专利名称：：用于拮抗rage的方法及组合物的制作方法用于拮抗RAGE的方法及组合物相关申请交叉参考案本案根据35U.S.C.gll9(e)的规定主张2007年3月16日申请的美国临时专利申请案第60/895,303号及2006年3月21日申请的美国临时专利申请案第60/784,575号的优先权，两案的全文内容均以引用方式并入本文中。
技术领域：
概括来说，本发明是关于与晚期糖化终产物受体(RAGE)特异性结合的抗体及其片段、关于将所述抗体及其片段投与到人类患者及非人类哺乳动物中以治疗或预防RAGE相关疾病及病症的方法。
背景技术：
：晚期糖化终产物受体(RAGE)是免疫球蛋白超家族的多配体细胞表面成员。RAGE由细胞外结构域、单跨膜结构域及胞质尾巴组成。所述受体的细胞外结构域由一种V-型免疫球蛋白结构域继之以两种C-型免疫球蛋白结构域组成。RAGE也以可溶性形式(sRAGE)存在。RAGE在包括肺、心脏、肾、骨骼肌及脑在内的多种不同组织中由多种细胞类型表达，例如，内皮和平滑肌细胞、巨噬细胞和淋巴细胞。在诸如风湿性关节炎及糖尿病肾病等慢性炎症性状态下表达增加。尽管还不清楚其生理功能，但其与炎症性反应有关并且在包括成肌细胞分化及神经发育在内的多种发育过程中起作用。RAGE是罕见的结合数种不同种类内源分子的模式识别受体，所述内源分子导致多种细胞反应，包括细胞因子分泌、增加的细胞氧化剂应激、神经突增生及细胞迁移。RAGE的配体包括在长期血糖过多状态下形成的晚期糖化终产物(AGE)。然而，AGE仅为偶然性的病原性配体。除AGE夕卜，RAGE的已知配体包括具有为淀粉样蛋白沉积及促炎介质所特有的(3-折叠原纤维的蛋白质，包括S100/钙粒蛋白(例如，S100A12、S100B、S100A8-A9)、血清淀粉样蛋白(SAA)(原纤维形式)、卩-淀粉样蛋白蛋白质(AP)、及高迁移率族染色体蛋白B1(HMGB1，也称为两性蛋白)。已在两种鼠科动物脓毒症模型中显示HMGB-1是后期致命性介体，并且认为RAGE与诸如HMGB1等配体间的相互作用在脓毒症及其它炎症性疾病的发病机制中起重要作用。数种重大人类病症与RAGE配体的增加产生或与RAGE本身的增加产生有关。这些病症中许多得不到始终如一的有效治疗。这些病症包括(例如)许多慢性炎症性疾病，包括风湿性及银屑病关节炎及肠病、癌症、糖尿病及糖尿病肾病、淀粉样变性、心脏血管疾病及脓毒症。对于所述RAGE相关病症来说，具有安全且有效的治疗将极为有益。脓毒症是对感染的全身性炎症性反应(SIRS)，并且在甚至先前正常的患者中仍具有深远影响。脓毒症由存在以下四种临床体征中的至少两种来界定体温过低或过热、心动过速、呼吸急促、过速呼吸或白细胞像异常。伴有一种器官功能障碍/衰竭的脓毒症定义为严重脓毒症，并且伴有顽固性低血压的严重脓毒症为脓毒性休克。其它类型的脓毒症包括败血症及新生儿脓毒症。在美国、欧洲及日本每年发生200多万例脓毒症，估计年度费用为170亿美元且死亡率介于20-50%范围内。与未患脓毒症的监护病室(ICU)患者相比，脓毒症幸存患者的ICU停留平均延长65n/。。尽管最近市场进入及医院护理不断改良，但脓毒症仍然是重要的未满足医疗需要的病症。脓毒症患者的治疗是时间及资源密集型治疗。新药齐IK包括引入XIGRIS⑧)对结果的效应一般。所述综合征继续展示20-50%的死亡率。能够衰退早期脓毒症到严重脓毒症或脓毒性休克进展的安全且耐受良好的治疗剂可提供脓毒症治疗的突破。
发明内容本发明提供用于预防及治疗RAGE相关疾病及病症(例如，脓毒症、糖尿病及糖尿病相关病变、心脏血管疾病及癌症)的新颖免疫试剂，具体来说，是与RAGE结合的治疗性抗体试剂。本发明的代表性抗体包括与RAGE特异性结合的抗体(即，抗RAGE抗体)，其与XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7、或XT-M4抗体竞争结合RAGE或与结合XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7、或XT-M4抗体的RAGE的表位结合。本发明的其它代表性抗RAGE抗体可包含选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4组成的群组的抗体的轻链或重链的一或多个互补决定区(CDR)。本发明还进一步提供上述抗体的RAGE结合片段。本发明抗RAGE抗体可姐断RAGE体配偶体的结合。例如，本发明抗RAGE抗体可包含(a)XT-H1—VL(SEQIDNO:19)、XT-H2—VL(SEQIDNO:22)、XT-H3—VL(SEQIDNO:25)、XT-H5—VL(SEQIDNO:23)、XT-H7—VL(SEQIDNO:27)、或XT-M4—VL(SEQIDNO:17)的轻链可变区；(b)具有与SEQIDNO:19、SEQIDNO:22、SEQIDNO:25、SEQIDNO:23、SEQIDNO:27、或SEQIDNO:17的氨基酸序列至少90%—致的氨基酸序列的轻链可变区；或(c)(a)或(b)中的抗体的RAGE结合片段。作为另一实例，本发明抗RAGE抗体可包含(a)IXT-H1—VH(SEQIDNO:18)、XT-H2VH(SEQIDNO:21)、XT-H3一VH(SEQIDNO:24)、XT-H5—VH(SEQIDNO:20)、XT-H7—VH(SEQIDNO:26)、或XT-M4—VH(SEQIDNO:16)的重链可变区；(b)具有与SEQIDNO:18、SEQIDNO:21、SEQIDNO:24、SEQIDNO:20、SEQIDNO:26、或SEQIDNO:16的氨基酸序列至少90%—致的氨基酸序列的重链可变区；或(c)(a)或(b)中的抗体的RAGE结合片段。本发明进一步提供具有任何一个上述轻链可变区及任何一个上述重链可变区的抗RAGE抗体。例如，本发明抗RAGE抗体可为嵌合抗体或其RAGE结合片段，其具有与XT-M4轻链可变区氨基酸序列(SEQIDNO:17)至少90%—致的轻链可变区氨基酸序列、与XT-M4重链可变区氨基酸序列(SEQIDNO:16)至少90%—致的重链可变区氨基酸序列、及源自人类恒定区的恒定区，例如具有以下的抗体具有XT-M4轻链可变区氨基酸序列(SEQIDNO:17)的轻链可变区、具有XT-M4重链可变区序列氨基酸序列(SEQIDNO:16)的重链可变区、人类k轻链恒定区及人类IgGl重链恒定区。本发明的其它代表性抗RAGE抗体包括人类化抗体，例如，具有与氨基酸序列XT-H2—hVL一V2.0(SEQIDNO:32)、XT-H2—hVL一V3.0(SEQIDNO:33)、XT-H2—hVL—V4.0(SEQIDNO:34)、XT-H2—hVL—V4.1(SEQIDNO:35)、XT-M4—hVL—V2.4(SEQIDNO:39)、XT-M4—hVL—V2.5(SEQIDNO:40)、XT-M4hVL_V2.6(SEQIDNO:41)、XT-M4—hVL_V2.7(SEQIDNO:42)、XT-M4—hVL—V2.8(SEQIDNO:43)、XT-M4—hVL_V2.9(SEQIDNO:44)、XT-M4hVL—V2.10(SEQIDNO:45)、XT-M4—WLV2.11(SEQIDNO:46)、XT-M4—hVL_V2.12(SEQIDNO:47)、XT掘一hVL—V2.13(SEQIDNO:48)、或XT-M4—hVL_V2.14(SEQIDNO:49)至少90%—致的人类化轻链可变区的抗体。作为另一实例，人类化抗RAGE抗体可包含与氨基酸序列XT-H2—hVH—V2.0(SEQIDNO:28)、XT-H2_hVH_V2.7(SEQIDNO:29)、XT陽H2一hVH一V4(SEQIDNO:30)、XT-H2—WH—V4.1(SEQIDNO:31)、XT-M4一hVH—V1.0(SEQIDNO:36)、XT-M4—hVH—Vl.l(SEQIDNO:37)、或XT-M4_hVH—V2.0(SEQIDNO:38)至少90%一致的人类化重链可变区。人类化抗体可为半人类抗体(即，其中仅轻链及重链可变区之一经人类化)或完全人类化抗体(即，其中轻链及重链可变区二者均经人类化)。本文所揭示的其它代表性人类化抗RAGE抗体包括人类化XT-M4抗体及人类化XT-H2抗体。本发明还进一步提供含有如下CDR的抗RAGE抗体，所述CDR具有以下特征中的至少八个(a)在VHCDRl中的氨基酸序列为Y-X-M(Y32;X33;M34)，其中X优选为W或N;(b)在VHCDR2中氨基酸序列为I-N-X二S(151;N52;X53及S54)，其中X为P或N;(c)在VHCDR2中位置58上的氨基酸为苏氨酸；(d)在VHCDR2中位置60上的氨基酸为酪氨酸；(e)在VHCDR3中位置103上的氨基酸为苏氨酸；(f)在VHCDR3中存在一或多个酪氨酸残基；(g)在VLCDRl中位置24上为带正电荷的残基(Arg或Lys);(h)在VLCDRl中位置26上为亲水性残基(Thr或Ser);(i)在VLCDR1中位置25上为小残基Ser或Ala;(j)在VLCDR1中位置33上为带负电荷的残基(Asp或Glu);(k)在VLCDR1中位置37上为芳香族残基(Phe或Tyr或Trp);(I)在VLCDR2中位置57上为亲水性残基(Ser或Thr);(m)在VLCDR3的末端为P-X-T序列，其中X可为疏水性残基Leu或Trp;其中氨基酸位置分别如SEQIDNO:22及SEQIDNO:16中的轻链及重链氨基酸序列中所示。