氧化苦参碱-胎盘间充质干细胞水凝胶、制备方法及应用与流程

本申请涉及医学技术领域，特别涉及一种氧化苦参碱-胎盘间充质干细胞水凝胶、制备方法及应用。

背景技术：

慢性难愈合创面是临床外科中治疗的难题，究其原因是因为这样的创面长期处于病理性炎症和极端缺血、缺氧状态，会使成纤维细胞、表皮细胞、血管内皮细胞等组织修复细胞的增殖缓慢，从而导致创面经久难愈。

技术实现要素：

本申请的目的在于提供一种氧化苦参碱-胎盘间充质干细胞水凝胶、制备方法及应用，以解决创面经久难愈的问题。

第一方面，根据本申请的实施例，提供了氧化苦参碱-胎盘间充质干细胞水凝胶，包括：胎盘间充质干细胞、含有氧化苦参碱的胶原以及水凝胶。

进一步地，所述胎盘间充质干细胞来源于胎盘的胎儿侧绒毛膜层。

第二方面，根据本申请的实施例，提供了氧化苦参碱-胎盘间充质干细胞水凝胶的制备方法，包括：

将培养好的胎盘间充质干细胞消化后以预设密度重悬于水凝胶中，得到含有胎盘间充质干细胞的水凝胶；

将所述含有胎盘间充质干细胞的水凝胶与含有氧化苦参碱的胶原混合，得到混合液；

将所述混合液接种到预设面积的培养皿表面，37℃下凝固30min，过夜，凝胶成型后得到氧化苦参碱-胎盘间充质干细胞水凝胶。

进一步地，所述胎盘间充质干细胞的培养方法，包括：

取新鲜胎盘组织，剪取胎儿侧胎盘组织；

利用含有1％抗生素的磷酸缓冲液漂洗所述胎儿侧胎盘组织至清洗液无色；

将清洗后的胎儿侧胎盘组织剪碎，利用所述磷酸缓冲液重复洗液3遍；

利用a型胶原酶和脱氧核糖核酸酶i，37℃水浴消化2小时；

洗涤离心接种于无菌培养皿中，置于37℃、5％co2条件下培养，第二天换液，以后每隔两天换液一次，得到p0代细胞；

显微镜下观察p0代细胞生长状态，待细胞达70％～80％融合密度时，利用重组酶消化液消化后按1：3传代，继续培养至p3代细胞，将p3代细胞作为培养好的胎盘间充质干细胞。

进一步地，所述含有氧化苦参碱的胶原的制备方法，包括：

将i型牛胶原溶液、dmem培养基、nahco3、hepes、naoh和氧化苦参碱贮存液在4℃下混合，得到含有氧化苦参碱的胶原。

第三方面，根据本申请的实施例，提供了氧化苦参碱-胎盘间充质干细胞水凝胶在慢性难愈合创面上的应用。

由以上技术可知，本申请采用含有氧化苦参碱的水凝胶作为细胞基质，胎儿来源的胎盘间充质干细胞作为种子干细胞，利用3d培养法构建干细胞复合凝胶，用于难愈合创面的局部治疗。基于胎盘间充质干细胞移植治疗能促进皮肤创伤愈合，但是，难愈合创面慢性长期的炎症、缺血、缺氧环境对移植的pmscs存活数量和细胞活力影响非常大，氧化苦参碱预处理能够提高pmscs移植后的存活数量和细胞活力，使pmscs发挥更好的修复创面作用。氧化苦参碱减轻缺氧应激，有利于移植干细胞的存活和创面组织细胞的再生；降低炎症因子表达，减少移植干细胞和组织细胞的凋亡；降低因低氧和炎症信号的协调作用而造成的组织细胞损伤和移植干细胞的死亡。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为根据本申请实施例示出的氧化苦参碱-胎盘间充质干细胞水凝胶制备方法流程图；

