一种具有复合涂层的钛基活性骨植入体及其制备方法与流程

本发明属于医用材料技术领域，具体涉及一种具有复合涂层的钛基活性骨植入体及其制备方法。

背景技术：

通常超过骨缺损的临界大小时，内源性修复很有限，尤其是在复杂的骨折和疾病的情况下，骨移植是不可避免的。钛及钛合金由于其良好的机械性能、耐腐蚀性和生物相容性被广泛应用于骨科领域。然而，纯钛表面的生物惰性限制了其与周围骨组织的骨整合，甚至损害了其长期植入的性能。此外，骨修复是一个高度调节和复杂的生理过程，其中骨衍生的间充质干细胞(mscs)起着不可或缺的作用。因此，通过精确调控mscs进一步提高钛基植入物的骨整合性能具有重要的现实意义。

近年来的研究表明，在损伤或病理条件下，多种趋化因子浓度的升高可诱导mscs及其它祖细胞迁移，进而增强原位组织再生的作用。然而，这些内源性修复过程往往不足以实现完整的组织再生。为了克服这些局限性，通过结合骨替代材料和外源性趋化因子的新策略被用于骨组织再生，且这些策略已被证明对原位骨组织修复有良好的影响。但是，利用钛基材料开展mscs招聘策略的研究却十分有限。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种具有复合涂层的钛基活性骨植入体的制备方法；目的之二在于提供一种具有复合涂层的钛基活性骨植入体。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种具有复合涂层的钛基活性骨植入体的制备方法，所述方法如下：

在纯钛表面喷涂mgsio3微米颗粒，获得mgsio3生物陶瓷层，然后在所述mgsio3生物陶瓷层上依次旋涂壳聚糖溶液、明胶溶液、神经肽p物质溶液，随后再依次旋涂明胶溶液、壳聚糖溶液、明胶溶液、神经肽p物质溶液，将随后依次旋涂明胶溶液、壳聚糖溶液、明胶溶液、神经肽p物质溶液称为一次完整旋涂，后续根据对神经肽p物质的实际需求释放量确定所述完整旋涂的次数，待完成最后一次所述完整旋涂后再旋涂一层明胶溶液，即可。

优选的，所述喷涂的方式为等离子喷涂或超音速喷涂。

优选的，所述mgsio3生物陶瓷层的厚度为90-100μm。

优选的，旋涂所述壳聚糖溶液、明胶溶液、神经肽p物质溶液时，均按如下方法旋涂：首先以500-900r/min的速度旋涂6-10s后，再以2000-2500r/min的速度旋涂20-25s，旋涂量为10-20μl/cm²。

优选的，所述壳聚糖溶液中壳聚糖的浓度为2-10mg/ml；所述明胶溶液中明胶的浓度为2-10mg/ml；所述神经肽p物质溶液中神经肽p物质的浓度为10-500μg/ml。

优选的，所述mgsio3微米颗粒的制备方法如下：

将na2sio3·9h2o和mg(no3)2·6h2o分别溶于水后，在搅拌下将mg(no3)2·6h2o溶液注入na2sio3·9h2o溶液中，出现乳白色物质，继续搅拌8-12h后静置12-24h，经抽滤洗涤后冷冻干燥，最后经煅烧、研磨、过筛，即可。

优选的，所述na2sio3·9h2o和mg(no3)2·6h2o的摩尔比为1:1。

优选的，所述抽滤洗涤具体为：以乙醇和水交替抽滤洗涤3-5次。

优选的，所述煅烧具体为：在800-1200℃下煅烧2-3h；所述过筛为过250目筛。

2、由所述的方法制备的具有复合涂层的钛基活性骨植入体。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种具有复合涂层的钛基活性骨植入体及其制备方法，该钛基活性骨植入体通过释放神经肽p物质以早期招募充足数量的mscs，克服早期组织修复过程mscs不足的固有缺陷，且在招募mscs过程中通过mgsio3生物陶瓷层持续释放镁离子、硅离子以及因离子释放引起的碱性微环境促进被招募的mscs的增殖和分化，这种新颖的分阶段对mscs精密调控设计可最大限度地促进植入体周围新骨的形成。另外，该钛基活性骨植入体中由壳聚糖、明胶、神经肽p物质在mgsio3生物陶瓷层上交替形成多层膜体系，该体系一方面是确保神经肽p物质的缓慢释放，另一方面还可以延缓mgsio3生物陶瓷层中离子释放及因释放的离子产生的ph变化，从而避免初期因离子释放过快和ph值过高而对mscs的活性引起的限制作用，可进一步提高种植体的生物活性。该具有复合涂层的钛基活性骨植入体制备方法简单易操作，适合扩大化生产。