本发明也提供编码任何所揭示抗RAGE抗体或抗体可变区的经分离核酸、及与具有如下核苷酸序列的核酸在严格杂交条件下特异性杂交的经分离核酸所述核苷酸序列为编码任何所揭示抗RAGE抗体或抗体可变区的核苷酸序列的互补序列。本发明的经分离核酸进一步包括(a)编码狒狒、猴或兔RAGE蛋白的核酸，所述RAGE蛋白具有选自由SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、及SEQIDNO:13组成的群组的氨基酸序列；(b)与(a)的所述互补序列特异性杂交的核酸；及(c)当询问覆盖度(querycoverage)为100%时，具有与编码狒狒、猴或兔RAGE的核苷酸序列95%—致的核苷酸序列的核酸，所述编码狒狒、猴或兔RAGE的核苷酸序列选自由SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、及SEQIDNO:12组成的群组。本发明也包括预防或治疗患有RAGE相关疾病或病症的个体所述疾病或病症的方法，其包含向所述个体投与治疗有效量的本发明抗RAGE抗体或其RAGE结合片段。本发明包括预防或治疗RAGE相关疾病或病症的方法，所述RAGE相关疾病或病症选自由下列组成的群组脓毒症、脓毒性休克(包括导致脓毒症或脓毒性休克的病状，例如社区获得性肺炎)、利斯特菌病、炎症性疾病、癌症、关节炎、克隆氏病、慢性急性炎症性疾病、心脏血管疾病、勃起功能障碍、糖尿病、糖尿病并发症、脉管炎、肾病、视网膜病变、及神经病变。本发明所述方法可包含投与组合物，所述组合物包含本发明抗RAGE抗体或其RAGE结合片段与一或多种可用于治疗所述待要治疗的RAGE相关疾病或病症的药剂。本发明所述药剂包括抗生素、消炎剂、抗氧化剂、卩-阻断剂、抗血小板剂、ACE抑制剂、降脂剂、抗血管生成剂、及化学治疗剂。本发明提供治疗人类个体脓毒症、脓毒性休克、或利斯特菌病(例如，全身性利斯特菌病)的方法，其包含向所述个体投与治疗有效量的嵌合抗RAGE抗体或其RAGE结合片段，所述嵌合抗RAGE抗体或其RAGE结合片段包含具有XT-M4轻链可变区氨基酸序歹i」(SEQIDNO:17)的轻链可变区、具有XT-M4重链可变区序列氨基酸序列(SEQIDNO:16)的重链可变区、人类K轻链恒定区、及人类IgGl重链恒定区。图1A-1C显示小鼠、大鼠、兔(两种同种型)、狒狒、食蟹猴及人类RAGE的比对氨基酸序列(SEQIDNO:3、14、11、13、7、9、1)。图2是来自直接结合ELISA的数据的曲线图，其展示XT-H2与hRAGE的结合(EC50值为90pM)及XT-M4与hRAGE-Fc的结合(EC50值为300pM)。图3是来自直接结合ELISA分析的数据的曲线图，其展示抗体XT-M4及XT-H2与hRAGEV-结构域-Fc的结合(EC50值为100pM)。图4是来自配体竞争ELISA结合测定的数据的曲线图，其显示XT-H2及XT-M4阻断HMG1与hRAGE-Fc结合的能力。图5是来自抗体竞争ELISA结合测定的数据的曲线图，其显示XT-H2及XT-M4共享类似表位并与人类RAGE上的重叠位点结合。图6显示鼠科动物抗RAGE抗体XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5及XT-H7、及大鼠抗RAGE抗体XT-M4的重链可变区的比对氨基酸序列(SEQIDNO:18、21、24、20、26、16)。图7显示鼠科动物抗RAGE抗体XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5及XT-H7、及大鼠抗RAGE抗体XT-M4的轻链可变区的比对氨基酸序列(SEQIDNO:'19、22、25、23、27、17)。图8显示编码狒狒RAGE的cDNA的核苷酸序列(SEQIDNO:6)。图9显示编码食蟹猴RAGE的cDNA的核苷酸序列(SEQIDNO:8)。图10显示编码兔RAGE同种型1的cDNA的核苷酸序列(SEQIDNO:10)。图11显示编码兔RAGE同种型2的cDNA的核苷酸序列(SEQIDNO:12)。图12A-12E显示编码狒狒RAGE的经克隆狒狒基因组DNA的核苷酸序列(克隆体18.2)(SEQIDNO:15)。图13呈现通过竞争ELISA结合测定所测定的四个曲线图，其显示嵌合XT-M4抗体及大鼠抗体XT-M4阻断RAGE配体HMGBl、淀粉样蛋白卩1-42肽、S100-A及S100-B与hRAGE-Fc结合的能力。图14呈现通过抗体竞争ELISA结合测定所测定的曲线图，其显示嵌合XT-M4与抗体XT-M4及XT-H2竞争结合hRAGE-Fc的能力。图15绘示食蟹猴、兔及狒狒肺组织的IHC-染色，其显示XT-M4与这些组织中的内源细胞表面RAGE结合。对照样品是表达通过XT-M4接触的hRAGE的CHO细胞、不表达RAGE的NGBCHO细胞、及表达通过对照IgG抗体接触的hRAGE的CHO细胞。图16显示大鼠抗体XT-M4与正常人类肺及患有慢性阻塞性肺疾病(COPD)的人类肺中的RAGE结合。图17显示人类化鼠科动物XT-H2HV区域的氨基酸序列。图18显示人类化鼠科动物XT-H2HL区域的氨基酸序列。图19显示人类化大鼠XT-M4HV区域的氨基酸序列。图20A-20B显示人类化大鼠XT-H2HL区域的氨基酸序列。图21绘示用于制造人类化轻链及重链多肽的表达载体。图22显示通过竞争ELISA测定的人类化XT-H2抗体与人类RAGE-Fc结合的ED50值。图23显示通过BIACORETM结合测定而测定的XT-M4及人类化抗体XT-M4-V10、XT-M4-V11及XT-M4-V14与hRAGE-SA结合的动力学速率常数(ka及k》及缔合和解离常数(Ka及Kd)。屈24显示通过BIACORETM结合测定而测定的XT-M4及人类化抗体XT-M4-V10、XT-M4-V11及XT-M4-V14与mRAGE-SA结合的动力学速率常数(ka及k》及缔合和解离常数(Ka及Kd)。图25显示鼠科动物XT-H2VL-VHScFv构建体的核苷酸序列(SEQIDNO:51)。图26显示鼠科动物XT-H2VH-VLScFv构建体的核苷酸序列(SEQIDNO:52)。图27显示大鼠XT-M4VL-VHScFv构建体的核苷酸序列(SEQIDNO:54)。图28显示大鼠XT-M4VH-VLScFv构建体的核苷酸序列(SEQIDNO:53)。图29是ELISA数据图，其显示VL/VH或VH/VL构型的XT-H2及XT-M4抗RAGE抗体的ScFv构建体与人类RAGE-Fc结合。图30是ELISA数据图，其显示以可溶性蛋白在大肠杆菌(Escherichiacoli)中表达的VL/VH或VH/VL构型的XT-H2及XT-M4抗RAGE抗体的ScFv构建体与人类RAGE-Fc及BSA结合。ActRIIb是作为阴性对照自相同载体表达的非结合蛋白。图31示意性地展示使用PCR将掺加突变引入到XT-M4的CDR中。图32显示XT-M4VL-VHScFv构建体的C末端核苷酸序列(SEQIDNO:56)。VH-CDR3加以下划线。也显示两种掺加寡核苷酸(SEQIDNO:57-58)，每一突变位点上具有可识别用于所述位点突变的掺加比的数字。也可识别对应于所述数字的掺加比的核苷酸组成。图33示意性地展示核糖体展示载体pWRIL-3。"T7"表示T7启动子，"RBS"是核糖体结合位点，"间隔多肽"是将折叠蛋白与核糖体连接的间隔多肽，"Flag-标签"是用于蛋白质检测的Flag表位标签。图34示意性地展示噬菌体展示载体pWRIL-1。图35示意性地展示使用Fab展示载体pWRIL-6来组合装配VL及VH掺加文库。图36是抗体竞争ELISA数据的曲线图，其显示在去除位置52上的糖基化位点的突变后XT-M4抗体对于hRAGE的亲和力增加。图37是存活率图，其显示与野生型对照动物相比纯合及杂合RAGE基因剔除小鼠及给与抗RAGE抗体的小鼠在CLP后显示存活优势。图38是显示CLP后肠道细菌组织菌落计数的图。图39是存活率图，其显示抗RAGE抗体的两种不同剂量对CLP后小鼠存活的效果。图40是存活率图，其显示在CLP后将抗RAGE抗体的单次剂量延迟长达36小时的效果。'图41显示与野生型对照动物相比自受感染纯合及杂合RAGE基因剔除小鼠及受感染的给与抗RAGEmAb的小鼠的肝及脾分离的单核细胞增生性利斯特菌(丄.mo"oc_y的含量。图42是显示与野生型对照动物相比受感染纯合及杂合RAGE基因剔除小鼠及受感染的给与抗RAGE抗体的小鼠的干扰素Y的血清含量的图。图43是存活率图，其显示与野生型对照动物相比纯合及杂合RAGE基因剔除小鼠在CLP后的存活优势。图44是存活率图，其显示与野生型对照动物相比给与抗RAGE抗体单次注射的小鼠在CLP后的存活优势。图45是存活率图，其显示在CLP后将抗RAGE抗体的单次剂量延迟6小时或12小时的效果。图46是显示与对照动物相比给与抗RAGE抗体的小鼠具有改良的病理学分数的图。