6％(体积/体积)、小于大约7％(体积/体积)、小于大约8％(体积/体积)、小于大约9％(体积/体积)、小于大约10％(体积/体积)、小于大约15％(体积/体积)或者小于大约20％(体积/体积)。在一些实施方案中，视网膜祖细胞和包含视网膜祖细胞的细胞群在不含血清(“无血清”)、不含血清替代物和/或不含任何补充剂的条件下生长。
在一些实施方案中，视网膜祖细胞或包含视网膜祖细胞的细胞群在“无动物产品”条件下培养。“无动物产品”或者“无动物产品源(xenogen-free)”指某些物种的细胞(例如人细胞)仅在人产品或补充剂(例如人血清白蛋白、人血清)而非来自其它物种的产物存在的情况下生长或培养的条件。这对于用于移植入人内的细胞是特别重要的。已经接触多种不明确的动物衍生产品的细胞使得它们在临床应用中不受欢迎，因为移植排斥、免疫反应、和病毒或细菌感染、朊病毒、和尚未鉴别的人畜共患病的风险增加。此外，对于所有哺乳动物使用，包括人使用或非人哺乳动物使用(例如兽医使用)，均针对正常核型或感染或污染(例如被支原体、革兰氏阴性细菌(例如内毒素试验)、真菌等等)的存在来筛选细胞。还可以通过端粒酶活性分析法、htert基因表达、和在软琼脂中的生长或在裸鼠中的肿瘤形成针对致瘤性或者向癌性表型的转化来筛选细胞。此类分析法是本领域已知的并且在本领域技术人员的技术范围内。
在备选的实施方案中，视网膜祖细胞或者包含视网膜祖细胞的细胞群可以在饲养细胞层(例如胚胎或者成体成纤维细胞)上培养，或者在细胞外基质骨架或基底诸如胶原、巢蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白、明胶、或者基质胶存在的情况下培养。例如，
在备选的实施方案中，细胞培养条件可以包括使细胞在被设置成37℃、5％co2的培养箱中生长。视网膜祖细胞或包含视网膜祖细胞的细胞群可以在正常氧或者大气(20％)条件下培养，并且可以在近似妊娠过程中正在发育的胎儿视网膜的氧水平的条件下生长，所述条件即“低的氧”或“低氧”条件，例如0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％或7％氧，或者它们之间的任何增量。
铺板密度指细胞数/培养基体积或者细胞数/cm2贴壁培养物。在该语境中相似术语是“汇合”，其通常用作细胞培养皿或瓶中细胞数量的量度，指细胞对培养皿或瓶的覆盖度。例如，100％汇合意思是培养皿完全被细胞覆盖，因此没有剩余供细胞生长的空间；而50％汇合意思是大致一半的培养皿被覆盖并且仍存在供细胞生长的空间。
传代(也称作继代培养或使细胞分裂)包括将少量的细胞转移到新容器内。在备选的实施方案中，如果细胞正常分裂，则可以将它们培养达较长的时间，因为这避免了与延长的高细胞密度相关的衰老。悬浮培养容易通过将包含少量细胞的少量培养物稀释于较大体积的新鲜培养基中来传代。对于贴壁培养物，需要首先使细胞脱附；这通常使用酶混合物诸如胰蛋白酶-edta或者非酶溶液样细胞解离缓冲液实现；然而，许多种酶或非酶混合物或制剂可用于此目的。然后将少量的脱附细胞用于长出新培养物。
大多数原代细胞培养物具有有限的寿命并且不会无限增殖。在一定数量的群体倍增数(称作hayflick极限)之后，细胞经历衰老过程并停止分裂，虽然通常保持生存力。在备选的实施方案中，视网膜祖细胞和细胞群可被培养不超过10代，例如，被传代1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10代。在备选的实施方案中，细胞可以被传代超过10次，诸如，例如，11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多代。在某些实施方案中，视网膜祖细胞和细胞群被培养达大约10-30代。在备选的实施方案中，视网膜祖细胞和包含它们的细胞群优选不是永生的，也不允许它们永生化或者强迫它们永生化。虽然本文所述的细胞被认为是未成熟的祖细胞，但是包含视网膜祖细胞的细胞群可包含可被认为本质上是“专能”干细胞的细胞，其中此类细胞通常在某些培养条件下能够分化成视网膜组织或者视网膜细胞，包括视网膜祖细胞。在备选的实施方案中，“专能”指具有自我更新能力、但是分化能力有限并且基本上定向产生特定细胞类型的未成熟、未分化和/或未特化细胞。在某些实施方案中，本文所述的细胞和细胞群包括密切相关的细胞，但是不必然指单一细胞类型。
在备选的实施方案中，视网膜祖细胞被遗传修饰以表达一种或更多种感兴趣的异源或外源核酸序列。核酸序列可以是“外源的”，这意味着该序列对于载体被引入的细胞是外来的，或者该序列与该细胞内的某条序列是同源的但是位于宿主细胞核酸内该序列通常不存在的位置上。核酸序列包括质粒、扩增子、cdna、mrna、反义rna、sirna，但不限于这些实例。术语“基因”指编码功能性蛋白质、多肽、或者肽的核酸单位。本领域技术人员会理解，该功能性的术语包括基因组序列、cdna序列、和表达或者可以经改造来表达蛋白质、多肽、结构域、肽、融合蛋白质和突变体的经工程改造的更小的基因片段。
本领域已知的任何方法均可用于遗传性改变组织。一个示例性的方法是使用重组病毒载体将基因插入到组织的细胞内。可以使用诸多不同载体中的任意一种，诸如如本领域所知的病毒载体、质粒载体、线性dna等，将编码治疗剂的外源核酸片段引入到靶细胞和/或组织内。这些载体的插入可以使用例如感染、转导、转染、磷酸钙介导的转染、deae-葡聚糖介导的转染、电穿孔、脂质体介导的转染、生物射弹基因递送、使用膜融合脂质体(fusogenicliposome)和阴离子脂质体(其是使用阳离子脂质体的备选方法)的脂质体基因递送、直接注射、受体介导的摄取、磁穿孔、超声和本领域已知的其它方法中的任意一种。
在备选的实施方案中，“载体”用于指核酸序列可被插入其中、用于引入到其可在其中复制的细胞中的载体核酸分子。载体包括质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)、和人工染色体(例如yac)。本领域技术人员将具备良好的技能，通过标准重组技术构建载体，所述标准重组技术描述于sambrook等(1989)molecularcloning：alaboratorymanual，coldspringharbor，ny；ausubel等(1987)currentprotocolsinmolecularbiology，greenepubl.assoc.&wiley-intersciences中。除了编码修饰的多肽，载体还可编码非修饰的多肽序列，诸如标签或者靶向分子。编码此类融合蛋白的有用载体包括pin载体、编码一串组氨酸的载体、和pgex载体，用于产生可溶性谷胱甘肽s-转移酶(gst)融合蛋白，以便后续纯化和分离或切割。
在备选的实施方案中，本发明的载体主要被设计成将异源核酸分子诸如“有效连接的”或者处于一个或更多个控制序列控制下的基因引入到细胞内。“启动子”指在rna聚合酶ii和其它转录激活蛋白的起始位点周围成簇存在的一个或更多个转录控制组件。还可使用任何启动子/增强子组合(按照真核启动子数据库epdb)以驱动感兴趣的核酸分子的表达(即，组成型表达、诱导型表达、抑制型表达、组织特异性表达)。同样，载体可包含选择标记以利于对它们进行体外(invitro)或者离体(exvivo)操作。载体还可包含多腺苷化信号，其可以从人生长激素(hgh)基因、牛生长激素(bgh)基因、或者sv40得到。此外，载体还可包含内部核糖体结合位点(ires)元件，用于产生多基因或多顺反子信使。ires元件可以绕过5-甲基化帽依赖翻译的核糖体扫描模式并且在内部位点开始翻译(pelletier，j.和sonenberg，n.(1988)nature334(6180)：320-325)。ires元件可与异源性可读框连接。多个可读框可以一起转录，每一个可读框由ires分隔开，从而产生多顺反子信使。借助于ires元件，核糖体可接近每一可读框以有效翻译。使用单一启动子/增强子转录出单一信使，可有效表达多个基因。
在备选的实施方案中，载体是病毒载体。本领域已知的病毒载体包括但不限于，腺病毒载体、反转录病毒载体、牛痘病毒载体、腺伴随病毒载体、多瘤病毒载体、α病毒载体、弹状病毒载体、慢病毒载体、epstein-barr病毒载体、微小核糖核酸病毒载体、或疱疹病毒载体。
在另外的实施方案中，核酸序列可以被包在脂质体或者脂质制剂内。脂质体是囊状结构，其特征在于具有磷脂双层膜和内部的水性介质。多层脂质体具有由水性介质分隔的多个脂质层。当磷脂在过量水性溶液中混悬时，它们自发形成。脂质成分先进行自我重排，然后形成闭合结构，在脂质双层之间包裹水和溶解的溶质(ghosh，p.c.和bachhawat，b.k.(1991)targeteddiagn.ther.4：87-103)。商业可得的脂质体或脂质制剂的一个实例是lipofectamine(invitrogen)。另外的实例包括fugene(promega)、promofectin(promokine)、affectene(qiagen)、polyfect(qiagen)、superfect(qiagen)、和transmessenger(qiagen)。
本文公开的主题还提供治疗需要治疗的受试者的视网膜疾病或病症的方法，该方法通过将包含含有哺乳动物视网膜祖细胞的细胞群的组合物施用到所述受试者的玻璃体腔或者视网膜下间隙内，并且任选地，测量所述受试者的视觉的改变或改善。
在备选的实施方案中，与本发明相关的多种语法形式的术语“治疗”指治愈、逆转、减弱、缓解、最小化、抑制或者停止疾病状态的有害作用、疾病进展、疾病致病因子或其它异常情况。例如，治疗可以包括缓解疾病的一个症状(即没必要是所有症状)或者减弱疾病进展。在备选的实施方案中，术语“预防”意思是指由于施用试剂，诸如本文公开的那些试剂，已经消除了疾病状态或者疾病致病因子的影响。在本语境中相似术语是“预后”。
“患者”或者“受试者”在本文中互换使用并且指治疗的接受者。包括哺乳动物和非哺乳动物受试者。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，诸如人、非人灵长类、犬、鼠、猫、牛、绵羊、猪、或山羊。在一些实施方案中，受试者是人。
本文所述的细胞群和相关组合物可通过多种不同方法向受试者或者患者提供。在某些实施方案中，将它们例如局部提供至实际的或者潜在的损伤或疾病部位。在一些实施方案中，使用注射器或穿刺针在可能的或者实际的损伤或疾病部位注射组合物来提供它们。在另外的实施方案中，全身性地提供它们，即静脉内或动脉内施用至血流内。具体的施用途径很大程度上依赖于被治疗或预防疾病或损伤的部位和性质。因此，本文所述主题包括通过任何已知的且可用的方法或途径，包括但不限于口服、肠胃外、静脉内、动脉内、鼻内、和肌内施用，来提供本发明的细胞群或组合物。基于本领域通常已知和医生获得的信息，可以容易地实现适宜剂量和治疗方案的确定。治疗可包括单次治疗或多次治疗。具体而言，对于预防目的，考虑在某些实施方案中将本发明的纯化的细胞群在可能潜在引起视网膜损伤的应激之后施用。在另外的实施方案中，细胞群和组合物可以单次注射的形式局部地施用至受试者玻璃体腔或者视网膜下间隙。备选地，在实施本文所提供的方法中，可施用组合物或者细胞群2次、3次、4次、或者任意次数。
在备选的实施方案中，本发明的方法包括哺乳动物视网膜祖细胞和包含此类细胞的组合物的分离和表征，所述哺乳动物视网膜祖细胞从供体组织收集、培养生长并且被配制成用于向受试者或患者施用。在一些实施方案中，所述方法包括在局表麻醉下将组合物直接施用至玻璃体腔，而不需对受试者的全身免疫抑制。在备选的实施方案中，不需要移植物的组织分型和与患者或受试者的配型，但是如果希望的话可以进行。组织分型和配型技术是本领域技术人员周知的。
用于实施本发明的视网膜祖细胞和细胞群可以被配制成用于通过任意或者多种方法施用的组合物，所述方法包括经口、肠胃外、通过吸入喷雾、经鼻、局部、鞘内、鞘内、脑内、硬膜外、颅内或经直肠。本文公开的组合物和制剂可包含可药用或可兽医用液体、载体、佐剂和赋形剂，并且可以是液体、片剂、胶囊、埋植剂、气溶胶、凝胶、脂质体、纳米粒子等等形式。