本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：

图1为实施例1步骤(1)中冷冻干燥后煅烧前制备的mgsio3微米颗粒、煅烧后制备的mgsio3微米颗粒、步骤(2)中处理后的纯钛及步骤(3)中负载有mgsio3生物陶瓷层的纯钛的xrd图(图1中a为步骤(1)中冷冻干燥后煅烧前制备的mgsio3微米颗粒的xrd图，图1中b为步骤(1)中煅烧后制备的mgsio3微米颗粒的xrd图，图1中c为步骤(2)中处理后的纯钛的xrd图，图1中d为步骤(3)中负载有mgsio3生物陶瓷层的纯钛的xrd图)；

图2为实施例1步骤(2)中处理后的纯钛、对比实施例1中制备的骨植入体(记为mgsi)、对比实施例2中制备的骨植入体(记为mgsi/lbl)及实施例1中制备的钛基活性骨植入体(记为mgsi/lbl-sp)的sem图(图2中a为实施例1步骤(2)中处理后的纯钛的sem图，图2中b为对比实施例1中制备的骨植入体的sem图，图2中c为对比实施例2中制备的骨植入体的sem图，图2中d为实施例1中制备的钛基活性骨植入体的sem图)；

图3为实施例1步骤(2)中处理后的纯钛、对比实施例1中制备的骨植入体(记为mgsi)、对比实施例2中制备的骨植入体(记为mgsi/lbl)及实施例1中制备的钛基活性骨植入体(记为mgsi/lbl-sp)的白光干涉仪测试结果图(图3中a为实施例1步骤(2)中处理后的纯钛的白光干涉仪测试结果图，图3中b为对比实施例1中制备的骨植入体的白光干涉仪测试结果图，图3中c为对比实施例2中制备的骨植入体的白光干涉仪测试结果图，图3中d为实施例1中制备的钛基活性骨植入体的白光干涉仪测试结果图)；

图4为实施例1中制备的钛基活性骨植入体中神经肽p物质的释放行为测试结果图；

图5为对比实施例1中制备的骨植入体(记为mgsi)、对比实施例2中制备的骨植入体(记为mgsi/lbl)及实施例1中制备的钛基活性骨植入体(记为mgsi/lbl-sp)中mg离子的释放行为测试结果图；

图6为实施例1步骤(2)中处理后的纯钛(记为ti)、对比实施例1中制备的骨植入体(记为mgsi)、对比实施例2中制备的骨植入体(记为mgsi/lbl)及实施例1中制备的钛基活性骨植入体(记为mgsi/lbl-sp)各组孵育液中ph值变化曲线图；

图7为实施例1步骤(2)中处理后的纯钛(记为ti)、对比实施例1中制备的骨植入体(记为mgsi)、对比实施例2中制备的骨植入体(记为mgsi/lbl)及实施例1中制备的钛基活性骨植入体(记为mgsi/lbl-sp)各组中mmp2的分泌水平测试结果图(n＝5，*p<0.05，**p<0.01)；

图8为实施例1步骤(2)中处理后的纯钛(记为ti)、对比实施例1中制备的骨植入体(记为mgsi)、对比实施例2中制备的骨植入体(记为mgsi/lbl)及实施例1中制备的钛基活性骨植入体(记为mgsi/lbl-sp)各组对mscs迁移能力测试结果图(n＝5，*p<0.05，**p<0.01)；

图9为实施例1步骤(2)中处理后的纯钛(记为ti)、对比实施例1中制备的骨植入体(记为mgsi)、对比实施例2中制备的骨植入体(记为mgsi/lbl)及实施例1中制备的钛基活性骨植入体(记为mgsi/lbl-sp)各组中细胞活性测定结果图(n＝5，*p<0.05，**p<0.01)；

图10为实施例1步骤(2)中处理后的纯钛(记为ti)、对比实施例1中制备的骨植入体(记为mgsi)、对比实施例2中制备的骨植入体(记为mgsi/lbl)及实施例1中制备的钛基活性骨植入体(记为mgsi/lbl-sp)各组碱性磷酸酶活性检测结果图(n＝5，*p<0.05，**p<0.01)；

