本发明涉及化妆品配方
技术领域：
，特别涉及一种美白祛斑抗糖化的植物发酵组合物及其在美白祛斑抗糖化的发酵产物化妆品上的应用。
背景技术：
：人类皮肤的颜色之所以能够呈现出不同的色泽，不是取决于黑素细胞的数量，而是取决于产生各种黑素的量，取决于于黑素小体的数量、大小、分布及黑素化程度。黑素细胞中正常黑素的形成和沉着，不仅具有保护皮肤、抵御紫外线射和防止内部组织过热等作用，同时对皮肤的健康和美观具有重要意义。当皮肤发生色素沉着过多、过少或缺乏等异常改变时，就会导致不同类型的色素障碍性皮肤疾病如白癜风、白化病、黄褐斑等，并产生相应的不良心理感受。与衰老相关的糖化实际上是一个简称，全称是非酶糖基化，简单地说，这种糖化反应是在没有酶作用的情況下，糖类和蛋白质结合，使蛋白质失去正常结构和颜色，变脆、发黄。蛋白质可以是多种，包括血红蛋白、弹性蛋白、胶原蛋白等等。皮肤的真皮层内有很多胶原蛋白，所以才会紧致有弹性。糖(葡萄糖和果糖)和胶原蛋白发生反应后，先形成可逆的初级糖基化产物，而后再形成不可逆的高级糖基化终末产物(ages)。胶原蛋白糖化后，除了进一步导致皮肤的衰老，也会使皮肤看起来颜色发黄，因此而失去白皙的质感。糖化不仅发生在真皮，新的研究发现表皮中的蛋白质(特别是角蛋白)也可以被糖化。除此以外，ages可以通过激ages受体，促进黑色素的产生。现有技术的美白产品往往只针对抑制酪氨酸酶的活性进行研究，本发明旨在提供一种美白祛斑抗糖化的植物发酵组合物及其在化妆品上的应用。技术实现要素：针对上述存在的问题，本发明的目的在于提供一种美白祛斑抗糖化的植物发酵组合物及其在化妆品上的应用。其通过安全可靠的纯植物培养基，配合益生菌发酵，预料不到的不仅可以大大提高络氨酸酶的抑制活性，还可以取得很好的抗糖化效果和抗氧化效果，从而总体达到良好的美白祛斑，抗老化的效果。乳杆菌，乳酸菌是公认的益生菌，并且其发酵产物(通常是溶胞物)具有一定的美容效果。本领域技术人员知道，益生菌的代谢受多方面调控，其代谢产物包括许多具有生物活性的物质，如小肽，胞外多糖，皂苷，氨基酸，矿物质，酚类等。而如胞外多糖的具体结构，都会大大影响其生理活性。对此，本发明团队对菌株进行了大量的筛选，以及培养工艺的改进，以期获得美容效果突出的发酵工艺。中国专利2013100043553公开过一株卷曲乳杆菌的菌株，该菌株为卷曲乳杆菌(lactobacilluscrispatus)的菌株，其特征在于，该菌株的保藏号为cgmccno.6364。该菌株的已知功能是能够有效地实现对多种致病菌的拮抗作用，此外，还具有更高的对阴道上皮细胞的粘附能力以及更高的产乳酸能力。本发明团队发现其作为不常用于化妆品的一株乳杆菌，具有很大的潜力，其常规发酵产物活性提取物具有较好的抗氧化功效，一定的络氨酸酶抑制活性。其特别之处在于可塑性，我们试图改变其发酵工艺，发现加入一些植物成分可以显著提高其多种美容功效，包括抗糖化性能，美白性能等。而我们观察到其他株的卷曲乳杆菌并没有如此突出的可塑性能。姜黄素是从姜科、天南星科中的一些植物的根茎中提取的一种化学成分，其中，姜黄约含3％～6％，是植物界很稀少的具有二酮的色素，为二酮类化合物。姜黄素为橙黄色结晶粉末，味稍苦，不溶于水，在食品生产中主要用于肠类制品、罐头、酱卤制品等产品的着色。医学研究表明，姜黄素具有降血脂、抗肿瘤、抗炎、利胆、抗氧化等作用。本发明团队尝试在培养基中加入一定的姜黄素，发现可以较大改变发酵产物的性能。