一种骨融合水凝胶支架及其制备方法与流程

本发明属于生物医用材料技术领域，特别涉及一种骨融合水凝胶支架及其制备方法。

背景技术：

三维(3d)打印作为一种增材制造技术，已经给医疗及生命科学领域带来了重大的变革。通过计算机辅助设计(cad)和计算机辅助制造(cam)技术，可以将细胞、生物材料以及生物大分子，精确地放置于预设空间的特定位置。利用3d打印技术可精确制作具有复杂三维结构的细胞支架，为细胞生长提供良好的环境，其在骨组织工程支架制作中具有重大应用前景。

为了给细胞的增殖生长提供良好的三维环境，同时不抑制也不干扰细胞的生长，需要在三维支架内部构建多孔结构；合适大小的三维孔径利于细胞向孔隙内生长，也利于组织的长入，促进细胞黏附，促进新生骨组织向材料内部延伸，也为钙化、矿化沉积提供了足够的三维结构和高孔隙空间，用来确保足够的细胞浸润性和必要的营养成分及细胞代谢废物的交换。

骨生长因子具有诱导和刺激骨细胞增殖、骨组织再生及完成骨缺损修复的生物学效应，是骨组织工程研究中的重要因素。目前，常用的骨生长因子主要包括：bmps、转化生长因子-β1(tgf-β1)、成纤维细胞生长因子(fgf)、血小板衍生生长因子(pdgf)、骨生成诱导因子(oif)等。其中bmp-2是脊柱手术中最为常用的骨生长因子，已被美国fda批准，其对骨的生成能够起到明显的调控和促进作用。但这类外源性生长因子在活体内的有效浓度、持续作用时间等因素均会对其生物调节功能产生显著影响，直接使用bmp-2常常难以达到所期望的生物学效应，甚至会产生一定的副作用。如何才能使bmp-2在骨修复中发挥其应有的调控作用，长期以来一直是骨组织工程构建过程中人们关注和研究的重点内容。

目前多数学者认为，能够提高骨生长因子局部作用效应的方式和途径主要有两种：第一，利用生物材料制备工艺研制能够负载骨生长因子的缓释系统，通过缓释系统在体内的自行降解实现局部持续释放骨生长因子的目的。第二，利用转基因技术将骨生长因子基因转染种子细胞，通过细胞植入达到在局部持续表达骨生长因子的目的。转基因技术复杂而又难于控制，如引起细胞基因突变、蛋白表达时间短以及病毒蛋白引起的抗原免疫等问题，均是困扰基因治疗应用于临床的技术瓶颈，尚需要进一步深入研究解决。与复杂的转基因技术相比，微球控释技术简单方便、可控性好、安全性更高。已有大量实验研究表明，无论是在体内还是在体外，骨生长因子微球缓释载体均体现出了良好的成骨效果。

技术实现要素：

本发明的技术目的是提供一种骨融合水凝胶支架及其制备方法，该制备方法工艺简单，采用该制备方法制得的骨融合水凝胶支架不仅具有高机械强度、高孔隙率以及高精度，同时所使用材料中微球控释骨生长因子具有促进骨髓间充质干细胞及骨组织长入从而诱导骨修复的能力。

为实现上述技术目的，本发明采取的技术方案为：一种骨融合水凝胶支架，包括网状圆盘结构的载药层、第一成骨介导层和第二成骨介导层，载药层、第一成骨介导层和第二成骨介导层通过高分子水凝胶由上至下依次粘连并固化形成多层多孔的水凝胶支架，载药层所用材料包括高分子水凝胶和负载重组人骨形态发生蛋白-2的2-n,6-o-硫酸化壳聚糖(rhbmp-2/nps)，第一成骨介导层和第二成骨介导层所用材料均包括高分子水凝胶和羟基磷灰石纳米晶体(nha)。