在一些实施方案中，视网膜祖细胞和细胞群可以药物组合物或兽医组合物形式向受试者施用。短语“可药用”指当向动物或者人施用时没有产生不利反应、变态反应或其他不良反应的分子实体和组合物。如本文所使用，“可药用载体”包括任何和所有水性和非水性载体，其包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等等)及其适宜的混合物、植物油诸如橄榄油、和可注射有机酯诸如油酸乙酯。可以通过例如使用包被材料诸如卵磷脂、在分散系情况下通过维持所需粒度、和通过使用表面活性剂，来维持适当流动性。这些组合物还可包含佐剂诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过灭菌过程和通过包含多种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、山梨酸等等，均可以保证防止出现微生物。在组合物中包含等渗剂诸如糖、氯化钠等等可能也是希望的。此外，通过包含延缓吸收的试剂诸如单硬脂酸铝和明胶可以实现可注射药物形式的延长吸收。其必须是制造和储存条件下稳定的并且必须被防腐对抗微生物诸如细菌和真菌的污染作用。此类介质和试剂用于药物用活性物质的用途是本领域众所周知的。
在某些实施方案中，必须向受试者施用有效量的视网膜祖细胞或者细胞群。“有效量”或者“治疗有效量”指产生所需效应的组合物的量。有效量部分地依赖于例如所递送的分子或试剂(此处是视网膜祖细胞或者细胞群)、被使用治疗剂所针对的适应症、施用途径、和受试者或患者的大小(体重、体表面或者器官大小)和状况(年龄和一般健康状况)。因此，临床医生或内科医生可滴定剂量并改变施用途径以得到最佳治疗效果。特定试剂对于特定目的的有效量可以使用本领域技术人员周知的方法确定。对于本文所定义的任何组合物，最初可以在细胞培养分析法中或者在动物模型诸如小鼠、大鼠、兔、狗、猪或猴中估计有效量。还可使用动物模型确定适宜浓度范围和施用途径。然后此类信息可用于确定对于在人中施用的有用剂量和途径。
有效量的本文所述组合物的实例包括体积为5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、50μl、100μl、150μl、200μl、250μl、300μl、350μl、400μl、450μl、500μl或者其间的任何增量、最高至5000μl(5ml)的细胞混悬液。体积的下限和上限受递送系统和/或方法限制。参见例如，kayikcuiglu，o.r.等，(2006)retina26(9)：1089-90。例如，在不进行玻璃体切割术而施用时，由于眼内压会升高，因此体积上限是大约200μl。在进行玻璃体切割术而向玻璃体腔内施用时，体积上限受玻璃体腔容积限制并且可以包含多达5ml或更多。由于视网膜会脱离，因此对于视网膜下注射的上限最多可以达200μl。在备选的实施方案中，这些体积包括以下范围的任何体积：1000至10,000,000个细胞/剂量、或者1000至2000个细胞/剂量、2000至3000个细胞/剂量、3000至4000个细胞/剂量、400至5000个细胞/剂量、5000至6000个细胞/剂量、6000至7000个细胞/剂量、7000至8000个细胞/剂量、8000至9000个细胞/剂量、9000至10,000个细胞/剂量、10,000至15,000个细胞/剂量、15,000至20,000个细胞/剂量、20,000至25,000个细胞/剂量、25,000至30,000个细胞/剂量、30,000至35,000个细胞/剂量、35,000至40,000个细胞/剂量、40,000至45,000个细胞/剂量、45,000至50,000个细胞/剂量、50,000至55,000个细胞/剂量、55,000至60,000个细胞/剂量、60,000至65,000个细胞/剂量、65,000至70,000个细胞/剂量、70,000至75,000个细胞/剂量、75,000至80,000个细胞/剂量、80,000至85,000个细胞/剂量、85,000至90,000个细胞/剂量、90,000至95,000个细胞/剂量、95,000至100,000个细胞/剂量、100,000至125,000个细胞/剂量、125,000至150,000个细胞/剂量、150,000至200,000个细胞/剂量、200,000至250,000个细胞/剂量、250,000至300,000个细胞/剂量、300,000至350,000个细胞/剂量、350,000至400,000个细胞/剂量、400,000至450,000个细胞/剂量、450,000至500,000个细胞/剂量、500,000至550,000个细胞/剂量、550,000至600,000个细胞/剂量、600,000至650,000个细胞/剂量、650,000至700,000个细胞/剂量、700,000至750,000个细胞/剂量、750,000至800,000个细胞/剂量、800,000至850,000个细胞/剂量、850,000至900,000个细胞/剂量、900,000至950,000个细胞/剂量、950,000至1,000,000个细胞/剂量、或者1000个细胞至最高达10,000,000个细胞/剂量之间的任何增量。当然，剂量会根据施用频率和持续时间而变。在备选的实施方案中，本文所述组合物中的细胞剂量包含在小体积内的高数量的细胞，诸如，例如，500,000个细胞/100μl。细胞数量可以通过本领域已知的任何方法，诸如通过血球计数器、分光光度法、coulter计数仪、流式细胞术等计数。给药可实施一次或者可在数次治疗的过程中实施。
在备选的实施方案中，本发明组合物可以被配制成用于肠胃外施用入眼睛内(特别是玻璃体腔或者视网膜下间隙内)、玻璃体腔或者视网膜下间隙、视网膜、脑、神经或者cns内，所述施用通过经巩膜递送，或者通过本领域已知的任何方法或方案，例如包括如美国专利7,585,517中所述的经巩膜递送；如美国专利号7,883,717中所述的用于递送至患者眼睛内部的缓释递送装置；如美国专利号5,378,475或者5,466,233中所述的用于插入到眼睛玻璃体区域的装置；或者通过使用皮下注射器或者斜角插入途径，例如美国专利申请公布号20110112470或20100256597(描述了用于靶向施用至患者眼睛的显微操作针)中所述；或者通过具有大小能通过泪点的亲水聚合物水凝胶，如美国专利申请公布号20100209478中所述；或者能进入人眼睛视网膜下间隙的装置，如美国专利申请公布号20100191176中所述。还可以进行前房穿刺，这由本领域技术人员所确定。在备选的实施方案中，在操作过程中和/或之后，特别是对于玻璃体内放置，所述方法不需要缝合眼球。然而，对于使用玻璃体切割操作的方法，例如当将细胞放置在视网膜下间隙内时，可能需要缝合眼球。
本文公开的组合物还可以被配制成用于鞘内、脑内、硬膜外、皮下、静脉内、肌内和/或动脉内施用；例如，如美国专利申请公布号200500480021中所述；通过注射途径，而且包括多种输注技术。施用可通过使用导管或泵例如鞘内泵或者可植入的医疗装置实现。在备选的实施方案中，本发明方法还可包括施用或者移植包含本文所公开的视网膜祖细胞、细胞群、或者组合物的填埋剂和人工器官、生物反应器系统、细胞培养系统、板、皿、管、瓶和烧瓶等等，诸如在美国专利号7,388,042；7,381,418；7,379,765；7,361,332；7,351,423；6,886,568；5,270,192；和美国专利申请公布号20040127987；20080119909；20080118549；20080020015；20070254005；20070059335；20060128015中描述的那些。
在备选的实施方案中，本文提供的方法可以用于治疗、缓解或者预防视网膜疾病或病症，诸如，但不限于，视网膜色素变性(rp)、莱伯先天性黑朦(lca)、斯塔加特病、乌斯赫尔氏综合征、无脉络膜、视杆-视锥或者视锥-视杆营养不良、纤毛病、线粒体病、进行性视网膜萎缩、退行性视网膜病、年龄相关黄斑变性(amd)、湿性amd、干性amd、地图样萎缩、家族性或者后天获得性黄斑病、视网膜光感受器疾病、基于视网膜色素上皮的疾病、糖尿病视网膜病变、黄斑囊样水肿、葡萄膜炎、视网膜脱离、外伤性视网膜损伤、医源性视网膜损伤、黄斑裂孔、黄斑毛细血管扩张症、神经节细胞疾病、视神经细胞疾病、青光眼、视神经病、缺血性视网膜疾病、早产儿视网膜病变、视网膜血管阻塞、家族性大动脉瘤、视网膜血管病、眼血管病、血管疾病、或者缺血性视神经病；用于改善明(日光)视觉；或者用于改善矫正视敏度，或者改善黄斑功能，或者改善视野，或者改善暗(夜)视觉。
在备选的实施方案中，本发明的治疗方法利用局表麻醉，然而可以在施用过程中使用任何局部、部位或者全身麻醉。适宜在本文所公开方法中使用的局部麻醉的实例包括但不限于，mepricaine、丙对卡因、丙胺卡因、罗哌卡因、苯佐卡因、布比卡因、苦味酸氨苯丁酯、氯普鲁卡因、可卡因、地布卡因、异喹卡因、达克罗宁、依替卡因、海克卡因、氯胺酮、利多卡因、甲哌卡因、普莫卡因、普鲁卡因、丁卡因、水杨酸盐类及其衍生物、酯、盐和混合物。
包含视网膜祖细胞或者细胞群的组合物可以任选地与一种或更多种药物共施用。药物的实例可以包括抗血管发生剂诸如制管张素(angiostatin)、醋酸阿奈可他、血小板反应蛋白、vegf受体酪氨酸激酶抑制剂和抗血管内皮生长因子(抗vegf)药物诸如兰尼单抗(ranibizumab)和贝伐单抗(bevacizumab)、哌加他尼(pegaptanib)、舒尼替尼(sunitinib)和索拉非尼(sorafenib)和任何多种已知的具有抗血管发生作用的小分子和转录抑制剂；各类的已知眼科药物，包括：青光眼药剂，诸如肾上腺素能拮抗剂，包括例如，β-阻断剂诸如醋丁洛尔(acetbutolol)、阿替洛尔(atenolol)、比索洛尔(bisoprolol)、卡维地洛(carvedilol)、艾司洛尔(asmolol)、拉贝洛尔(labetalol)、纳多洛尔(nadolol)、喷布洛尔(penbutolol)、吲哚洛尔(pindolol)、普萘洛尔(propranolol)、美替洛尔(metipranolol)、倍他洛尔(betaxolol)、卡替洛尔(carteolol)、左倍他洛尔(levobetaxolol)、左布诺洛尔(levobunolol)和噻吗洛尔(timolol)；肾上腺素能激动剂或者拟交感神经药诸如肾上腺素、地匹福林(dipivefrin)、可乐定(clonidine)、阿可乐定(aparclonidine)、和溴莫尼定(brimonidine)；拟副交感神经药或胆碱能受体激动剂诸如匹鲁卡品(pilocarpine)、卡巴胆碱(carbachol)、碘化磷酰胆碱(phospholineiodine)、和毒扁豆碱(physostigmine)、水杨酸、氯化乙酰胆碱、依色林(eserine)、二异丙基氟磷酸、地美溴铵(demecariumbromide)；毒蕈碱类；碳酸酐酶抑制剂药剂，包括局表和/或全身用药剂，例如乙酰唑胺(acetozolamide)、布林唑胺(brinzolamide)、多佐胺(dorzolamide)和甲醋唑胺(methazolamide)、依索唑胺(ethoxzolamide)、乙酰唑胺(diamox)、和双氯非那胺(dichlorphenamide)；睫状肌麻痹扩瞳药(mydriatic-cycloplegicagent)诸如阿托品、环喷托酯(cyclopentolate)、琥珀胆碱(succinylcholine)、后马托品(homatropine)、去氧肾上腺素(phenylephrine)、东莨菪碱(scopolamine)和托吡卡胺(tropicamide)；前列腺素类诸如前列腺素f2α、抗前列腺素、前列腺素前体、或前列腺素类似物药剂诸如比马前列素、拉坦前列素、曲伏前列素和乌诺前列酮。
