一种POSS增强水凝胶及其制备方法和用途与流程

本发明涉及生物医用水凝胶材料技术领域，特别是涉及一种poss增强水凝胶及其制备方法和用途。

背景技术：

水凝胶是一种含水率高的、较为柔软的三维交联网络结构的材料，在组织工程上有着广阔的应用前景。然而，水凝胶自身结构的不均一及其对能量耗散的缺乏，使得其力学强度低，韧性较差等，限制了其在力学强度要求较高的组织上的应用，如软骨，肌腱组织等。通过提高单一物质的交联度来提高水凝胶的力学强度虽然有所成效，但是得到的材料韧性差，阻碍了其进一步的应用，因此提高力学强度的同时也能改善其韧性是拓宽水凝胶应用的重点问题。

poss(笼状聚倍半硅氧烷)是一类由硅氧键交替连接纳米笼状结构的无机化合物；poss的直径在1.5nm左右，在其末端可以连接一个或者多个功能基团，极大的丰富了poss的用途。尽管poss具有诸多的优点，但由于poss的疏水性的硅氧结构，poss增强的水凝胶一般以油溶性的合成高分子为原料。然而，大部分的合成高分子的生物性能较差，缺乏一定的细胞调节机制。而水凝胶的另一来源——天然高分子，在细胞、组织的相容性以及生物诱导上发挥重要的作用，不幸的是，水溶性的天然高分子难以与疏水性的poss在同一溶剂中均匀反应。

透明质酸(ha)是一种由d-葡糖醛酸和n-乙酰-d-氨基葡糖重复构成的一中天然黏多糖，也是细胞外基质(ecm)的主要成分，广泛存在于皮肤、软骨等组织中，不仅能与多种细胞受体特异性结合，调节着细胞的生长、分离、迁移等特性，还能被体内的透明质酸酶分解为人体能吸收的氨基酸，具有良好的生物相容性和生物可降解性。明胶是胶原蛋白的降解产物，具有丰富的多肽，保留了胶原的特性，具有良好的生物相容性和生物可降解性。相关文献还报道了明胶比胶原蛋白更低的抗原性。然而透明质酸凝胶和明胶凝胶的力学性能较差，在一定程度上限制了它们在组织工程上的应用。

技术实现要素：

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种poss增强水凝胶及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种poss增强水凝胶的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

1)将透明质酸和poss混合；

2)加入光引发剂；

3)将步骤2)的体系在紫外光下照射即得poss增强水凝胶。

具体的，所述透明质酸为经过修饰的透明质酸。

具体的，经过修饰的透明质酸引入了疏水链段或基团。

更优选地，所述透明质酸为经过甲基丙烯酸修饰的透明质酸，简写为hama。制备时以溶剂的质量为基准，透明质酸的质量分数为1wt％～3wt％。

具体的，所述poss为改性后的poss。

优选地，所述改性后的poss为omaposs(八甲基丙烯酸酯基低聚倍半硅氧烷)。

制备时，以溶剂的质量为基准，所述poss的质量分数为1wt％～5wt％。

优选地，制备poss增强水凝胶时还加入明胶。

所述明胶为改性后的明胶。

优选地，所述明胶为甲基丙烯酸明胶或氨基化明胶。

制备时以溶剂的质量为基准，明胶的质量分数为1wt％～3wt％

具体的，所述光引发剂为lap。

制备时步骤2)中，以溶剂的质量为基准，lap的质量分数为0.07～0.13wt％。

具体的，制备方法步骤3)中，用紫外光照射10～30分钟。

具体的，所述制备方法中使用的溶剂为二甲基亚砜。

本发明还提供了上述制备方法得到的poss增强水凝胶。

本发明最后提供了poss增强水凝胶在制备细胞增殖或分化产品中的用途。

所述poss增强水凝胶能刺激细胞成骨分化基因的表达。

如上所述，本发明的一种poss增强水凝胶及其制备方法和用途，具有以下有益效果：

1)结构稳定，热学性能和机械性能高；

2)无毒，有良好的生物相容性；

3)成凝胶方式简单、多样化，能更广泛的应用于骨修复等组织工程中。

附图说明

图1显示为ha-poss-gel水凝胶构成示意图。

图2显示为透明质酸(ha)与双键修饰的透明质酸(hama)的核磁共振氢谱图。

图3显示为lap的核磁共振氢谱图。

图4(a)显示为d-hama溶液与gel-adh混合后的溶液，图4(b)显示为d-hama与gel-adh混合后的溶液。

图5显示为ha-poss-gel水凝胶的ftir谱图。

图6显示为实施例4制备的水凝胶外观图，其中(a)-(e)分别为添加omaposs的终浓度为0％、1％、2％、3％、4％的ha-poss-gel水凝胶，f为只添加dhama得到的水凝胶，g为dhama和omaposs得到的ha-poss水凝胶，其中dhama和omaposs的终浓度均为3％。