进一步地，所述负载重组人骨形态发生蛋白-2的2-n,6-o-硫酸化壳聚糖(rhbmp-2/nps)为带负电的2-n,6-o-硫酸化壳聚糖(2-n，6-o-sulfatedchitosan，26scs)纳米球与带正电的重组人骨形态发生蛋白-2(rhbmp-2)通过离子键交联而成，带负电的2-n,6-o-硫酸化壳聚糖(2-n，6-o-sulfatedchitosan，26scs)纳米球由2-n,6-o-硫酸化壳聚糖(26scs)溶于硫酸钠(ss)得到，带正电的rhbmp-2由rhbmp-2与带正电的壳聚糖溶液混合而成。

进一步地，所述高分子水凝胶为聚乙二醇二丙烯酸酯(pegda)水凝胶、聚乙二醇(peg)水凝胶中的一种或两种。

进一步地，所述载药层、第一成骨介导层和第二成骨介导层均为直径15mm，高1.2mm的网状圆盘，所述网状圆盘在紫外光激发下经过3d打印成型，由10条相互平行的双杠结构组成，其中每条杠宽250μm，双杠之间间隔200μm，相邻双杠之间间隔750μm，顶层和底层的网状圆盘的双杠结构正对齐，均与中间层网状圆盘的双杠结构互相垂直。

本发明还提供了骨融合水凝胶支架的制备方法，所述骨融合水凝胶支架在紫外光激发下通过3d打印成型，包括以下步骤：

步骤s1、3d打印载药层：高分子水凝胶载体和负载rhbmp-2/nps的2-n,6-o-硫酸化壳聚糖(rhbmp-2/nps)按一定比例混合后在紫外光激发下经过3d打印成直径15mm，高1.2mm的网状圆盘；

步骤s2、3d打印第一成骨介导层：高分子水凝胶与羟基磷灰石纳米晶体(nha)在紫外光激发下经过3d打印成直径15mm，高1.2mm的网状圆盘；

步骤s3、3d打印第二成骨介导层：高分子水凝胶和羟基磷灰石纳米晶体(nha)按一定比例混合后在紫外光激发下经过3d打印成直径15mm，高1.2mm的网状圆盘；

步骤s4、多层多孔状水凝胶支架固化成型：将上述3d打印成型的载药层、第一成骨介导层和第二成骨介导层通过高分子水凝胶由上至下依次粘连，其中，载药层和第二成骨介导层的双杠上下对齐，且均与第一成骨介导层的双杠相垂直，最后紫外照射下固化形成多层多孔的水凝胶支架。

进一步地，所述rhbmp-2/nps的2-n,6-o-硫酸化壳聚糖(rhbmp-2/nps)的制备方法为：

步骤1：26scs的制备：氯磺酸(hclso3)在0～4℃下逐滴加入47.25份二甲基甲酰胺中，混合搅拌15min进行稳定化；然后转移到装有2.5份分子量为20x104da～30x104da的壳聚糖、56.67份甲酰胺和2.44份甲酸的三颈烧瓶中，在机械搅拌和氩气环境下，在45～55℃反应2h，获得淡黄色溶液；向淡黄色溶液中加入394.5～789份乙醇对产物进行沉淀，再在真空下过滤沉淀，用乙醇洗涤至少3次；将沉淀溶于水中并用盐酸或者氢氧化钠调节ph至7～8，然后将溶液在5000rpm离心15min，得到上清液，再将上清液用分子量为14000da的透析膜透析3天，取透析过膜的液体通过冻干得到所需的26scs；；

步骤2：将壳聚糖在2％乙酸中溶解，得到0.02％(w/v)带正电荷的壳聚糖溶液；

步骤3：将rhbmp-2与0.02％(w/v)的带正电荷壳聚糖溶液混合，制得带正电的重组人骨形态发生蛋白-2(rhbmp-2)溶液；

步骤4：将10mg/ml的2-n,6-o-硫酸化壳聚糖(26scs)溶于7.1份硫酸钠(ss)溶液中，制得带负电的2-n,6-o-硫酸化壳聚糖(2-n，6-o-sulfatedchitosan，26scs)纳米球溶液；

步骤5：将带正电的重组人骨形态发生蛋白-2(rhbmp-2)等体积缓慢逐滴加入到带负电的2-n,6-o-硫酸化壳聚糖(2-n，6-o-sulfatedchitosan，26scs)纳米球溶液中，并在室温下涡旋制得rhbmp-2/nps。