另外的药物实例还可包括抗炎药，包括例如糖皮质激素和皮质类固醇，诸如倍他米松、可的松、地塞米松、地塞米松21-磷酸盐、甲基泼尼松龙、泼尼松龙21-磷酸盐、醋酸泼尼松龙、泼尼松龙、氟米龙、氯替泼诺、甲羟松、醋酸氟轻松、曲安奈德、曲安西龙、醋酸曲安西龙、倍氯米松、布地奈德、氟尼缩松、氟米龙、氟替卡松、氟氢可的松、氢化可的松、醋酸氢化可的松、氯替泼诺、利美索龙和非类固醇抗炎药包括例如阿司匹林、双氯酚酸(diclofenac)、氟比洛芬、布洛芬、溴芬酸(bromfenac)、奈帕芬胺、和酮洛酸、水杨酸盐、吲哚美辛、萘普生(naxopren)、吡罗昔康和萘丁美酮二氟尼柳(nabumetonediflunisal)、依托度酸、非诺洛芬、氟比洛芬、吲哚美辛、酮洛酚(ketoprofen)、甲氯灭酸盐、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、奥沙普嗪(oxaprozin)、吡罗昔康、双水杨酯、舒林酸和托美丁；cox-2抑制剂如塞来考西(celecoxib)、罗非考西(rofecoxib)和伐地考昔(valdecoxib)；抗感染药或抗微生物剂诸如抗生素包括例如四环素、金霉素、杆菌肽、新霉素、多粘菌素、短杆菌肽、头孢氨苄、土霉素、氯霉素、利福平、环丙沙星、妥布霉素、庆大霉素、红霉素、青霉素、磺胺类药、磺胺嘧啶、磺胺醋酰、磺胺甲噻二唑、磺胺异
另外的药物实例还可包括抗病毒剂诸如碘苷、三氟胸苷、阿昔洛韦、西多福韦、法昔洛韦、更昔洛韦(gancyclovir)、伐昔洛韦、缬更昔洛韦、阿糖腺苷、曲氟尿苷和膦甲酸；蛋白酶抑制剂诸如利托那韦、沙奎那韦、洛匹那韦、茚地那韦、阿扎那韦(atazanavir)、安泼那韦(amprenavir)和奈非那韦(nelfinavir)；核苷酸/核苷/非-核苷逆转录酶抑制剂诸如阿巴卡韦(abacavir)、ddl、3tc、d4t、ddc、替诺福韦(tenofovir)和恩曲他滨(emtricitabine)、地拉韦啶(delavirdine)、依法韦伦(efavirenz)和奈韦拉平；其它抗病毒剂诸如干扰素、利巴韦林和曲氟尿苷(trifluridiene)；抗细菌剂包括碳杂青霉烯类(cabapenem)如厄他培南(ertapenem)、亚胺培南和美罗培南；头孢菌素类诸如头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢地尼、头孢托仑、头孢氨苄、头孢克洛、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢替坦、头孢西丁、头孢泊肟、头孢丙烯、头孢他啶、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松、头孢呋辛和氯碳头孢；其它大环内酯类和酮内酯类诸如阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素和泰利霉素；青霉素类(带有和不带有克拉维酸盐)包括阿莫西林、氨苄西林、匹氨西林、双氯西林、萘夫西林、苯唑西林、哌拉西林、和替卡西林；四环素类诸如多西环素、米诺环素和四环素；其它抗细菌剂诸如氨曲南、氯霉素、克林霉素、利奈唑胺、呋喃妥因和万古霉素。
另外的药物实例还可包括免疫调节剂诸如抗变态反应剂包括例如，色甘酸钠(sodiumchromoglycate)、安他唑啉、美沙吡啉(methapyriline)、氯苯那敏、塞替利嗪、美吡拉敏、非尼拉敏(prophenpyridamine)、阿地白介素、阿达木单抗、硫唑嘌呤、巴利昔单抗、达克珠单抗、依那西普、羟氯喹、英夫利昔单抗、来氟米特、甲氨蝶呤、麦考酚酸酯(mycophenolatemofetil)、和柳氮磺吡啶；抗组胺剂诸如氮
另外的治疗试剂可包括神经保护剂诸如罗吡唑(lubezole)、尼莫地平和相关化合物，并且包括血流增强剂、钠通道阻断剂、谷氨酸抑制剂诸如美金刚胺、神经营养因子、一氧化氮合酶抑制剂；自由基清除剂或者抗氧化剂；螯合化合物；凋亡相关蛋白酶抑制剂；减少新蛋白质合成的化合物；放射治疗剂；光动力学治疗剂；基因治疗剂；遗传调节剂；和干眼药物诸如环孢素a、舒缓剂(delmulcent)、和透明质酸钠；α-阻断剂诸如多沙唑嗪、哌唑嗪和特拉唑嗪；钙通道阻断剂诸如氨氯地平(amlodipine)、苄普地尔、地尔硫
另外的治疗剂可包括前列腺素pde-5抑制剂和其它的前列腺素剂诸如前列地尔、卡前列素、西地那非(sildenafil)、他达拉非(tadalafil)和伐地那非；凝血酶抑制剂；抗血栓形成剂；抗血小板凝集剂；血栓溶解剂和/或纤维蛋白溶解剂诸如阿替普酶、阿尼普酶、瑞替普酶、链激酶、替奈普酶和尿激酶；抗增殖剂诸如西罗莫司、他克莫司、依维莫司、唑他莫司(zotarolimus)、紫杉醇和霉酚酸；激素相关药剂包括左甲状腺素、氟甲睾酮(fluoxymestrone)、甲睾酮、诺龙、氧雄龙、睾酮、雌二醇、雌酮、哌嗪雌酮(estropipate)、氯米芬、促性腺激素、羟基孕酮、左炔诺孕酮、甲羟孕酮、甲地孕酮、米非司酮、炔诺酮、催产素、孕酮、雷洛昔芬和他莫昔芬；抗肿瘤剂包括烷化剂诸如卡莫司汀、洛莫司丁、美法仑、顺铂、氟尿嘧啶3、和丙卡巴肼；抗生素样药剂诸如博来霉素、柔红霉素、多柔比星、伊达比星、丝裂霉素和普卡霉素；抗增殖剂(诸如1,3-顺式视黄酸、5-氟尿嘧啶、紫杉醇、雷帕霉素、丝裂霉素c和顺铂)；抗代谢剂诸如阿糖胞苷、氟达拉滨、羟基脲、巯嘌呤和5-氟尿嘧啶(5-fu)；免疫调节剂诸如阿地白介素、伊马替尼(imatinib)、利妥昔单抗和托西莫单抗；有丝分裂抑制剂多西他塞、依托泊苷、长春碱和长春新碱；放射性药剂诸如锶-89；和另外的抗肿瘤剂诸如伊立替康、托泊替康和米托坦。
本文所述的用途和方法可以容易地且持续地恢复和/或维持有临床意义程度的哺乳动物受试者的视网膜的视觉功能，包括但不限于，改善的明(日光)视觉，提高的最佳矫正视敏度，改善的黄斑功能，维持或恢复中心注视，改善的视野，暗(夜)视觉的改善，提高或改善对声音的敏感性，和对侧眼内视敏度的改善。另外的改变可以包括多种全身性益处，例如由于身体改善而导致的外表改变，这可能与光对昼夜节奏、垂体功能、激素释放、血管紧张度的影响有关；改善的视觉能力感觉；改善的走动独立性；改善的健康感；和/或改善的日常生活活动。视觉的此类变化可以通过本领域已知的方法测量。视觉的益处可在治疗后第一周内出现，但是也可在较长阶段内出现渐增的益处。可进行视网膜细胞置换和/或使供体细胞迁移进入视网膜、视网膜回路、或外核层或黄斑内，但是对于临床功效不是必需的；供体细胞移植进入视网膜内是可能的，但是对于临床功效不是必需的。
测量视觉变化，包括源于用本文所公开视网膜祖细胞组合物治疗的视觉的改善，可使用标准眼科检查技术实现，所述技术包括但不限于，眼底检查、最佳矫正视敏度(bcva)、iop、裂隙灯检查、荧光素血管造影术(fa)、光相干断层扫描(oct)、立体眼底照相术、视网膜电图(erg)、视锥闪烁视网膜电图、视野检查(视野)、微视野检查、暗适应、迷宫谈判技能(mazenegotiatingskill)、光动/视动反应、瞳孔反应、视觉诱发电位(vip)、和自适应光学激光扫描眼底镜检查(aoslo)。
试剂盒和说明书
本发明提供包含本发明组合物(例如胎儿神经视网膜细胞的异质混合物)和方法(例如治疗视网膜疾病或病症，或者产生胎儿神经视网膜细胞的异质混合物)的试剂盒，包含其使用说明书。在备选的实施方案中，本发明提供包含本发明的组合物、制造的产品、或细胞的混合物或培养物(例如胎儿神经视网膜细胞的异质混合物)的试剂盒；其中任选地，所述试剂盒还包含用于实施本发明方法的说明书。
本发明提供包含含有本文所述哺乳动物视网膜祖细胞的细胞群的试剂盒，不论是作为培养的、新鲜的或冷冻的细胞提供的，还是作为用于向受试者施用的组合物配制的。所述试剂盒还可以包含用于实施本发明方法的说明书。此类试剂盒可额外地包含结合本文所述视网膜祖细胞的一种或更多种标志物的试剂(例如抗体或寡核苷酸引物)，和基础或者条件培养基。例如，试剂盒可包含：包含对于一种或更多种标志物具有特异性的抗体的第一个容器，其中所述抗体通过例如缀合至荧光标志物或者磁珠而被改造用于分离或检测；和包含基础或者条件培养基的第二个容器。在多个相关实施方案中，所述试剂盒还包含用于制备本发明细胞群的一种或更多种额外试剂，诸如细胞培养基，细胞外基质包被的细胞培养皿，和适宜组织处理的酶。所述试剂盒还可包括关于其用于纯化和扩增从组织样品得到的视网膜祖细胞或细胞群的说明书。在另外的实施方案中，所述试剂盒还可包含用于从患者或者供体得到组织样品的装置，和/或容纳所得到组织样品的容器。
兽医应用
在备选的实施方案中，本发明的组合物和方法可以用于兽医应用；例如本发明证明了猫rpc的第一次成功生长，和对营养不良猫和其它动物例如任何哺乳动物宠物、普通家养和珍贵野生哺乳动物物种、动物园动物、农场动物、体育(例如赛跑用狗或马)动物等等的视网膜的第一次治疗应用。
许多家养动物携带有导致失明的基因，这是广泛地近亲繁殖的结果。这包括猫、狗、和马、和可能的其它物种。在野生和家养动物中存在的视网膜疾病和损伤会从使用本发明的组合物和方法的治疗中受益。
制造的产品，埋植剂和人工器官
本发明还提供包含含有胎儿神经视网膜细胞的异质混合物的一种或更多种本发明制剂或药物的埋植剂和人工器官、生物反应器系统、细胞培养系统、板、皿、管、瓶和烧瓶。
在备选的实施方案中，本发明提供包含胎儿神经视网膜细胞的异质混合物的生物反应器、埋植剂、支架、人工器官或相似装置；例如，如美国专利号7,388,042；7,381,418；7,379,765；7,361,332；7,351,423；6,886,568；5,270,192；和美国专利申请公开号20040127987；20080119909(描述耳埋植剂)；20080118549(描述眼睛埋植剂)；20080020015(描述生物活性创伤敷料)；20070254005(描述心脏瓣膜生物假体，血管移植物，关节盘埋植剂)；20070059335；20060128015(描述肝脏埋植剂)中描述或者与其类似的埋植剂。
本发明参考下列实施例进行进一步描述；然而，应当理解本发明不受这些实施例的限制。
实施例
实施例1：视网膜祖细胞的分离和培养
大约16至19周孕龄(ga)胎儿的整个胎儿眼睛从供体得到并且置于装有含有l-谷氨酰胺(biowhittaker)的rpmi-1640培养基的15ml管中。眼睛在冰上运输4.5小时至约21.5小时的一段时间。同时，抽取供体的血液样品并送去进行针对与外源因子接触的检测。到达后，检查每一个眼球以保证角膜透明并具有正常形状，然后将眼球置于无菌条件下的层流洁净工作台中。整个胎儿眼睛用不同的50ml管内包含抗生素的40ml冷磷酸缓冲盐水(pbs)漂洗三次。然后通过剥离去除视神经和剩余的间充质组织。开展该方法以避免可能的视网膜分离物被不需要的非视网膜来源的细胞污染。剥离之后，将眼睛用包含抗生素的冷pbs再漂洗一次。
在双目镜解剖显微镜下，使用安置有25-5/8号针的1ml“tb”型注射器在每一眼睛的手术角膜边缘(surgicallimbus)处刺一个孔。然后通过使用精细手术剪沿着角膜边缘剪切而周向地打开眼球。前面的结构(角膜、晶状体)和任何剩余的玻璃体从眼杯中去除。然后通过小心地撕开视网膜色素上皮(rpe)来分离出视网膜，并将视网膜转移至装有大约2ml冷dmem/f12培养基的小培养皿中。通过在培养皿中用1ml吸头轻柔地破碎将视网膜组织人工破碎成小片。将视网膜块在悬浮下转移到15ml冷的锥形底的管内，并且通过用1ml冷dmem/f12洗涤培养皿2-3次收集任何剩余的组织并将其加入到该15ml管内。通过以1000rpm(179×g)离心5分钟使组织旋转下沉并丢掉上清液。