图7显示为ha-poss-gel水凝胶的sem图，其中(a)-(e)分别为添加omaposs的终浓度为0％、1％、2％、3％、4％的水凝胶的内部形貌，标尺为200μm。

图8显示为ha-poss-gel水凝胶的压缩性能测试数据：(a)ha-gel水凝胶的应力-应变曲线，(b)ha-gel水凝胶的压缩模量，(c)ha-poss-gel水凝胶的应力-应变曲线，(d)ha-poss-gel水凝胶的压缩模量。

图9显示为ha-poss-gel水凝胶连续3次加-卸载应力曲线，(a)(b)(c)(d)分别为omaposs的终浓度为1％，2％，3％和4％制备得到的水凝胶。

图10显示为由图9中第一次加-卸载应力曲线得到的ha-poss-gel水凝胶的耗散能。

图11显示为ha-poss-gel水凝胶在0.1％应变，1-100rad/s条件下的旋转流变性能，g’和g”分别代表水凝胶的储能模量和损耗模量。

图12显示为ha-poss-gel水凝胶的溶胀性能。

图13显示为水凝胶在透明质酸酶中的降解性能。

图14显示为mscs经ha-poss-gel水凝胶培养后的死活荧光染色情况，其中(a)-(e)分别为omaposs的终浓度为0％、1％、2％、3％、4％的水凝胶，图中绿色为活细胞，红色为死细胞，标尺为200μm。

图15-1显示为细胞在ha-poss-gel水凝胶上增殖情况，其中(a)-(e)分别为omaposs的终浓度为0％、1％、2％、3％、4％的水凝胶。

图15-2显示为细胞在ha-poss和ha水凝胶上的增殖情况。

图16-1显示为细胞在ha-poss-gel水凝胶上的成骨分化情况，其中(a)-(e)分别为omaposs的终浓度为0％、1％、2％、3％、4％的水凝胶。

图16-2显示为细胞在ha-poss和ha水凝胶上的成骨分化情况。

上述附图中，如无特别说明，

误差线表示标准偏差(sd)

“*”代表0.01≤p<0.05

“**”代表p<0.01。

具体实施方式

本发明的发明人通过深入研究，发明了一种poss增强水凝胶的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

1)将透明质酸和poss混合；

2)加入光引发剂；

3)将步骤2)的体系在紫外光下照射即得poss增强水凝胶。

所述poss增强水凝胶是指poss作为性能增强纳米颗粒与基体共价交联形成的纳米复合水凝胶材料。

所述基体包括透明质酸，基体和poss两种天然高分子同时存在时二者之间存在静电作用，有利于水凝胶的形成。

具体的，所述透明质酸为经过修饰的透明质酸，亦即，经过改性的透明质酸。

具体的，经过修饰的透明质酸引入了疏水链段或基团，例如c10～c20的烃基、含有芳基、酯、醚、胺、酰胺等基团的烃基或其他含有双键的烃基。

在一种实施方式中，经过修饰的透明质酸接枝了大量含有酯基的烃基，接枝率至少为50％。

在一较佳实施方式中，所述透明质酸为经过甲基丙烯酸修饰的透明质酸，缩写为hama，hama可以为商品化的试剂，也可以实验室合成。制备时以溶剂的质量为基准，透明质酸的质量分数为1wt％～3wt％。