图11为实施例1步骤(2)中处理后的纯钛(记为ti)、对比实施例1中制备的骨植入体(记为mgsi)、对比实施例2中制备的骨植入体(记为mgsi/lbl)及实施例1中制备的钛基活性骨植入体(记为mgsi/lbl-sp)各组胶原分泌水平测试结果图(n＝5，*p<0.05，**p<0.01)；

图12为实施例1步骤(2)中处理后的纯钛(记为ti)、对比实施例1中制备的骨植入体(记为mgsi)、对比实施例2中制备的骨植入体(记为mgsi/lbl)及实施例1中制备的钛基活性骨植入体(记为mgsi/lbl-sp)各组基质矿化水平测试结果图(n＝5，*p<0.05，**p<0.01)；

图13为实施例1步骤(2)中处理后的纯钛(记为ti)、对比实施例1中制备的骨植入体(记为mgsi)、对比实施例2中制备的骨植入体(记为mgsi/lbl)及实施例1中制备的钛基活性骨植入体(记为mgsi/lbl-sp)各组上生长的mscs的相关蛋白(ocn、opn、col-1、bmp2)的表达水平测试结果图(n＝3，*p<0.05，**p<0.01)；

图14为实施例1步骤(2)中处理后的纯钛(记为ti)、对比实施例1中制备的骨植入体(记为mgsi)和实施例1中制备的钛基活性骨植入体(记为mgsi/lbl-sp)植入手术7d后tunel染色代表性图和染色的定量结果图(n＝5，*p<0.05，**p<0.01，图14中a图是tunel染色代表性图，图14中b图是tunel染色的定量统计图)；

图15为实施例1步骤(2)中处理后的纯钛(记为ti)、对比实施例1中制备的骨植入体(记为mgsi)和实施例1中制备的钛基活性骨植入体(记为mgsi/lbl-sp)植入手术7d和14d后ti基植入物周围的cd29⁺/cd90⁺双阳性细胞的免疫荧光图和阳性细胞定量结果图(n＝5，*p<0.05，**p<0.01，图15中a图是植入7d后的免疫荧光图，图15中b图植入14d后的免疫荧光图，图15中c图是各植入体的cd29⁺/cd90⁺双阳性细胞进行定量计数图)；

图16为实施例1步骤(2)中处理后的纯钛(记为ti)、对比实施例1中制备的骨植入体(记为mgsi)和实施例1中制备的钛基活性骨植入体(记为mgsi/lbl-sp)植入1个月后，micro-ct分析评估新骨形成结果图(图16中a图是各组新生骨和植入体界面处的骨形成状况3d图，图16中b图是各组新生骨bv/tv(新骨量/总骨量)的定量分析图)。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

实施例1

制备具有复合涂层的钛基活性骨植入体

(1)将等摩尔量的na2sio3·9h2o和mg(no3)2·6h2o分别溶于水后，在搅拌下将mg(no3)2·6h2o溶液注入na2sio3·9h2o溶液中，出现乳白色物质，继续搅拌10h后静置16h，经乙醇和水交替抽滤洗涤3次后冷冻干燥，在1000℃下煅烧2h后研磨，过筛250目筛，制得mgsio3微米颗粒；

(2)将纯钛依次经过洗衣粉水、酒精、去离子水、酒精各超声清洗15min，烘干备用；

(3)将经步骤(2)处理后的纯钛表面等离子喷涂步骤(1)获得mgsio3微米颗粒，获得厚度为90μm的mgsio3生物陶瓷层，然后在mgsio3生物陶瓷层上依次旋涂壳聚糖溶液、明胶溶液、神经肽p物质溶液，随后再依次旋涂明胶溶液、壳聚糖溶液、明胶溶液、神经肽p物质溶液，将随后依次旋涂明胶溶液、壳聚糖溶液、明胶溶液、神经肽p物质溶液称为一次完整旋涂，后续再进行4次完整旋涂后再旋涂一层明胶溶液，制得具有复合涂层的钛基活性骨植入体(记为mgsi/lbl-sp)，其中，壳聚糖溶液中壳聚糖的浓度为5mg/ml，明胶溶液中明胶的浓度为5mg/ml，神经肽p物质溶液中神经肽p物质的浓度为100μg/ml；旋涂壳聚糖溶液、明胶溶液、神经肽p物质溶液时，均按如下方法旋涂：首先以700r/min的速度旋涂8s后，再以2000r/min的速度旋涂20s，旋涂量为20μl/cm²。