然后通过将组织在0.8ml未稀释trypleexpress(invitrogen)中室温孵育40秒进行酶消化。然后用1ml移液器吸头将胰蛋白酶消化的组织上下吹吸。接着通过加入10ml冷的新鲜的无血清细胞培养基来中和胰蛋白酶并通过以1000rpm(179×g)离心4分钟收集混合物。去除上清液并将沉淀重悬于冷的新鲜细胞培养基中，然后通过台盼蓝(invitrogen)拒染法并使用countess(invitrogen)或者人工计数确定细胞生存力和细胞数。得到约10×106个细胞团，其中约80％是小/中细胞团，约9至18％是单细胞，并且约1至2％是大细胞团。该技术导致细胞生存力在92％左右。
然后将细胞接种到两个先前用人(无动物产品)纤连蛋白包被的t75培养瓶中。在一些实验中使用人血浆纤连蛋白(invitrogen)。在另外的实验中，使用鸟氨酸、聚赖氨酸、层粘连蛋白或基质胶。然后使用lowox培养箱将细胞在5％co2和大气氧下或者备选地在3％o2下于37℃孵育。由于细胞随后要传代，因此在培养过程中，要通过胰蛋白酶作用和/或捣碎小心地将细胞团进一步解离以防止过早分化。每1天或每2天，更换90％的细胞培养基并在60-80％汇合，任选40-90％汇合时，使用trypleexpress于37℃作用5至6分钟将细胞传代。加入10ml冷培养基或者冷pbs停止胰蛋白酶作用。通过台盼蓝染色确定细胞生存力并且计数细胞数。然后将解离的细胞以1至6.7×104/cm2的密度接种到新的纤连蛋白包被瓶或板中。
通过先使用trypleexpress收获细胞来制备细胞用于冷冻。通过以1000rpm(179×g)离心5分钟收集细胞。去除上清液并将细胞沉淀重悬于新鲜的培养基或者冷pbs中。确定细胞生存力和细胞数量。随后再次以1000rpm离心5分钟使细胞旋转下沉，并将细胞重悬于细胞低温保存培养基中(90％新鲜的完全培养基，10％dmso)，以0.5至5×106个细胞/冷冻管分装。将冷冻管置于1℃冷冻容器中，然后移到-80℃冰箱中、液氮罐中、或者其他持续低温贮存器中。
为了解冻细胞，将冷冻管从液氮/贮存器中取出并置于37℃水浴中2-3分钟至到冰晶消失。然后立即使用1ml移液器吸头将解冻的细胞转移至冷的15ml锥形管中并用冷的新鲜培养基洗涤该冷冻管两次。将10ml冷的新鲜培养基逐滴加入到该15ml管内，同时轻轻摇动。然后通过以800rpm(115×g)离心3分钟收集细胞，丢弃上清液，并将所得到的细胞沉淀重悬于新鲜培养基中。如本文所述确定细胞数和生存力，然后将细胞接种到新的纤连蛋白包被瓶中并在上面所述的条件下培养。
猫视网膜来源的祖细胞形态示于图1中。如该图中所见，在持续培养过程中的不同时间点形态得以维持。图2图解说明生长于两种不同类型细胞培养基内的猫rpc的生长曲线。在sm中的猫rpc在第10传代日(p10)时衰老，而同样的细胞在ul中继续生长。在p14之后，存在一个生长的向上拐点。
图3中人细胞的形态显示出小的细胞团，其在最初被看到，并且到第一周结束时系统地转变成粘附的单细胞培养物。这通过如上所述在传代过程中的解离实现。通常，最初使用小的或者中等大小的细胞团促进了细胞的生存力，这在完全缺乏血清的情况下是有利的。随后的完全解离同时保持相对高的细胞密度可以促进增殖，同时避免分化。
hrpc生长动力学示于图4和5中。来源于供体的细胞在p4时在临床上使用。在大气氧下观察到的生长是显著的，并且持续至少10代(p10)，然而生长不是无限的。无限生长特性是禁忌的，因为这预示着多能性、永生化和增加的肿瘤发生风险。
测试了多种无血清和无动物产品细胞培养基以确定对于繁殖rpc最佳的条件，包括dmem/f12(标准的、高等的和knockout；invitrogen)、neurobasal(invitrogen)、ultraculture(lonza)和rencell(chemicon)。用于rpc培养的细胞培养基有时在前两周补充有n2补充剂(invitrogen)、b27(invitrogen或者其它商标)、stempro(invitrogen)、维生素c、白蛋白、重组人表皮生长因子(egf)、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、glutamaxi、l-谷氨酰胺、和/或青霉素-链霉素(invitrogen)。如本文所提供的“sm”指基于dmem/f12的标准生长培养基。“ul”在本文中指使用ultraculture作为基础培养基的生长培养基。无血清培养基在抗生素不存在的情况下或者在前两周中存在抗生素、然后在约6周中使用无抗生素培养基的条件下使用。不使用抗真菌剂。图5显示所开展的确定对于rpc最佳的培养基的实验结果。对于基础培养基，将标准dmem/f12——一种补充有n2补充剂、生长因子、谷氨酰胺或glutamaxtm(glutamaxtm)的培养基——与以相同方式补充的“高等dmem/f12”比较。如图6a中所见，同样包含补充的维生素c和白蛋白的“高等”版本的培养基被证明更有效并且将hrpc得率增加了18-29％。
还研究了细胞培养补充的作用。为此目的，还将n2补充剂与b27xeno-free补充剂相比较。图6b显示，补充b27xeno-free的确增加了rpc得率。n2少量增加了得率，并且这些量对于治疗效果是足够的。还测试了额外的维生素c的作用。维生素c补充剂被每2天加入到培养基中。图7a显示，维生素c的确将hrpc得率提高了约30％。虽然高级dmem/f12包含添加的维生素c，但是显然通过额外补充所提供的更高水平的(0.05mg/ml至0.1mg/ml)维生素c有助于hrpc生长。每2天添加新鲜的维生素c是足够的；发现不需要每天添加。最后，测试了白蛋白的添加。将无动物产品人重组白蛋白以1.0mg/ml加入到培养基中，并且当加入到标准dmem/f12基培养基中时观察到增殖增强(最高达27％)，但是当将额外的白蛋白加入到高级dmem/f12基培养基中时没有观察到可检测的提高作用，在该种情况下高级dmem/f12基培养基是偏爱的基础培养基(并且已经包含了所添加的白蛋白)。见图7b和7c。
还通过使用不同渗透浓度(osm)的培养基，结合不同的商业可得补充剂，检查了细胞培养基的渗透浓度。见图8。与通常使用的神经添加剂n2或b27一起时，低渗透浓度培养基(knockoutdmem/f12；276mosm/kg)是不利的，并且在一些情况下导致与正常渗透浓度培养基(dmem/f12；300-318mosm/kg)相比得率显著较差。这表明，如果组合使用不太常用的补充剂，对于低渗透性是有利的(stemprotm试剂盒，invitrogen，数据未显示)。
除了生存力％和增殖速度之外，还开发了预示着最初收集物的最佳(例如体外)结果的额外的度量(metric)，在本文中指“下降的时间(time-to-drop)”。“下降的时间”专门指所解离的细胞在培养生长培养基中下沉到瓶底的时间。保持悬浮(不下降)可能与分离过程的创伤所致的细胞损伤或无生存力有关，并且细胞成功地自我修复与所观察到的恢复细胞膜稳态、正常渗透性等的能力有关，并由此复得负浮力并因此“下降”。延缓的自我修复对于细胞是应激性的并且导致产生活性/健康较差的培养物。使用约90％下降(基于细胞群的％)作为报告标准，观察到对于来自21.5小时运输时间的组织的细胞下降时间为约6小时，对于来自4.5小时运输时间的组织的细胞，下降时间缩短至约1.5小时。立即进行铺板的猫rpc和脑祖细胞，其下降时间为1小时。人细胞可以实现约1小时或者更短的下降时间。
将用于证明患rp的人视觉改善的细胞在大气氧条件下培养。研究了使rpc于低氧条件下生长产生的影响，所述低氧条件密切地模拟妊娠过程中正在发育的胎儿视网膜的氧水平，在该实例中为3％氧(“lowox”)。如图9所示，3％氧(“lowox”)明显地改善了hrpc增殖，以及更加地维持了增殖(在第56天时，p10)，并且大大地增加来自给定供体的总体细胞得率。显示了在大气氧(20％)条件下的生长特性用于比较并且显示出强度明显较差的增殖速度以及更早的生长衰老(第47天，p7)和较低的总得率。图9还显示了对应于在lowox中在大约40％汇合水平时出现的hrpc生长加速的拐点，强调了高密度培养条件对于最佳hrpc生长的重要性。在低氧条件下生长的细胞中观察到相似的结果(图10)。在低氧条价下生长的wcb细胞的生长特性是可再现的(图11)。
还对细胞进行了类固醇毒性试验，因为在移植时经常在患者中使用类固醇。图12显示眼科应用中通常使用的类固醇曲安奈德对于hrpc具有毒性，但是仅仅在超出预期临床用量的水平上具有毒性。临床剂量的曲安奈德似乎对细胞增殖没有影响，但是高剂量(大约>10倍于预期临床剂量)可能会降低供体细胞生存力。
将先前在液氮中冻存的细胞解冻并测试生存力。图13显示冻融实验结果。这些先前冻存的细胞在低氧和正常氧细胞培养条件下均是活的。发现对于两种氧条件细胞的生存力均为大约94％。解冻后的细胞表现出与在连续培养条件下维持的hrpc相似的生长动力学。
实施例2：rpc的表征
免疫细胞化学
将细胞解离并使其在4或8孔腔室培养玻片上生长1-3天，然后在4％多聚甲醛中固定15分钟并在pbs中洗涤3次。将玻片在包含5％驴血清和/或0.3％tritonx-100的溶液中封闭1小时，然后再次用pbs洗涤。然后与一组抗体于4℃孵育过夜以检测祖细胞所表达的抗原。这包括抗巢蛋白抗体(chemicon1：200)、抗波形蛋白抗体(sigma1：200)、抗sox2抗体(santacruz1：400)、抗ssea-1抗体(bd1：200)、抗gd2抗体(chemicon1：100)、抗ki-67抗体(bd1：200)、抗β3-微管蛋白抗体(chemicon1：400)、抗gfap抗体(chemicon1：400)、和抗gdnf抗体(santacruz1：200)。接着与抗小鼠alexa546(invitrogen1：400)、抗山羊alexa488(invitrogen1：400)、或抗兔fitc(chemicon1：800)二抗孵育。使用leica倒置显微镜检测荧光并通过metamorph软件可视化。通过对六个随机选择的视野中表现出特异免疫反应性的那些细胞进行计数来计算阳性细胞百分数，其中dapi用于确定总细胞数。
rna提取
使用rneasy小型试剂盒(qiagen，ca，美国)按照制造商的说明书提取总rna并用dna酶i处理。通过分光光度计(nd-1000；nanodroptechnologiesinc.，wilmington，de)测量光密度(od)来定量rna，其中260nm/280nm为1.90-2.10并且260nm/230nm为1.90-2.20。
微列阵分析
在开始靶材制备/处理步骤之前，通过将少量的每一样品(有代表性地25–250ng/孔)在rna6000nanolabchip上(在agilentbioanalyzer2100(agilenttechnologies，paloalto，ca)上评价)进行检测来评价所有起始总rna样品的质量。使用genechipwtcdna合成试剂盒(affymetrix，inc.，santaclara，ca)和以t7启动子序列标签化的随机六聚物从所分离的rna中存在的聚(a)+mrna合成双链cdna。有代表性地，对于每一样品反应使用100ng总rna起始材料。然后将双链cdna用作模板，以从使用affymetrixgenechipwtcdna扩增试剂盒在t7rna聚合酶存在下进行16小时的体外转录反应产生诸多拷贝的反义crna。在使用随机六聚物的第二轮cdna反应中使用10μgcrna，其被反转录产生有义方向的单链dna。
按照预先准备的方案(affymetrixgenechipwt有义靶标标记测定手册)将单链dna样品片段化(wt末端标记试剂盒，affymetrix)成平均链长60个碱基(范围为40–70bp)。然后将片段化的单链dna用重组末端脱氧核苷酸转移酶和affymetrix受专利保护的与生物素共价连接的dna标记试剂标记。按照推荐的操作步骤，将0.54μg该片段化的单链靶标cdna于45℃与affymetrix人基因1.0st阵列中存在的探针组旋转杂交17小时(affymetrixgenechip杂交炉640)。洗涤genechip阵列，然后在affymetrix洗涤工作站(fluidicsstation)450(洗涤方案fs450_007)上用链亲和素-藻红蛋白染色。使用genechip扫描仪30007g和genechip操作软件v1.4扫描阵列产生cel强度文件。