修饰后的透明质酸可以溶于dmso，使水溶性的透明质酸能与疏水性的poss在同一溶剂中均匀反应。

具体的，poss即低聚倍半硅氧烷，是一种结构稳定的具有纳米级尺寸的新型有机-无机纳米杂化材料，作为交联剂能均匀的分布于各种基体材料中。

具体的，所述poss为改性后的poss。

在一种实施方式中，所述改性后的poss为omaposs(八甲基丙烯酸酯基低聚倍半硅氧烷)，结构式如下：

omaposs是末端有8个双键活性基团的一种poss，作为交联剂改善水凝胶的整体力学机械性能。

制备时，以溶剂的质量为基准，所述poss的质量分数为1wt％～5wt％。

在一种实施方式中，制备poss增强水凝胶时还加入明胶，加入明胶后制得的水凝胶有更好的力学性能，良好的生物相容性，较缓慢的降解速度，更有利于细胞的粘附、铺展和分化。

所述明胶为改性后的明胶。

在一种实施方式中，所述明胶为甲基丙烯酸酯明胶，化学式如下：

在另一种实施方式中，所述明胶为氨基化明胶，所述氨基化明胶为明胶经过与己二酸二酰肼(adh)和1-羟基苯并三唑(hobt)反应后得到的含有大量氨基的明胶。

所述氨基化明胶上的利用紫外-可见分光光度法检测氨基含量为0.527±0.008μmol/mg

制备时以二甲基亚砜的质量为基准，明胶的质量分数为1wt％～3wt％。

具体的，所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(lap)。

制备时步骤2)中，以二甲基亚砜的质量为基准，lap的质量分数为0.07～0.13wt％，例如可以为0.1wt％。

在一种实施方式中，待步骤2)中的溶液完全透明后再进行步骤3)。

具体的，制备方法步骤3)中，用紫外光照射10～30分钟，具体照射时长根据紫外灯的功率和波长不同而不同，例如可以使用功率为8mw/cm²的365nm的紫外灯照射10分钟。

紫外光照射结束后，即得到poss增强水凝胶。

具体的，所述制备方法中使用的溶剂为二甲基亚砜。

本发明还提供了上述制备方法得到的poss增强水凝胶。所述poss增强水凝胶的压缩模量、断裂伸长率、耗散能等力学机械性能优于不含有poss的水凝胶，其溶胀性、降解性能以及内部微孔结构也优于不含有poss的水凝胶，尤其是其内部微孔结构中孔道更加致密，管壁间的小孔结构更小，同时大孔的结构依然存在，这种梯度微孔结构为其在细胞上的用途奠定了基础。

本发明还提供了poss增强水凝胶在制备细胞增殖或分化产品中的用途。

普通的透明质酸水凝胶不仅力学性能差，还缺少细胞必要的粘附单元，细胞不易贴附生长，本发明的poss增强水凝胶提高了细胞和水凝胶之间的粘附力，使细胞贴附在水凝胶上而不影响其增殖。

所述poss增强水凝胶在制备刺激细胞成骨分化基因表达的产品中的用途。

所述成骨分化基因包括opn、osx、bsp、runx2中的一种或几种。

在一种实施方式中，所述细胞为间充质干细胞。

所述poss增强水凝胶在制备骨修复产品中的用途。

所述产品必然包括poss增强水凝胶，并以poss增强水凝胶作为前述功效的有效成分。

所述产品包括但不限于药物、试剂等。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1甲基丙烯酸修饰的透明质酸(hama)及脱除钠盐的制备

通过甲基丙烯酸酐和透明质酸钠上的羟基的反应而在透明质酸钠上接枝双键基团，反应方程式如下：

制备过程如下：首先将1g透明质酸钠(ha)配成100ml的水溶液，并置于4℃的冰浴环境下。接着，逐滴加入2.5ml的甲基丙烯酸酐，通过naoh溶液调节ph使溶液的整体ph＝8，然后在冰浴条件下反应8h，并维持先前的ph。搅拌过夜，第二天后，再逐滴加入1ml的甲基丙烯酸酐，并在冰浴反应下调节ph，继续搅拌4h，反应完成之后，用透析袋装好溶液，并在去离子水中透析3d，接着冷冻干燥得到产物并于-20℃保存。取少量的产物溶于氘水，并通过核磁共振氢谱图确定产物的合成及其接枝率(结果如图2)。

取500mg上述的hama溶于20ml的去离子水中，并装到透析袋中，用0.02m的hcl溶液透析2天，中途更换一次hcl溶液；接着，用去离子水继续透析2天以除去过量的盐酸，去离子水更换时间是3次/天，最后冻干样品，得到脱钠盐的d-hama并保存于-20℃冰箱。

