小柴胡颗粒在防治合胞病毒、腺病毒中的新应用的制作方法

本发明属中成药领域，涉及一种中药组合物—小柴胡颗粒在防治合胞病毒、腺病毒中的新应用。
背景技术：
：呼吸道感染主要症状是发热、咳嗽、鼻塞等，该病主要由细菌和病毒感染引起，其中病毒感染所占比例高达90％以上，而病毒中以合胞病毒、腺病毒尤为常见。呼吸道合胞病毒是一种rna病毒，属副粘液病毒科。近十年来合胞病毒肺炎及毛细支气管炎占我国婴幼儿病毒性肺炎第一位，其症状与副流感病毒肺炎、轻症流感病毒肺炎及轻症腺病毒肺炎临床上几乎无法区别。腺病毒(adenovirus)是一种没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，由252个壳粒呈廿面体排列构成。每个壳粒的直径为7～9nm。衣壳里是线状双链dna分子，约含4.7kb，两端各有长约100bp的反向重复序列。人体腺病毒已知有52种，分别命名为adl～ad52，研究得最详细是ad2，分为a、b、c、d、e和f六个亚群(subgroup)。腺病毒对呼吸道、胃肠道、尿道和膀胱、眼、肝脏等均可感染，人腺病毒约1/3的已知血清型通常与人类疾病相关，但一种血清型可引起不同的临床疾患；相反，不同血清型也可引起同一种疾患。腺病毒肺炎约占儿童期肺炎的10％，多由腺病毒3、7型引起；在青年人腺病毒肺炎的病死率为8％～10％；肺炎也是新兵急性呼吸道疾病的一种严重表现。呼吸道合胞病毒和腺病毒引起的上呼吸道感染具有发病急，传变迅速等特点，如不能及时有效控制，可引起毛细支气管炎、支气管肺炎等，严重危及生命健康。流行病学调查显示，呼吸道合胞病毒(rsv)感染及腺病毒感染好发于婴幼儿，已成为导致婴幼儿死亡的重要原因之一。利巴韦林是传统的抗病毒药物，临床常用于各种病毒感染性疾病的治疗，但效果有限，且长期使用有骨髓和免疫抑制风险。因此，开发新的抑制合胞病毒、腺病毒所致呼吸道感染的药物具有重要的现实意义和社会意义。自由基是人体生命活动中各种生化反应的中间代谢产物，具有不配对电子的分子、原子、离子或原子团，为了使自己变得稳定，自由基会很活跃地夺取其它原子或分子的电子。若自由基的产生和清除之间的平衡打破，自由基便会攻击机体内的生物大分子物质及各种细胞器，造成机体损伤。病毒入侵机体会诱发大量氧自由基的产生，如：超氧阴离子自由基、过氧化氢、羟自由基、单线态氧等。同时病毒可激活巨噬细胞产生过量一氧化氮进而反应生成过氧亚硝酸盐。两者造成氧化应激水平升高，机体局部损伤，全身免疫应答功能下降，生物膜脂质过氧化损伤，最终导致肺组织损伤。病毒感染机体以后，自由基是机体损伤的主要原因。因此，清除病毒所致的过量自由基，对机体保护和治疗病毒感染有着十分重要的意义。小柴胡颗粒系依据东汉医圣张仲景名著《伤寒杂病论》经典名方“小柴胡汤”研制而成的纯中药制剂，是治疗感冒、流感及各种变异流感等伤寒疫症的主方，其为活性成分由柴胡、黄芩、半夏(姜制)、党参、生姜、甘草、大枣七个药味按照“君臣佐使”组方而制成的颗粒型中成药制剂。小柴胡颗粒具有解表散、疏肝和胃的功效，可有效提高人体抵抗力和免疫力，对感冒、流感等防控疗效显著。目前，尚未有涉及小柴胡颗粒在抑制合胞病毒、腺病毒及其所致自由基损伤中的应用。技术实现要素：本发明的目的之一在于提供一种中药组合物-小柴胡颗粒在临床上的新用途。实现上述目的技术方案包括如下。一种中药组合物在制备防治感染呼吸道病毒所致疾病的药物中的应用，所述中药组合物的活性成分的重量份组成为：柴胡150±5份、黄芩56±5份、姜半夏56±3份、党参56±3份、生姜56±3份、甘草56±3份、大枣56±3份，所述呼吸道病毒是合胞病毒、和/或腺病毒。一种中药组合物在制备清除感染呼吸道病毒所致的过度自由基的药物中的应用，所述中药组合物的活性成分的重量份组成为：柴胡150±5份、黄芩56±5份、姜半夏56±3份、党参56±3份、生姜56±3份、甘草56±3份、大枣56±3份，所述呼吸道病毒是合胞病毒、和/或腺病毒。在其中一些实施例中，所述呼吸道病毒是合胞病毒和腺病毒。