使用探针对数强度误差(plier)估计方法进行归一化，所述方法包括在关联软件算法内的分位数归一化方案。简言之，上面产生的探针细胞强度文件(*.cel)使用affymetrixexpressionconsole软件v1.1用plier算法进行分析以产生探针水平的总结文件(*.chp)。所使用的算法来自plierv2.0(定量化标度：线性；定量化类型：信号和检测p值；背景：pm-gcbg；归一化方法：分位数略图)。然后使用jmpgenomics4.1(sasamericas)评价微列阵数据。通过单因素anova使用posthoct检验分析数据并且将所得到的p-值使用fdrα<0.05校正。将所得到的数据表进行注释。除了从anova结果产生火山图之外，jmp软件还用于使用默认的快读ward方法产生主成分分析、venn图、以及分级聚类和热作图。
实时qpcr测定
基于对该细胞类型的先前工作，结合与当前研究的潜在关联性选择候选标志物。重点特别放在与神经谱系未成熟细胞有关的标志物上，以及所选的神经和神经胶质分化的标志物上。来自样品制剂的2μg总rna用omniscriptase逆转录物酶试剂盒(qiagen，ca，美国)和10μm随机引物(sigma，mo，美国)根据制造商的说明书进行逆转录。使用7500快速实时pcr系统(appliedbiosystems，irvine，美国)使用powersybr绿(appliedbiosystems，irvine，美国)或者taqman基因表达分析(appliedbiosystems)开展定量pcr。
当使用sybr绿方法时，通过解链曲线分析实现了对来自非特异的产物扩增的目的产物的解析。将β-肌动蛋白或gdnph用作内源对照以归一化基因表达。使用下列一般性的实时pcr方案：变性程序(95℃10分钟)、重复40个循环的定量化程序(95℃15秒和60℃130分钟)、解链曲线程序(95℃15秒和60℃1分钟，连续进行荧光测量)、和最后于40℃的冷却程序。每一反应一式三份开展。画图并通过δδct方法(7500快速系统软件1.4和dataassist2.0，appliedbiosystems，irvine，美国)和jmp软件4.1(sasamericas)分析。所有数据点表示为平均值±标准误差(se)。使用t检验确定统计学差异。当p<0.05时认为数据具有显著性。
细胞毒性研究
将细胞计数试剂盒-8(cck-8；dojindomoleculartechnologiesinc.，gaithersburg，md)用于确定rpc的细胞毒性。该试剂盒使用wst-8，在电子载体1-甲氧基pms存在的情况下发生生物还原作用时，wst-8会产生水溶性的有颜色的甲
被免疫细胞化学(icc)标志物染色的猫rpc细胞显示波形蛋白的高表达水平。见图14。在人rpc中观察到相同结果。包括巢蛋白、波形蛋白、ki-67、β3-微管蛋白、胶质原纤维酸性蛋白(gfap)、和视紫红质在内的谱系标志物显示存在神经元、光感受器、神经胶质，并且证明了rpc培养物具有保留的专能性和异质性。使用标志物转录物的qpcr观察到随时间的猫rpc基因谱。表达谱的动态变化：标志物表达随培养时间量向下变化的大体趋势，正如也在人prc中观察到的那样。见例如图15。还通过qpcr比较了ul和sm细胞培养基条件之间的基因表达(图16a)。由于猫祖细胞(rpc和bpc两者)的增殖不能在sm培养中良好地持续，所以对比较基因表达开展了研究。使用sm在第13天时用作比较的基线(设置成“1.0”)，在培养第31天时比较在sm和ul中生长的猫rpc。所检查的大多数标志物显示表达随着培养时间降低，然而sm培养物显示gfap表达明显升高，这与进行性丧失专能性和沿着神经胶质谱系受限的趋势相一致。在ul培养基中的细胞没有显示出这一特点。
还比较了猫rpc与脑祖细胞(bpc)。见图16b。与bpc相比，猫rpc显示出一些标志物具有相对增加的表达；这些标志物包括参与视网膜特化和发育的转录因子dach1、lhx2和pax6，以及也参与视网膜发育的转录因子hes1和hes5。cd133、巢蛋白、sox2、波形蛋白是一般的cns祖细胞标志物，而β3-微管蛋白、map2和pkcα是谱系标志物。
将猫rpc移植至营养不良埃塞俄比亚猫的视网膜下间隙并且对分离的移植后细胞进行染色。见图17。细胞在移植至视网膜下间隙中存活，并且还显示具有迁移入受体视网膜内的能力。植入的细胞显示具有分化成似乎是mueller神经胶质的能力，通过形态学和通过波形蛋白标记均如此。mueller细胞是视网膜特异性的神经胶质并且跨整个视网膜厚度延伸提供结构稳定性。它们对于众多的视网膜功能包括神经元存活是重要的。
通过icc使用标志物表达确定了人rpc的形态。图18和19显示了所培养细胞群内某些关键标志物的表达百分比。巢蛋白表达被确认并且据信与神经干细胞/祖细胞和rpc有关。波形蛋白被该细胞群极大量地表达，但是据信其表达对于rpc是非特异性的。sox2是也与神经发育有关的转录因子并且也存在于hrpc中。ssea-1(也称作cd15、lex)已经与es细胞的多能性相关联；研究显示该标志物由专能脑和视网膜祖细胞(rpc)(非多能性的)的一个亚组表达。还在hrpc中观察到gd2-神经节苷脂的表达。ki-67是活跃增殖的标志物并且用于证实该实施方案的细胞在临床使用时是增殖性的并且是有丝分裂活跃的。该标志物的存在将hrpc与有丝分裂后的前体细胞群分别开(surani，m.a.和mclarena.(2006)nature443(7109)：284-285)。在oct4表达相对不存在的情况下，ki-67将rpc与有丝分裂活跃的多能干细胞(es，ips)区别开，所述的有丝分裂活跃的多能干细胞对于移植是不安全的，除非经历进一步的分化。ki-67活性水平也使得可以监测分离的hrpc培养物的质量(健康和适合性)。β3-微管蛋白是神经元发育的标志物并且被发现在培养物中中等水平表达，暗示着神经谱系的决定和分化成神经元的潜能。由于神经元形成倾向于在高传代数时丧失，所以该标志物的表达可以证实培养物保留了专能性。gfap是通常与神经胶质分化特别是星形细胞有关的标志物，但其也在多种扰动之后或者在培养中被视网膜mueller细胞表达。同样地，观察到的gfap表达的低百分比提示自发分化成神经胶质细胞的速度并且帮助我们确认培养物保留了专能性，然而还已知未成熟的祖细胞也表达gfap。在一些动物模型中，gdnf是与拯救神经元(包括光感受器)有关的神经营养因子，并且通过icc显示如本文所述分离的hrpc细胞群表达该因子，然而阴性的elisa数据表明该因子不必然被分泌。另外的因子可能对于rpc-介导的光感受器拯救更重要。
值得注意的是，如通过rna水平的标志物表达所示，可以将hrpc与成纤维细胞(hfb)区别开。见图20，其显示qpcr热作图，其证明波形蛋白是由hrpc而非成纤维细胞极高度表达的标志物，并且还显示了相对表达谱随培养时间的动态变化。图21a-21c显示了比较hrpc与hfb的qpcr实验结果并且扩展了标志物检测。鉴定出了在rpc中更高的多个基因(aqp4、cd133、gfap、map2、mash1、巢蛋白、notch1、恢复蛋白、six6、sox2)、和更低的1个基因(klf4)(因此在hfb中更高)。表达水平随培养时间而变，但是在细胞类型之间的相对优势度相当一致。图22包括在不同供体之间表现出一致行为(在hrpc对hfb中)的一列11个基因(来自所使用的约26个基因的谱)。在所有3个供体中一致的基因用黄色突出显示，为下述基因：klf4(rpc<fb)；和gfap、map2、巢蛋白、恢复蛋白、six6、和sox2(rpc>fb)。
通过实时qpcr将所选择标志物的表达水平作为培养时间的函数画出迹线。如图23中所示，高表达的标志物倾向于随时间从峰值表达水平下降。例如，ki-67倾向于随时间而下降，这与祖细胞状态和缺乏永生化一致。mhc和gdnf表达显示随培养时间少量增加。测试了早期与晚期世代细胞中标志物表达水平的变化，其结果示于图24中。细胞周期基因和six6(对于视网膜发育至关重要的转录因子)在晚期世代细胞中被最强地下调。相反，神经保护因子gdnf倾向于在晚期世代中被上调，这可能是细胞应激的结果。
图25中显示了区别(人)rpc与神经干细胞(bpc)的微列阵数据总结。主成分分析显示rpc数据组(3)与bpc(3)的明显分开，说明作为细胞群类型的rpc可以基于它们的转录组与类似的脑来源细胞类型诸如bpc区分开。火山图显示这种差异的基础，其形式是：与bpc相比，在rpc中接近于1000个转录物被显著上调，以及约600个转录物被显著下调。使用转录物树形图根据具体的基因分类进一步进行比较并且鉴定特异的基因。例如，转录因子bhlhe41(碱性螺旋-环-螺旋家族，成员e41)被rpc高度表达，而被bpc极低表达。该基因编码属于碱性螺旋-环-螺旋因子的毛状/分裂增强子(hairy/enhancerofsplit)亚家族的转录因子。所编码的蛋白质作为转录阻抑物起作用。相对于bpc被rpc优先表达的其它转录因子包括hhex、sox3和sox13、hoxb2、lhx2、klf10、tle4、mycbp、tfap2a、fosl1和2、foxd1、nhlh1、gbx2、neurod、met等。至于信号分子，众多转录物显示在rpc中比在bpc/神经干细胞中显著更高地表达，包括wnt5a和b、kdr、lif、calb1、rgs4、cav2、il11、il1r1、il1rap、il4r、il21r、cxcl6和12、cxcr7、dkk1、hbegf、smad7、bmp2等。类似地，ecm基质基因纤连蛋白、lum、alcam、tgfbi、ecm1、parva，以及胶原4a1、4a2、5a1、5a2、7a1、9a2、13a1、18a1，和许多种其它ecm基因也被rpc优先表达。
开展了测试hrpc在用视黄酸(ra)分化之后标志物表达的实验；结果示于图26中。将在标准增殖培养基(sm)中生长的hrpc的基因谱与基于ra的分化条件(无gf的sm+ra)进行比较。增殖标志物ki-67降低了，波形蛋白也如此，而肿瘤阻抑制因子基因p21连同谱系标志物像aipl-i、map2、nrl、cralbp、gfap和恢复蛋白一起增加。神经胶质和神经元标志物均增加与所培养rpc细胞群的专能性相一致。可用于实施本发明以鉴定hrpc细胞的其它标志物描述于美国专利号7,419,825中。
此外，测试了在低氧条件下相较于在大气氧条件下生长的hrpc的基因表达(图27)。数据表明存在可检测的基因表达改变，其中表面标志物cd9和cd73上调，但是主要观察到基因下调，包括肿瘤阻抑制因子基因p21以及谱系标志物cralbp、gfap、map2、nrl、和恢复蛋白。这些改变与非必需基因表达降低最为一致，因为在这些许可条件下细胞以持续方式增殖。gdnf也下调，可能是因为对于自分泌神经保护的需要降低。
测试了来源于不同供体并在多个细胞培养基条件和时间点下培养的hrpc之间的基因表达的差异，并且结果示于图28-30中。图28a显示在sm条件下在不同时间点通过qpcr检测的基因表达的实验结果；图28b图解说明在sm-ul(最初是ul，然后是sm)条件下在不同时间点时通过qpcr检测的基因表达；图29a图解说明在sm-fbs(最初是sm+fbs，然后是sm)条件下在不同时间点通过qpcr检测的基因表达。图29b图解说明仅sm下，在2个不同时间点通过qpcr检测的基因表达。大多数测试的标志物显示随培养时间表达降低，而一些标志物保持大致水平。值得注意的是，在所测试的标志物当中，仅gdnf随培养时间表达增加。图29c图解说明在sm(在最初的sm+fbs之后)下在相同的2个时间点通过qpcr检测的基因表达。如图29b中所示，仅gdnf升高。图30示出这些时间点比较的总结。