实施例2氨基化明胶(gel-adh)的制备

在1g明胶中加入100ml的去离子水中，并放置在35℃的油浴锅中使其完全溶解。接着加入己二酸二酰肼(adh)，搅拌15分钟，然后加入108mghobt(溶于2mldmso)，154mgedc并调节溶液ph＝5，反应12小时，反应方程式如下(明胶的结构式中曲线代表肽链)：

最后将溶液放在透析袋中并用去离子水透析3d，最后冷冻干燥这个溶液，并将得到的产物保存在-20℃冰箱。

氨基化的明胶上氨基的含量利用现有技术中tnbs法标定。首先将待测的gel-adh溶液及未改性的明胶用去离子水配成0.5mg/ml的溶液，并配置4wt％nahco3的缓冲溶液，然后将tnbs溶液用此缓冲溶液稀释为0.1v/v％的溶液，配置10wt％sds溶液。取待测溶液1ml，缓冲溶液1ml，0.1％tnbs溶液1ml，10％sds溶液1ml于40℃避光反应2小时，接着加入0.5ml的1mhcl并在340nm处的测溶液的紫外吸收强度。用一系列的甘氨酸溶液标定氨基含量与其在340nm处的紫外吸收强度的关系，进而得到明胶改性前后的氨基的含量。

实施例3苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(lap)光引发剂的合成

称取2g(11.75mmol)二甲基苯基磷酸盐于25ml的schlenk瓶中，开启搅拌；接着在平稳的氩气的保护条件下，用恒压滴液漏斗缓慢滴加2.15g(11.75mmol)的2,4,6-三甲基苯甲酰氯，避光反应18小时，之后将反应后的溶液转移到烧瓶中。然后，称取溴化锂(4.08g,47mmol)使其溶于100ml的2-丁酮中，并加入到之前的反应溶液中，接着升温至50℃。避光反应10min后，出现白色沉淀物，沉淀物放在室温下冷却4小时，过滤，并将沉淀物用大量的2-丁酮溶液冲洗，除去过量的溴化锂，最后将沉淀物真空干燥即为所得的光引发剂lap，并将其避光保存在4℃冰箱中，反应方程式如下：

取少量lap溶于氘水中，测核磁共振氢谱，分析其合成情况。1hnmr谱图中各质子氢的归属如下，具体位置为：4.84(d2o),7.75(m，2h)，7.6(m，1h)，7.5(m，2h)，6.91(s，2h)，2.26(s，3h)，2.03(s，6h)(图3)。

实施例4水凝胶的制备

1.透明质酸-明胶-poss复合水凝胶(ha-poss-gel)的制备

首先将实施例1制备的d-hama配成4wt％的dmso溶液(图4a)，然后将实施例2制备的gel-adh同样用dmso配成2wt％、4wt％、6wt％溶液，并和d-hama以1:1的体积混合均匀(图4b)，接着将omaposs(美国hybridplastics公司,500mg/ml，溶于1,4-二氧六环)以1％，2％，3％，4％w/v的终浓度加入到混合溶液中，最后加入0.2％的lap引发剂，将所得的混合物注入直径为15mm厚度为1mm的聚四氟乙烯模具中，用表面洁净的盖玻片液封，并在功率为8mw/cm²的紫外灯光照10min，取出样品，并放在去离子水中透析3d来置换凝胶中的dmso并使其溶胀平衡。不加poss的对照组所得的水凝胶缩写h-gx，其中x表示gel-adh在凝胶中的终浓度(wt％)。实验组中，当gel-adh的质量终浓度为2％时，所得的水凝胶缩写为h-py-g2，其中y表示omaposs在凝胶中的终浓度(wt％)，如h-p1-g2，表示该凝胶中omaposs终浓度为1wt％。

2.透明质酸-poss水凝胶(ha-poss)的制备

在1ml的二甲基亚砜中，加入30mgd-hama，使其终浓度为3wt％；加入30mgomaposs，使其终浓度为3wt％；加入1mg的光引发剂lap，使其终浓度为0.1wt％，于25℃的环境温度下搅拌20分钟，形成完全透明的预凝胶溶液。用移液枪吸取预凝胶溶液注入聚四氟乙烯模具中，用表面洁净的盖玻片液封；将聚四氟乙烯模具转移到紫外灯下，用功率为8mw/cm²的紫外光照射10分钟以形成凝胶。将获得的凝胶从模具中取出，在磷酸盐缓冲溶液中(pbs)中浸泡数次，去除未反应的单体和光引发剂，获得纳米复合水凝胶材料。

