一种基于Kif11基因的重组腺相关病毒抑制病理性疼痛的应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，涉及基于kif11基因的重组腺相关病毒抑制病理性疼痛的应用，尤其是针对kif11基因干扰shrna重组腺相关病毒转染神经细胞及其抑制病理性疼痛应用。

背景技术：

病理性疼痛是当前影响人类健康的重要问题之一，其产生机制复杂。在急性炎症、组织损伤、神经压迫、肿瘤以及慢性感染等诱因作用下，神经细胞兴奋性异常增高，而这些病理生理过程持续进行将导致神经系统结构和功能可塑性改变，最终使疼痛持续慢性化而进入疾病状态。对于病理性痛，尤其是慢性痛，目前尚无满意的治疗药物。背根节(drg)神经元表达神经递质、受体和离子通道等多种疼痛调节分子，是病理性痛信号产生和传递的第一级神经元，也是镇痛药物发挥作用的重要靶位。针对这些疼痛调节分子已经开发出多种化合物，有些甚至已经美国fda批准进入iii期临床试验，但结果治疗效果并不理想，最好的非阿片类镇痛药物对疼痛评分的抑制程度也到30％。而阿片类镇痛药物由于成瘾性等副作用，主要用于癌性痛的治疗。因此，疗效差、特异性差、副作用多等问题是困扰当前镇痛药物研发的瓶颈。

近年来，rna干扰(rnainterference，rnai)技术的迅猛发展，能特异性剔除或关闭特定基因的表达，为疾病的治疗开辟了全新的途径。目前人工实现rnai的主要方法之一是直接将体外合成的sirna序列导入细胞，主要缺点在于转染效率低，效果不稳定，作用持续时间短。另一种是通过转染载体持续稳定表达sirna，主要优点在于稳定大量的表达短发夹rna(shrna)，shrnas末端在体内被加工、处理成约21bp的类sirna分子，sirna将启动rnai因此可用于长时间干扰靶基因的表达。与逆转录病毒和慢病毒载体相比的突出优势在于腺相关病毒(adeno-associatedvirus，aav)载体安全性高，免疫原性低，宿主范围广，携带的转染载体基因能长期稳定表达，体外和体内均可应用，具有广阔的应用范围和前景。近年有报道显示，运用rnai技术特异性干扰神经细胞离子通道(如钾离子通道，钠离子通道，谷氨酸受体等)能发挥镇痛作用，提示rna干扰技术在疼痛药物研发方面具有潜力。

kif11(kinesinfamilymember11，又称eg5)是驱动蛋白家族成员之一。多数研究认为该分子主要参与细胞分裂中染色体的定位、中心体的分离以及双极纺锤体的形成和分离有关，因此可以作为抗肿瘤药物的靶点。近年来发现kif11在非分裂的神经细胞中也有表达，参与调节神经轴突的生长，但是该分子在神经细胞中是否发挥其他作用尚未明确。

虽然目前已经有针对kif11的小干扰rna，例如圣克鲁斯的生产的sirna、shrna质粒和慢病毒包装颗粒，以小鼠kif11基因为靶点，病毒滴度低(每毫升含有1×10⁶慢病毒转导颗粒)，能否转染神经细胞并发挥生物学作用等未见相关报道。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供基于kif11基因的重组腺相关病毒抑制病理性疼痛的应用。为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了基于kif11基因的重组腺相关病毒raav9-zsgreen-shrna-kif11在制备抗疼痛药物中的应用。

优选地，所述的药物为抑制病理性疼痛的药物。

更进一步优选地，所述的药物是以kif11基因作为干预靶点的抑制病理性疼痛的药物。

优选地，所述的药物为通过转染神经细胞抑制疼痛的药物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开了含有大鼠kif11基因干扰shrna序列的重组腺相关病毒raav9-zsgreen-shrna-kif11具有转染体外培养背根节神经细胞的作用，具有转染活体动物背根节神经细胞的作用，具有抑制病理性痛敏反应的作用，因此在疼痛治疗药物方面具有良好的应用前景。

附图说明

图1为重组腺相关病毒raav9-zsgreen-shrna-kif11转染离体培养的大鼠背根节神经细胞图；其中，箭头所示为荧光基团zsgreen，可指示被转染的离体培养神经细胞；

图2为重组腺相关病毒raav9-zsgreen-shrna-kif11转染活体动物背根节神经细胞图，其中，箭头所示为荧光基团zsgreen，可指示被转染的体内神经细胞；

图3是重组腺相关病毒raav9-zsgreen-shrna-kif11能抑制完全弗氏佐剂(cfa)诱发的痛敏行为结果图。其中，第一个箭头为病毒背根节注射时间，第二个箭头为cfa足底注射时间，图中：*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

1、重组腺相关病毒raav9-zsgreen-shrna-kif11制备

包括：大鼠kif11基因shrna序列、干扰序列导入raav9-zsgreen-shshrna质粒载体、raav9-zsgreen-shrna-kif11干扰质粒载体酶切鉴定、干扰载体raav9-zsgreen-shrna-kif11重组9型腺相关病毒包装等步骤。