进一步地，步骤s1中，高分子水凝胶载体的制备：按重量份计，将60份的pegda(mn＝700)溶液、40份的peg(mw＝300)溶液、0.3份光引发剂混合后静置过夜，充分溶解。

进一步地，步骤s1中，载药层由高分子水凝胶载体与0.3mg/ml的rhbmp-2/nps混合，在紫外光激发下经过3d打印成直径15mm，高1.2mm的网状圆盘；步骤s2中，第一成骨介导层由nha、pegda水凝胶、光引发剂以10％：1：0.5％的重量比混合，在紫外光激发下经过3d打印成直径15mm，高1.2mm的网状圆盘；步骤s3中，第二成骨介导层由nha、pegda水凝胶、光引发剂以20％：1：0.5％的重量比混合，在紫外光激发下经过3d打印成直径15mm，高1.2mm的网状圆盘，且载药层、第一成骨介导层和第二成骨介导层之间通过pegda水凝胶粘连。

进一步地，所述光引发剂为2,4,6-三甲基苯甲酰二苯氧磷(bapo)。

进一步地，所述紫外光的波长为355nm，功率为40～110mw。

本发明的有益效果：

(1)本发明的骨融合水凝胶支架复合现有的人工(rhbmp-2/nps)和天然(高分子水凝胶、nha)材料，综合各种材料的优点，提高了材料学性能；

(2)本发明利用3d打印技术精确制作具有复杂三维结构的细胞支架，制备工艺简便，支架构建与固化一次完成，同时多层多孔的细胞支架为细胞的增殖和生长提供了良好的三维环境，提高了生物学性能；

(3)本发明的骨融合水凝胶支架载药层使用壳聚糖纳米球缓释bmp-2，让其在脊柱骨融合中安全、有效地发挥调控作用，提高药物学性能。

附图说明

图1是本发明的骨融合水凝胶支架结构示意图；

图2是图1的俯视图；

图3是本发明实施例1的骨融合水凝胶支架的光镜图；

图4是本发明实施例1的骨融合水凝胶支架的扫描电镜(sem)图。

其中的附图标记为：载药层1、第一成骨介导层2、第二成骨介导层3。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。

下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。

为解决背景技术中存在的技术问题，提供一种骨融合水凝胶支架，下面从结构和制备方法两个方面来具体叙述。

一、骨融合水凝胶支架的结构

1.1结构

本发明的骨融合水凝胶支架为紫外光激发下通过3d打印制备的三维结构细胞支架，该三维结构细胞支架由载药层1、第一成骨介导层2和第二成骨介导层3通过高分子水凝胶由上至下依次粘连并在紫外照射下固化形成，载药层1、第一成骨介导层2和第二成骨介导层3均为网状圆盘，网状圆盘在紫外光激发下经过3d打印成型，由10条相互平行的双杠结构组成，其中每条杠宽250μm，双杠之间间隔200μm(双杠的两条单杠间距)，相邻双杠之间间隔750μm，顶层网状圆盘(载药层1)和底层网状圆盘(第二成骨介导层3)的双杠结构正对齐，均与中间层网状圆盘(第一成骨介导层2)的双杠结构互相垂直，载药层1、第一成骨介导层2和第二成骨介导层3的双杠之间形成的方孔孔位对齐，如图1和图2所示，通过3d打印技术制备的具有复杂三维结构的多层多孔细胞支架，提升了材料的孔隙率和精度。

1.2材料

载药层1、第一成骨介导层2和第二成骨介导层3通过高分子水凝胶由上至下依次粘连，高分子水凝胶复合现有的人工和天然材料，综合各种材料的优点，既增强了材料机械性能，又使支架与体内的细胞和组织之间有良好的亲和能力，此外，该材料的制作原料价格便宜，简便易得，安全有效，使用后可在体内自行降解。