实施例5傅里叶转换红外光谱(ftir)测定

将实施例4制备的ha-poss-gel水凝胶样品冷冻干燥得到干燥的样品。接着取适量干燥样品，利用ftir配件atr(衰减全反射)进行红外谱图的测定(华东理工大学材料学院测试中心检测)，测试的波谱范围在650-4000cm^-1。

结果图5所示，水凝胶在1240cm^-1附近的c-n的伸缩振动明显增强，说明gel-adh与d-hama的复合水凝胶的形成，除此之外，在ha-poss-gel水凝胶中看到omaposs中si-o-si的振动(1124cm^-1)，说明此水凝胶的成功合成。

实施例6扫描电子显微镜测试

将实施例4所得的水凝胶通过真空冷冻干燥机进行干燥处理，接着将切开的干燥水凝胶样品放置于贴有导电胶的样品台上。接着喷金20s，用扫描电子显微镜(sem)进行微观形貌的观察，结果如图6和图7所示，ha-poss-gel水凝胶有两级相互贯穿的孔结构，其中较大的孔径在100-200μm，较小的孔径小于50μm，大孔与大孔之间的孔壁较厚，且在孔壁上分散着较小的孔，这可能是ha-poss-gel水凝胶中既存在静电相互作用又存在共价交联作用而造成。其次，从图中可以发现，随着omaposs浓度的增大，水凝胶的孔径有所减少，并且水凝胶孔道结构更加致密，管壁间的小孔结构更小，同时大孔的结构依然存在。有相关研究表明，较大的孔径(100-300μm)有利于细胞在水凝胶内部的迁移与生长，而小孔径(几十微米)有利于细胞的粘附，因此这种梯度结构的水凝胶可能更有利于细胞的相关迁移、增殖等活动。

实施例7水凝胶的力学表征

压缩性能测试：使用万能电子试验机测定水凝胶的压缩性能，将水凝胶放置在测试台上，以1mm/min的速度压缩样品，直至压断，得到应力—应变的曲线，压缩模量根据水凝胶10％形变时的应力计算而得，因为在前10％应变时，应力和应变呈较好的线性关系，符合胡克定律，结果如图8所示，随着omaposs含量的增加，h-py-g2水凝胶的压缩模量逐渐增大，而水凝胶的断裂伸长率先增后减，说明omaposs能起到较好的力学增韧效果。

循环加-卸载应力测试：使用万能电子试验机，将omaposs终浓度不同的水凝胶以1mm/min的速度压缩或是释放应力，并以50％的形变量作为最高的形变量，连续性的进行三次加-卸载应力测试(图9)。

第一次加-卸载应力曲线得到的ha-poss-gel水凝胶的耗散能结果如图10所示，耗散能是通过计算水凝胶第一次加-卸载应力(转换为应力-压缩距离曲线)围成的曲线的积分而得到，h-p4-g2水凝胶较h-p1-g2水凝胶的耗散能提高了超过6倍，说明ha-poss-gel水凝胶能够有效地耗散施加的应力，维持结构的完整性。

流变性能测试：使用旋转流变仪，将所得的omaposs终浓度不同的水凝胶样品放置于25mm的平行板上，电脑测试软件设定参数，在25℃下，以0.1％的应变，在1-100rad/s频率区间内进行振荡频率扫描，结果如图11所示，从水凝胶的储能模量g’和损耗模量g”可以看出水凝胶的结构较为稳定，而且poss的引入增强了h-py-g2等一系列ha-poss-gel水凝胶的机械强度。

实施例8水凝胶的溶胀率检测

水凝胶放置在去离子水中溶胀平衡后，用滤纸擦干水凝胶表面的水分，得到水凝胶的湿态质量w2，再将其冷冻干燥得到样品的干态质量w1，溶胀率定义为样品的湿重除以样品的干重即w2/w1，结果如图12所示，omaposs终浓度越高，h-py-g2水凝胶的溶胀率越小。

