本发明涉及中药提取
技术领域：
，具体涉及一种裸花紫珠提取物及其在制备治疗过敏性紫癜药物中的应用。
背景技术：
：裸花紫珠系马鞭草科植物裸花紫珠的根、茎、叶，内含缩合鞣酸、黄酮苷、中性树脂、酚类、多糖、羟基化合物及镁、钙、铁盐等，具有消炎、解毒、收敛、止血、阵痛等多种功能。裸花紫珠能降低毛细血管通透性，有明显收缩血管的作用，能抑制金黄色葡萄球菌、链球菌、伤寒沙门菌、绿脓杆菌等多种细菌生长，可预防继发感染和抗感染；对早期的炎性渗出、肿胀有显著的抗炎性反应，能加快创面渗出的吸收，促进上皮生长和伤口愈合。此外，裸花紫珠分散片还有抗病毒作用。由于其广泛的药理作用，被应用于各种皮肤病的治疗，如寻常痤疮、带状疱疹、湿疹、接触性皮炎、过敏性皮炎、过敏性紫癜、皮肤血管炎及液氮冷冻术后等。过敏性紫癜又称自限性急性出血症，是一种侵犯皮肤和其他器官细小动脉和毛细血管的过敏性血管炎，发病原因可能是病原体感染、某些药物作用、过敏等致使体内形成iga或igg类循环免疫复合物，沉积于真皮上层毛细血管引起血管炎。主要表现为紫癜、腹痛、关节痛和肾损害，但血小板不减少。过敏性紫癫发病原因和机制至今未完全阐明，可能与链球菌感染、病毒感染、药物、食物、虫咬等有关，发生机制是由于抗原与抗体结合形成免疫复合物在血管壁沉积，激活补体，导致毛细血管和小血管壁及其周围产生炎症，使血管壁通透性增高，从而产生各种临床表现。裸花紫珠多以干燥的叶入药，主要分布于我国的广东、海南和广西等省，并以海南五指山产为上品。始载于唐《本草拾遗》，入选《中国药典》2015年版新增中药品种。其味苦、微辛、性平；全年均可采收，根茎叶均可入药，有止血消炎、散瘀消肿、抗菌解毒等功效。作为临床常备药物，裸花紫珠以单味药成药，适用于止血恢复和炎症消退。通过急性毒性实验测试，在合理剂量浓度范围内安全无毒。裸花紫珠中发现的化学成分以黄酮类、苯丙素、环烯醚萜及三萜类为主，但是目前公开的裸花紫珠的提取方法主要为单一组分有机溶剂提取。例如中国专利申请201711285943.3中公开了一种裸花紫珠提取物、其制备方法及应用。其制备方法为：取裸花紫珠与有机溶剂混合，提取，获得提取液，离心，收集滤液；所述有机溶剂为乙醇，乙醇的体积浓度为50％～70％，制得的裸花紫珠提取物中总黄酮的含量至少为0.2mg/ml，毛蕊花糖苷的含量至少为2mg/ml，制得的裸花紫珠提取物中所述毛蕊花糖苷的质量百分含量为2.6％，其有效成分的提取率较低，无法满足需求。再如，中国专利申请201910537780.6中公开了一种裸花紫珠提取物在制备降脂药物中的应用。所述的裸花紫珠提取物是通过以下方法制备的：取新鲜干燥的裸花紫珠叶，自然风干，粉碎过筛，使用甲醇超声浸提，冷却后，将提取液冷冻离心，静置，取上清液过微孔滤膜，将滤液冷冻干燥，得到裸花紫珠提取物，该申请公开的提取方法使用单一溶剂提取，其提取效率不高，有效成分的含量不高，从而造成中药成分的浪费。因此，开发一种可以有效提高裸花紫珠的提取效率，减少中药有效成分流失的裸花紫珠提取物的制备方法十分必要。技术实现要素：基于现有技术中的缺陷与不足，本发明目的之一是提供一种裸花紫珠提取物，该提取物使用多组分有机溶剂进行提取并控制提取溶液的浓度(体积分数)，可以有效提高药物有效成分的含量，从而可以有效提高中药成分的利用率，减少资源浪费。为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：一方面，本发明提供了一种裸花紫珠提取物，包括紫珠萜酮、芹菜素、毛蕊花糖苷、木犀草苷及其配糖体等黄酮类物质。另一方面，本发明还提供了一种裸花紫珠提取物的提取方法，包括以下步骤：s1、取干净的裸花紫珠根、茎、叶，干燥后粉碎，然后加水超声浸泡，过滤，得滤液1和滤渣1，备用；s2、将步骤s1中得到的滤渣1中加入混合溶剂回流提取，得到的滤液2和滤渣2，备用；s3、将步骤s1中得到的滤液1和步骤s2中得到的滤液2混合，过滤，将滤液冷冻干燥，得到的裸花紫珠提取物。上述步骤s1中所述的粉碎粒径为100-150目；优选为120-150目。上述步骤s1中所述的超声频率为20-50khz，优选为30-40khz；超声时间为20-30分钟；优选为25-30分钟。