在其中一些实施例中，所述呼吸道病毒是腺病毒，在一些优选的实施方式中，腺病毒是adv3型、adv4型、adv5型、adv6型、adv7型、adv11型、adv21型，更优选地，是adv3型。在其中一些实施例中，所述疾病是肺炎。在其中一些实施例中，所述中药组合物的活性成分的重量份组成为：柴胡150份、黄芩56份、姜半夏56份、党参56份、生姜56份、甘草56份、大枣56份。在其中优选的一些实施例中，所述中药组合物的剂型是颗粒剂。本发明通过采用体外抗病毒实验、体内小鼠病毒感染模型实验，以合胞病毒和腺病毒为感染病毒进行实验，发现小柴胡颗粒具有很好的体外抗病毒(合胞病毒和腺病毒)活性，且能够改善合胞病毒、腺病毒所致的肺部损伤，明显减轻病毒引起的呼吸道过氧化损伤，显著增加机体清除自由基能力(显著调控：cat、sod、gsh-px、mda、no、mpo、tnf-a、il-6、ros、抗超氧阴离子等)，呈现量效关系特征。即发现小柴胡颗粒在抑制和清除合胞病毒、腺病毒及其所致自由基损伤中的新作用。附图说明图1、图2、图3、图4分别是本发明实施例3中各组药物对rsv感染小鼠血清tnf-a、il-6、ros、抗超氧阴离子作用结果示意图；图5、图6、图7、图8、图9、图10分别是本发明实施例3中各组药物对rsv感染小鼠肺组织cat、sod、gsh-px、mda、no、mpo作用结果示意图；图11、图12、图13、图14分别是本发明实施例3中各组药物对adv3感染小鼠血清tnf-a、il-6、ros、抗超氧阴离子作用结果示意图；图15、图16、图17、图18、图19、图20是本发明实施例3中各组药物对adv3感染小鼠肺组织cat、sod、gsh-px、mda、no、mpo作用结果示意图。具体实施方式本发明下列实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明的术语包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或组分，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或组分。在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。以下实施例中的小柴胡颗粒由广州白云山光华制药出售，其活性成分具体组成为：柴胡150g、黄芩56g、姜半夏56g、党参56g、生姜56g、甘草56g、大枣56g，制剂为颗粒剂。因辅料蔗糖可导致抗菌试验产生假阳性结果，故本研究以小柴胡颗粒(无糖版)用于后续试验。实施例1实施例1：小柴胡颗粒体外抗病毒抑制试验1.实验材料：1.1受试药物：小柴胡颗粒(无糖，广州白云山光华制药股份有限公司)。1.2对照药物：利巴韦林。1.3病毒株：合胞病毒(rsv，long株)、腺病毒(adv3型、adv4型、adv5型、adv6型、adv7型、adv11型、adv21型)。病毒用hela细胞单层连续传代2次，收获细胞培养液，冻藏于-80℃冰箱备用。1.4细胞模型：hep-2细胞。2.实验方法：2.1病毒毒力的测定将100μl10倍系列稀释得到的10个浓度的病毒液，每浓度设8个复孔，依次接种到长满单层hep-2细胞层的96孔板中，同时设细胞对照。37℃、5％co2病毒培养箱中培养，逐日用倒置显微镜观察细胞病变(cpe)，连续观察3天，用mtt法进行检测。在酶标仪570nm波长测定吸光度od值，用reed-muench法计算病毒半数感染剂量(tcid50)。测定结果：rsv在hep-2细胞中病毒毒力tcid50为10-6.1/0.1ml，腺病毒(adv3型、adv4型、adv5型、adv6型、adv7型、adv11型、adv21型)在hep-2细胞中病毒毒力tcid50分别为10-5.3/0.1ml、10-5.7/0.1ml、10-5.0/0.1ml、10-5.3/0.1ml、10-4.9/0.1ml、10-5.0/0.1ml、10-5.4/0.1ml。