图2为hpmscs细胞成脂成骨成软骨分化结果；

图3为hpmscs细胞流式鉴定表面标志抗原结果；

图4为不同细胞培养液上清中生长因子蛋白芯片杂交结果；

图5为raybiotech技术对三种来源间充质干细胞蛋白水平的定量检测结果；

图6为hpmsc培养上清促进血管内皮细胞生成血管的结构观察结果；

图7为hpmsc培养上清促进血管内皮细胞生成血管的定量分析结果；

图8为omt联合hpmscs处理对nrf2及其靶基因检测结果；

图9为omt对hpmscs细胞凋亡的影响结果；

图10为cck-8检测各组细胞增殖能力结果；

图11为氧化苦参碱联合胎盘间充质干细胞治疗糖尿病小鼠效果评价结果。

具体实施方式

根据本申请的实施例，提供了氧化苦参碱-胎盘间充质干细胞水凝胶，包括：胎盘间充质干细胞、含有氧化苦参碱的胶原以及水凝胶。

胎盘间充质干细胞也具有来源广泛、取材方便、低免疫原性以及可自体移植等优势。人胎盘间充质干细胞(placentamesenchymalstemcells，pmscs)能够明显促进小鼠糖尿病溃疡创面的愈合、促进血管内皮细胞和肌细胞的再生。但是在pmscs移植治疗过程中发现：pmscs移植虽然可以改善炎症、缺血缺氧环境，但是移植pmscs后存活的干细胞数量有限。

氧化苦参碱(oxymatrine，omt)是天然植物来源的生物碱，omt一方面可抑制长期不愈创面的细菌存活及细菌生物膜的形成，并抑制局部th1免疫细胞的炎症因子分泌，可减少组织修复细胞受到的炎症损伤。另一方面，omt具有抗细胞凋亡活性的能力。因此omt能够增加炎症环境下间充质干细胞的存活比例；omt能够提高缺血缺氧应激状态下移植的pmscs的生存能力；能够对pmscs治疗难愈性创面起到协同增效的作用。

虽然mscs具有持续自我更新并无限增殖的能力，且能够向受损部位迁移的特点，但移植mscs在缺氧缺血条件下出现存活数量和细胞活力的问题，影响了mscs治疗修复的效果。因此本申请利用omt水凝胶负载pmscs移植治疗难愈合创面的应用，是基于氧化苦参碱能够协同促进胎盘间充质干细胞移植治疗过程中抗凋亡、抗炎、免疫调节和血管再生的作用，明确改善创面微环境(土壤)更有利于mscs(种子)的生长和修复创面的的作用。

omt预处理协同pmscs在创面移植后有较好的修复效果，而且协同处理后促增殖、抗凋亡、抑制炎性因子效果显著，同时提高了细胞代谢、自噬和环境密切配合，促进细胞生存，其协同促进并增强修复效果的机制是tlr4/nf-κb/i-κbα信号和nrf2/pink1线粒体自噬信号独立和相互作用的影响，阐明omt预处理协同pmscs移植增强创面修复效果，确定难愈性创面修复的机制。

进一步地，所述胎盘间充质干细胞来源于胎盘的胎儿侧绒毛膜层。

胎儿侧绒毛膜层来源间充质干细胞相比较与母体侧基蜕膜层来源的间充质干细胞分泌更高的肝细胞生长因子(hgf)，血小板衍生生长因子(pdgf)和胰岛素样生长因子ii(igf-ii)等促进组织细胞再生的蛋白。更好的促进皮肤缺损部位的表皮基底细胞再生，促进创面愈合。胎儿侧绒毛膜层来源间充质干细胞特有的cd200阳性亚群，具有免疫调节特性，减少促炎因子分泌，改善炎症诱导的成纤维细胞分泌的iii型胶原沉积，进而减少皮肤瘢痕形成和愈合不良的发生。

由以上技术可知，本申请采用含有氧化苦参碱的水凝胶作为细胞基质，胎儿来源的胎盘间充质干细胞作为种子干细胞，利用3d培养法构建干细胞复合凝胶，用于难愈合创面的局部治疗。基于胎盘间充质干细胞移植治疗能促进皮肤创伤愈合，但是，难愈合创面慢性长期的炎症、缺血、缺氧环境对移植的pmscs存活数量和细胞活力影响非常大，氧化苦参碱预处理能够提高pmscs移植后的存活数量和细胞活力，使pmscs发挥更好的修复创面作用。氧化苦参碱减轻缺氧应激，有利于移植干细胞的存活和创面组织细胞的再生；降低炎症因子表达，减少移植干细胞和组织细胞的凋亡；降低因低氧和炎症信号的协调作用而造成的组织细胞损伤和移植干细胞的死亡。