桑白皮是一种中药药材，它是桑树的根皮，含有大量的营养物质，可促进身体的新陈代谢，对细胞还具有修复的作用，因此，桑白皮对疤痕具有一定的祛除作用，可以是皮肤变得更加细腻光滑，具有不错的美容效果。本发明使用桑白皮水提物加入培养基中，发现其和姜黄素可以协同提高卷曲乳杆菌cgmccno.6364发酵产物的美容效果。此外，桑白皮本身也具有一定的美容功效，具有调控微生物生长以及直接作用于皮肤美容的双重作用。为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现：一种美白祛斑抗糖化的植物发酵组合物，其特征在于，其制备方法如下：(1)在无菌条件下，将保存好的卷曲乳杆菌cgmccno.6364接种于mrs培养基中，于35℃，200rpm下培养12小时，所得培养物作为发酵培养的种子液体，终浓度为6*107cfu/ml；(2)卷曲乳杆菌cgmccno.6364种子液按照接种量10v/v％接种于液体培养基中，30℃，200rpm下震荡摇床培养24小时；所述液体培养基制备方法：将0.3g的姜黄素、50ml的桑白皮提取液、25g的葡萄糖、8g的蛋白胨、7g的酵母膏、8g的牛肉膏、5g的乙酸钠、2g的柠檬酸铵、2ml的吐温-80、0.6g的mgso4·7h2o、0.3g的mnso4·4h2o、2g的k2hpo4和1000ml的蒸馏水混合，调节ph值为6.2-6.4并且经高压蒸汽灭菌后得到的无菌培养基；(3)将由步骤(2)所得的发酵液离心，离心转速8000r/min，时间30min，收集上清液，得到发酵滤液，并过0.22um除菌过滤器，得到无菌的发酵组合物。本发明还提供了一种化妆品，其含有所述美白祛斑抗糖化的植物发酵组合物。作为优选，所述化妆品剂型可以是面膜，精华液，面霜等。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明的化妆品活性成分是由天然安全的底物用筛选得到的益生菌发酵制备而成，适用人群更广，无明显毒副作用，无刺激性，抗糖化和美白效果明显，还具有良好的抗氧化活性。作为优选实施例，可以用于面膜，使用方便，效果极佳。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。本实施例的桑白皮提取液为市售获得，购自陕西康跃生物科技有限公司。实施例1一种美白祛斑抗糖化的植物发酵组合物，其特征在于，其制备方法如下：(1)在无菌条件下，将保存好的卷曲乳杆菌cgmccno.6364接种1v/v％于mrs培养基中，于35℃，200rpm下培养12小时，所得培养物作为发酵培养的种子液体，终浓度为6*107cfu/ml；(2)(2)卷曲乳杆菌cgmccno.6364种子液按照接种量10v/v％接种于液体培养基中，30℃，200rpm下震荡摇床培养24小时；所述液体培养基制备方法：将0.3g的姜黄素、50ml的桑白皮提取液、25g的葡萄糖、8g的蛋白胨、7g的酵母膏、8g的牛肉膏、5g的乙酸钠、2g的柠檬酸铵、2ml的吐温-80、0.6g的mgso4·7h2o、0.3g的mnso4·4h2o、2g的k2hpo4和1000ml的蒸馏水混合，调节ph值为6.2-6.4并且经高压蒸汽灭菌后得到的无菌培养基；(3)将由步骤(2)所得的发酵液离心，离心转速8000r/min，时间30min，收集上清液，得到发酵滤液，并过0.22um除菌过滤器，得到无菌的发酵组合物。实施例2对比例本研发团队发现姜黄素和桑白皮具有协同增加发酵提取物的抗氧化，美白，抗糖化性能。