图47是存活率图，其显示给与抗RAGE抗体与抗生素的小鼠在CLP后的存活率。图48是存活率图，其显示单独给与抗生素的小鼠在CLP后的存活率。图50是显示受感染纯合及杂合RAGE基因剔除小鼠及给与抗RAGE抗体的小鼠的肝及脾中的单核细胞增生性利斯特菌的图。图51是显示单次静脉内投与到小鼠中后嵌合XT-M4的血清浓度的图。图52显示在CLP模型中嵌合XT-M4抗体具有保护性。图53显示在手术后长达24小时嵌合XT-M4抗体在CLP模型中具有保护性。具体实施例方式抗RAGE抗体本发明提供与RAGE(包括本文所述的可溶性RAGE及内源分泌型RAGE)特异性结合的抗体。代表性抗RAGE抗体可包含至少一种SEQIDNO:16-49中所示的抗体可变区氨基酸序列。本发明抗RAGE抗体包括与RAGE特异性结合并具有与SEQIDNO:16-49的任何一种氨基酸序列一致或基本一致的氨基酸序列的抗体。基本一致的抗RAGE抗体的氨基酸序列是与SEQIDNO:16-49的任何一种氨基酸序列具有至少85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%—致性者。本发明抗RAGE抗体包括如下抗体与RAGE特异性结合，且(a)包含选自由SEQIDNO:19,22、25、23、27及17组成的群组的轻链可变区，或(b)包含具有与SEQIDNO:19、22、25、23、27及17的任何一种氨基酸序列至少90%—致的氨基酸序列的轻链可变区，或为(a)或(b)中的抗体的RAGE结合片段。本发明抗RAGE抗体也包括如下抗体与RAGE特异性结合，且(a)包含选自由SEQIDNO:18、21、24、20、26及16组成的群组的重链可变区，或(b)包含具有与SEQIDNO:18、21、24、20、26及16的任何一种氨基酸序列至少90%—致的氨基酸序列的重链可变区，或为(a)或(b)中的抗体的RAGE结合片段。本发明包括如下抗RAGE抗体与RAGE特异性结合，且(a)与选自由XT-HI、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4组成的群组的抗体竞争结合RAGE;(b)与RAGE的表位结合，所述RAGE的表位与选自由XT-HI、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4组成的群组的抗体结合；(c)包含选自由XT-HI、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4组成的群组的抗体的轻链或重链的一或多个互补决定区(CDR);或(d)为(a)、(b)或(c)中的抗体的RAGE结合片段。本发明包括与表达RAGE的细胞在活体外及活体内特异性结合的抗RAGE抗体及抗体与人类RAGE结合，其解离常数(Kd)介于至少约1x10—7M至约1x10—1()M的范围。也包括与人类RAGE的V结构域特异性结合的本发明抗RAGE抗体及阻断RAGE与RAGE结合配偶体(RAGE-BP)结合的抗RAGE抗体。本发明也包括如下抗体与RAGE特异性结合并且阻断RAGE与RAGE结合配偶体(例如配体，例如HMGB1、AGE、A卩、SAA、S100、两性蛋白、S100P、S100A(包括S100A8及S100A9)、S100A4、CRP、(32-整联蛋白、Mac-1及p150，95)结合，且含有具有以下特征中的四个或更多个特征的CDR(位置编号是关于图6及7中所示VH及VL序列的氨基酸位置)1.在VHCDR1中的氨基酸序列为Y-X-M(Y32;X33;M34)，其中X优选为W或N;2.在VHCDR2中氨基酸序列为I-N-X-S(151;N52;X53及S54)，其中X为P或N;3.在VHCDR2中位置58上的氨基酸为苏氨酸；4.在VHCDR2中位置60上的氨基酸为酪氨酸；5.在.VHCDR3中位置103上的氨基酸为苏氨酸；6.在VHCDR3中存在一或多个酪氨酸残基；7.在VLCDR1中位置24上为带正电荷的残基(Arg或Lys);8.在VLCDR1中位置26上为亲水性残基(Thr或Ser);9.在VLCDR1中位置25上为小残基Ser或Ala;10.在VLCDR1中位置33上为带负电荷的残基(Asp或Glu);11.在VLCDR1中位置37上为芳香族残基(Phe或Tyr或Tip);12.在VLCDR2中位置57上为亲水性残基(Ser或Thr);13.在VLCDR3的末端为P-X-T序列，其中X可为疏水性残基Leu或Trp。本发明抗RAGE抗体包括如下抗体与人类RAGE的V结构域特异性结合并且阻断RAGE与其配体结合且含有具有13个特征中的5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或全部特征的CDR。本发明抗RAGE抗体包括上文所述抗RAGE抗体或选自由下列组成的群组的RAGE结合片段嵌合抗体、人类化抗体、单链抗体、四聚体抗体、四价抗体、多特异性抗体、结构域特异性抗体、结构域缺失抗体、融合蛋白、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、ScFv片段、Fd片段、单结构域抗体、dAb片段及Fc融合蛋白(即，与免疫球蛋白恒定区融合的抗原结合结构域)。这些抗体可与细胞毒性剂、放射治疗剂或可检测标记偶联。例如，已经制备包含大鼠XT-M4抗体的VH及VL结构域的ScFv抗体(SEQIDNO:63)并且通过基于细胞的ELISA分析显示其对于狒狒、小鼠、兔及人类的RAGE具有亲和力，此亲和力与嵌合及野生型XT-M4抗体的亲和力相当。本发明抗体进一步意欲包括对于一种标的多肽具有亲和力的复共轭对配合物、双特异性、单链及嵌合及人类化分子，所述亲和力由抗体的至少一个CDR区赋予。与RAGE特异性结合的本发明抗体也包括可容易地利用已知分子生物学及克隆技术制备的本文所述任何一种抗体的变体。参见，例如，美国公开专利申请案第2003/0118592号、第003/0133939号、第004/0058445号、第005/0136049号、第005/0175614号、第005/0180970号、第005/0186216号、第005/0202012号、第005/0202023号、第005/0202028号、第005/0202534号、及第2005/0238646号、及其相关专利家族成员，所有这些专利的全文都以引用方式并入本文中。例如，本发明的变体抗体也可包含结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白，其包括与免疫球蛋白铰链或铰链作用区域多肽融合或否则连接的结合结构域多肽(例如，scFv)，所述免疫球蛋白铰链或铰链作用区域多肽又与包含一或多个来自免疫球蛋白重链的天然或经设计恒定区的区域融合或否则连接，所述恒定区不为CH1，其为(例如)IgG及IgA的CH2及CH3区域、或IgE的CH3及CH4区域(对于更完全阐述参见(例如)莱德贝特(Ledbetter,J.)等人的美国专利第2005/0136049号，其以引用方式并入本文中)。结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白可进一步包括一个区域，所述区域包括与铰链区多肽融合或否则连接的天然或经设计的免疫球蛋白重链CH2恒定区多肽(或CH3，在构建体全部或部分源自IgE的情况下)及与CH2恒定区多肽(或CH3，在构建体全部或部分源自IgE的情况下)融合或否则连接的天然或经设计的免疫球蛋白重链CH3恒定区多肽(或CH4，在构建体全部或部分源自IgE的情况下)。一般来说，所述结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白能够具有至少一种免疫活性，例如，与RAGE特异性结合、抑制RAGE与RAGE结合配偶体间的相互作用、诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、诱导补体固定等。本发明抗体也可包含附接到其上且能够检测的标记(例如，标记可为放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)。RAGE多肽本发明也提供具有SEQIDN0:7、9、11、或13中所示氨基酸序列的狒狒、食蟹猴及兔的经分离RAGE蛋白，且进一步包括具有与SEQIDNO:7、9、11、或13中所示氨基酸序列基本一致的氨基酸序列的RAGE蛋白，即其氨基酸序列与SEQIDNO:7、9、11、或13的任何一种氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9°/(>一致。本发明也包括通过业内已知的任何手段来制造本发明抗RAGE抗体及其RAGE结合片段的方法。本发明也包括单克隆抗体的经纯化制备品，所述单克隆抗体与任何SEQIDNO:1、3、7、9、11、或13中所述的RAGE氨基酸序列的一或多个表位特异性结合。定义为方便起见，在说明书、实例及随附权利要求书中所用的某些术语集中于此。除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与所属
技术领域：