参阅图1，本申请实施例提供了氧化苦参碱-胎盘间充质干细胞水凝胶的制备方法，包括：

步骤s1：将培养好的胎盘间充质干细胞消化后以预设密度重悬于水凝胶中，得到含有胎盘间充质干细胞的水凝胶；

进一步地，将培养好的胎盘间充质干细胞消化后以6×10⁶密度重悬于1ml的水凝胶中，得到含有胎盘间充质干细胞的水凝胶；其中，水凝胶可以为vitrogel水凝胶。

进一步地，所述胎盘间充质干细胞的培养方法，包括：

1)取新鲜胎盘组织，剪取胎儿侧胎盘组织；

2)利用含有1％抗生素的磷酸缓冲液漂洗所述胎儿侧胎盘组织至清洗液无色；

其中，抗生素为青霉素、链霉素、两性霉素混合抗生素。

3)将清洗后的胎儿侧胎盘组织剪碎，利用所述磷酸缓冲液重复洗液3遍；

4)利用a型胶原酶和脱氧核糖核酸酶i，37℃水浴消化2小时；

5)洗涤离心接种于无菌培养皿中，置于37℃、5％co2条件下培养，第二天换液，以后每隔两天换液一次，得到p0代细胞；

6)显微镜下观察p0代细胞生长状态，待细胞达70％～80％融合密度时，利用tryple消化后按1：3传代，继续培养至p3代细胞，将p3代细胞作为培养好的胎盘间充质干细胞。

其中，胎盘间充质干细胞的培养方法具体为：

取新鲜胎盘组织(一般取分娩后24小时内胎盘组织，若不能及时分离培养暂时置于4℃冰箱，实验证明存放时间越短培养细胞状态越佳)置于事先30分钟紫外线消毒后的超净工作台上，利用剪刀分别小心剪取部分胎儿侧胎盘组织(剪取时注意尽量避开大血管，剪取大小约为2.0cm×1.0cm×0.5cm)分别置于两个无菌一次性培养皿中，利用pbs(添加1％抗生素)漂洗胎盘组织3～5遍直至清洗液无色为止(目的是清洗掉组织中的血液成分，以免影响提取细胞质量)，将清洗后的胎盘组织分别置于新的无菌一次性培养皿中，利用眼科剪彻底剪碎组织，收集剪碎后的组织分别移至干净无菌的一次性50ml离心管中，加入40ml左右pbs颠倒混匀10次左右(进一步洗去组织块中的血液成分)，1500rpm快速离心10秒后使组织块沉淀，小心弃去洗液，再次加入适量的pbs重复上述操作，离心后同样弃去洗液，向两离心管分别加入30ml左右的dmem并加入a型胶原酶和dnasei酶(脱氧核糖核酸酶i)，封口膜封闭后将上述离心管移至37℃水浴锅中水浴消化，消化时间为2小时，期间每隔10分钟左右颠倒混匀3～5次使组织块与消化酶充分接触保证其完全消化，待消化完毕后将离心管置于离心机中按1500rpm的转速快速离心10秒，离心后将上清液移至另一干净无菌50ml离心管中，剩余沉淀加入适量pbs洗涤后同样按1500rpm离心10秒，将所得洗涤液也移至上述无菌离心管，最后将上述所得上清按1500rpm离心10分钟后弃去上清，利用pbs重悬沉淀物，先后用100μm、40μm细胞筛过滤沉淀，收集过滤后所得细胞悬液，1500rpm离心10分钟后弃去上清，利用完全培养基(dmem+10％fbs+1％抗生素)重悬沉淀后将细胞悬液分别接种于10cm无菌培养皿中，置于37℃、5％co2条件下培养，第二天小心换液，以后每隔两天换液一次，此细胞即为p0代，显微镜下观察细胞生长状态，待细胞达70％～80％融合密度时，利用tryple(重组酶消化液)消化后按1：3传代，继续培养至p3代作为实验用细胞，即培养好的胎盘间充质干细胞。