实施例2

制备具有复合涂层的钛基活性骨植入体

(1)将等摩尔量的na2sio3·9h2o和mg(no3)2·6h2o分别溶于水后，在搅拌下将mg(no3)2·6h2o溶液注入na2sio3·9h2o溶液中，出现乳白色物质，继续搅拌12h后静置24h，经乙醇和水交替抽滤洗涤4次后冷冻干燥，在1200℃下煅烧2h后研磨，过筛250目筛，制得mgsio3微米颗粒；

(2)将纯钛依次经过洗衣粉水、酒精、去离子水、酒精各超声清洗15min，烘干备用；

(3)将经步骤(2)处理后的纯钛表面等离子喷涂步骤(1)获得mgsio3微米颗粒，获得厚度为100μm的mgsio3生物陶瓷层，然后在mgsio3生物陶瓷层上依次旋涂壳聚糖溶液、明胶溶液、神经肽p物质溶液，随后再依次旋涂明胶溶液、壳聚糖溶液、明胶溶液、神经肽p物质溶液，将随后依次旋涂明胶溶液、壳聚糖溶液、明胶溶液、神经肽p物质溶液称为一次完整旋涂，后续再进行5次完整旋涂后再旋涂一层明胶溶液，制得具有复合涂层的钛基活性骨植入体(记为mgsi/lbl-sp)，其中，壳聚糖溶液中壳聚糖的浓度为10mg/ml，明胶溶液中明胶的浓度为10mg/ml，神经肽p物质溶液中神经肽p物质的浓度为500μg/ml；旋涂壳聚糖溶液、明胶溶液、神经肽p物质溶液时，均按如下方法旋涂：首先以900r/min的速度旋涂6s后，再以2500r/min的速度旋涂20s，旋涂量为15μl/cm²。

实施例3

制备具有复合涂层的钛基活性骨植入体

(1)将等摩尔量的na2sio3·9h2o和mg(no3)2·6h2o分别溶于水后，在搅拌下将mg(no3)2·6h2o溶液注入na2sio3·9h2o溶液中，出现乳白色物质，继续搅拌8h后静置12h，经乙醇和水交替抽滤洗涤5次后冷冻干燥，在800℃下煅烧3h后研磨，过筛250目筛，制得mgsio3微米颗粒；

(2)将纯钛依次经过洗衣粉水、酒精、去离子水、酒精各超声清洗15min，烘干备用；

(3)将经步骤(2)处理后的纯钛表面等离子喷涂步骤(1)获得mgsio3微米颗粒，获得厚度为95μm的mgsio3生物陶瓷层，然后在mgsio3生物陶瓷层上依次旋涂壳聚糖溶液、明胶溶液、神经肽p物质溶液，随后再依次旋涂明胶溶液、壳聚糖溶液、明胶溶液、神经肽p物质溶液，将随后依次旋涂明胶溶液、壳聚糖溶液、明胶溶液、神经肽p物质溶液称为一次完整旋涂，后续再进行6次完整旋涂后再旋涂一层明胶溶液，制得具有复合涂层的钛基活性骨植入体(记为mgsi/lbl-sp)，其中，壳聚糖溶液中壳聚糖的浓度为2mg/ml，明胶溶液中明胶的浓度为2mg/ml，神经肽p物质溶液中神经肽p物质的浓度为10μg/ml；旋涂壳聚糖溶液、明胶溶液、神经肽p物质溶液时，均按如下方法旋涂：首先以500r/min的速度旋涂10s后，再以2200r/min的速度旋涂25s，旋涂量为10μl/cm²。

对比实施例1

与实施例1的区别在于，步骤(3)中仅在纯钛表面等离子喷涂mgsio3微米颗粒，获得厚度为90μm的mgsio3生物陶瓷层，制得骨植入体(记为mgsi)。

对比实施例2

与实施例1的区别在于，步骤(3)中，然后在mgsio3生物陶瓷层上依次旋涂壳聚糖溶液、明胶溶液，将依次旋涂壳聚糖溶液、明胶溶液称为一次完整旋涂，后续再进行11次完整旋涂，制得骨植入体(记为mgsi/lbl)。