的技术人员通常所了解含义相同的含义。本文所用的冠词"一"("a"及"an，，)是指一个或一个以上(即指至少一个)的所述冠词的文法受词。举例来说，"一元件"意指一个元件或一个以上的元件。除非上下文另外明确说明，否则本文所用的术语"或"意指术语"及/或"，且可与"及/或"互换使用。"经分离"或"经纯化"多肽或蛋白质(例如，"经分离抗体")是纯化至超过其天然存在状态的多肽或蛋白质。例如，"经分离"或"经纯化"多肽或蛋白质(例如，"经分离抗体")基本上不含来自蛋白质源自其的细胞或组织来源的细胞材料或其它杂质蛋白，或基本上不含化学合成时的化学前体或其它化学品。非抗体蛋白(本文中也称为"杂质蛋白")或化学前体小于约50%的抗体蛋白制备品视为"基本上不含"。非抗体蛋白或化学前体占40%、30%、20%、10%且更优选5%(以干燥重量计)视为基本上不含。当抗体蛋白或其生物活性部分是经重组产生时，其也优选基本上不含培养基，即，培养基占蛋白质制备品体积或质量的小于约30%，优选小于约20%，更优选小于约10%，且最优选小于约5%。在本文中以"重组体"提及的蛋白质或多肽是通过重组核酸表达所产生的蛋白质或多肽。在本文中术语"抗体"可与术语"免疫球蛋白"互换使用，且包括完整抗体、抗体片段(例如，Fab、F(ab')2片段)及在其恒定区及/或可变区中发生突变的完整抗体及片段(例如，突变以产生嵌合、部分人类化、或完全人类化抗体，以及产生具有期望特性的抗体，例如，增强的IL13结合及/或减弱的FcR结合)。术语"片段"是指比完整(intact或complete)抗体或抗体链包含较少氨基酸残基的抗体或抗体链的一部分(part或portion)。片段可经由对完整(intact或complete)抗体或抗体链进行化学或酶处理而获得。片段也可通过重组手段获得。实例性片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc、Fd、dAb、及scFv及/或Fv片段。术语"抗原结合片段"是指免疫球蛋白或抗体的多肽片段，其与抗原结合或与完整抗体(即，与其源自的完整抗体)竞争与抗原结合(即，特异性结合)。只要抗体或片段与RAGE特异性结合并且中和或抑制一或多种RAGE相关活性(例如，抑制RAGE结合配偶体(RAGE-BP)与RAGE结合)，这些抗体或其片段就包括在本发明范围内。所述抗体包括包含通过二硫键相互连接的四条多肽链(两条重(H)链及两条轻(L)链)的分子结构。各重链包含重链可变区(本文縮写为HCVR或VH)及重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2及CH3。各轻链包含轻链可变区(本文縮写为LCVR或VL)及轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(CL)。可将VH及VL区进一步细分成高度可变区(称为互补决定区(CDR))和较为保守的区(称为构架区(FR))，二者间杂排列。各VH及VL由三个CDR及四个FR构成，其自氨基端至羧基端按如下顺序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。术语"抗体"意欲涵盖自任何来源(例如，人类及非人类灵长类动物、及啮齿类动物、兔类动物、山羊、牛科动物、马科动物、绵羊等)获得的任何Ig类或任何Ig亚类(例如IgG的IgGl、IgG2、IgG3及IgG4亚类)。本文所用的术语"Ig类"或"免疫球蛋白类"是指已在人类及高等哺乳动物中识别出的五类免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgD及IgE)。术语"Ig亚类"是指已在人类及高等哺乳动物中识别出的IgM的两个亚类(H及L)、IgA的三个亚类(IgAl、IgA2及分泌型IgA)、及IgG的四个亚类(IgGpIgG2、IgG3及IgG》。抗体可以单体或聚合形式存在；例如，IgM抗体以五聚体形式存在，且IgA抗体以单体、二聚体或多聚体形式存在。术语"IgG亚类"是指分别通过免疫球蛋白的Y重链(Yl-Y4)在人类及高等哺乳动物中识别出的IgG类免疫球蛋白的四个亚类-IgG,、IgG2、IgG3及IgG4。术语"单链免疫球蛋白"或"单链抗体"(在本文中可互换使用)是指具有由重链及轻链组成的两条多肽链结构的蛋白质，所述链(例如)通过链间肽连接体经稳定化，所述蛋白质具有与抗原特异性结合的能力。术语"结构域"是指包含(例如)通过P-折叠片及/或链间二硫键经稳定化的肽环(例如，包含3个至4个肽环)的重链或轻链多肽的球状区域。结构域在本文中进一步指"恒定"或"可变"结构域，此基于"恒定"结构域情况下各类成员结构域内的序列变异相对缺乏或"可变"结构域情况下各类成员结构域内显著变异。抗体或多肽"结构域"通常是指抗体或多肽"区域"(业内可互换)。抗体轻链的"恒定"结构域是指"轻链恒定区"、"轻链恒定结构域"、"CL"区域或"CL"结构域(可互换)。抗体重链的"恒定"结构域是指"重链恒定区"、"重链恒定结构域"、"CH"区域或"CH"结构域(可互换)。抗体轻链的"可变"结构域是指"轻链可变区"、"轻链可变结构域"、"VL"区域或"VL"结构域(可互换)。抗体重链的"可变"结构域是指"重链恒定区"、"重链恒定结构域"、"VH"区域或"VH"结构域(可互换)。术语"区域"也可指抗体链或抗体链结构域的一部分(part或portion)(例如，如本文所定义的重链或轻链的一部分或恒定结构域或可变结构域的一部分)以及所述链或结构域的更分散部分。例如，如本文所定义，轻链及重链或轻链及重链可变结构域包括散布于"框架区"或"FR"中的"互补决定区"或"CDR"。术语"构象"是指蛋白质或多肽(例如，抗体、抗体链、结构域或其区域)的三级结构。例如，短语"轻(或重)链构象"是指轻(或重)链可变区的三级结构，且短语"抗体构象"或"抗体片段构象"是指抗体或其片段的三级结构。抗体"特异性结合"意指抗体对于特定抗原或表位展示可观亲和力且通常不展示显著交叉反应性。本文所用的术语"抗RAGE抗体"是指与RAGE特异性结合的抗体。抗体可展示无交叉反应性，例如，不与非RAGE肽或RAGE上的遥远表位交叉反应。"可观"结合包括以至少106、107、108、109M"、或101()M—'的亲和力结合。亲和力大于WM"或10SNf1的抗体一般以对应较强的特异性结合。本文所述亲和力值的中间值也意欲包括在本发明范围内且本发明抗体以以下范围的亲和力与RAGE结合，例如，106至10"NT1、或107至101GM-'、或108至101GM"。"不展示显著交叉反应性"的抗体是不与不是其靶标的实体(例如，不同表位或不同分子)可观结合的抗体。例如，与RAGE特异性结合的抗体将与RAGE可观结合，但不与非RAGE蛋白或肽显著反应。对特定表位具有特异性的抗体将(例如)不与相同蛋白质或肽上的遥远表位显著交叉反应。特异性结合可按照用于测定所述结合的任何业内公认手段来测定。优选地，按照斯卡査德分析(Scatchardanalysis)及/或竞争结合测定来测定特异性结合。本文所用的术语"亲和力"是指单一抗原结合位点与抗原决定簇的结合强度。亲和力取决于抗体结合位点与抗原决定簇之间的立体化学吻合紧密性、其间的接触面积大小、带电荷基团及疏水性基团的分布等。抗体亲和力可通过平衡透析或动力学BIACORETM方法测量。BIACORETM方法依赖于表面等离子共振(SPR)现象，其在金属/液体界面激发表面等离子波时发生。光在不与样品接触的表面侧直射并自其反射，并且SPR造成特定角度及波长组合下的反射光强度降低。双分子结合事件使表面层的折射率改变，此可以SPR信号的改变来检测。解离常数Kd及缔合常数Ka是亲和力的数量测量。平衡时，游离抗原(Ag)及游离抗体(Ab)与抗原-抗体复合物(Ag-Ab)相平衡，且速率常数(ka及kd)定量各反应的速率kakdAb+Ag—Ab-Ag及Ab-Ag—Ab+Ag平衡时，ka[Ab][Ag〗=kd[Ag-Ab]。解离常数Kd由Kd=kd/ka=[Ag][Ab]/[Ag-Ab]给出。Kd具有浓度单位，最一般为M、mM、^M、nM、pM等。当比较以Kd表示的抗体亲和力时，对RAGE具有较大亲和力者由较低值表示。缔合常数Ka由Ka二ka/kd^[Ag-Ab]/[Ag][Ab]给出。Ka具有浓度倒数单位，最一般为M—1、mM'1、pM'1、nM—1、pM"等。本文所用的术语"亲合力"是指在可逆复合物形成后抗原-抗体键的强度。抗RAGE抗体可以其与RAGE蛋白结合的Kd为特征，以"在约(较低Kd值)至约(较高Kd值)范围内的解离常数(Kd)"结合。在此上下文中，术语"约"意指所指出的Kd值±20%;即，约1Kd=0.8-1.2Kd。本文所用的术语"单克隆抗体"是指源自结构及抗原特异性均一的抗体产生细胞(例如，B淋巴细胞或B细胞)的克隆群体的抗体。术语"多克隆抗体"是指源自结构及表位特异性不均一但识别共同抗原的抗体产生细胞的不同克隆群体的多种抗体。单克隆抗体及多克隆抗体可在体液内以粗制备品形式存在，或可如本文所述经纯化。术语抗体"结合部分"(或"抗体部分")包括一或多个完整结构域(例如，一对完整结构域)以及保留与RAGE特异性结合能力的抗体片段。己显示，抗体的结合功能可由全长抗体的片段来实施。