本申请无血清培养基细胞培养后符合间充质干细胞标准，活力好。

步骤s2：将所述含有胎盘间充质干细胞的水凝胶与含有氧化苦参碱的胶原混合，得到混合液；

进一步地，所述含有氧化苦参碱的胶原的制备方法，包括：

将i型牛胶原溶液、dmem培养基、nahco3、hepes、naoh和氧化苦参碱贮存液低温下配置，得到含有氧化苦参碱的胶原。

8ml含有氧化苦参碱的胶原配置方法具体为：6ml1.5mg/mli型牛胶原溶液，0.8ml10×dmem培养基，0.4ml0.86mnahco3，0.8ml200mmhepes，0.05ml1mnaoh，20mg/ml的氧化苦参碱溶液0.04-0.08ml，依次混合入15ml无菌离心管，在4℃下进行。最终每ml凝胶中氧化苦参碱含量为0.10～0.20mg/ml。

步骤s3：将所述混合液接种到预设面积的培养皿表面，37℃下凝固30min，过夜，凝胶成型后得到氧化苦参碱-胎盘间充质干细胞水凝胶。

预设面积根据实际需要设置。凝胶成型后的氧化苦参碱-胎盘间充质干细胞水凝胶可敷于患处表面。

本申请实施例提供氧化苦参碱-胎盘间充质干细胞水凝胶在慢性难愈合创面上的应用。

本申请中虽然是胎盘间充质干细胞移植，但实质上没有单独利用胎盘间充质干细胞直接移植到皮肤损伤部位，而是利用omt水凝胶作为细胞载体，移植到受损部位，达到更好更快的修复效果；本申请中通过干细胞生物学、中医药学、微生物学、免疫学和组织工程等多学科联合攻关，利用了氧化苦参碱显著的抗炎症抗凋亡特性和pmsc干细胞分泌生物活性因子的组织修复能力相结合，发挥两种治疗方法的优势，对皮肤损伤愈合及修复展开研究，最终尽可能地使难愈合创面达到较好的愈合效果。

本申请研究了氧化苦参碱抗炎抗凋亡的保护作用加强胎盘间充质干细胞移植后的生存能力，目前已知omt具有抗炎作用，进一步求证是否通过抑制tlr4/nf-κb通路在抗炎中起着关键的作用。发现低剂量氧化苦参碱具有抗凋亡的特点，且上调了nrf2、pink1和ho-1的表达，进一步求证是否通过抑制nrf2介导的线粒体自噬通路在抗凋亡中起着关键的作用。从以上两方面阐明omt双向调节炎症、缺血缺氧条件下pmscs生存和组织修复能力。

具体实验如下：

实验例1胎盘间充质干细胞培养方法与组织修复效果

胎盘间充质干细胞培养方法在上文已详细描述，在此不再赘述。

(1)胎盘间充质干细胞分化、旁分泌和促血管生成的实验研究

a.胎盘间充质干细胞分化

实验方法：

流式鉴定表面标志抗原：取对数生长期的p5代人胎盘胎儿侧间充质干细胞1×10⁷个，用tryple^tmexpress重组酶消化，2倍体积pbs稀释终止消化，300g，离心5min。pbs洗涤细胞两遍，300g，离心5min。加3mlpbs重悬细胞后过滤膜。调整细胞密度为1×10⁷/ml，取80μl分装于流式细胞管，分别加入20μl抗体：igg2a-fitc、igg1-pe、cd73-pe、cd105-pe、cd14-fitc、cd34-fitc、cd45-fitc、cd90-fitc和hla-dr-fitc鼠抗人单克隆抗体。室温避光孵育30min，pbs洗涤细胞2次，300g，离心5min。弃上清，沉淀重悬于500μl的pbs进行流式细胞仪检测。