针对kif11基因的shrna核苷酸序列，正义链：

5’-gatccgtgctgcaaggatcgattgatttcaagagaatcaatcgatccttgcagcacttttttagatcta-3’；

反义链：

5’-agcttagatctaaaaaagtgctgcaaggatcgattgattctcttgaaatcaatcgatccttgcagcacg-3’。

其重组腺相关病毒滴度高，每毫升含有1×10¹³病毒转导颗粒，对kif11基因的抑制率达70％，能抑制kif11基因表达，具有抗肿瘤作用。

具体地，含有大鼠kif11基因干扰shrna的重组腺相关病毒raav9-zsgreen-shrna-kif11的制备操作可以参照发明专利cn105002181b公开的制备方法。

2、重组腺相关病毒raav9-zsgreen-shrna-kif11转染离体培养的离体背根节神经细胞

常规急性分离成年大鼠(出生后4周)背根节神经元，制成细胞悬液，培养皿接种，置于37℃、5％co2培养箱内培养。6h换液，用raav9-zsgreen-shrna-kif11重组腺相关病毒(1×10¹³vg/ml)转染神经元，置于37℃、5％co2培养箱内培养48h，换液后置于37℃、5％co2培养箱内培养，在转染后2天、4天、9天分别在荧光显微镜下检测转染效果。

结果显示：转染2天后，未检测到荧光指示基团zsgreen阳性神经元；转染4天和9天后，荧光指示基团zsgreen阳性神经元的数量和强度逐渐增强(见图1，图中箭头所示为荧光基团zsgreen，可指示被转染的离体培养神经细胞)，提示重组腺相关病毒raav9-zsgreen-shrna-kif11具有转染体外培养的背根节神经细胞的作用。

3、重组腺相关病毒raav9-zsgreen-shrna-kif11转染活体动物背根节神经细胞

病毒转染活体动物背根节神经细胞按常规方法操作执行。6％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，外科手术暴露左侧腰4至腰6背根神经节，用5ul微量进样器向腰4至腰6神经节缓慢注射1ul病毒(1×10¹³vg/ml)，逐层缝合肌肉皮肤，术后抗生素预防感染，动物常规饲养。病毒注射4周后可以鉴定转染效果。用4％戊巴比妥钠将大鼠麻醉后开胸，经左心室插管伸至升主动脉。先以200ml的生理盐水冲洗血液，再用含4％多聚甲醛的磷酸缓冲液(ph7.2-7.4)700ml灌流固定动物。灌注完毕后立即取出腰4至腰6背根节，置于相同的新鲜固定液中后固定24h(4℃)，再移入30％蔗糖pb液中至沉底(4℃)。用leica1800恒冷箱切片机做冰冻切片，片厚30μm。将切片收集在磷酸盐缓冲液(pbs)中清洗3×10min，之后贴片、风干、封片。在共聚焦显微镜(olympusfv1000,japan)下进行图片采集。

结果表明：在被根节组织切片中能检测到荧光指示基团zsgreen阳性神经元，参见图2(图中箭头所示为荧光基团zsgreen，可指示被转染的体内神经细胞)，从图2中可以看出：重组腺相关病毒raav9-zsgreen-shrna-kif11具有转染活体动物背根节神经细胞的作用。

4、重组腺相关病毒raav9-zsgreen-shrna-kif11对疼痛行为的作用

病毒背根节神经内注射方法同前所述。转染4周后，左侧足底注射完全弗氏佐剂cfa(100μl，1：1溶于0.9％生理盐水)诱发炎性痛敏，用von-frey纤维测量机械刺激阈值(pawwithdrawalmechanicalthreshold,pwmt)。以不同粗细和不同长度的尼龙丝制成14个刺激强度不同(1.0、2.5、3.5、4、4.5、5、7.5、10、15、20、30、40、50、60g)的机械刺激器(von-frey纤维)。将一20cm×20cm×25cm的透明有机玻璃罩放置于30cm高的金属丝制成的网格垫上，将待测大鼠置于罩中。使其适应30min后，试验者手持von-frey纤维穿过金属丝网格分别刺激大鼠两侧足底中心部位，刺激强度由小到大，每个强度反复刺激10次(每次间隔3-5s)，将出现50％以上缩足反射的强度定为大鼠对机械刺激的反应阈值。

结果参见图3(图中，第一个箭头为病毒背根节注射时间，第二个箭头为cfa足底注射时间)，结果表明：与scramble对照组相比，重组腺相关病毒raav9-zsgreen-shrna-kif11能显著抑制痛敏行为，提示重组腺相关病毒raav9-zsgreen-shrna-kif11具有抑制病理性痛敏反应的作用，在疼痛治疗药物方面有应用前景。

综上所述，本发明提供的大鼠kif11基因干扰shrna具有转染体外培养背根节神经细胞的作用；具有转染活体动物背根节神经细胞的作用；具有抑制病理性痛敏反应的作用，在疼痛治疗药物方面有应用前景。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。