结合片段可通过重组DNA技术或通过对完整免疫球蛋白实施酶或化学裂解来产生。结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc、Fd、dAb、Fv、单链、单链抗体(例如，scFv)及单结构域抗体(姆德曼(Muyldermans)等人，2001，26:230-5)及经分离互补决定区(CDR)。Fab片段是由VL、VH、CL及CH1结构域组成的单价片段。F(ab')2片段是包含两个在铰链区通过二硫桥键连接的Fab片段的二价片段。Fd片段由VH及CH1结构域组成，且Fv片段由抗体单臂的VL及VH结构域组成。dAb片段由VH结构域组成(沃德(Ward)等人，(1989)自然(Nature)341:544-546)。尽管Fv片段的两个结构域(VL及VH)是由单独基因编码，但是可使用重组方法通过合成连接体将此两个结构域连接在一起，此合成连接体使其能够以其中VL及VH区域配对形成单价分子的单一蛋白链(称为单链Fv(scFv))产生(伯德(Bird)等人，(1988)科学(Science)242:423-426)。所述单链抗体也意欲涵盖于术语抗体的"结合部分"中。也涵盖单链抗体的其它形式(例如双特异抗体)。双特异抗体是二价双特异性抗体，其中VH及VL结构域在多肽单链上表达，但是所用连接体太短以致不容许相同链上的两个结构域之间配对，从而迫使此等结构域与另一链的互补结构域配对并形成两个抗原结合位点(参见，例如，豪里格(Holliger)等人，1993，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90:6444-6448)。抗体或其结合部分也可为通过抗体或抗体部分与一或多种其它蛋白质或肽共价或非共价缔合而形成的较大免疫粘附分子的一部分。所述免疫粘附分子的实例包括使用抗生蛋白链菌素核心区域来制造四聚体cFv分子(克普瑞雅纳夫(KipriyaiKw,S.M.)等人(1995)人类抗体及杂交瘤(HumanAntibodiesandHybridomas)6:93-101)及使用半胱氨酸残基、标记肽及C-端聚组氨酸标签来制造二价及生物素化scFv分子(克普瑞雅纳夫等人(1994)分子免疫学(Mol.Immunol.)31:1047-1058)。诸如Fab及F(ab')2片段等结合片段可利用习用技术自全抗体制备，例如全抗体的分别木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。而且，抗体、抗体部分及免疫粘附分子可利用本文所述且为所属
技术领域：
的技术人员所习知的标准重组DNA技术获得。除"双特异性"抗体或"双功能"抗体外，抗体应理解为其每一结合位点均相同者。"双特异性"抗体或"双功能"抗体是具有两个不同重/轻链对及两个不同结合位点的人工杂交抗体。双特异性抗体也可包括具有间插恒定区的两个抗原结合区。双特异性抗体可通过多种方法(包括杂交瘤融合或连接Fab'片段)产生。参见，例如，松思维莱(Songsivilai)等人，免疫学临床及实验(Clin.Exp.Immunol.)79:315-321，1990.;考斯戴尼(Kostelny)等人，1992，免疫学(J.Immunol.)148，1547-1553。术语"回复突变"是指人类抗体的一些或全部经体突变的氨基酸由来自同源种系抗体序列的对应种系残基所代替的过程。将本发明人类抗体的重链及轻链序列与VBASE数据库中的种系序列单独比对以识别具有最高同源性的序列。通过使编码所述不同氨基酸的经界定核苷酸位置突变将本发明人类抗体的差异返回到种系序列。应研究因此经识别作为回复突变候选者的每一氨基酸的作用(在抗原结合中的直接或间接作用)且在突变后发现影响人类抗体任何期望特征的任何氨基酸都不应包括在最终人类抗体中；作为实例，通过选择性诱变途径识别的活性增强氨基酸不经历回复突变。为使经历回复突变的氨基酸数目最小化，发现与最接近种系序列不同但与第二种系序列中的对应氨基酸相同的那些氨基酸位置可保留，只要在所研究氨基酸的两侧上所述第二种系序列与本发明人类抗体序列至少10个、优选12个氨基酸相同及共线性即可。回复突变可在抗体优化的任何阶段发生；优选地，回复突变在选择性诱变途径之前或之后不久发生。更优选地，回复突变在选择性诱变途径之前不久发生。完整抗体(也称为免疫球蛋白)一般是由两条轻(L)链(每一约25kDa)及两条重(H)链(每一约50kDa)构成的四聚体糖基化蛋白。在抗体中发现两种轻链类型，称为X及k。根据重链恒定结构域的氨基酸序列，可将免疫球蛋白分成五个主要种类:A、D、E、G及M，且可将这些中的几种进一步分成亚类(同种型)，例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl及IgA2。每一轻链由N端可变(V)结构域(VL)及恒定(C)结构域(CL)构成。每一重链由N端V结构域(VH)、三个或四个C结构域(CH)及铰链区构成。与VH最接近的CH结构域称为CH1。VH及VL结构域由四个相对保守的称为框架区的序列区域组成(FR1、FR2、FR3、及FR4)，其形成三个超变序列区域(互补决定区，CDR)的支架。CDR含有造成抗体与抗原特异性相互作用的大多数残基。CDR以CDR1、CDR2及CDR3提及。因此，重链上的CDR组件称为Hl、H2及H3，而轻链上的CDR组件称为L1、L2及L3。CDR3是抗体结合位点内分子多样性的最主要来源。例如，H3可短至两个氨基酸残基或多于26个氨基酸。不同种类免疫球蛋白的亚单元结构及三维构型已为所属
技术领域：
的技术人员所熟知。对于抗体结构的综述，参见抗体实验室手册(An他odies:ALaboratoryManual),冷泉港实验室(ColdSpringHarborLaboratory)编辑，哈娄(Harlow)等人，1988。所属
技术领域：
的技术人员将意识到每一亚单元结构(例如，CH、VH、CL、VL、CDR、FR结构)包含活性片段，例如，与抗原结合的VH、VL或CDR亚单元部分(即结合片段)或例如，与(例如)Fc受体及/或补体结合及/或激活Fc受体及/或补体的CH亚单元部分。抗体多样性是通过使用多种编码可变区的种系基因及多种体细胞事件发生。体细胞事件包括将V基因(variablegene)节段与D基因(diversitygene)及J基因(joininggene)节段重组以产生完整VH区域及将V基因及J基因节段重组以产生完整VL区域。重组过程本身是不精确的，导致V(D)J连接处氨基酸丢失或添加。这些多样性机制发生在抗原暴露之前的B-细胞发育中。在抗原刺激后，B-细胞中表达的抗体基因经历体细胞突变。基于种系基因节段的估计数目，这些节段随机重组及随机VH-VL配对可产生至多1.6x107种不同抗体(基础免疫学(FundamentalImmunology),第3版(1993)编辑，保罗(Paul)，雷文出版社(RavenPress),纽约，NY)。当考虑促成抗体多样性的其它过程(例如体细胞突变)时，认为可产生多达lxl(^种不同抗体(免疫球蛋白基因(ImmunoglobulinGenes)，第2版(1995)，杰尼奥(Jonio)等人编辑，美国学术出版社(AcademicPress)，圣迭戈(SanDiego)，加利福尼亚州)。因为许多过程涉及产生抗体多样性，所以具有相同抗原特异性的独立衍生单克隆抗体不可能具有相同的氨基酸序列。术语"二聚多肽"或"二聚结构域"包括与另一多肽形成二聚体(或更高级复合物，例如三聚体、四聚体等)的任何多肽。视情况，二聚多肽与其它相同二聚多肽连接，由此形成同型多体。IgGFc元件是易于形成同型多体的二聚结构域的实例。视情况，二聚多肽与其它不同二聚多肽连接，由此形成异型多体。Jun亮氨酸拉链结构域与Fos亮氨酸拉链结构域形成二聚体，且因此是易于形成异型多体的二聚结构域的实例。二聚结构域可形成25种异型及同型多体(二者)。术语"人类抗体"包括具有对应于如卡百特(Kabat)等人所述的人类种系免疫球蛋白序列的可变区及恒定区的抗体(参见，卡百特等人，(1991)具有免疫学兴趣的蛋白质序歹!j(SequencesofproteinsofImmunologicalInterest),第5版，美国卫生禾口人类服务部(U.S.DepartmentofHealthandHumanServices),国家卫生研究院公开案(NIHPublication)第91-3242号)。本发明人类抗体可在(例如)CDR内且尤其CDR3内包括不是由人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过活体外随机诱变或定点诱变或通过活体内体细胞突变引入的突变)。突变优选地利用本文所述"选择性诱变途径"引入。人类抗体可至少一个位置经不是由人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基代替，例如，活性增强氨基酸残基。人类抗体可至多二十个位置经不是人类种系免疫球蛋白序列一部分的氨基酸残基代替。而且，至多十个、至多五个、至多三个或至多两个位置经代替。这些代替可属于在下文中详细阐述的CDR区域。然而，本文所用的术语"人类抗体"不欲包括其中源自另一哺乳动物物种(例如小鼠)种系的CDR序列已移植到人类框架序列上的抗体。