qpcr用于对于生长因子途径进一步表征hrpc并且针对的是分泌因子的相对表达。具体系列包括血管发生和wnt信号传导途径。在这些实验中使用的细胞来源于在正常氧(20％氧)和低氧(3％氧)条件下生长的低世代hrpc；来源于工作细胞库，所述工作细胞库包括在低氧条件下生长的更高世代的hrpc；或者来源于第0天(捐赠当天)的人胎儿视网膜组织，其代表hrpc的基线起点。人胎儿rpe(hrpe)细胞和人胎儿成纤维细胞(hfb)用于比较。
图31是用于生长因子途径研究的qpcr数据的热作图分析。每一垂直列是不同的细胞类型或者处理条件。人胎儿rpe和成纤维细胞用作比较物(前2列)，右边的3列是hrpc。在3个hrpc库中的2个hrpc库中显著高表达、且在另一个hrpc库中中等表达、但不被rpe或fb中表达的一个细胞因子是spp1(骨桥蛋白，opn)，其当前是作用因子的营养机制主要的候选物。另一候选物是ptn(多营养因子)，其也高度表达，但该因子似乎比spp1(opn)特异性低。就表达水平而言，来自该数据的其它潜在的候选物是mdk(中期因子(midkine))、tgfb1(tgfβ1)、jag1、vegfa(vegfa)、pgk1(磷酸甘油酸激酶1)，并且在不同的程度上，候选物也可以是其他因子，诸如gdf11、dkk1、ppia(肽酰脯氨酰异构酶a)、和lif等，这取决于所使用的标准。同样，b2m(β2-微球蛋白——mhci类的一种成分)本质上不是细胞因子，但是由hrpc强烈表达并且是mhci类的成分。
当强调特异性时，树图聚类显示从hbegf(肝素结合egf-样生长因子，hb-egf)、jag1、下至spp1(opn)所列的那些均显示对hrpc而非对胎儿hrpe和胎儿hfb的总体特异性，并且因此促成了混杂的“鸡尾酒”效应。这包括ptn，以及低水平的il1b(白细胞介素1β)。也可能20％mcb具有最大的营养效力，在这种情况下，从mdk、下至lefty2所列的因子将令人感兴趣。ubc(遍在蛋白c)也被检测到了。这些基因中的许多基因已知在视网膜发育中起作用，包括gdf11、lefty、nodal、dkk1、lif等。许多基因已知是神经营养性的，包括spp1、ntf3、hb-eg，或者与神经发育有关，诸如中期因子、神经调节蛋白(nrg1，3)、jag等。
在图32中提供了来自生长因子途径研究的qpcr数据的另一幅图，在此处作为直方图。人胎儿rpe细胞用于比较。就表达水平而言在数量上看，显示由hrpc特别高表达的分泌型基因包括fgf9、gdf10、il-1a(白细胞介素1α)、ptn、和spp1(骨桥蛋白，opn)。发现所有这些基因被归为似乎是热作图中相对hrpc特异的簇(上面)的组，并且因此被认为是介导营养机制的候选物。显示较低的相对表达但仍然升高的其它基因包括bmp2、fgf7,13,14、lefty1,2、nodal、ntf3、血小板生成素和可能的vegfa,c。相对于hrpe，被hrpc优先下调的基因是jag2、ngf、抑制素βb(inhbb)、和il-10。
在视网膜血管发生之前和期间rpc是活跃的并且因此预期在血管发生中起作用，尤其是当它们开始分化时。参与调节血管发生的分子途径的因子和受体在变性视网膜环境中可能也是潜在神经营养性的。同样地，对这些途径的活化或抑制在一系列视网膜病(包括amd)中是重要的：要么是有益的，要么作为不希望的副作用。
图33a中所示的所有基因比在rpe中上调至少10倍。上调超过100倍的基因包括vegf受体kdr、软骨调节素/lect1(仅低氧条件)、转录因子prox1、和受体tek(tie2)。与在rpe中相比具有最高表达的因子是多营养因子(ptn)，对于低氧hrpc超过10,000倍，而对于正常氧细胞则接近该倍数。
发现了血管发生相关基因表达增加的明显证据和对最佳营养因子候选物之一ptn的高水平表达的额外确认。在先前筛选中鉴定出的表面标志物kdr和tek表达升高也在此处得以证实。一致地发现vegf受体kdr在rpc中相对于在其它细胞类型中升高。微列阵数据还显示，kdr表达在hrpc中比在hbpc(脑祖细胞)中高出80倍，并且在猪rpc中比在bpc中高出106倍。因此，kdr是有可能用于rpc鉴定和富集的表面标志物，是区别rpc与bpc(神经干细胞)的方式并且可能对于rpc功能是重要的。
据信wnt途径对于神经发育(包括整个cns中并包括视网膜在内的神经元和神经胶质的分化)是重要的。基于wnt相关基因(包括wnt、“frizzled”受体和wif(wnt抑制因子))的基因表达水平，基因组研究先前已经发现wnt途径在hrpc中有活性的相当多的证据。在图33b中，与rpe相比，所示的所有基因上调至少10倍。上调超过100倍的基因包括frzb、sfrp4(正常氧)、tle2(仅低氧)、和wnt7b(正常氧)。sfrp4(低氧)和wnt7b(低氧)均以大于1000的水平上调。恰好达到10,000倍变化的是wif1(仅低氧)，其显示表达改变约10,000倍。
总之，通过微列阵分析发现了wnt途径基因表达(包括wnt抑制基因的突出表达)的明显证据。先前的微列阵数据已经显示wif1优先由hrpc表达，该表达比由hbpc(脑)表达高出45倍。sfrp4且特别是wif1的显著上调(均可能起因于frzb活化)似乎是在低氧条件下生长的hrpc的特性。这与hrpc更好地维持未成熟状态和在低氧条件下增殖达延长阶段的能力有关，因此巨大地增加了那些难以生长的细胞的得率。有意义的是，上面所给出的qpcr数据与先前从微列阵得到的结果相互交叉。这显示：lif、hb-egf、dkk1(dickkopf1)、骨桥蛋白(spp1，opn)、tgfβ1、bmp2和jag1优先在hrpc中表达，该表达比在hbpc(脑)中的表达分别高出65倍、30倍、23倍、6倍、5倍、5倍和3倍。这些基因中的每一个基因均是hrpc与类似脑干细胞/祖细胞(神经干细胞)的组成/特性中的重要因子，kdr也如此，程度甚至更大(80倍)，并且wif也如此(45倍)。
来自微列阵数据的主成分分析(pca)数据显示基于总体基因表达模式区分细胞群(治疗的、非治疗的/对照)的能力。这也与通过显示样品的密切相关程度以及年龄(培养时间)和培养条件(正常氧与低氧)影响表达模式的程度对hrpc的表征有关。
3对胎儿眼(生物学重复)在同一天得到并且在第0天提供rna(视网膜组织)并且还用于生长rpc(正常氧和低氧)以及巩膜成纤维细胞。稍后从培养的细胞群提取rna并且全部送去用于同时进行微列阵分析。
图34a描述pca数据，其清楚地显示培养的rpc在基因表达方面与衍生它们的胎儿视网膜组织不同，而且与巩膜成纤维细胞也不同。rpc与成纤维细胞相比更接近胎儿视网膜。此外，正常氧和低氧rpc可以被区分开，尽管它们看上去形成一个连续体，其中年轻细胞在一端并且年老细胞在另一端。在图34b中，hrpc与p0来源视网膜组织被清楚地区别开。
培养时间的影响是明显的，因为最老的细胞(低氧wcb)可以与其他年轻的样品区别开。正常氧和低氧条件之间的差异没有显示出有力的区分。
开展全基因组微列阵研究以表征与其他细胞类型相比hrpc的组成，包括它们与来源组织(胎儿视网膜)以及与严重紊乱的和危险的致瘤类似物即成视网膜细胞瘤(rb)如何不同。同样地，开展研究以描绘在正常氧和低氧hrpc培养物之间的相似性和差异。在affymetrix人基因芯片上比较了细胞群的总体基因表达。
主成分分析(pca)提供了细胞样品群之间总体相似性和差异的直接的三维可视化。见图34c。相似样品被归为一组(均是相同的颜色，均是一式三份)表明了数据的可靠性。与4个不同hrpc样品相比，观察到与胎儿视网膜组织(“视网膜”)之间明显的分离。rpc在每一处理条件下多少有点差异，然而它们与所测试的其他眼睛细胞类型即胎儿rpe、胎儿fb和rb均分开。可以划线分开神经视网膜和神经视网膜衍生细胞(左)与非神经视网膜细胞(右上)。最后，正常氧和低氧hrpc彼此相对接近，尽管有可能在一些程度上区分它们，但它们似乎是密切相关的。所显示的数据与先前关于这些不同细胞类型的相对相似性/差异的数据一致。图35显示3个hrpc群(顺序为：低氧mcb，正常氧mcb，低氧wcb)相对于胎儿视网膜组织的聚类分析(对于每一群一式三份使用)。图35是火山图，显示低氧mcb和组织之间的比较实验的结果。数据显示，hrpc群可以与原始组织群相区分。除少数例外外，在组织(右列)中显示为红色的基因在rpc中是绿色的，反之亦然。
图37a显示随处理条件而异的在hrpc组之间差异表达的基因数(胎儿视网膜组织用作比较物)。大多数的差异可以通过相对于组织的变化解释(11,706，中心，灰色)，其为rpc群共有，而在图的周围观察到个别的重叠和差异。每一hrpc群表达约1300-2100个不同基因。在hrpc组之间差异表达的基因数作为传代和处理条件的函数进行测量。见图37b。在正常氧条件下生长的细胞也进行了比较。低氧mcb与正常氧mcb(相同传代数)的差异比其与处于更晚传代数的低氧wcb的差异小。因此，培养时间的确对hrpc中的基因表达具有明显的影响，尽管该影响远远小于细胞类型之间的影响，或者hrpc与来源组织之间的影响。
图38a和38b是显示不同的hrpc相对于来源组织的火山图，而图39a和39b中的火山图显示低氧hrpc相对于正常氧的。“火山”代表一种类型的图，其中每一基因作为一个数据点显示，相对于变化倍数(上升或下降，x轴)和统计学显著性(p-值的函数，y轴)绘制，提供发生变化的基因数目、变化程度和变化方向(上升相对于下降)的概貌。结果表明与hrpc条件之间相比，从组织至hrpc一致性改变的基因数量更多。在从组织至hrpc中，下调的基因比上调的基因更多，据推测，这是因为在组织中存在的分化程度更高的细胞类型在培养中丢失或者其生长被更原始的增殖类型超过。然而，当比较低氧与正常氧时，在低氧条件下相对于在正常氧条件下更多基因上调。
还通过微阵列分析检查了特定的基因和途径。比较了hrpc、胎儿视网膜组织(第0天)、和人胎儿成纤维细胞(正常氧)。肾上腺髓质素在hrpc中相对于在组织中上调。多营养因子被发现在hrpc中相对于在组织和hfb中上调。骨桥蛋白在hrpc中相对于在hfb中上调。还发现血管发生途径上调。血管生成素一般在hrpc中相对于在组织中升高，并且在hfb中以较小的程度升高。angptl4在hrpc中相对于在组织中上调30-60倍，并且相对于在hfb中上调约20倍。bai3(抑制剂)下调，在hrpc中相对于在组织中减少约30倍。血小板反应蛋白1在hrpc中相对于在组织中上调约100倍，而血小板反应蛋白2在hrpc中相对于在组织中上调约40倍。基质金属肽酶1在hrpc中相对于在组织中上调约200倍。粘附分子ncan(神经蛋白聚糖)在hrpc中相对于在组织中下调16-21倍。还测量了癌基因/增殖相关基因myc、mycn、和nbl1。myc在hrpc中相对于在组织中上调8-9倍，这与hrpc增殖一致。mycn(v-myc相关的，成神经细胞瘤)在hrpc中相对于在组织中下调25-40倍。nbl1下调3-4倍。广范围的线粒体/代谢基因，包括atp合酶h+转运体和溶质运载体家族25，一般均在hrpc中相对于在组织中上调2-4倍，然而slc25a27(成员27)下调约20倍。这些数据与培养的hrpc比来源胎儿视网膜组织中的细胞在代谢上更活跃并且增殖更强的观念一致。