图1为实施例1步骤(1)中冷冻干燥后煅烧前制备的mgsio3微米颗粒、煅烧后制备的mgsio3微米颗粒、步骤(2)中处理后的纯钛及步骤(3)中负载有mgsio3生物陶瓷层的纯钛的xrd图，其中，图1中a为步骤(1)中冷冻干燥后煅烧前制备的mgsio3微米颗粒的xrd图，图1中b为步骤(1)中煅烧后制备的mgsio3微米颗粒的xrd图，图1中c为步骤(2)中处理后的纯钛的xrd图，图1中d为步骤(3)中负载有mgsio3生物陶瓷层的纯钛的xrd图。由图1可知，烧结前在mgsio3微米颗粒中未发现晶体结构，相比之下，烧结后的mgsio3微米颗粒在2θ≈20.22、28.2、31.1、35.6处显示强峰，这与斜长石(jcpdsno.350601)的卡片图谱一致。步骤(2)中经处理后的纯钛的峰型与α-ti(jcpdsno.441294)相同，即在34.94、38.26和52.82附近出峰，步骤(3)中负载有mgsio3生物陶瓷层的纯钛，在21.38、28.06、31.04、40.06、52.92、70.56处发现了几个新峰，表明在纯钛表面均匀覆盖了mgsio3陶瓷涂层。

图2为实施例1步骤(2)中处理后的纯钛、对比实施例1中制备的骨植入体(记为mgsi)、对比实施例2中制备的骨植入体(记为mgsi/lbl)及实施例1中制备的钛基活性骨植入体(记为mgsi/lbl-sp)的sem图，其中，图2中a为实施例1步骤(2)中处理后的纯钛的sem图，图2中b为对比实施例1中制备的骨植入体的sem图，图2中c为对比实施例2中制备的骨植入体的sem图，图2中d为实施例1中制备的钛基活性骨植入体的sem图，由图2可知，纯钛表面平整但稍有划痕，这可能是砂纸打磨造成的，对比实施例1中制备的骨植入体表面经等离子喷涂后明显粗糙和致密，对比实施例2中制备的骨植入体和实施例1中制备的钛基活性骨植入体两者表面虽经多层膜覆盖，但表面形貌与对比实施例1中制备的骨植入体的表面形貌相差不大，这可能是因为上层多层膜的厚度是纳米级，对于微米级别的图层太薄，并不能明显改变粗糙的基底形貌。

图3为实施例1步骤(2)中处理后的纯钛、对比实施例1中制备的骨植入体(记为mgsi)、对比实施例2中制备的骨植入体(记为mgsi/lbl)及实施例1中制备的钛基活性骨植入体(记为mgsi/lbl-sp)的白光干涉仪测试结果图，其中，图3中a为实施例1步骤(2)中处理后的纯钛的白光干涉仪测试结果图，图3中b为对比实施例1中制备的骨植入体的白光干涉仪测试结果图，图3中c为对比实施例2中制备的骨植入体的白光干涉仪测试结果图，图3中d为实施例1中制备的钛基活性骨植入体的白光干涉仪测试结果图，图3中所展示的结果与图2中所展示的结果相印证。

实施例4

测试实施例1中制备的钛基活性骨植入体中神经肽p物质的释放行为

(1)制备含fitc标记了神经肽p物质的钛基活性骨植入体(记为mgsi/lbl-spfitc)

与实施例1的区别在于，将步骤(3)中的神经肽p物质溶液替换为fitc标记神经肽p物质溶液(spfitc)，制得含fitc标记了神经肽p物质的钛基活性骨植入体；

(2)将mgsi/lbl-spfitc浸泡于pbs缓冲溶液的24孔板中，并在37℃条件下孵育，随后在相应的时间点收集孔板孵育液进行荧光分光光度计检测，最后根据标准曲线计算spfitc在各个时间点的释放量，得到spfitc从mgsi/lbl-spfitc中的累积释放曲线，如图4所示，由图4可知，神经肽p物质在14d内以可持续从mgsi/lbl-sp基底释放。经计算，两周内神经肽p物质从多层膜的总释放量达到0.28μg。