短语"重组人类抗体"包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的人类抗体，例如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(在下文第II部分进一步阐述)、自重组组合人类抗体文库分离的抗体(在下文第m部分进一步阐述)、自人类免疫球蛋白基因转基因动物(例如，小鼠)分离的抗体(参见，例如，泰勒(Taylor,L.D.)等人(1992)核酸研究(Nud.AcidsRes.)20:6287-6295)或通过涉及将人类免疫球蛋白基因序列拼接到其它DNA序列上的任何其它手段制备、表达、产生或分离的抗体。所述重组人类抗体具有源自人类种系免疫球蛋白序列的可变区及恒定区(参见，卡百特(Kabat,E.A.)等人(1991)具有免疫学兴趣的蛋白质序列(S叫uencesofproteinsofImmunologicalInterest),第5版，美国卫生和人类服务部(U.S.DepartmentofHealthandHumanServices),国家卫生研究院公开案(NIHPublication)第91-3242号)。然而，所述重组人类抗体可经受活体外诱变(或者，当使用人类Ig序列转基因动物时，经受活体内体细胞诱变)且因此重组抗体VH及VL区的氨基酸序列(当源自或与人类种系VH及VL序列相关时)是不可天然存在于人类活体内抗体种系谱中的序列。然而，在某些实施例中，所述重组抗体可能是选择性诱变途径或回复突变或二者的结果。"经分离抗体"包括基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，与RAGE特异性结合的经分离抗体基本上不含与非hRAGE的RAGE特异性结合的抗体)。与RAGE特异性结合的经分离抗体可结合来自其它物种的RAGE分子。而且，经分离抗体可基本上不含其它细胞材料及/或化学品。"中和抗体"(或"中和RAGE活性的抗体")包括与hRAGE结合导致hRAGE生物活性调节的抗体。所述hRAGE生物活性的调节可通过测量一或多种hRAGE生物活性的指示物来评价，例如在人类RAGE受体结合测定中的受体结合抑制(参见，例如，实例6及7)。hRAGE生物活性的这些指示物可通过所属
技术领域：
的技术人员所习知的数种标准活体外或活体内测定的一或多种来评价(参见，例如，实例6及7)。"人类化"形式的非人类(例如，鼠科动物)抗体是含有最少量源自非人类免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人类化抗体是如下的人类免疫球蛋白(接受者抗体)来自接受者超变区的残基由来自非人类物种(例如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物)超变区(供体抗体)的具有期望特异性、亲和力及容量的残基所代替。在一些情况下，人类免疫球蛋白的框架区(FR)残基由对应非人类残基所代替。此外，人类化抗体可包含未曾在接受者抗体或供体抗体中发现的残基。实施所述修饰可进一步改良抗体特性。一般来说，人类化抗体可包含基本上所有至少一个且通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有超变区对应于非人类免疫球蛋的超变区，且所有或基本上所有FR区是人类免疫球蛋白序列的FR区。人类化抗体视情况也包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常为人类免疫球蛋白恒定区)的至少一部分。对于更详细阐述，参见琼斯(Jones)等人，自然(Nature)321:522-525(1986);里耶曼(Riechmann)等人，自然332:323-329(1988);及普锐斯塔(Presta)，结构生物学新观点(Curr.Op.Struct.Biol.)2:593-596(1992)。术语"活性"包括以下活性例如，抗体对抗原的结合特异性/亲和性(例如，与RAGE结合的抗hRAGE抗体)、及/或抗体的中和效能(例如，与hRAGE的结合可抑制RAGE生物活性的抗hRAGE抗体，例如，在人类RAGE受体结合测定中抑制受体结合)。"表达构建体"是包括可表达核酸及足以介导可表达核酸蛋白质或多肽在适宜宿主细胞中表达的调控元件的任何重组核酸。术语"融合蛋白"及"嵌合蛋白"可互换且是指具有如下氨基酸序列的蛋白质或多肽所述氨基酸序列的一部分对应于来自两种或更多种蛋白质的氨基酸序列。来自两种或更多种蛋白质的序列可为蛋白质的全部或部分(即，片段)。融合蛋白也可在对应于蛋白质氨基酸序列的部分之间具有氨基酸连接区。所述融合蛋白可通过重组方法制备，其中通过用核酸酶及连接酶处理将对应核酸连接在一起并纳入到表达载体中。一般来说，融合蛋白的制备已为所属
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的技术人员所了解。术语"核酸"是指聚核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)及(合适时)核糖核酸(RNA)。此术语也应理解为包括自核苷酸类似物制造的RNA或DNA的等效物、类似物、及适用于所述实施例的单链(同义或反义)及双链聚核苷酸。术语"百分比(％)—致"或"百分比(％)—致性"是指两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的序列一致性。百分比一致性可通过比较每一序列中的位置来测定，所述每一序列可为比较目的而进行比对。一致性百分比表达式是所比较序列共有位置上相同氨基酸或核酸数目的函数。可使用多种比对算法及/或程序，包括FASTA、BLAST或ENTREZ。FASTA及BLAST可作为GCG序列分析程序包(威斯康星大学(UniversityofWisconsin),麦迪逊(Madison)，威斯康星州(Wis.))的一部分获得，且可以(例如)默认设置使用。ENTREZ是通过国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation),国家医学图书馆(NationalLibraryofMedicine),国家卫生研究院(NationalInstitutesofHealth),贝塞斯达市(Bethesda)，马里兰州(Md)获得。两个序列的一致性百分比可通过缺口权重为1的GCG程序来测定，例如使每一氨基酸缺口加权，好像其是两个序列之间的单氨基酸或核苷酸错配一样。其它比对技术阐述于酶学方法(MethodsinEnzymology)，第266巻大分子序列分析的计算机方法(ComputerMethodsforMacromolecularSequenceAnalysis)(1996)，杜利特尔(Doolittle)编辑，学术出版社(AcademicPress)公司，哈考特公司(HarcourtBrace&0).)的分部，圣地亚哥(SanDiego)，加利福尼亚(California)，美国。优选地，使用允许序列中存在缺口的比对程序来实施序列比对。史密斯-华特曼(Smith-Waterman)算法是允许序列比对中存在缺口的一种算法类型。参见，分子生物学方法(Meth.Mol.Biols.)70:173-187(1997)。而且，使用尼德曼温斯(NeedlenanandWunsch)比对方法的GAPI程序可用以实施序列比对。替代研究策略使用在MASPAR计算机上运行的MPSRCH软件。MPSRCH使用史密斯-华特曼算法在整体平行的计算机上评价5个序列。此方法提高了挑选关系较远匹配的能力，且尤其容忍小缺口及核苷酸序列差错。可使用编码核酸的氨基酸序列来搜索蛋白质及DNA数据库二者。在本文中，术语"多肽"与"蛋白质"可互换使用。如所属