载药层1的制备材料选择高分子水凝胶和负载重组人骨形态发生蛋白-2的2-n,6-o-硫酸化壳聚糖(rhbmp-2/nps)，负载重组人骨形态发生蛋白-2的2-n,6-o-硫酸化壳聚糖(rhbmp-2/nps)为带负电的2-n,6-o-硫酸化壳聚糖(2-n，6-o-sulfatedchitosan，26scs)纳米球与带正电的重组人骨形态发生蛋白-2(rhbmp-2)复合而成，带负电的2-n,6-o-硫酸化壳聚糖(26scs)纳米球由2-n,6-o-硫酸化壳聚糖(26scs)溶于硫酸钠(ss)得到，带正电的rhbmp-2由rhbmp-2与带正电的壳聚糖溶液混合而成，rhbmp-2是转化生长因子β超家族中的一员，对骨的生成能够起到明显的调控和促进作用，是脊柱手术中最为常用的骨生长因子，已被美国fda批准使用；26scs是使用氯磺酸、二甲基甲酰胺、高分子量的壳聚糖、甲酰胺、甲酸、乙醇制备而成，经过前期大量的实验验证，26scs缓释rhbmp-2能显著地提升c2c12细胞系中骨钙素mrna的含量，碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,alp)活性和矿化作用，在动物实验中也表现出了强大的成骨活性，此外还能促进骨组织周围毛细血管的形成，作用时间可长达12周，这归因于26scs和其释放的rhbmp-2的协同作用。

第一成骨介导层2和第二成骨介导层3的制备材料均包括高分子水凝胶和羟基磷灰石纳米晶体(nha)，nha可直接购买也可自行制备(由磷酸铵溶液，水，氢氧化铵，硝酸钙溶液等复合而成，冻干后形成的细粉)；nha由于其独特的生物结构和成分，不仅能作为纳米机械加固材料，而且可以作为成骨介导因子，与前述载药层1通过高分子水凝胶粘连复合形成的三层骨融合水凝胶支架具有良好的力学性能以及可以加快新骨形成的速度，而且nha的主要成分羟基磷灰石也是人体骨组织中的主要成分，因此该材料与人体组织具有良好的生物相容性。

由nha与高分子水凝胶混合液为材料通过3d打印形成的两层成骨介导层(第一成骨介导层2和第二成骨介导层3)，由高分子水凝胶和负载重组人骨形态发生蛋白-2的2-n,6-o-硫酸化壳聚糖(rhbmp-2/nps)混合液为材料通过3d打印形成的载药层1，在保证材料机械强度不变的情况下，形成了高孔隙率、高精度的支架结构，通过基质掺入、表面吸附和原位成核来提高细胞支架的性能，使骨髓间充质干细胞、新生的成骨细胞和骨组织能在支架内部更好地生长、融合。

二、骨融合水凝胶支架的制备方法

将载药层1作为骨融合水凝胶支架的顶层，在光固化打印机中加入高分子水凝胶载体和0.3mg/mlrhbmp-2/nps，打印一个直径15mm，高1.2mm的网状圆盘；第一成骨介导层2作为骨融合水凝胶支架的中间层，在光固化打印机中加入质量比为10％：1：0.5％的nha、pegda水凝胶、光引发剂混合液，打印形状同载药层1；第二成骨介导层3作为骨融合水凝胶支架的底层，在光固化打印机中加入20％wt/wt/0.5％wt的nha/pegda/光引发剂混合液，打印形状同载药层1；将打印完成的载药层1、第一成骨介导层2和第一成骨介导层2用pegda水凝胶由上至下依次粘连，并于紫外照射下固化形成多层多孔的水凝胶支架；具体制备步骤如下：

步骤s1、高分子水凝胶载体的制备：按重量份计，将60份的pegda(mn＝700)溶液、40份的peg(mw＝300)溶液、0.3份光引发剂混合后静置过夜，充分溶解。所述光引发剂为苯基双(2,4,6-三甲基苯甲酰基)氧化膦(phenylbis(2,4,6-trimethylbenzoyl)-phosphineoxide，bapo)；

详细地，所述的peg及其衍生物pegda是少数几个可被用于3d打印的天然材料，具有优良的固化性能和塑性效果。将pegda、peg和光引发剂均匀混合后，装入用锡箔纸遮光处理的容器内，加入磁力搅拌器中速均匀搅拌，其中pegda和peg可快速互溶，光引发剂溶解较慢，待次日光引发剂完全溶解后将材料放在阴凉避光处储存，并尽快使用；