实施例5

通过电感耦合等离子体原子发射光谱法(icp-aes)分别测试对比实施例1中制备的骨植入体(记为mgsi)、对比实施例2中制备的骨植入体(记为mgsi/lbl)及实施例1中制备的钛基活性骨植入体(记为mgsi/lbl-sp)中mg离子的释放行为，测试结果如图5所示，由图5可知，mgsi/lbl和mgsi/lbl-sp组中mg浓度略低于mgsi组，说明多层膜覆盖后mg离子的释放被明显延缓。

实施例6

取实施例1步骤(2)中处理后的纯钛(记为ti)、对比实施例1中制备的骨植入体(记为mgsi)、对比实施例2中制备的骨植入体(记为mgsi/lbl)及实施例1中制备的钛基活性骨植入体(记为mgsi/lbl-sp)，将第三代mscs按1×10⁴个细胞/cm²的接种量分别接种到上述样品上，然后在不同时间点用ph计测量细胞孵育液的ph值，测试结果如图6所示，由图6可知，在12天内，mgsi组细胞孵育液的ph值高于mgsi/lbl和mgsi/lbl-sp组细胞孵育液的ph值。而且mgsi/lbl组细胞培养基的ph值变化与mgsi/lbl-sp组细胞培养基的ph值变化几乎相同，直到14天，三组的ph值趋于相似，可见，覆盖在mgsio3生物陶瓷层上的多层膜延迟了细胞孵育液的ph变化。

实施例7

取实施例1步骤(2)中处理后的纯钛(记为ti)、对比实施例1中制备的骨植入体(记为mgsi)、对比实施例2中制备的骨植入体(记为mgsi/lbl)及实施例1中制备的钛基活性骨植入体(记为mgsi/lbl-sp)，将第三代mscs按1×10⁴个细胞/cm²的接种量分别接种到上述样品上，均以200μl的1％fbs的低糖培养基为孵育液，均放置于孵箱孵育12h和24h后，分别收集孵育液并离心收集上清液。将上清液定量后与等体积的样本缓冲液制成上样液，随后采用明胶酶谱法测定mmp2的分泌水平，测试结果如图7所示，由图7可知，各组在12h和24h两个时间点mmp2分泌趋势基本一致，在两个时间点下，ti组均具有最低的mmp2分泌水平，而mgsi/lbl-sp组显示出最高的mmp2分泌水平，说明mgsi/lbl-sp组释放的趋化因子神经肽p物质能使mscs向mgsi/lbl-sp基底的趋化迁移能力增强。

实施例8

将实施例1步骤(2)中处理后的纯钛(记为ti)、对比实施例1中制备的骨植入体(记为mgsi)、对比实施例2中制备的骨植入体(记为mgsi/lbl)及实施例1中制备的钛基活性骨植入体(记为mgsi/lbl-sp)分别置于tanswell下室中，并浸入细胞培养基(600μl，1％fbs)中，将去血清处理的细胞悬液(100μl，1×10⁴个细胞)接种在tanswell上室中，最后将孔板放置于孵箱中。在12h和24h后，取出tanswell小室，然后把tanswell上室未迁移的mscs用棉签轻轻擦拭干净，随后加入适量的0.1％的结晶紫着色迁移的mscs。最后，使用奥林巴斯倒置显微镜在5个不同的随机位置对每个样品成像，并计算并记录着色mscs的数量，测试结果如图8所示，由图8可知，纯ti和mgsi组无论在12h还是24h时都只有很少数目的mscs从上室往下室迁移，而在12h和24h后，mgsi/lbl和mgsi/lbl-sp组中的mscs的迁移数目较纯ti和mgsi组明显提高，其中，mgsi/lbl-sp组中检测到mscs迁移数目最多，这是由于趋化因子神经肽p物质从多层涂层中有效释放，从而显著增强了mscs迁移能力。

实施例9

取实施例1步骤(2)中处理后的纯钛(记为ti)、对比实施例1中制备的骨植入体(记为mgsi)、对比实施例2中制备的骨植入体(记为mgsi/lbl)及实施例1中制备的钛基活性骨植入体(记为mgsi/lbl-sp)，将第三代mscs按1×10⁴个细胞/cm²的接种量分别接种到上述样品上，孵箱中培养4d和7d后通过3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四氮唑(mtt)实验分析评估各组中的mscs增殖情况，结果如图9所示，由图9可知，相较于未经任何修饰的纯ti组，mgsi、mgsi/lbl和mgsi/lbl-sp各组中mscs生存活力在孵育4d和7d均显著升高。说明等离子喷涂的mgsio3生物陶瓷层具有明显增强mscs增殖的作用。特别是mgsi/lbl组和mgsi/lbl-sp组在4d时mscs生存活力均高于mgsi组，这可能归因于mgsi/lbl组和mgsi/lbl-sp组由于多层膜的覆盖后表现出更缓和的离子释放速率以及ph变化。此外mgsi/lbl组和mgsi/lbl-sp具有近似的mscs生存活力，表明多层膜体系中趋化因子神经肽p物质的插入并不会影响mscs的增殖水平。