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的技术人员所习知，"RAGE"蛋白是"晚期糖化终产物受体"。代表性RAGE蛋白陈述于图1A-1C中。RAGE蛋白包括可溶性RAGE(sRAGE)及内源分泌型RAGE(esRAGE)。内源分泌型RAGE是在细胞外释放的RAGE拼接变体，其中其能够结合AGE配体并中和AGE作用。参见，例如，小山(Koyama)等人，X7T￡，2005;25:2587-2593。已观察到人类血浆esRAGE与代谢综合征的数个组成(BMI、胰岛素抗性、BP、高甘油三酯血症及IGT)逆相关。血浆esRAGE含量也与患有糖尿病或不患有糖尿病的个体的颈动脉及股动脉粥样硬化(通过超声定量)逆相关。而且，与年龄匹配的健康对照相比，在患有经血管造影术证实的冠状动脉疾病的非糖尿病患者中血浆esRAGE含量显著较低。"晚期糖化终产物受体配体结合元件"或"RAGE-LBE"(在本文中也称为"RAGE-Fc"及"RAGE-链球菌")包括保留与RAGE配体结合能力的跨膜RAGE多肽及其片段的任何细胞外部分。此术语也涵盖与RAGE多肽具有至少85%—致性、优选至少90%—致性或更优选至少95%—致性的多肽，例如，RAGE配体或RAGE-BP将与其结合的人类或鼠科动物多肽。"晚期糖化终产物受体结合配偶体"或"RAGE-BP"包括在生理学环境下与RAGE蛋白(受体多肽，例如，RAGE或RAGE-LBE)的细胞外部分结合的任何物质(例如，多肽、小分子、碳水化合物结构等)。"RAGE相关病症(RAGE-relateddisorder或RAGE-associateddisorder)包括其中受侵袭的细胞或组织展示增加或降低的RAGE或一或多种RAGE配体的表达及/或活性的任何病症。RAGE相关病症也包括可通过减弱RAGE功能(包括(例如)投与破坏RAGE:RAGE-BP相互作用的药剂)治疗(即，一或多个症状可消除或改善)的任何病症。"RAGE的V-结构域"是指如尼普(Neeper)等人，"RAGE的克隆及表达蛋白质晚期糖化终产物的细胞表面受体(OoningandexpressionofRAGE:acellsurfacereceptorforadvancedglycosylationendproductsofproteins)"，生物化学(J.Biol.Chem.)267:14998-15004(1992)图5中所示的免疫球蛋白样可变结构域，所述文献的内容以引用方式并入本文中。所述V-结构域包括SEQIDNO:l及SEQIDNO:3中所示自位置1至位置120的氨基酸。RAGE的人类cDNA具有1406个碱基对且编码404个氨基酸的成熟蛋白质。参见尼普(Neeper)等人，1992的图3。术语"重组核酸"包括包含至少两条非天然共存在序列的任何核酸。重组核酸可通过(例如)利用分子生物学方法在活体外产生或通过(例如)在新染色体位置上通过同源或非同源重组插入核酸在活体内产生。术语对个体的"治疗"是指改良个体疾病或病症的至少一种症状。治疗可为治愈疾病或病状或使其得以改良。术语"载体"是指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一种载体类型是附加体，g卩，能够染色体外复制的核酸。另一种载体类型是经设计与宿主细胞的遗传物质重组的整合载体。载体可自主复制及整合二者，且载体的特性可随细胞环境而不同(即，载体可在一种宿主细胞类型中自主复制及在另一种宿主细胞类型中纯粹整合)。能够引导与其可操作连接的可表达核酸表达的载体在本文中称为"表达载体"。"特异性免疫反应"是指当抗体与特定肽序列相互作用时化合物[抗体]优先与特定肽序列结合。本文所用的短语"有效量"意指可在动物中有效产生一些期望效果的一或多种药剂、材料或包含一或多种本发明药剂的组合物的量。已意识到，当使用药剂来达成治疗效果时，包含"有效量"的实际剂量将随多种条件而改变，包括所治疗的特定病状、疾病的严重程度、患者的个头及健康状况、投与途径等。熟练的医务人员可利用医学
技术领域：
技术人员所熟知的方法容易地确定合适剂量。本文所用的短语"医药学上可接受的"是指如下化合物、材料、组合物、及/或剂型在合理医学诊断范畴内、适于与人类及动物组织接触使用而无过度毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症、与合理效益/风险比相称。本文所用的短语"医药上可接受的载剂"意指医药上可接受的材料、组合物或媒剂，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料，其参与自身体的一种器官或一部分向身体的另一种器官或另一部分携带或转运标的药剂。每一载体在与调配物其它成份相容意义上必须为"可接受的"。一些可用作医药上可接受的载剂的材料实例包括(1)糖类，例如乳糖、葡萄糖及蔗糖；(2)淀粉类，例如玉米淀粉及马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素及乙酸纤维素；(4)粉末状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，例如可可脂及栓剂蜡；(9)油类，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油及豆油；(10)二醇类，例如丙二醇；(11)多元醇类，例如甘油、山梨醇、甘露醇及聚乙二醇；(12)酯类，例如油酸乙酯及月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁及氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液(Ringer'ssolution);(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；及(21)用于医药调配物中的其它无毒性可相容物质。单克隆抗体的制备哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠或兔)可用全长蛋白或其片段或编码全长蛋白或其片段的cDNA(肽的免疫原性形式)实施免疫。赋予蛋白质或肽免疫原性的技术包括所属
技术领域：
的技术人员所熟知的与载剂偶联或其它技术。多肽的免疫原性部分可在佐剂存在下投与。免疫过程可通过检测血浆或血清中的抗体滴度来监测。可使用免疫原作为抗原的标准ELISA或其它免疫测定来评价抗体含量。在用标的多肽抗原制备品对动物实施免疫后，可获得抗血清且(若需要)自血清分离出多克隆抗体。为制造单克隆抗体，可自经免疫动物收获产生抗体的细胞(淋巴细胞)并通过标准体细胞融合程序使其与永生细胞(例如骨髓瘤细胞)融合以产生杂交瘤细胞。所述技术已为所属
技术领域：
的技术人员所熟知，且包括(例如)杂交瘤技术(最初由科勒(Kohler)及米尔斯坦(Milstein)，(1975)自然(Nature),256:495-497提出)、人类B细胞杂交瘤技术(科兹巴(Kozbar)等人，(1983)现代免疫学(ImmunologyToday),4:72)、及产生人类单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(科尔(Cole)等人，(1985)单克隆抗体及癌症治疗(MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy),阿兰里斯(AlanR.Liss)公司，第77-96页)。可对杂交瘤细胞实施免疫化学筛选以产生与RAGE多肽表位特异性反应的抗体及自包含所述杂交瘤细胞的培养物分离的单克隆抗体。人类化嵌合抗体包含来自至少两种不同物种的序列。作为一个实例，重组克隆技术可用以包括含有抗原结合位点的来自非人类抗体(即，在用抗原免疫的非人类物种中制备的抗体)的可变区及源自人类免疫球蛋白的恒定区。人类化抗体是一种嵌合抗体，其中造成抗原结合的可变区残基(即，互补决定区残基、縮短互补决定区残基、或参与抗原结合的任何其它残基)源自非人类物种，而剩余可变区残基(即，框架区残基)及恒定区源自(至少部分源自)人类抗体序列。人类化抗体框架区残基及恒定区残基的亚组可源自非人类来源。人类化抗体的可变区也可阐述为人类化可变区(即，人类化轻链或重链可变区)。用于经抗原免疫的非人类物种一般为(例如)小鼠、大鼠、兔、非人类灵长类动物或其它非人类哺乳动物物种。人类化抗体一般比传统嵌合抗体具有较低免疫原性且在投与到人类中后显示改良的稳定性。参见，例如，本科萨(Benincosa)等人，(2000)药理学及实验治疗G/尸Aa，aco/.五x;.7%e。292:810-6;卡勒松(Kalofonos)等人，(1994)欧洲癌症(五wrJOmcer)30A:1842-50;苏布阿曼(Subramanian)等人，(1998)儿科传染病/一ctJ.)17:110-5。互补决定区(CDR)是参与抗原结合的抗体可变区残基。通常使用数种用于识别CDR的编号系统。卡百特(Kabat)定义是基于序列可变性，且邵氏(Chothia)定义是基于结构环区域的定位。AbM定义是卡百特与邵氏方法的折衷。按照卡百特、邵氏或AbM算法，轻链可变区的CDR是由位置24及34(CDRl-L)、50及56(CDR2-L)、及89及97(CDR3-L)上的残基约束。按照卡百特定义，重链可变区的CDR是由位置31及35B(CDRl-H)、50及65(CDR2-H)、及95及102(CDR3-H)上的残基约束(按照卡百特编号)。按照邵氏定义，重链可变区的CDR是由位置26及32(CDR1-H)、52及56(CDR2-H)、及95及102(CDR3-H)上的残基约束(按照邵氏编号)。按照AbM定义，重链可变区的CDR是由位置26及35B(CDR1-H)、50及58(CDR2-H)、及95及102(CDR3-H)上的残基约束(按照卡百特编号)。参见，马丁(Martin)等人，(1989)美国国家科学院院刊86:9268-9272;马丁等人(1991)酶学方法203:121-153;派德森(Pedersen)等人(1992)免疫方法(/www"ome/zo&)l:126;及瑞斯(Rees)等人，(1996)斯藤伯格(SternbergM丄E.)(编辑)，蛋白质结构预测(ProteinStructurePrediction),牛津大学出版社(OxfordUniversityPress),牛津，第141-172页。本文所用的术语"CDR"是指由卡百特或邵氏定义的CDR;而且，本发明的人类化抗体可变区可经构建以包含一或多个由卡百特定义的CDR，且也包含一或多个由邵氏定义的CDR。