对比例1实验方法同实施例1，但是发酵培养基不加入姜黄素和桑白皮提取液，其他不变。对比例2：实验方法同实施例1，但是发酵培养基不加入姜黄素，其他不变。对比例3：实验方法同实施例1，但是发酵培养基不加入桑白皮提取液，其他不变。对比例4：实验方法同实施例1，但是将卷曲乳杆菌cgmccno.6364更换成卷曲乳杆菌cgmcc1.2743，其他不变。实施例3细胞毒理测试：将实施例1得到的植物发酵组合物溶于无血清dmem培养液中，各配制4个样品，质量分数分别为0.25％、0.5％、1％、2％，以无血清dmem培养液为阴性对照样组进行mtt检测，评价美白祛斑抗糖化的植物发酵组合物的细胞毒性。按照100μl/孔接种l929细胞至96孔板，调整浓度为1×105个/ml，在37℃、5％co2，无血清dmem培养液培养24h进行贴壁后，吸弃培养液，每孔加入100μl不同质量分数的样品溶液，阴性对照样组继续无血清dmem培养，常规培养48h。再加入5mg/mlmtt溶液20μl，置培养箱内避光孵育4h。弃上清液加入dmso100μl，摇床低速振荡20min，570nm波长处测定吸光度值。按下式计算其他各组细胞相对存活率(β)。结果如表1所示。β＝an/a0式中，an为实验组吸光度，a0为阴性对照组吸光度表1细胞毒理测试细胞相对存活率(％)0.25％0.5％1％2％实施例1组96.37±8.5693.43±7.5591.55±9.2790.72±6.51根据iso10993-5：2009所述的毒性分级评价方法，细胞存活率大于70％，可视为无毒性。由上表结果可见，本发明的植物发酵组合物在所选取质量浓度下，细胞存活率较高均高于90％，考虑其无细胞毒性。实施例4评估美白祛斑抗糖化的植物发酵组合物羟自由基清除能力的测定。抗氧化是指抗氧化自由基的简称，英文anti-oxidant。人体因为与外界的持续接触，包括呼吸(氧化反应)、外界污染、放射线照射等因素不断的在人体体内产生自由基。科学研究表明，癌症、衰老或其它疾病大都与过量自由基的产生有关联。研究抗氧化可以有效克服其所带来的危害，所以抗氧化被保健品、化妆品企业列为主要的研发方向之一，也是市场最重要的功能性诉求之一。抗氧化效果公认可以表征抗衰老效果。选用维生素c作为阳性对照组用药，设置将实施例1组、对比例1-4组和vc组。各组均分别用纯净水充分溶解，配制成浓度为15ug/ml、25ug/ml、35ug/ml、45ug/ml、55ug/ml的样品溶液，按照a、a1、a2的配置方法分别加入样品、feso4·7h2o溶液(4.5mmol/l)、水杨酸-乙醇溶液和、h2o2溶液(4.4mmol/l)，然后混合均匀，于37℃恒温水浴锅中避光温浴30min，测定510nm处的吸光度；羟自由基清除率(％)＝[1-(a1-a2)/a0]×100％a0：1.0mlfeso4·7h2o+1.0ml水杨酸+1.0ml过氧化氢+1.0mlh2oa1：1.0mlfeso4·7h2o+1.0ml水杨酸+1.0ml过氧化氢+1.0ml样品a2：1.0mlfeso4·7h2o+1.0ml水杨酸+1.0mlh2o+1.0ml样品相关测试数据如表2所示：表2各组不同浓度对羟自由基清除能力从表2中的测试数据可以看出，实施例1和使用vc的阳性实验组相比较，其对羟自由基清除能力更高；而含有卷曲乳杆菌cgmccno.6364，但是含有姜黄素或桑白皮提取液发酵的培养液清除率好于单纯的卷曲乳杆菌cgmccno.6364发酵培养(对比例2组和对比例3组清除率大于对比例1)；而将卷曲乳杆菌cgmccno.6364更换成卷曲乳杆菌cgmcc1.2743进行发酵(其他培养条件不变)，清除自由基的效果最差，甚至差于单纯的卷曲乳杆菌cgmccno.6364发酵，说明卷曲乳杆菌cgmccno.6364常规发酵产物活性提取物本身具有较好的羟自由基清除能力，同时加入姜黄素或和桑白皮提取液可以显著提高其作用，而其他株的卷曲乳杆菌并没有如此突出的功效。