2.2小柴胡颗粒细胞毒性测定取hep-2细胞已长成单层的96孔细胞培养板，倾去培养液，用pbs洗涤2次，加入不含血清dmem培养基连续2倍系列稀释(1600μg/ml-50μg/ml)小柴胡颗粒药液，100μl/孔，每个浓度设4个复孔，设正常细胞对照4孔。37℃、5％co2病毒培养箱中培养72h，用mtt法进行检测，在570nm波长下测出各实验组与细胞对照组的吸收度。以对照孔为参照，计算各试验孔细胞的活力比值。根据reed-muench法计算细胞tc50，整个实验重复3次，取平均值。测定结果：小柴胡颗粒的细胞半数毒性量tc50>770μg/ml。2.3小柴胡颗粒抗病毒活性测试取hep-2细胞已长成单层的96孔细胞培养板，倾去培养液，用pbs洗涤2次，加入100tcid50病毒液，100μl/孔，37℃、5％co2吸附2h。加入不含血清的dmem培养基连续2倍系列稀释(200μg/ml-12.5μg/ml)小柴胡颗粒药液，同时设病毒对照组、细胞对照组、阳性药组。在37℃、5％co2病毒培养箱中培养72h，用mtt法进行检测，用酶标仪测570nm波长的吸光度od值。按下述公式计算药物对病毒的抑制率：病毒抑制率(％)＝(药物处理组od均值-病毒对照组od均值)/(细胞对照组od均值-病毒对照组od均值)×100％，根据reed-muench法计算药物对rsv或腺病毒(adv3型、adv4型、adv5型、adv6型、adv7型、adv11型、adv21型)致cpe产生的抑制率、ec50及药物抑毒指数(ti)，整个实验重复3次，取平均值。实验结果：根据mtt结果，采用reed-muench法计算，小柴胡颗粒及利巴韦林组cpe抑制率均在45％以上，均能显著抑制rsv和腺病毒增值(p＜0.01)，其中小柴胡颗粒对rsv和腺病毒(adv3型、adv4型、adv5型、adv6型、adv7型、adv11型、adv21型)的ec50分别为30.3μg/ml、29.6μg/ml、28.6μg/ml、26.7μg/ml、29.1μg/ml、27.3μg/ml、29.4μg/ml、32.8μg/ml，ti分别为26.78、26.52、25.93、26.61、26.75、25.94、27.16、27.41，阳性药物利巴韦林对rsv和腺病毒(adv3型、adv4型、adv5型、adv6型、adv7型、adv11型、adv21型)的ec50分别为18.5μg/ml、22.9μg/ml、19.6μg/ml、17.6μg/ml、20.1μg/ml、16.2μg/ml、18.9μg/ml、18.5μg/ml，ti分别为19.22、10.23、10.53、12.36、11.41、10.98、11.56、11.24。结论：表明小柴胡颗粒安全性优于利巴韦林，在hep-2细胞中，对rsv及腺病毒(adv3型、adv4型、adv5型、adv6型、adv7型、adv11型、adv21型)具有较强的抑制作用，起到抗病毒效果。实施例2：小柴胡颗粒对合胞病毒、腺病毒感染小鼠肺炎模型体内实验1.实验材料：1.1受试药物：小柴胡颗粒(无糖，广州白云山光华制药股份有限公司)。1.2对照药物：利巴韦林。1.3病毒：合胞病毒(rsv，long株)，腺病毒(adv3型)。2.实验动物：spf级昆明种小鼠，18～20g，120只，雄性，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号syxk(粤)2019－0185。在实验动物适应新环境一周后开始实验，并在实验过程中采取适当的方法减轻对动物的伤害。3.实验方法：3.1抗合胞病毒感染小鼠肺炎模型将小鼠随机分为空白对照组、rsv模型组、利巴韦林组、小柴胡颗粒低剂量组(5.4g/kg，为人体临床等效剂量)、小柴胡颗粒中剂量组(10.8g/kg)、小柴胡颗粒高剂量组(21.6g/kg)，共六组，每组10只，小鼠在乙醚轻度麻醉下，除空白对照组外，每只小鼠以25μl50ld50病毒液滴鼻感染，空白对照组用等量生理盐水滴鼻。