步骤s2、rhbmp-2/nps的制备：

(1)26scs的制备：氯磺酸(hclso3)在0-4℃冷却条件下逐滴加入47.25份二甲基甲酰胺，混合搅拌15min进行稳定化；然后转移到装有2.5份高分子量的壳聚糖(20x10⁴da～30x10⁴da)、56.67份甲酰胺和2.44份甲酸的三颈烧瓶中，在机械搅拌和氩气环境下，在45～55℃反应2h，最终获得均匀的淡黄色溶液，以上反应完成后，加入394.5～789份乙醇对产物进行沉淀，在真空下过滤沉淀，用乙醇洗涤至少3次，再溶于水中，用盐酸或者氢氧化钠调节ph至7～8.将未溶解的物质在5000rpm离心15min，得到上清液，用分子量为14000da的透析膜透析3天，通过冻干得到所需的26scs；

(2)rhbmp-2/nps的制备：将高分子量的壳聚糖(20x10⁴da～30x10⁴da)在2％乙酸中溶解，得到0.02％(w/v)带正电荷的壳聚糖溶液，将所需量的rhbmp-2与0.02％(w/v)的壳聚糖溶液混合(电动电势12.3mv)，制得带正电的重组人骨形态发生蛋白-2(rhbmp-2)溶液(rhbmp-2/壳聚糖溶液)；将26scs(10mg/ml)溶于7.1份硫酸钠(sodiumsulfate,ss)作为带负电荷的26scs纳米球溶液(26scs/ss溶液，电动电势-18.8mv)；将等体积的rhbmp-2/壳聚糖溶液缓慢逐滴加入到26scs/ss溶液中，并在室温下以最大速度涡旋60秒，从而制得rhbmp-2/nps；

进一步地，加入5～8g的氯磺酸可以得到不同分子量以及不同硫化程度的26scs；在45～55℃选择不同温度进行反应可以得到不同分子量以及不同硫化程度的26scs；本研究采用复合凝聚法制备rhbmp-2/nps，将制备的rhbmp-2/nps离心后的沉淀颗粒冻干提纯。

步骤s3、nha的制备：将90份磷酸铵溶液加入到375份的水中，用氢氧化铵调整ph至10，164份硝酸钙溶液在搅拌时滴入上述混合物中，室温下羟基磷灰石持续析出10min；添加完硝酸钙后，在teflonliner中将ha沉淀及溶液在200℃下用水热法处理20h；20h后，将nha沉淀离心，用水彻底冲洗三次，在80℃干燥12h并磨成细粉；

详细地，通过水热法处理合成仿生nha，可以对纳米级结晶度和表面形貌有很好的控制，此外，该方法合成的nha作为3d打印骨结构可以提供良好的机械强化，用于增强承受压缩载荷的能力。

进一步地，上述nha还可从市场上直接购买获得。

步骤s4、三层水凝胶支架的固化成型：载药层1为骨融合水凝胶支架的顶层，在光固化打印机中加入步骤s1所述的高分子水凝胶载体和0.3mg/ml步骤s2所述的rhbmp-2/nps，打印一个直径15mm，高1.2mm的网状圆盘；第一成骨介导层2作为骨融合水凝胶支架的中间层，在光固化打印机中加入质量比为10％：1：0.5％(10％wt/wt/0.5％wt)的nha、pegda水凝胶、光引发剂混合液，打印一个直径15mm，高1.2mm的网状圆盘；第二成骨介导层3作为骨融合水凝胶支架的底层，在光固化打印机中加入20％wt/wt/0.5％wt的nha/pegda/光引发剂混合液，打印一个直径15mm，高1.2mm的网状圆盘；将打印完成的载药层1、第一成骨介导层2和第一成骨介导层2用pegda水凝胶由上至下依次粘连，并于紫外照射下固化形成多层多孔的水凝胶支架，如图1所示。