还检测了生长因子表达。ctgf(结缔组织生长因子)在hrpc中相对于在组织中强力(>70倍)上调。lif(白血病抑制因子)在hrpc中相对于在组织中类似地上调。bdnf和egf在hrpc中相对于在组织中中度(2-14倍)上调。cntf在hrpc中相对于在组织中下调约25倍。fgf9，基于先前的研究其是候选的营养因子，被证实在hrpc中相对于在hfb中上调(4-6倍)，然而相对于在组织中降低14-25倍。fgf5是在hrpc中相对于在组织中上调最大的(20-40倍)的家族成员，然而fgf5表达相对于在hfb中更低。fgf14相对于在组织中下调最多，为16-38倍。hgf(肝细胞生长因子)相对于在hfb中下调30倍。胰岛素样生长因子结合蛋白家族成员即igfbp3、igfbp5和igfbp7一般在hrpc中相对于在组织中上调。成员3、5、7均强力上调(15-110倍)。igfbp3和5上调最强，特别是在低氧细胞中(mcb，wcb)。ntf3是候选的因子，相对于在组织中没有升高，但是在正常氧hrpc中相对于在hfb中升高8倍。ntrk2(神经营养酪氨酸激酶，受体，类型2)在hrpc中相对于在组织中少量上调并且在所有hrpc中相对于在hfb中强力上调(50-180倍)。pdgfc(血小板来源生长因子c)是另一个候选营养因子，其相对于在组织中上调20倍。vegfa(vegfa)在低氧hrpc中少量上调。dach1相对于在hfb中少量升高，但是在hrpc中相对于在组织中强力下调。dlg2(突触标志物)也在hrpc中相对于在组织中强力下调。klf家族成员显示相对于在hfb中klf4下调(3-4倍)，并且相对于在组织中klf5上调(4-5倍)。
neurod1(与分化相关的转录因子)相对于在组织中极其强力地下调(>300倍)，neurod4和神经元素(neurogenin)1(和2)以及neuronatin(2-10倍)也如此。命运决定相关因子(fatespecification-associatedfactor)nog(noggin)在hrpc中相对于在组织中强力表达(10-21倍)。otx2(眼转录因子)在hrpc中相对于在组织中极其强力下调。pax6、six3、six6、rax、rax2(眼转录因子)仅在hrpc中相对于在组织中少量下调。已知pax6至少由至少一些rpc表达。
dcx(有丝分裂后的成神经细胞标志物)和迁移性成神经细胞标志物reln(颤蛋白(reelin))相对于在组织中(reln(颤蛋白)在低氧hrpc中)强力下调。sox2——一种重要的神经发育转录因子——相对于在组织中无变化，但是在hrpc中相对于在hfb中极其强力上调(>100倍)。basoon——一种成熟视网膜突触标志物——和恢复蛋白(成熟视网膜细胞标志物)相对于在组织中强力或者极其强力下调(分别为20倍和50-450倍)。
表面糖蛋白cd44在hrpc中相对于在组织中上调6倍。ccl2趋化因子(mcp-1)在hrpc中相对于在组织中强力上调(68-105倍)。cxcl12(sdf-1)是(非特异性的)hrpc表面标志物cxcr4的配体。与hfb相比sdf-1下调，因此表达低(如从elisa中所知)，然而，其在hrpc中相对于在组织中升高4-12倍。cxcr4是hrpc的表面标志物并且在hrpc中相对于在hfb中明显上调。与组织相比的意义在于：在正常氧mcb中比在组织中更低，但是在低氧细胞中相似。这证实两种hrpc条件均表达cxcr4，其中在低氧条件下表达更多，并且在视网膜组织中与在低氧细胞中相似。
il-11和il-18相对于在组织中上调。il-1a(il-1α)相对于在组织中上调，尽管对于低氧mcb“情况不是这样”。许多il受体相对于在组织中上调，最突出的是il-7r(60-105倍)、il-31ra(28-80倍)、和il-4r(18-40倍)。这些均代表着hrpc相对于来源组织的潜在阳性标志物。
相对于在组织中上调的wnt途径基因包括一些先前通过qpcr鉴定的基因，包括wnt7b和sfrp4。在hrpc中相对于在组织中也上调的基因是dkk2、fzd6、sfrp1、wnt5a。wif1相对于在hfb(对于低氧的)中强力上调，然而相对于组织(对于正常氧的)中强力下调。notch途径基因相对于在组织中下调或无变化，jag1除外，jag1是候选的hrpc营养标志物，其被上调(8-13倍)。下调最强的是dll4和heyl。
jak-stat基因相对于在hfb中中度但一致性地下调(2-5倍)，stat3除外，其对于在低氧hrpc中相对于在fb中无变化。它们相对于组织无变化。凋亡基因的情况是复杂的。相对于在组织中升高最大的是gadd45b。更加突出的是，gadd45g和dapl1下调(20-56倍)。bmp2(候选物)相对于在hfb中上调，但是相对于在组织中没有观察到变化。其它bmp一般相对于在fb中降低并且相对于在组织中也没有变化。tgfβ基因自始至终没有变化。
hif1a(hif1α)相对于在组织中中度下降(4倍)。神经毡蛋白(neuropilin)1，尤其是神经毡蛋白2似乎增加(低氧mcb除外)。rictor相对于在组织中少量降低(2倍)。toll样受体3-7和9相对于在组织中未变化。dcx相对于在组织中强力下调，许多其它神经标志物也以较低的程度相对于在组织中下调，下调次强的是nrxn1(神经元表面蛋白1(neurexin1)，>25倍)。gfap相对于在hfb中明显上调，相对于在胎儿视网膜组织中上调明显程度低。大量的视网膜相关基因在hrpc中相对于在来源胎儿视网膜组织中强力下调。这些基因包括crx、eys、impg1,2；nrl、恢复蛋白、rgr、rp1、和vsx1,2。在所检查的98个小的非编码rna(snord)中，相对于在组织中几乎全部下调，有时是强烈地下调，但114-6、49b、75、和78除外，其中114-2、44、49a、74、79、96a是提示性的，但是在各个条件之间多少有点不一致。尽管如此，上调没有达到高水平。
总之，数据表明，ctgf是hrpc标志物并且可能有助于确定治疗效果背后的营养机制。其它的此类标志物包括spp1(opn)、ptn、lif、fgf9、jag1、il-1a、il-11、il-18、和noggin。ntrk2神经营养蛋白受体是hrpc表面标志物，白细胞介素受体il7r、il-31ra、和il-4r也是hrpc表面标志物。值得注意的是，hgf似乎具有作为hrpc阴性标志物的潜能，或者备选地，用于检测污染细胞类型的方法中的潜能。眼转录因子dach1、otx2、crx、nrl、vsx1,2和分化转录因子neurod1(和4)、有丝分裂后成神经细胞标志物双皮层蛋白(doublecortin，dcx)、突触标志物dlg2、许多notch途径基因、神经元表面蛋白1、以及成熟视网膜标志物恢复蛋白和光感受器间基质基因impg1,2的下调也可用于区别培养的hrpc与来源组织。表达这些标志物的细胞更特化、更成熟和增殖较差，并且因此其丰富程度远不如在增殖性hrpc培养中的。cpa4高度上调，而par4和一长列的snord下调。
对于猫rpc得到相似的数据。在图40中，提供了测试细胞培养条件随时间的实验的图表总结。图41-44显示在不同时间点通过qpcr测量在ul培养基中的猫rpc的基因表达的实验的结果。值得注意的是，在ul培养基中，所测试的标志物下调，其中祖细胞标志物巢蛋白和波形蛋白显示表达比第0天基线升高。细胞周期蛋白d2在第0天基线后的时间点在ul中升高。对于猫crpc，所测试谱中的表达改变模式在图45中作为辐射图给出。具有高拷贝数的基因靠图中心，而具有较低表达的基因在周围。从12点处的巢蛋白沿顺时针(辐射图上)至6：30处的波形蛋白列出了祖细胞标志物。也显示了谱系标志物。注意到在第0天时在标志物当中表达倾向于最高(深蓝色)，并且随着时间的推移，一些标志物(但不是全部标志物)的表达降低。表达降低最大似乎出现在从第0天至培养中所测量的第一时间点(第31天)。在谱系和祖细胞标志物的一个亚组中观察到表达降低。总结猫rpc表达数据的图表示于图46中，其描绘了不同的供体和培养条件下的qpcr数据。
为了表征hrpc和潜在作用机制(即神经保护作用)，开展了酶联免疫吸附测定(elisa)。通过多重测定法或者夹心elisa开展这些研究。对于多重elisa测定法，将测定缓冲液加入到96孔滤板中并将板置于摇床上10分钟。然后通过真空将板清空并且向每一孔内加入25μl测定缓冲液或者其它适宜缓冲液，其中向适当的孔中加入25μl标准物/样品/对照。然后加入包含缀合至珠上的所需要细胞因子(1：50稀释)的25μl混合物。然后将板置于摇床上4℃过夜。然后将板洗涤3次。加入检测抗体并将板置于摇床上室温摇动1小时。然后向每一孔内加入25μl藻红蛋白(1：25稀释)，在摇床上摇动30分钟。然后将板洗涤3次并且向每一孔内加入150μlsheath流体。然后使用luminex100阅读器和softmaxpro软件读板。使用millipore’sbeadlyte软件计算数据。
对于夹心elisa，通过双抗体elisa使用生物素-链霉亲和素-过氧化物酶检测测量标志物。聚苯乙烯板用捕获抗体于25℃包被过夜。将板用50mmtris，0.2％tween-20，ph7.0-7.5洗涤4次，然后用测定缓冲液于25℃封闭90分钟。将板洗涤4次，并将50μl测定缓冲液连同50μl的在测定缓冲液中制备的标准物或样品加入到每一孔中。然后将板于37℃孵育2小时。将板洗涤4次并加入100μl在测定缓冲液中的生物素化检测抗体并于25℃孵育1小时。洗涤板4次之后，加入在酪蛋白缓冲液中的链霉亲和素-过氧化物酶聚合物(rdi)并于25℃孵育30分钟。将板洗涤4次并加入100μl商业制备的底物(tmb；neogen)并于25℃孵育约10-30分钟。用100μl2nhcl终止反应并在微孔板阅读器(moleculardynamics)上读取a450(减去a650)。使用计算机程序(softpro；moleculardynamics)拟合标准物曲线并且从标准曲线方程式中计算每一样品中的细胞因子浓度。数据反映出来自平均样品的蛋白质分泌。在标准正常氧(20％o2)以及低氧(3％o2)条件下评价5个候选营养因子gdnf、bdnf、vegf、opn、和sdf-1的表达。
在图47中，发现gdnf表达在分泌蛋白水平(<0.1pg/ml)是不可检测的。bdnf表达在低限范围之外(oor)，但是刚好可检测到，对于正常氧条件平均浓度为1.58pg/ml，并且对于低氧条件平均浓度为0.55pg/ml。对于正常氧(20％o2)条件，vegf在低限范围之外，但是对于低氧(3％o2)条件，vegf可检测到，平均浓度为92pg/ml。opn(骨桥蛋白，spp1)表达在两种条件下均为强阳性(ng范围，而不是pg范围)，在正常氧条件下大约是在低氧条件下的两倍(平均值分别为72.2ng/ml对31.3ng/ml)。在两种情况下表达水平均是显著的，并且表明了该已知神经保护/抗细胞凋亡因子的作用。sdf-1(基质细胞来源因子1)在低限范围之外，但是可以检测到，对于正常氧和低氧培养物，均平均浓度为约48pg/ml。
骨桥蛋白(opn，spp1)由hrpc高度表达，并且以据预测为生理有效浓度的浓度被分泌到周围的培养基中。其它表达数据显示该基因相对于在其它细胞类型中的差异表达。综合在一起，这些数据表明opn在hrpc的神经保护/视锥再活化作用中起作用。所测试的其它因子较小可能起此类作用(除非在移植后它们响应玻璃体/变性视网膜微环境而碰巧大幅上调，这种可能性较小)。
开展荧光激活细胞分选以表征hrpc和确定细胞群内标志物表达的程度。对培养的细胞或者解离的视网膜单细胞通过缀合的表面抗体标志物/同种型对照(bd)染色，或被固定并透化，接着用缀合的细胞内抗体标志物/同种型对照(bd)室温染色30分钟。在染色缓冲液(bd)中洗涤3次之后，将细胞通过bdariaii分选仪运行。正是从与用于微列阵研究的3个同时捐赠的胎儿眼得到了数据。
图48显示与在正常氧(20％)条件或低氧(3％)条件下生长的所培养hrpc相比，在视网膜组织中的10个标志物(谱系相关的或潜在相关的表面或遗传标志物)在第0天的表达。数据显示了来源视网膜组织和所培养rpc之间的差异，特别是mhci类大幅上调，伴随着fas(cd95)大量增加，但是mhcii类不这样。gfap表达水平低但是以较小的程度增加。其它标志物以不同的程度变化。
实施例3：rpc的体内有效性
首先通过用trypleexpress收获rpc并且以1000rpm离心5分钟收集rpc来制备用于移植的rpc。细胞在hbss中洗涤一次，然后重悬于冷hbss中以确定细胞生存力和细胞数量。对于人移植，使用100μlhbss中的0.5×106个细胞。对于向大鼠内移植，使用2μlhbss中4000至75,000个细胞的不同剂量范围。