感染后1h，空白对照组和模型组予以等体积生理盐水灌胃，小柴胡颗粒低、中、高剂量组给予小柴胡颗粒药液灌胃，每日一次，连续5日。3.2adv3病毒感染小鼠肺炎模型将小鼠随机分为空白对照组、adv3模型组、利巴韦林组、小柴胡颗粒低剂量组(5.4g/kg，为人体临床等效剂量)、小柴胡颗粒中剂量组(10.8g/kg)、小柴胡颗粒高剂量组(21.6g/kg)，共六组，每组10只，小鼠在乙醚轻度麻醉下，除空白对照组外，每只小鼠以25μl50ld50病毒液滴鼻感染，空白对照组用等量生理盐水滴鼻。感染后1h，空白对照组和模型组予以等体积生理盐水灌胃，小柴胡颗粒低、中、高剂量组给予小柴胡颗粒药液灌胃，每日一次，连续5日。感染后第6天，剖杀小鼠，剖杀前禁食不禁水12h以上。腋下动脉放血处死后取出鼠肺，将鼠肺放在盛有9g/l生理盐水的培养皿中洗净表面血液，并用吸水纸吸干表面水分，然后放在锡纸上一起称湿质量，做好标记放到65℃烘箱烘干48h，质量不变后称量干质量，计算肺湿干比率、肺指数与肺指数抑制率。计算公式：肺湿干比率＝肺湿质量(g)/肺干质量(g)；肺指数＝肺质量(g)/体重(g)×100％；肺指数抑制率＝(模型对照组平均肺指数-实验组平均肺指数)/模型对照组平均肺指数×100％。数据处理与统计方法：数据用平均值±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析；采用spss22.0软件处理数据。4.实验结论：肺指数值与肺湿干比率越大，表示肺炎越严重。结果表明(表1、表2)，小柴胡颗粒能够显著降低rsv及adv3感染小鼠的肺指数与肺湿干比率，且对rsv及adv3分别呈现量效特征，表明小柴胡颗粒对合胞病毒及腺病毒所致肺炎具有改善作用。表1小柴胡颗粒对rsv感染小鼠肺炎模型肺指数及肺湿干比率的作用(n＝10)组别肺指数肺湿干比抑制率(％)空白对照组0.75±0.072.25±0.23—模型组1.46±0.18##6.07±0.40##—利巴韦林组0.83±0.07**4.70±0.24**43.15低剂量实验组1.27±0.15*4.76±0.12**13.01中剂量实验组0.98±0.08**4.62±0.15**32.88高剂量实验组0.93±0.04**4.45±0.13**37.58注：与空白对照组比较，#p<0.05，##p<0.01；与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01表2小柴胡颗粒对adv3感染小鼠肺炎模型肺指数及肺湿干比率的作用(n＝10)注：与空白对照组比较，#p<0.05，##p<0.01；与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01实施例3：小柴胡颗粒清除合胞病毒、腺病毒感染小鼠肺炎模型体内过量自由基实验1.实验材料：1.1受试药物：小柴胡颗粒(无糖，广州白云山光华制药股份有限公司)。1.2对照药物：利巴韦林。1.3病毒：合胞病毒(rsv，long株)，腺病毒(adv3型)。1.4.实验动物：spf级昆明种小鼠，18～20g，120只，雄性，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号syxk(粤)2019－0185。在实验动物适应新环境一周后开始实验，并在实验过程中采取适当的方法减轻对动物的伤害。2.实验方法：2.1抗合胞病毒感染小鼠肺炎模型将小鼠随机分为空白对照组、rsv模型组、利巴韦林组、小柴胡颗粒低剂量组(5.4g/kg，为人体临床等效剂量)、小柴胡颗粒中剂量组(10.8g/kg)、小柴胡颗粒高剂量组(21.6g/kg)，共六组，每组10只，小鼠在乙醚轻度麻醉下，除空白对照组外，每只小鼠以25μl50ld50病毒液滴鼻感染，空白对照组用等量生理盐水滴鼻。感染后1h，空白对照组和模型组予以等体积生理盐水灌胃，小柴胡颗粒低、中、高剂量组给予小柴胡颗粒药液灌胃，每日一次，连续5日。