成脂、成骨和成软骨的分化：取一接种于100mm培养皿的p4代胎儿侧胎盘间充质干细胞(placentaderivedmesenchymalstemcells，pmscs)，倒置显微镜下观察待细胞密度达70％-90％，用tryple^tmexpress重组酶消化至显微镜下观察75％细胞呈圆形从皿底脱落，加入2倍体积pbs稀释终止消化，收集细胞悬液于离心管中，300g离心5分钟，弃上清，加入lonzaultraculturetm无血清培养基重悬细胞，按1×10⁵个接种于cellbinding表面的35mm培养皿中。培养至每孔密度达70％-80％，大约需要1-2天。

成脂：弃去上清，每孔加入1-1.5ml脂肪细胞诱导培养基。每隔3天换液。14-21天后，用油红o染色法检测诱导培养结果。

成骨：每孔加入1-1.5ml成骨细胞诱导培养基。每隔3-4天换液。14-21天后，用茜素红染色法检测诱导染色结果。

成软骨：每孔加入1-1.5ml软骨细胞诱导培养基。每隔2-3天换液。21-28天后，用阿新兰染色法检测诱导染色结果。

实验结果：

本申请已经建立了稳定、可靠的间充质干细胞的分选和培养技术平台，且已经培养并鉴定胎盘间充质干细胞及其表面标志和分化能力，hpmscs细胞流式检测和成脂成骨分化结果如图2和图3。图2中，hpmscs为胎盘间充质干细胞形态，成脂为脂肪分化，成骨为成骨分化，成软骨为流式检测间质细胞表面标志。细胞接种一周左右时已形成较多克隆样区域。由图2可知，hpmsc细胞呈短梭形或多边形，梭形，呈簇样生长。待细胞达70％～80％融合密度时传代，传代后细胞呈涡旋状生长。具有成脂、成骨、成软骨分化能力，表达间充质细胞表面标志抗原：cd73、cd90、cd105，不表达造血细胞标记cd34、cd45、cd14，如图3。

b.胎盘间充质干细胞旁分泌的细胞因子对移植治疗的效果

实验方法：

用raybiotech蛋白芯片对两种不同来源的细胞开展的细胞因子的定量检测，芯片根据抗原-抗体杂交的原理，利用蛋白印迹的方法定量培养基中生长因子蛋白的表达量。芯片扫描得到的原始数据经raybiotech软件进行芯片背景去除、芯片间归一化处理。

实验结果：

如图4和图5所示，hpmscs较皮肤成纤维细胞(humandermalfibroblasts，hdfs)高表达pdgf-aa、vegf、igf-ii、g-csf、igfbp-1、igfbp-4、igfbp-3、egfr、tgf-b、m-csf、hgf等生长因子，较脂肪来源的间充质干细胞(adipose-derivedmesenchymalstemcells，amscs)高表达igfbp-4、egfr、pdgf-bb、pdgf-ab、bfgf、pdgf-aa、hgf等生长因子，更有利于组织修复细胞的生长和血管形成。

c.胎盘间充质干细胞促进血管生成

实验方法：

1)加100μl4℃融化的matrigel(注意在冰上操作)于冷藏的24孔板，使其均匀覆盖皿底，将培养皿放入37℃培养箱，放置30分钟使胶凝固。

2)复苏huvec细胞，培养于含10％fbs和100u青/链霉素的dmem培养基，待细胞密度达80％左右，消化细胞。

3)按如下实验分组分别重悬huvec细胞：

①huvec细胞完全培养基；

②huvec细胞完全培养基加入20ng/ml重组人vegf；

③huvec细胞+胎盘来源间充质干细胞培养上清液(100mm皿培养的msc，长满，换液5mlhuvec细胞培养基，24h收获，离心去细胞，4℃保存待用)；

4)将3)中的huvec细胞按每孔1×10⁵个加入1)处理后的24孔板，放入培养箱培养孵育，12h后观察血管样结构的生成情况，以形成环状结构为判定依据，随机选取数个视野进行计数。