将人rpc作为混悬液移植至营养不良hoodedrcs大鼠的玻璃体或视网膜下间隙。提供给大鼠环孢菌素a和类固醇以避免异种移植物排斥。对照眼接受仅由媒介物构成的假注射(视网膜下，玻璃体内)。在无限制觉醒状态下使用设计用于定量视动反应(or)的商业化仪器对移植动物进行功能性测试。测试一个亚组动物在整个视野当中的亮度阈。这通过电生理学借助于在对侧上丘进行细胞外记录实现。在研究结束时，对眼进行收集、固定和组织学分析，寻找宿主光感受器拯救和供体细胞存活的证据。
图49图解说明使用体内移植的本发明方法的概念的证据：将hrpc(或仅媒介物，“假治疗(sham)”)注射至营养不良rcs大鼠(遗传性光感受器变性模型)的眼睛。或者注射入玻璃体内，或者注射入视网膜下间隙内。在第60日龄时，具有移植至任一部位的hrpc移植物的动物表现明显好于假治疗或者未治疗对照。此时间点的组织学显示出广泛的拯救，其位于视网膜下注射的区域(图50-51)，或者在玻璃体内移植物的情况下遍布整个视网膜(图52-53)。使用对侧上丘内的电生理记录，进一步检查了数例在第90日龄在整个视野当中的亮度阈。具有移植物的动物与假治疗或者未治疗对照相比表现出明显改善的敏感性。在第90天的组织学显示出对宿主光感受器的持续高水平拯救。图54-55显示在rcs全片上开展的免疫细胞化学的结果。
体内数据确认且证明，大鼠模型中以功能性水平和解剖水平移植hrpc是成功的。数据还表明，就被拯救的宿主视网膜的范围而言，在某些情况下，玻璃体内注射具有超越视网膜下移植的优势。当置入视网膜下时rpc也是有效的，尽管是以更加受限的方式(对于许多研究者所使用的大多数(如果不是全部的话)非恶性细胞的视网膜下置入，就会有此种拯救受限)。
实施例4：患者内hrpc移植的临床研究
在患有视网膜疾病的患者中开展rpc眼内注射的前瞻性、开放性、可行性研究以得到初步的安全性数据。在开始临床研究之前，首先评价了细胞和组织的安全性。组织来源于advancedbioscienceresources公司(abr)，该公司还能够提供gtp水平的组织样品，预期该组织样品会形成基于该技术建立cgmp主细胞库的基础。针对与外源因子(例如hiv、乙肝和丙肝病毒、巨细胞病毒)的接触情况对供体样品开展病理学和血液检验，并且在培养的供体样品上开展针对内毒素、支原体和真菌的测试，诸如用于内毒素检测的鲎变形细胞溶解物(lal)测试(动力学比浊法)和用于检测真菌污染的fungitell动态生色法，或者通过直接接种的最终容器无菌测试。收集细胞培养基并在发明人的实验室或者支原体核心服务部门中使用lookout支原体pcr检测试剂盒(sigma)或者mycoalert支原体检测试剂盒(lonza)进行测量。还对培养的供体样品进行软琼脂测定以测试肿瘤发生潜能。将来自不同供体和不同时间点的0.2×105个或1.0×105个细胞的细胞混悬液接种到含0.35％琼脂的生长培养基上，然后覆盖到0.7％琼脂凝胶上。在培养28天后，用0.005％结晶紫染色集落并给出相对于阳性对照和阴性对照生长的评分。用于移植的细胞还经历端粒酶活性测试。来自不同供体和培养不同时间点的1μg细胞蛋白质使用trapezert端粒酶检测试剂盒(chemicon)和titaniumtaqdna聚合酶(bdclontech)，根据制造商的说明书测试。此外，通过第三方公司对细胞进行核型分析以检测是否存在任何异常，因为任何异常预示着所培养祖细胞自发发生永生化和具有癌性行为。最后，通过台盼蓝(invitrogen)染色，通过countess自动细胞计数仪(invitrogen)计数或者使用血球计数器(fisherscientific)人工计数来确定细胞生存力和细胞数量。
临床试验结果表明，来自供体的血液样品是致命病毒和其它外源因子阴性的。用于移植的细胞也是内毒素、支原体和真菌感染阴性的。此外，制备用于移植的细胞没有在软琼脂中形成集落，表明它们缺乏致瘤性。还开展了核型分析以保证所培养hrpc的临床安全性(经合同外包给资深的fda推崇的供应商，celllinegenetics)。核型分析也显示没有异常。至于细胞生存力和细胞数，将收获的细胞放在培养箱外的冰上的移植培养基中持续不同的时长。还通过27g皮下注射针头取出一亚部分以评价所述取出操作对存活的影响。经皮下取出没有可检测的影响。预期实际的操作时间小于1小时。在培养箱外的存活在2.5小时时有明显下降，但是一直至3.5小时，存活保持大于90％(可接受的)。这表明临床移植操作不会对供体细胞存活具有大的影响。
制备用于移植的细胞表现出低或者中等的端粒酶活性，但是该端粒酶活性水平没有升高。端粒酶活性有代表性地在早期胚胎发育之外的哺乳动物细胞中下调，但在某些细胞中包括必须有效地永生且无限传递的种系细胞中例外。正常的端粒酶活性丧失与生物体的有限寿命有关，但是也表明致瘤性的低可能性。在哺乳动物癌细胞和多能干细胞和人永生化细胞培养中观察到增加的端粒酶活性。与恶性活性的密切相关意味着移植端粒酶水平升高的细胞是有潜在危险的。安全性测试表明，在一直至97天(即超过当前可用界限)的培养时间点范围内，制备用于移植的细胞的条件没有造成端粒酶活性升高。实际上，端粒酶活性倾向于随时间而下降，这与发育“衰老”一致。换言之，细胞最终变得衰老并丧失增殖的能力。
准入的患者接受一次单侧细胞注射。通过选择具有严重末期视网膜或视神经疾病中任何一种疾病的患者、具有20/200或更低的差残留中心视敏度且使用矫正镜片的患者、和/或具有不良的视觉预后的患者确定准入条件。患者还必须具有足够的瞳孔扩大和透明的眼介质以便进行立体镜眼底照相、21mmhg或更小的眼内压力和开放的前房角。患者被排除在外的条件是：患者呈现出窄的前房角，前房虹膜粘连或新生血管形成，闭角青光眼病史，将妨碍治疗过程中的观察、眼底检查、视敏度测量、一般毒性评价的明显的存在的介质混浊，在研究开始3个月内在同一眼内开展过任何眼内手术；具有已知的对用于血管造影的荧光素染料的严重过敏；严重心脏病的先前病史或证据(nyha功能分类iii或iv)，6个月内有心肌梗死，或者需要持续治疗的室性快速型心律失常，或者不稳定型心绞痛。
选择3名法定盲人患者，他们患有视网膜疾病(即视网膜色素变性)，视敏度不大于20/200，且视觉改善预后差。招募的患者年龄范围从46岁至57岁，两名女性，一名男性，他们均被诊断患有rp。两名具有iol，一名具有白内障。
通过转录物和蛋白质表达谱表征早期世代人胎儿视网膜祖细胞并就正常核型对其进行测试。细胞还是真菌、细菌(内毒素)、支原体阴性的。还针对外源病毒对组织进行了筛选并且发现该组织是hiv1和hiv2抗体、乙型肝炎抗原、丙型肝炎抗体、梅毒、单纯疱疹病毒igm抗体、西尼罗病毒tma：singlet、和ebvigmvca抗体阴性的。制备细胞用于以100μl细胞混悬液的剂量进行玻璃体内推注(这向眼睛内递送了约500,000个细胞)。
在第0天之前，患者在家中用局表抗生素滴剂自我治疗3天。在第0天，患者接受基础的临床检查，包括眼底照相。冲洗眼睛并使用局表抗生素，然后瞳孔扩大并且应用局表麻醉滴剂。在无菌操作条件下，通过外科显微镜在直接目测下，使用标准的斜角进入方法以产生自我闭合的进入通道并且避免移植物回流，向清醒的、非镇静状态的患者在“手术角膜边缘”水平注射一次细胞，使细胞通过眼球壁进入玻璃体腔内。开展前房穿刺以预防眼内压力的医源性升高。没有免疫抑制治疗、缝合或者伤口闭合操作。此后施用注射后抗生素并且仔细监测眼内压力。所有患者同一天离开，需要陪同人员但不需要住院。告知患者手术后保持头部抬高至少45度达至少2小时，以避免细胞团沉降在黄斑上。在从医院离开之前，指示患者在手术后的2-3天，在家睡觉时头稍微抬高。
临床随访被安排在治疗后的1天、3天、1周、1个月、2个月、3个月、6个月、1年、以及在治疗后的5年中的每一年。通过标准眼科检查技术，包括眼底检查、最佳矫正视敏度(bcva)、iop、裂隙灯检查、荧光素血管造影术(fa)、光相干断层扫描(oct)、立体眼底照相术、和视锥闪烁视网膜电图(erg)反应，鉴定眼不良事件的发生率和严重度。
对所有患者的随访裂隙灯检查显示在玻璃体内可见移植物细胞，一些结成丝样结构，证实所移植的细胞已经进入到眼睛内并滞留于此，并且置入玻璃体导致产生一团玻璃体细胞。值得注意的是，这并没有因为视轴遮挡(挡住了受试者眼外的视线)而消除视觉改善，这在理论上可能会发生。
开展了随访b扫描，其中在术后4个月用超声装置追踪玻璃体细胞。结果显示在眼睛内没有肿瘤形成并且在前眶(眼睛后)中没有肿瘤形成。所移植细胞的持久保留(和持久的视觉改善)表明，接受移植细胞的患者不需要常规的免疫抑制。通过检查或者通过眼底照相没有观察到肿瘤、血管并发症或者视网膜脱离的证据。值得注意的是，没有患者因为操作而丧失视觉并且所有患者报告视觉具有可检测的改善。改善与疾病严重性有关：最初视觉越差，改善越有限，而最初视觉越好，改善越大且越快。具有手动视觉的一位患者(002)能够在4个月再次看到视力表。另一位患者(003)恢复了中心注视和一定程度的黄斑功能(这是达到好于20/200的视敏度所需的)。患者003达到视力表上“20个字母”的视敏度的改善，这是非常大的且显著的改善。视觉改善是持久的并且视敏度获得持续至至少1.5年。患者还报告更佳的整体视觉功能和改善的日常生活活动。
在图55中提供了视敏度测试结果用于比较患者之间的趋势。标度均并不恰好线性的。在所有三个病例中在第1周内观察到视觉迅速改善的证据，与对宿主视网膜的临床显著营养作用最为一致。同样地，在1个月之后看到额外的改善的趋势，这包括移植物植入和视网膜细胞的取代。患者的一些问题对应于数据趋势中的某些明显偏离。患者002(蓝色)对术后滴剂不顺从并且出现前葡萄膜炎，这通过使用标准术后药物迅速解决了。值得注意的是，她的长期进展显示出改善。患者001(粉红色)具有早已存在的白内障，可能是由于操作原因，其白内障在移植后的前几个月内恶化了，并且这可能与其后续的视觉下降有关(虽然视觉比最初水平有所改善)。没有发现iop异常与hrpc移植有关(见表1)。
表1：所研究眼的眼内压力
在视野测试中，所有3名患者在治疗前均已经丧失中心注视，这是因为由于与末期视网膜色素变性所致的黄斑功能丧失相关的视敏度差。患者003在第3天恢复了中心注视，并且能够开展自动视野测试，该测试显示小的2度区敏感度为20db(正常)。该患者的中心注视点鼻侧的另一区域的视觉敏感度也提高了。由于该患者恢复了中心注视，所以有可能使用自动视野检查仪(hvf)测试他的视野。该测试显示，他恢复了中央凹区中的小的、但高度敏感的视觉岛。数据支持如下观点：该治疗涉及移植细胞(通过玻璃体分布到视网膜)的快速营养作用，并且似乎会恢复宿主残留视锥的功能。对暗视觉改善(多名患者)和erg表现改善(患者003)的报告支持同样改善视杆光感受器功能的作用。这些改善还可能是因为向宿主视网膜的功能性细胞整合。开展了其它视网膜检查诸如视网膜形态、rnfl、oct、和其它检查。没有观察到肿瘤形成或者免疫学组织排斥的证据。
总之，所有患者在临床试验中均感受到了由治疗改善的视敏度。视觉益处在注射后持续至少20个月。至少一名患者具有改善的视野，特征为中心注视的恢复。没有观察到手术并发症或者免疫排斥的证据，尽管没有进行免疫抑制，也没有使用免疫抑制药物。基于所有的临床检查，即裂隙灯、间接眼底镜检查、对眼和眶的超声(b扫描)、和眼底照相，均没有观察到明显的供体细胞体内增殖。一直至至少20个月没有观察到肿瘤形成。
虽然已经在上面详细描述了少数的改变，但是其它修改或添加是可能的。具体而言，除了本文所述的那些特征和/或改变之外，可以提供另外的特征和/或改变。例如，上面所述的实施可以涉及所公开特征的多种组合和亚组合和/或上面所公开数个另外的特征的组合和亚组合。此外，在附图中描述的和/或本文所述的逻辑流程不需要所示的特定顺序或者连续顺序来达到所需结果。另外的实施方案处于所附权利要求书的范围内。
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