实施例5抑制非酶糖基化试验试验用牛血清白蛋白和果糖混合孵育来模拟人体内非酶糖基化反应，通过加入非酶糖基化反应的抑制剂来抑制该反应的进行，加入抑制剂体系的荧光强度会弱于不加抑制剂的对照，用抑制率来反映样品对非酶糖基化反应的抑制情况。取一定量含10mg/ml牛血清白蛋白和0.25mol/l果糖的混合溶液作为反应液。pbs配制质量分数为1％实施例1、对比例1-4溶液做为处理组，并设阳性对照组(质量分数为1.00％的vc乙基醚)，阴性对照组(pbs代替样品)以及空白组(pbs代替反应液).每组设3个平行管。37℃避光孵育。选择第1、3、5、7d用荧光酶标仪在370nm(吸收波长)/440nm(激发波长)检测各试验组的荧光强度(rfu，relativefluorescenceunit)，并计算抑制率。结果如表3所示。抑制率(％)＝[1-(rfu抑制组-rfu空白组)/rfu阴性对照组]×100％表3各实验组抑制非酶糖基化试验结果相对抑制率d1d3d5d7阳性组(％)40.3±2.350.6±4.757.0±4.162.8±7.7实施例1组(％)47.6±5.158.8±6.770.3±5.173.8±4.3对比例1组(％)12.2±1.315.6±1.416.2±2.618.4±2.0对比例2组(％)14.3±1.818.4±1.918.5±1.721.7±1.8对比例3组(％)15.4±1.517.4±1.720.7±1.522.8±3.1对比例4组(％)5.3±0.636.4±0.97.3±1.19.3±2.3从表4可见，各个实验组经过培养时间的延长，对非酶糖基化反应的抑制率增加逐渐升高。实施例1和阳性实验组相比较，非酶糖基化反应的抑制率更高；而含有卷曲乳杆菌cgmccno.6364，但是含有姜黄素或桑白皮提取液发酵的培养液抑制率好于单纯的卷曲乳杆菌cgmccno.6364发酵培养(对比例2组和对比例3组抑制率大于对比例1)；而将卷曲乳杆菌cgmccno.6364更换成卷曲乳杆菌cgmcc1.2743进行发酵(其他培养条件不变)，抑制率最低。说明卷曲乳杆菌cgmccno.6364常规发酵产物活性提取物本身具有较好的非酶糖基化反应抑制率，并且加入姜黄素或和桑白皮提取液还具有很好的协同作用，能够提高非酶糖基化反应的抑制率。而其他株的卷曲乳杆菌并没有如此突出的功效。实施例5体外抑制酪氨酸酶实验：pbs溶液配制1mg/ml的酪氨酸溶液和200u/ml的酪氨酸酶溶液。设计实施例1、对比例1-4做为处理组，维生素c乙基醚溶液为阳性对照组。将处理组的发酵组合物和维生素c乙基醚溶液使用pbs配制为质量分数分别为0.25％、0.5％、1％、2％的4个实验浓度。酶活检测：使用微量移液器分别按照表3移取a、b、c、d四组样液置于1.5mlep管(配制反应体系为1000u1)，35℃水浴10min；加入酪氨酸酶溶液200ul，35℃水浴30min，各反应管分别取150ul加入96孔板，酶标仪测定475nm吸光度a值。每组重复试验3次。