实施例9降解性能

将新制的水凝胶冻干，得到其干重w0，接着将水凝胶浸泡在含有100单位/ml透明质酸酶的pbs中，每天更换酶溶液，在规定的时间内测定拿出水凝胶，冻干样品得到水凝胶的残余质量wt，水凝胶的质量残余量＝降解之后的质量(wt)/降解之前的质量(w0)×100％，结果如图13所示，omaposs终浓度越高，水凝胶越不易降解。

实施例10细胞相容性的表征

酒精灭菌处理：将制得的水凝胶切成适当的尺寸，放置在24孔板中，接着用75％v/v的酒精浸泡24小时，并经常性的更换酒精，确保灭菌的效果。接着，用无菌的pbs反复冲洗，并再浸泡12小时，确保酒精的完全清除。最后将其放在4℃冰箱备用。

(1)细胞的死活染色测试：

在含有水凝胶的24孔板中加入含有10％fbs(v/v)，100单位/ml青霉素以及链霉素的α-mem培养基中培养，并在每孔中加入4×10⁴的鼠源的间充质干细胞(mscs)，放在细胞培养箱中培养1天。达到培养时间后，用死活染色试剂(含2mm钙黄绿素-am和2mmpi的pbs溶液)对细胞进行30分钟的染色处理。染色结束后，用pbs冲洗多余的染料3遍，接着在激光扫描共聚焦显微镜(clsm)上观察细胞存活情况，其中，活细胞被染成绿色，死细胞被染成红色，结果如图14所示，接种在ha-poss-gel水凝胶上的mscs呈现出较好的存活情况，且可以发现omaposs的增加有助于提高细胞在水凝胶上的粘附，细胞数量有多提高，因此水凝胶具有良好的细胞相容性，为进一步细胞增殖、分化的研究奠定基础。

(2)细胞贴附实验

间充质干细胞在水凝胶上于培养基中培养1，2，3和4天后，分别在24孔板的每个孔中加入100μl的cck-8工作液于37℃反应4小时，然后将100μl培养液转移到96孔板中分别用cck-8工作液测量波长450nm处的吸光度，评估细胞增殖情况参见图15-1，含omaposs各组的细胞数量均高于不含omaposs的对照组，且omaposs终浓度越高，细胞数量越多，即说明细胞的贴附性越强。图15-2表明，细胞在不添加明胶只添加omaposs的水凝胶上增殖的数量较不含明胶、omaposs更多。

(3)细胞在水凝胶上的分化情况

间充质干细胞在水凝胶上于分化培养基中孵育14天后，加入1ml的trizol裂解细胞并用现有技术提取rna，使用酶标仪测定rna的浓度，按照primescripttmrt试剂盒(perfectrealtime，takara，中国)说明书说明进行反转录，qpcr的10μl组分包括5μlpowersybrgreenpcrmastermix(appliedbio-systems，irvine，ca，usa)，3μl无核酸酶水，1μlcdna和1μl引物以及7500实时pcr检测系统，加样完毕，将ep管至于2000rpm，4℃离心机中离心2min。qpcr的反应程序设置为：95℃30秒热启动，95℃20秒、60℃34秒、72℃40秒，反应40个循环，再以95℃15秒、60℃40秒、95℃15秒反应溶解曲线。用分析软件deltadeltactrelativequantitation分析结果。利用qpcr检测成骨分化基因(opn、osx、bsp、runx2，引物序列如表1)的表达量，结果参见图16-1和图16-2，无论是否添加明胶，含omaposs各组各成骨分化基因的表达量均明显高于不含omaposs对照组；在添加明胶的各组中，omaposs的浓度越高，成骨分化基因的表达量越高，说明omaposs有利于成骨基因的表达。在不添加明胶只添加omaposs的水凝胶上成骨分化基因的表达量较不含明胶、omaposs的水凝胶上更高。

表1引物序列表

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110>上海交通大学医学院附属第九人民医院

华东理工大学

<120>一种poss增强水凝胶及其制备方法和用途

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cactggagccaatgcagaaga21

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tggtggggttgtaggttcaaa21

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ctccattgactcgaacgactc21

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

caggtctgcgaaacttcttagat23

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

cctctgcgggactcaacaac20

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

agcccattagtgcttgtaaagg22

<210>7

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

tggttactgtcatggcgggta21

<210>8

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

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<210>9

<211>21

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

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<210>10

<211>23

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

ggctgttgtcatacttctcatgg23