2.2adv3病毒感染小鼠肺炎模型将小鼠随机分为空白对照组、adv3模型组、利巴韦林组、小柴胡颗粒低剂量组(5.4g/kg，为人体临床等效剂量)、小柴胡颗粒中剂量组(10.8g/kg)、小柴胡颗粒高剂量组(21.6g/kg)，共六组，每组10只，小鼠在乙醚轻度麻醉下，除空白对照组外，每只小鼠以25μl50ld50病毒液滴鼻感染，空白对照组用等量生理盐水滴鼻。感染后1h，空白对照组和模型组予以等体积生理盐水灌胃，小柴胡颗粒低、中、高剂量组给予小柴胡颗粒药液灌胃，每日一次，连续5日。感染后第6天，小鼠眼球取血，4℃、3500r/min离心15min分离血清，-20℃保存备用。按试剂盒说明书检测血清中tnf-a、ros、il-6含量与抗超氧阴离子(o2-)活力单位；处死动物后取出全肺，置匀浆器中加生理盐水，研磨制成匀浆，4℃、2500r/min离心20min，取上清液，-20℃保存备用。按试剂盒说明书检测肺组织cat、sod、gsh-px、mda、no、mpo的含量。实验数据采用spss22.0软件进行统计分析，计量资料以平均值±标准差表示，组间差异采用单因素方差分析，p<0.05为差异有统计学意义。3.实验结果：tnf-a、il-6能诱导肺内皮细胞活化、白细胞迁移、粒细胞脱颗粒和毛细血管渗漏等，激活损伤粒细胞、内皮细胞、血小板等，进一步释放氧自由基、溶酶体酶等，诱发并加重炎症反应。mda的水平越高，反映脂质过氧化程度越高；高水平no、ros与mpo导致细胞毒性作用，介导免疫损伤。由表3(图1-图4)、表4(图5-图10)、表5(图11-图14)、表6(图15-图20)可知，小柴胡颗粒给药租与模型组比较，小鼠肺组织中生化指标发生明显变化，mda、no、mpo、tnf-a、il-6、ros含量降低，差异均具有统计学意义(p＜0.01，p＜0.05)，提示小柴胡颗粒可明显抑制体内氧自由基的释放，减轻脂质过氧化程度和降低各种炎症因子的水平，从而减轻炎症反应。抗超氧阴离子活力单位越高，说明清除超氧阴离子(o2-)能力越强；cat、sod、gsh-px是机体重要的抗氧化酶，可清除自由基，减轻氧化损伤。由表3、表4、表5、表6可知，小柴胡颗粒给药租与模型组比较，cat、sod、gsh-px活性与抗超氧阴离子升高，清除自由基的能力增强，肺组织损伤减轻，使机体受到保护，差异均具有统计学意义(p＜0.01，p＜0.05)。上述结果表明，小柴胡颗粒可用于清除rsv、adv3感染导致的过量自由基。表3小柴胡颗粒对rsv感染小鼠肺炎模型血清tnf-a、il-6、ros、抗超氧阴离子的作用(n＝10)注：与空白对照组比较，#p<0.05，##p<0.01；与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01表4小柴胡颗粒对rsv感染小鼠肺炎模型肺组织cat、sod、gsh-px、mda、no、mpo的作用(n＝10)注：与空白对照组比较，#p<0.05，##p<0.01；与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01表5小柴胡颗粒对adv3感染小鼠肺炎模型血清tnf-a、il-6、ros、抗超氧阴离子的作用(n＝10)注：与空白对照组比较，#p<0.05，##p<0.01；与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01表6小柴胡颗粒对adv3感染小鼠肺炎模型肺组织cat、sod、gsh-px、mda、no、mpo的作用(n＝10)注：与空白对照组比较，#p<0.05，##p<0.01；与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.014.实验结论：小柴胡颗粒在抑制合胞病毒、腺病毒及其所致自由基损伤中能够有效的减轻合胞病毒、腺病毒引起的呼吸道、肺部过氧化损伤，增加机体清除自由基的能力，达到治疗病毒感染所致肺炎的效果。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12