实验结果：

如图6所示，小管形成实验检测体外血管生成作用，静脉内皮细胞结合条件培养基并接种于基底上，易形成三维网状结构。如图7所示，通过imageproplus6.0软件测量形成网状小管的长度，定量分析显示hpmsc上清具有与添加20ng/mlvegf相似的促血管形成能力。

实验例2氧化苦参碱局部缺氧环境下对胎盘间充质干细胞的保护作用

实验方法：

构建缺血缺氧损伤细胞模型：正常培养hpmscs传代后分为5组，除常氧对照组外，其他4组(分别添加omt0μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml)至于1％o2、37℃、5％co2培养24h，之后至于不含血清替代物的pmsc培养基中继续培养24h后，进行以下实验。

cck-8检测细胞增殖：以trypleexpress消化处于对数生长期的人hpmscs，以每100μl接种于96孔板中(细胞密度3000个/孔)，用以上模型制备方法处理48h后，每孔加入10μlcck-8溶液，继续在37℃恒温培养箱中孵育4h后，酶标仪检测450nm波长处各孔的od值。96孔板置于37℃、5％co2恒温培养箱，完全培养基中继续培养5天，每24h测6个复孔，并设无细胞的空白对照组。上述实验均重复3次，结果取平均值。根据公式计算各组细胞群体倍增时间，td＝δt×lg2/(lgnt–lgn0)。

流式法检测细胞凋亡：收集正常培养、损伤后与hpmscs共培养的各组细胞，消化离心后，pbs漂洗1遍，按annexinv-fitc流式细胞分析试剂盒说明染色，染色后，pbs漂洗1遍，上流式细胞仪分析细胞annexinv和fitc阳性率。

westernblot分析：ripa裂解液提取样本总蛋白，bca法测定蛋白质浓度，等量上样，sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，湿法转膜后，5％脱脂奶粉封闭1h，次序与一抗(4℃过夜)、二抗孵育(室温30min)，利用ecl法检测目的蛋白条带，灰度扫描后分析蛋白质表达水平的差异。使用imageproplus6.0专业图像分析软件进行图像分析，用gapdh标准化蛋白表达量。

实验结果：

如图8所示，westernblot蛋白定量检测100μg/mlomt处理的hpmscs细胞中nrf2蛋白和上游hif-1α和下游ho-1蛋白的表达，结果显示omt上调了这三种蛋白的表达。

如图9所示，利用annexinv-fitc/pi细胞凋亡染色方法，流式检测缺血缺氧培养hpmscs细胞凋亡情况，设annexinv和pi双阴性为阴性对照，结果显示，正常培养细胞凋亡率为2.61％，缺血缺氧培养诱导凋亡后凋亡率上升到8.4％，而在添加50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml的omt组中细胞的凋亡率分别降低至6.85％、5.36％和5.30％。说明omt能够抑制缺血缺氧培养引起的细胞凋亡。

cck-8法检测各组hpmscs的细胞生长曲线结果如图10所示，氧化苦参碱干预的hpmscs细胞的活细胞数量均高于缺血缺氧培养的pmscs细胞活细胞数量，在培养的第2天起各培养时间点od值均高于缺血缺氧培养的pmscs细胞，但均少于正常培养的pmscs细胞活细胞数量，在培养的第2天起各培养时间点od值均低于正常培养的pmscs细胞差异有统计学差异(p<0.05)，说明氧化苦参碱干预能够恢复缺血缺氧培养的pmscs细胞的增殖缓慢。