上述步骤s2中所述的混合溶剂为乙醇、丙酮和石油醚的混合溶液；所述的乙醇、丙酮和石油醚的体积比为1-5：1-2：1-2；优选地，所述的乙醇、丙酮和石油醚的体积比为2-4：1-2：1-2；再优选地，所述的乙醇、丙酮和石油醚的体积比为4：1：2。所述的乙醇的浓度为60-80％，所述的丙酮的浓度为50-60％，所述的石油醚的浓度为50-60％。优选地，所述的乙醇的浓度为80％，所述的丙酮的浓度为60％，所述的石油醚的浓度为60％上述步骤s2中所述的回流提取的温度为60-80℃，优选为60-70℃。上述步骤s2中所述的回流提取时间为5-10分钟，回流提取次数为1-2次。上述步骤s3中所述的过滤为微孔滤膜过滤，所述的微孔滤膜的粒径为0.22μm；所述的药材与提取溶剂的质量体积比为1-5g：10-50ml；优选地，药材与提取溶剂的质量体积比为1g：10ml、2g：20ml、3g：30ml、4g：40ml或5g：50ml。在一些优选实施方案中，本发明提供了一种裸花紫珠提取物的提取方法，包括以下步骤：s1、取干净的裸花紫珠根、茎、叶，干燥后粉碎至粒径为100-150目，然后加水在频率为20-50khz条件下超声，浸泡时间为20-30分钟，过滤，得滤液1和滤渣1，备用；s2、将步骤s1中得到的滤渣1中加入体积比为1-5：1-2：1-2的乙醇、丙酮和石油醚混合溶剂中回流提取，回流提取的温度为60-80℃，提取时间为5-10分钟，提取1-2次，得到的滤液2和滤渣2，备用；s3、将步骤s1中得到的滤液1和步骤s2中得到的滤液2混合，过0.22μm微孔滤膜，将滤液冷冻干燥，得到的裸花紫珠提取物。本发明还提供了所述的裸花紫珠提取物在制备治疗过敏性紫癜药物中的应用。本发明还提供了一种组合物，包括所述的裸花紫珠提取物和药学上可接受的辅料。本发明所述的组合物的剂型为片剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、栓剂、软膏剂、乳膏剂或喷雾剂，优选为颗粒剂。本发明还提供了所述的组合物在制备治疗过敏性紫癜药物中的应用。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：(1)本发明提供的裸花紫珠提取物的提取方法采用混合溶剂进行提取，通过控制提取溶剂的体积比，可以明显提高裸花紫珠有效成分的释放，能够使黄酮类物质的总提取率明显提高；(2)本发明通过控制提取溶剂的浓度可以明显提高提取效率，缩短提取时间，在较低的温度下依然可以保证有效成分的高效释放，提高提取效率，减少中药浪费；(3)本发明提供的裸花紫珠提取物能够有效的治疗过敏性紫癜，治疗效果好，安全有效。具体实施方式以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。本发明所用于提取试验的裸花紫珠为常规药店购买药材。实施例1一种裸花紫珠提取物的提取方法包括以下步骤：s1、取干净的裸花紫珠根、茎、叶，干燥后粉碎至粒径为100目，然后加水在频率为20khz条件下超声，浸泡时间为20分钟，过滤，得滤液1和滤渣1，备用；s2、将步骤s1中得到的滤渣1中加入体积比为1：1：1的60％乙醇、50％丙酮和50％石油醚混合溶剂中回流提取，回流提取的温度为60℃，提取时间为10分钟，提取2次，得到的滤液2和滤渣2，备用；s3、将步骤s1中得到的滤液1和步骤s2中得到的滤液2混合，过0.22μm微孔滤膜，将滤液冷冻干燥，得到的裸花紫珠提取物。实施例2一种裸花紫珠提取物的提取方法包括以下步骤：s1、取干净的裸花紫珠根、茎、叶，干燥后粉碎至粒径为150目，然后加水在频率为50khz条件下超声，浸泡时间为30分钟，过滤，得滤液1和滤渣1，备用；s2、将步骤s1中得到的滤渣1中加入体积比为5：2：2的80％乙醇、60％丙酮和60％石油醚混合溶剂中回流提取，回流提取的温度为80℃，提取时间为5分钟，提取2次，得到的滤液2和滤渣2，备用；s3、将步骤s1中得到的滤液1和步骤s2中得到的滤液2混合，过0.22μm微孔滤膜，将滤液冷冻干燥，得到的裸花紫珠提取物。