进一步地，上述制备步骤中紫外照射的紫外光波长为355nm，功率为40～110mw。

进一步地，载药层1、第一成骨介导层2和第一成骨介导层2为形状尺寸完全相同的网状圆盘结构，在紫外光激发下经过3d打印成型，该网状圆盘由10条相互平行的双杠结构组成，其中每条杠宽250μm，双杠之间间隔200μm，两个双杠之间间隔750μm，其中相邻层网状圆盘的双杠结构互相垂直(顶层和底层的网状圆盘的双杠结构正对齐，均与中间层网状圆盘的双杠结构互相垂直)，如图2所示，三层网状圆盘形成的多孔结构使得新组织在形成过程中能够进行有效的营养交换和代谢废物清除。

本发明提供的上述骨融合水凝胶支架制备方法，在保证融合材料具有高机械强度、高孔隙率以及高精度的同时，具有微球控释骨生长因子促进骨髓间充质干细胞及骨组织长入从而诱导骨修复的能力，且制备方法步骤简便，支架构建与固化一次完成。载药层中的壳聚糖纳米微球可长效缓释骨生长因子，两层骨介导层加入了水热法处理合成的nha，共同促进骨髓间充质干细胞的增殖和早期成骨。

下面提供具体的实施例来进一步阐述本申请的骨融合水凝胶支架是如何制作的：

实施例1

步骤s1、高分子水凝胶载体的制备：将27g的pegda溶液、18g的peg溶液、0.135g光引发剂混合后静置过夜，充分溶解；

步骤s2、rhbmp-2/nps的制备

1)制备26scs：在三颈烧瓶中加入2.5g高分子量的壳聚糖、50ml甲酰胺和2ml甲酸，hclso3在0℃冰水中稳定2min，打开通风设备，逐滴加入50ml的dmf，混合搅拌15min，将反应后的产物转移到三颈烧瓶中，加入磁力搅拌器并通氩气，在50℃水浴中反应2h，得到淡黄色溶液，向溶液中加入750ml的etoh，得到淡黄色沉淀，在真空下过滤沉淀，用etoh洗涤3次，再溶于水中，测量ph值，并用hcl和naoh调节ph至7；然后将产物在5000rpm离心15min，取上清液，上清液用分子量为14000da的透析膜透析3天，透析过膜的液体冻干得到26scs。

2)制备rhbmp-2/nps：将高分子量的壳聚糖在2％乙酸中溶解得到0.02％(w/v)带正电荷的壳聚糖溶液，将400ng的rhbmp-2与0.02％(w/v)的壳聚糖溶液混合得到rhbmp-2/壳聚糖溶液；将26scs溶于50mm的ss得到26scs/ss溶液；通过将等体积的rhbmp-2/壳聚糖溶液缓慢逐滴加入到26scs/ss溶液中，并在室温下以最大速度涡旋60秒，从而制得rhbmp-2/nps；

步骤s3、nha的制备：将37.5ml0.6m磷酸铵溶液加入到375ml的水中，用氢氧化铵调整ph至10，1m硝酸钙溶液在搅拌时滴入上述混合物中，室温下羟基磷灰石持续析出10min；添加完硝酸钙后，在125mlteflonliner中将ha沉淀及溶液在200℃下用水热法处理20h；20h后，将nha沉淀离心，用水彻底冲洗三次，在80℃干燥12h并磨成细粉得到纳米精度的nha晶体；

s4、三层水凝胶支架的固化成型：在光固化打印机中加入40ml高分子水凝胶载体和12mgrhbmp-2/nps，打印一个直径15mm，高1.2mm的网状圆盘；在光固化打印机中加入40ml质量分数为10％nha/pegda水凝胶和质量分数为bapo，打印形状同载药层；在光固化打印机中加入40ml质量分数为20％nha/pegda水凝胶和质量分数为bapo，打印形状同载药层。将打印完成的三层结构用pegda水凝胶粘连，并于紫外照射下固化形成多层多孔的水凝胶支架；

该骨融合水凝胶支架的光镜图和扫描电镜(sem)图分别如图3和图4所示，从图中可以看到预设的横向纵向的水凝胶结构，此结构有效提高了支架的稳定性，孔隙率。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。