表4相对抑制率abcd酪氨酸溶液0200ul0200ul酪氨酸酶溶液200ul200ul200ul200ul水溶液200ul200ul00pbs800ul600ul800ul600ul实验组00200ul200ul计算各实验组的酪氨酸酶抑制率(i)，i＝[1-(ad-ac)/(ab-aa)]*100％。试验结果如表4所示。表5各实验组不同浓度下酪氨酸酶抑制率从上表可见，各个实验组酪氨酸酶抑制率均随着浓度的增加逐渐升高。实施例1和阳性实验组相比较，酪氨酸酶抑制率更高；而含有卷曲乳杆菌cgmccno.6364，但是含有姜黄素或桑白皮提取液发酵的培养液抑制率好于单纯的卷曲乳杆菌cgmccno.6364发酵培养(对比例2组和对比例3组抑制率大于对比例1)；而将卷曲乳杆菌cgmccno.6364更换成卷曲乳杆菌cgmcc1.2743进行发酵(其他培养条件不变)，抑制率最低，甚至差于单纯的卷曲乳杆菌cgmccno.6364发酵，说明卷曲乳杆菌cgmccno.6364常规发酵产物活性提取物本身具有较好的酪氨酸酶抑制率，并且加入姜黄素或和桑白皮提取液还具有很好的协同作用，能够大大抑制络氨酸酶。而其他株的卷曲乳杆菌并没有如此突出的功效。实施例7做成面膜的示范例按照实施例1的美白祛斑抗糖化的植物发酵组合物再添加以下原料制备相对应的面膜，按照重量份：美白祛斑抗糖化的植物发酵组合物5份，小分子玻尿酸0.1份、蚕丝蛋白粉3份、羧甲基纤维素钠1份、海藻酸钠2份、鲸蜡硬脂醇10份、玫瑰提取液5份，去离子水200份。所述面膜的制备方法为：s1.将羧甲基纤维素钠、鲸蜡硬脂醇等按重量份数分别称量，随后将其混合均，同时往里加入适量的去离子水，并将其加热至85℃～95℃，加热过程中不断搅拌至其完全溶解，静置在烧杯中待用匀(a组分)；s2.将小分子玻尿酸、蚕丝蛋白粉、海藻酸钠、芦荟提取液按重量份数分别称量，并将其混合均匀，同时往里加入适量的去离子水，并将其加热到70℃～85℃，至其完全溶解，静置在烧杯中待用(b组分)；s3.将美白祛斑抗糖化的植物发酵组合物按重量份数分别称量，并将其混合均匀，同时往里加入适量的去离子水，并将其加热到55℃～75℃，至其完全溶解，静置在烧杯中待用(c组分)；s4.并用高速剪切机在3000～4500r/min条件下分别对a组分、b组分和c组分搅拌8～20min，促进其溶解，随后将a组分、b组分和c组分进行混合均质，均质时间7～15min；均质1～3次；s5.均质完成后，待其自然冷却，至温度低于25℃以下时，并在室温条件下冷却静置2～3h，即得护肤品。做成的面膜液补水效果的，各项指标符合国家相关规定。实施例8皮肤斑贴安全性试验对本发明的美白祛斑抗糖化的植物发酵组合物进行人体安全性研究，选用1％浓度的本发明实施例1的美白祛斑抗糖化的植物发酵组合物纯净水溶液作为测试组1以及蒸馏水作为对照组进行测试，每组30人，两组之间无统计学差异。根据《化妆品卫生规范》(2007年版)中的规定，30位受试者中出现“++”级皮肤不良反应的人数多于2位或出现任何1位“+++”级或“+++”级以上皮肤不良反应时，判定受试物对人体有不良反应。相关测试结果如下表所示。表6皮肤斑贴安全性试验如上表所示，在去除斑试器0.5，24和48h后，30名受试者中蒸馏水对照区均未观察到皮肤不良反应，美白祛斑抗糖化的植物发酵组合物受试区无1例出现“++”反应，该结果表明本发明美白祛斑抗糖化的植物发酵组合物的安全性很高，对人体皮肤未引起不良反应。最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。当前第1页12