实施例3一种裸花紫珠提取物的提取方法包括以下步骤：s1、取干净的裸花紫珠根、茎、叶，干燥后粉碎至粒径为120目，然后加水在频率为30khz条件下超声，浸泡时间为25分钟，过滤，得滤液1和滤渣1，备用；s2、将步骤s1中得到的滤渣1中加入体积比为4：1：2的80％乙醇、60％丙酮和60％石油醚混合溶剂中回流提取，回流提取的温度为70℃，提取时间为8分钟，提取2次，得到的滤液2和滤渣2，备用；s3、将步骤s1中得到的滤液1和步骤s2中得到的滤液2混合，过0.22μm微孔滤膜，将滤液冷冻干燥，得到的裸花紫珠提取物。对比例1与实施例3的区别在于80％乙醇、60％丙酮和60％石油醚的体积比为1：5：5，其他操作和步骤与实施例3相同。对比例2与实施例3的区别在于80％乙醇、60％丙酮和60％石油醚的体积比为10：1：1，其他操作和步骤与实施例3相同。对比例3与实施例3的区别在于乙醇、丙酮和石油醚的浓度分别为50％、70％、70％，其他操作和步骤与实施例3相同。对比例4与实施例3的区别在于乙醇、丙酮和石油醚的浓度分别为90％、50％、50％，其他操作和步骤与实施例3相同。对比例5与实施例3的区别在于仅使用70％的乙醇，其他操作和步骤与实施例3相同。对比例6与实施例3的区别在于仅使用60％的丙酮，其他操作和步骤与实施例3相同。试验例1提取率检测实施例1-3和对比例1-6中得到的裸花紫珠提取物中毛蕊花糖苷、木犀草苷的提取率以及黄酮类物质的总提取率检测。检测方法：色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-0.1％磷酸溶液(60：40)为流动相，检测波长为348nm，理论板数按木犀草苷峰计算应不低于3000。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-0.1％醋酸溶液(16：84)为流动相，检测波长为332nm，理论板数按毛蕊花糖苷峰计算应不低于4000。对照品溶液制备：取木犀草苷和毛蕊花糖苷对照品适量，称定，分别加70％甲醇和50％甲醇制成每毫升含30mg和40mg的溶液，即得。供试品溶液制备：分别取实施例1-3和对比例1-6的样品，加溶剂溶解，定容后过滤，记得供试品溶液。测定法：分别吸取对照品溶液、供试品溶液个10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。具体提取效率见下表1-2。表1实施例1-3和对比例1-6中得到的裸花紫珠提取物中毛蕊花糖苷、木犀草苷的提取率以及黄酮类物质的总提取率表2实施例1-3以及对比例1-6制备得到的提取物中毛蕊花糖苷、木犀草苷以及黄酮类物质的浓度将实施例1-3以及对比例1-6制备的提取物溶于水，得到药液，检测药液中毛蕊花糖苷、木犀草苷以及黄酮类物质的浓度，药液浓度为0.02g/ml。实例毛蕊花糖苷浓度木犀草苷浓度黄酮类物质浓度实施例13.2mg/ml0.18mg/ml0.29mg/ml实施例23.4mg/ml0.20mg/ml0.28mg/ml实施例33.7mg/ml0.24mg/ml0.31mg/ml对比例13.0mg/ml0.15mg/ml0.24mg/ml对比例22.9mg/ml0.13mg/ml0.23mg/ml对比例32.5mg/ml0.12mg/ml0.21mg/ml对比例42.6mg/ml0.12mg/ml0.22mg/ml对比例52.0mg/ml0.09mg/ml0.20mg/ml对比例62.1mg/ml0.10mg/ml0.20mg/ml试验二、动物试验本发明实施例1-3以及对比例1-6制备的提取物对过敏性紫癜小鼠模型的治疗效果研究。造模：随机选取昆明种小鼠110只，雌性，鼠龄8-10周，体质量18-25g，购自广州中医药大学。试验开始后，随机取出10只作为空白对照组，灌喂小鼠5mmol/l的hc1溶液，0.5ml/只，隔日灌喂，连续至10周。剩余小鼠按如下方法建立iga肾病模型：实验前3周尾静脉注射印度墨水0.4mg/10g，每周1次，3周后灌喂小鼠0.1％麦胶蛋白、5mmol/lhc1溶液，0.5ml/只，隔日灌喂，连续10周。