实验例3omt协同pmscs修复小鼠难愈性皮肤创伤的效果评价

难愈性皮肤损伤模型的建立

缺血性糖尿病溃疡模型：将小鼠60只腹部注射40mg/kgstz(链脲佐菌素)7天，背部剃毛消毒。以3％戊巴比妥钠按30mg/kg剂量腹腔注射，麻醉后在小鼠背部脊柱一侧做一深至筋膜的切口，钝性分离，将磁片植入皮下，切口缝合后消毒，手术后的小鼠单笼饲养。4d后创口完全愈合，第5天禁食12h，按照上述剂量腹腔注射1％的stz(stz使用前用0.1mol/l、ph＝4.5的柠檬酸缓冲液调配)，分别在注射stz前及注射1d、3d、7d、10d测各组动物空腹血糖值、体重、饮水量及进食量。注射stz第7天(小鼠糖尿病成模)，在埋植磁铁处接外源磁片，外接磁铁与体内植入的磁铁相互吸引产生压力，造成局部皮肤缺血，每次磁铁压迫时间为2h、2h、1h，中间将磁铁拿下，让组织血流恢复30min，如此为一个循环，每天3个循环，连续4d。观察小鼠溃疡的形成与变化，第15天(压迫结束后)取溃疡周边皮肤组织10％甲醛固定，常规石蜡包埋切片，he染色，光学显微镜下观察创面组织病理状况。

(1)氧化苦参碱水凝胶联合pmscs移植治疗方案

凝胶制备：低剂量omt水凝胶：其中氧化苦参碱含量为150μg/ml，牛i型胶原为主要成分，用于细胞移植用负载介质。

实验分组：根据研究内容，随机将造好的缺血糖尿病溃疡模型随机分为糖尿病模型组、氧化苦参碱凝胶组、氧化苦参碱凝胶+pmscs组每组各12只。

溃疡形成后，以低剂量omt水凝胶0.5g，负载5×10⁶的pmscs每个创面。

(2)皮肤愈合效果评价

观察损伤后1-4周不同时间点愈合部位角化细胞迁移、增殖和表皮创面愈合面积情况；根据上皮完整程度评价创面愈合程度。采用imagej软件，于处理后第0、3、7和10天，根据溃疡面计算溃疡面积。

分别获得各组小鼠治疗前和治疗后2-4周皮肤进行对比分析，取皮损部位皮肤组织，石蜡切片，根据以下指标评价创伤愈合质量：存在上皮坏死，但无炎症信号；出现炎症反应，无新毛细血管增殖；炎症反应突出，溃疡表面少量毛细血管增生，但表面没有上皮形成；炎症反应减少，表面有新的毛细血管增生，上皮开始形成。

结果如图11所示，试验通过糖尿病大鼠模型制备难愈合创面，并利用omt水凝胶和胎盘间充质干细胞联合局部治疗，相比于单用pmscs和糖尿病模型对照组，溃疡面积显著减小，说明omt水凝胶和胎盘间充质干细胞联合敷育创面，对溃疡具有更好的治疗及改善作用。

本申请利用氧化苦参碱的抗氧化应激活性，改善了移植间充质干细胞线粒体功能，提高了细胞能量代谢，最终促进了细胞存活，氧化苦参碱水凝胶复合胎盘间充质干细胞能够提高胎盘间充质干细胞移植后的存活，更有利于胎盘间充质干细胞在炎症、缺血和缺氧环境中的生存，提高胎盘间充质干细胞对难愈合皮肤创面的治疗效果。

由以上技术可知，本申请采用含有氧化苦参碱的水凝胶作为细胞基质，胎儿来源的胎盘间充质干细胞作为种子干细胞，利用3d培养法构建干细胞复合凝胶，用于难愈合创面的局部治疗。基于胎盘间充质干细胞移植治疗能促进皮肤创伤愈合，但是，难愈合创面慢性长期的炎症、缺血、缺氧环境对移植的pmscs存活数量和细胞活力影响非常大，氧化苦参碱预处理能够提高pmscs移植后的存活数量和细胞活力，使pmscs发挥更好的修复创面作用。氧化苦参碱减轻缺氧应激，有利于移植干细胞的存活和创面组织细胞的再生；降低炎症因子表达，减少移植干细胞和组织细胞的凋亡；降低因低氧和炎症信号的协调作用而造成的组织细胞损伤和移植干细胞的死亡。

本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的申请后，将容易想到本申请的其它实施方案。本申请旨在涵盖本申请的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本申请的一般性原理并包括本申请未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本申请的真正范围和精神由下面的权利要求指出。

应当理解的是，本申请并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本申请的范围仅由所附的权利要求来限制。