实施例10

取实施例1步骤(2)中处理后的纯钛(记为ti)、对比实施例1中制备的骨植入体(记为mgsi)、对比实施例2中制备的骨植入体(记为mgsi/lbl)及实施例1中制备的钛基活性骨植入体(记为mgsi/lbl-sp)，将第三代mscs按1×10⁴个细胞/cm²的接种量分别接种到上述样品上，孵箱中培养4d和7d后使用1％tritonx-100/pbs溶液裂解然后离心(12000rpm)几分钟后收集上清液。随后，用碱性磷酸酶活性检测试剂盒进行定量检测，测试结果如图10所示，由图10可知，与ti组相比，生长在mgsi，mgsi/lbl和mgsi/lbl-sp组的mscs在第4d和第7d均表现出更强的alp活性，说明等离子喷涂的mgsio3生物陶瓷层具有明显增强mscs早期分化的作用。此外，在第7d，mgsi/lbl和mgsi/lbl-sp组与mgsi组相比，生长在mgsi/lbl和mgsi/lbl-sp组的mscs有具有显著增强的alp活性，这可能归因于多层膜覆盖后缓和了离子释放速率以及ph变化。mgsi/lbl组和mgsi/lbl-sp组具有近似的mscs的alp活力值，表明多层膜体系中趋化因子神经肽p物质的插入并不会影响mscs的alp活力水平。

实施例11

取实施例1步骤(2)中处理后的纯钛(记为ti)、对比实施例1中制备的骨植入体(记为mgsi)、对比实施例2中制备的骨植入体(记为mgsi/lbl)及实施例1中制备的钛基活性骨植入体(记为mgsi/lbl-sp)，将第三代mscs按1×10⁴个细胞/cm²的接种量分别接种到上述样品上，同时取对比实施例1中制备的骨植入体(记为mgsi)不接种mscs作为对照(记为mgsinocell)，以消除染色过程中mgsi基底对最终结果的干扰，上述各组均在孵箱中培养14d和21d后用天狼星红染色试剂盒进行染色实验，测试各组胶原分泌水平，测试结果如图11所示，同时孵箱中培养14d和21d后用茜素红染色试剂盒进行染色实验，测试各组基质矿化水平，测试结果如图12所示。由图11和图12可知，在14d和21d时，mgsi，mgsi/lbl和mgsi/lbl-sp组的胶原蛋白分泌水平和基质矿化水平显著高于纯ti和tcps组，说明等离子喷涂的mgsio3生物陶瓷层具有明显增强mscs晚期分化的作用。在14d和21d时，mgsi/lbl和mgsi/lbl-sp组的胶原蛋白分泌水平显著高于mgsi组，在21d时，mgsi/lbl和mgsi/lbl-sp组基质矿化水平显著高于mgsi组，这可能归因于多层膜覆盖后缓和了离子释放速率以及ph变化。

实施例12

取实施例1步骤(2)中处理后的纯钛(记为ti)、对比实施例1中制备的骨植入体(记为mgsi)、对比实施例2中制备的骨植入体(记为mgsi/lbl)及实施例1中制备的钛基活性骨植入体(记为mgsi/lbl-sp)，将第三代mscs按1×10⁴个细胞/cm²的接种量分别接种到上述样品上，经过两周培养后，1×sds溶液裂解细胞收集蛋白样品，经过定量和煮沸后制成上样样品。然后用12％sds-page凝胶分离体积为20μg的总蛋白，再进一步电转移到pvdf膜上得到初步条带，紧接着将上述条带用特异性一抗和二抗孵育后显影，最后使用quantityone软件计算并通过gapdh蛋白归一化处理目的蛋白表达水平，结果如图13所示，由图13可知，与纯ti和tcps样品相比，在mgsi，mgsi/lbl和mgsi/lbl-sp上生长的mscs的相关蛋白(ocn、opn、col-1、bmp2)的表达水平显着提高。说明等离子喷涂的mgsio3生物陶瓷层具有明显增强mscs成骨分化的作用。此外，结果还显示mgsi/lbl-sp组中上述蛋白的表达水平最高，这归因于多层膜覆盖后优化了离子释放速率和ph变化。