造模的最后3天，尾静脉注射，用1mg麦胶蛋白加入5mmol/lhc1溶液、ph7.4的磷酸盐缓冲液(pbs)中，0.2ml/只，每天1次。连续3d，第11周开始，将造模小鼠随机分为模型对照组和实验组，每组10只。实验组小鼠灌胃给予实施例1-3以及对比例1-6制备的提取物颗粒300mg/kg，每日1次，连续灌喂3周，空白对照组、模型对照组分别灌喂等容积蒸馏水(20ml/kg)。灌喂给药3周后，各组收集6h尿液进行尿量、尿蛋白定量测定；次日各组小鼠再随机选5只，进行摘眼球取血，离心，分离血清，取血清进行24小时尿蛋白定量、尿变形红细胞计数、血清肌酐、血清il-4含量和ifn-γ含量等指标测定。测定方法分别为：①24h尿蛋白定量测定：代谢笼收集6h排尿量(每2只放一笼，每组放5笼)，收集尿液后，检测尿量，乘4后为24h总尿量；采用考马斯亮蓝比色法测定小鼠尿蛋白定量。②尿变形红细胞计数：采用相差显微镜测量。③血清il-4含量测定：采用酶联免疫吸附法。④ifn-γ含量测定：采用酶联免疫吸附法。表3各组小鼠24小时尿量及尿蛋白定量比较实例n尿蛋白定量(mg/24h)尿变形红细胞(个/hp)空白对照组100.304±0.1320模型对照组100.742±0.13214.8±4.2实施例1组100.546±0.125**8.0±3.6**实施例2组100.553±0.118**8.2±2.3**实施例3组100.482±0.109**7.5±2.8**对比例1组100.621±0.124*9.2±3.2*对比例2组100.625±0.142*9.3±3.4*对比例3组100.654±0.108*9.5±2.6*对比例4组100.649±0.125*9.8±2.9*对比例5组100.684±0.130*9.9±3.1*对比例6组100.675±0.124*9.7±3.0*注：与模型组相比：**p≤0.01，*p≤0.05与空白组相比，模型组的24小时尿蛋白定量显著增加(p≤0.01)，与模型组相比，实施例1-3组与对比例1-6组的24h尿蛋白定量均不同程度的下降，均有统计学意义，实施例1-3组相当于与对比例1-6组24小时尿蛋白定量明显减少，具有统计学意义。各组小鼠，空白组尿液检查没有发现变形红细胞，其余各组均出现数量不等的变形红细胞，与空白组相比，各组均有显著性差异，与模型组相比，实施例1-3组变性红细胞数显著减少，对比例1-6组虽有减少，但是较实施例组减少不明显。各组小鼠的血清肌酐、血清il-4含量和ifn-γ含量结果见表4。表4实例n肌酐(μmol/l)血清il-4含量()血清ifn-γ含量空白对照组1048.6±9.60.58±0.1250.23±2.56模型对照组1056.8±8.50.85±0.1036.24±3.12实施例1组1049.4±8.40.61±0.13**48.15±3.14**实施例2组1049.2±9.20.63±0.09**48.56±2.95**实施例3组1048.8±9.00.60±0.11**49.38±3.25**对比例1组1053.4±7.60.65±0.14*42.89±2.96*对比例2组1053.6±8.10.66±0.12*43.15±3.04*对比例3组1052.9±7.90.68±0.13*40.54±3.01*对比例4组1052.4±9.20.66±0.10*41.06±2.62*对比例5组1051.6±9.40.69±0.09*40.07±2.31*对比例6组1050.4±8.60.71±0.08*39.12±3.21*注：与模型组相比：**p≤0.01，*p≤0.05根据上表4的检测结果可以看出血清肌酐变化不明显，均在正常范围内；与空白组相比，模型组的血清ifn-γ含量明显降低，与模型组相比，实施例1-3组与对比例1-6组均可不同程度的升高血清ifn-γ含量，具有统计学意义；与空白组相比，模型组的血清il-4含量明显升高，与模型组相比，实施例1-3组与对比例1-6组均可不同程度的降低血清il-4含量，具有统计学意义。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12