实施例13

选取无病原体sd大鼠(雌性)做为实验动物，并随机分为三组。首先腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，给手术部位周围剃毛后，再通过小型的电钻沿着股骨平行的方向造孔，将实施例1步骤(2)中处理后的纯钛(记为ti)、对比实施例1中制备的骨植入体(记为mgsi)和实施例1中制备的钛基活性骨植入体(记为mgsi/lbl-sp)无菌植入体插入到相应组大鼠的股骨前端。在手术后7d和14d天后安乐死各组sd大鼠，取出股骨以福尔马林溶液固定后并脱钙1个月，将脱钙后的股骨组织进行石蜡包埋、切片、脱蜡后使用tunel凋亡检测试剂盒进行种植体周围细胞凋亡情况的评估，结果如图14所示，其中，图14中a图tunel染色代表性图，图14中b图是tunel染色的定量统计图，由图14可知，ti组周围的细胞凋亡与mgsi组处于相同水平，而mgsi/lbl-sp组中细胞凋亡急剧下降至ti组的15.3％。因此，mgsi/lbl-sp中的神经肽p物质的释放还可以有效地减少细胞凋亡水平。此外，脱蜡切片还使用cd29和cd90(mscs特异性标记)抗体进行了免疫荧光染色，用荧光显微镜捕获染色图像并进行定量分析，结果如图15所示，其中，图15中a图是植入7d后的免疫荧光图，图15中b图植入14d后的免疫荧光图，图15中c图是各植入体的cd29⁺/cd90⁺双阳性细胞进行定量计数图，由图15可知，与植入7d相比，在14d时，在植入物周围出现了更多数量的着色的mscs，与ti和mgsi组相比，在mgsi/lbl-sp组中观察到募集的mscs的数量显著增多。经计算，在7d和14d时，mgsi/lbl-sp组周围富集的mscs的数目分别是mgsi组的5.8倍和4.0倍，这归因于神经肽p物质从植入体的多层系统释放后大大增强了对mscs的趋化作用。

实施例14

选取无病原体sd大鼠(雌性)做为实验动物，并随机分为三组。首先腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，给手术部位周围剃毛后，再通过小型的电钻沿着股骨平行的方向造孔，将实施例1步骤(2)中处理后的纯钛(记为ti)、对比实施例1中制备的骨植入体(记为mgsi)和实施例1中制备的钛基活性骨植入体(记为mgsi/lbl-sp)无菌植入体插入到相应组大鼠的股骨前端，手术1个月后，安乐死各组sd大鼠，取出各组股骨组织使用福尔马林固定后，使用micro-ct扫描和3d重建以展现骨和植入物界面处的骨形成状况并定量计算，结果如图16所示，其中，图16中a图是各组新生骨和植入体界面处的骨形成状况3d图，其中纵向切割图中黄色部分为植入体部分，由该纵向切割图可知，在纯ti植入体周围仅观察到少量新形成的骨组织(灰色)，而在mgsi植入体和mgsi/lbl-sp植入体周围发现新骨填充，且在mgsi/lbl-sp植入体周围观察到大量新形成的骨骼，新生骨图中展现了与纵向切割图类似的趋势，即mgsi/lbl-sp植入体出现了最大量的新骨，且骨小梁厚度图中也显示出mgsi/lbl-sp植入体新骨的骨小梁厚度最大。图16中b图是各组新生骨bv/tv(新骨量/总骨量)的定量分析图，由该图可知，mgsi组优于纯ti组，且有统计学差异，是因为mgsio3生物陶瓷层具有优异的促进骨缺损部位的成骨增殖和分化的能力。此外，含有神经肽p物质的多层膜覆盖的mgsi/lbl-sp组又明显优于mgsi组，则归因于多层膜体系中的神经肽p物质释放后导致了大量的mscs聚集参与骨修复，而底层的mgsio3生物陶瓷层又加速了成骨增殖和分化，最终导致该组的新骨形成能力最强。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。