特异性决定区(SDR)是CDR内与抗原间接相互作用的残基。SDR与超变残基对应。参见(帕德兰(Padlan)等人，(1995)美国实验生物学联合会会志(尸^SE5/)9:133-139)。框架残基是非超变区或CDR残基的那些抗体可变区残基。框架残基可源自天然存在的人类抗体，例如与本发明抗RAGE抗体的框架区基本上类似的人类框架。也可使用代表各序列共有序列的人工框架序列。当选择框架区人类化时，在人类中广泛呈现的序列要优于人口较少的序列。可实施人类框架受体序列的额外突变以恢复认为与抗原接触有关的鼠科动物残基及/或与抗原结合位点结构整合有关的残基或改良抗体表达。可利用肽结构预测来分析人类化可变重及轻区域序列以识别并避免通过人类化设计引入的翻译后蛋白质修饰位点。人类化抗体可使用多种方法中的任何一种来制备，包括下文所述的覆盖、互补决定区(CDR)移植、縮短CDR移植、特异性决定区(SDR)移植及弗氏(Frankenstein)组装。人类化抗体也包括在CDR中引入一或多个改变的超人类化抗体。例如，人类残基可取代CDR中的非人类残基。可将这些一般途径与标准诱变及合成技术组合以产生具有任何期望序列的抗RAGE抗体。覆盖是基于通过用人类氨基酸序列重作抗体的溶剂可及外表表面以减少啮齿类动物或其它非人类抗体中的潜在免疫原性氨基酸序列的观点。因此，经覆盖的抗体比未经修饰的非人类抗体似乎更适合于人类细胞。参见，帕德兰(1991)分子免疫学(Mo/./mmw"o/.)28:489-98。如下覆盖非人类抗体识别非人类抗体中的暴露外表框架区残基(其与人类抗体框架区中相同位置上的那些残基不同)并用人类抗体中占据这些相同位置的氨基酸代替所识别的残基。CDR移植是通过用供体抗体(例如，非人类抗体)的CDR代替受体抗体(例如，人类抗体或包含期望框架残基的其它抗体)的一或多个CDR来实施。可基于候选受体抗体与供体抗体间框架残基的类似性来选择受体抗体。例如，按照弗氏方法，识别与相关非人类抗体的每一框架区具有实质序列同源性的人类框架区，并将非人类抗体的CDR移植到不同人类框架区的复合结构上。可用于制备本发明抗体的有关方法阐述于美国专利申请公开案第2003/0040606号中。縮短CDR的移植是相关方法。縮短CDR包括特异性决定残基及相邻氨基酸，包括轻链中位置27d-34、50-55及89-96位置上的氨基酸及重链中位置31-35b、50-58及95-101上的氨基酸((卡百特等人(1987)的编号约定)。参见(帕德兰(Padlan)等人，(1995)美国实验生物学联合会会志(尸A5五SJ)9:133-9)。特异性决定残基(SDR)移植的前提是如下协定抗体结合位点的结合特异性及亲和性是由每一互补决定区(CDR)内的最高度可变残基决定。基于CDR内每一位置上存在的氨基酸残基的结构不相似性，可利用抗体-抗原复合物的三维结构分析与可变氨基酸序列数据的分析来模拟序列可变性。SDR识别为由接触残基组成的最小免疫原性多肽序列。参见帕德兰(Padlan)等人，(1995)美国实验生物学联合会会志(FAS^^J)9:133-139)。可对用于CDR或缩短CDR移植的受体框架实施进一步修饰以引入期望残基。例如，受体框架可包含人类亚群I共有序列的重链可变区，视情况在位置1、28、48、67、69、71及93的一或多个位置上具有非人类供体残基。作为另一实例，人类受体框架可包含人类亚群I共有序列的轻链可变区，视情况在位置2、3、4、37、38、45及60的一或多个位置上具有非人类供体残基。在移植后，可对供体及/或受体序列实施额外改变以优化抗体结合及功能。参见，例如，PCT国际公开案第WO91/09967号。可用于制备人类化抗RAGE抗体的重链可变区的人类框架包括以下的框架残基DP-75、DP54、DP-54FWVH3JH4、DP-54VH33-07、DP-8(VHl-2)、DP陽25、Vl-2b及VI-3(VHl-03)、DP-15及Vl-8(VHl-08)、DP-14及V1-18(VH1隱18)、DP-5及V1-24P(VHl-24)、DP-4(VHl-45)、DP-7(VHl-46)、DP-IO、DA-6及YAC-7(豐-69)、DP-88(VHl-e)、DP-3、及DA-8(VHl-f)。可用于制备人类化抗RAGE抗体的轻链可变区的人类框架包括人类种系克隆体DPK24、DPK-12、DPK-9Vkl、DPK-9Jk4、DPK9Vkl02、及种系克隆体亚群VkIII及VKI的框架残基。DPK24种系的以下突变可增加抗体表达F10S、T45K、163S、Y67S、F73L、及T77S。本发明的代表性人类化抗RAGE抗体包括具有选自SEQIDNO:16-27的可变区氨基酸序列的一或多个CDR的抗体。例如，人类化抗RAGE抗体可包含两个或更多个CDR，所述CDR选自SEQIDNO:16、18、21、24、20及26的任一者的重链可变区的CDR或SEQIDNO:17、19、22、25、23及27的任一者的轻链可变区的CDR。人类化抗RAGE抗体也可包含如下重链及轻链，所述重链包含具有SEQIDNO:16、18、21、24、20及26的任一者的两个或三个CDR的可变区，且所述轻链包含具有SEQIDNO:17、19、22、25、23及27的任一者的两个或三个CDR的可变区。本发明人类化抗RAGE抗体可如下构建其中第一条链的可变区(即，轻链可变区或重链可变区)经人类化，且其中第二条链的可变区未经人类化(即，在非人类物种中产生的抗体的可变区)。这些抗体是称为半人类化抗体的人类化抗体类型。嵌合及人类化抗RAGE抗体的恒定区可源自IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、及其任何同种型(例如，IgG的IgGl、IgG2、IgG3、或lgG4同种型)中任何一种的恒定区。己知许多抗体恒定区的氨基酸序列。人类同种型的选择及同种型中特定氨基酸的修饰可增强或消除宿主防御机制的活性并改变抗体生物分布。参见(瑞夫(Reff)等人，(2002)癌症控制(Ca"cwCo"&o/)9:152-66)。对于克隆编码免疫球蛋白恒定区的序列，可缺失内含子序列。嵌合及人类化抗RAGE抗体可使用所属
技术领域：
的技术人员所习知的标准技术来构建。例如，可变区可通过使编码可变区的重叠寡核苷酸一起复性并将其连接到含有人类抗体恒定区的表达载体中来制备。参见，例如，哈娄及莱恩(Harlow&Lane)(1988)抗体实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约及美国专利第4,196,265号；第4,946,778号；第5,091,513号；第5,132,405号；第5,260,203号；第5,677,427号；第5,892,019号；第5，985,279号；第6,054,561号。可制备包含两种完整四聚体抗体(包括同二聚体及异二聚体)的四价抗体(H4L4)，例如，如PCT国际公开案第WO02/096948号中所述。抗体二聚体也可经由在抗体恒定区中引入促进链间二硫键形成的半胱氨酸残基通过使用异双功能交联剂(沃尔夫(Wolff)等人(1993)癌症研究(Cawcer7仏)53:2560-5)或通过重组产生以包括双重恒定区(史蒂文森(Stevenson)等人，(1989)抗癌药物设计04""c^cwZ)^gDes.)3:219-30)来制备。本发明抗体的抗原结合片段可通过(例如)经截短抗体序列的表达或全长抗体的翻译后消化来制备。可容易地制备包括多种改变、取代、插入及缺失的本发明抗RAGE抗体的变体。例如，可针对用于抗体表达的细胞类型中的密码子使用对抗体序列进行优化。为延长抗体的血清半衰期，可将补救受体结合表位(若仍不存在)纳入到抗体重链序列中。参见美国专利第5,739,277号。可增强抗体稳定性的其它修饰包括用脯氨酸代替残基241上的丝氨酸对IgG4进行修饰。参见安高(Angal)等人，(1993)分子免疫学30:105-108。其它有用改变包括优化抗体与药物的偶联效率所需要的取代。例如，可对抗体羧基端进行修饰以包括用于药物附着的氨基酸，例如可添加一或多个半胱氨酸残基。可对恒定区进行修饰以引入用于结合碳水化合物或其它部分的位点。其它抗体变体包括达成改良功能特性的糖基化同种型。例如，Fc糖基化修饰可达成改变的效应子功能，例如，增加与Fcy受体结合及改良ADCC及/或可降低Clq结合及CDC(例如，Fc寡糖自复杂形式改变成高甘露糖或杂交类型可降低Clq结合及CDC(参见，例如，堪达(Kanda)等人，糖生物学(Glycobiology)，2007:17:104-118))。修饰可通过对细菌、酵母、植物细胞、昆虫细胞及哺乳动物细胞实施生物工程来进行；其也可通过在经基因工程构建的有机体中实施蛋白质或天然产物糖基化路径来进行。也可通过利用糖结合酶(糖基转移酶)可容忍大量不同底物的慷慨来改变糖基化。最后，所属
技术领域：
的技术人员可通过多种化学途径使蛋白质及天然产物糖基化用小分子、酶、蛋白质连接、代谢生物工程或全合成。N-聚糖加工的适宜小分子抑制剂实例包括澳粟精胺(CS)、几夫碱(Kifonensine)(KF)、脱氧甘露糖野尻霉素(Deoxymannojirimycin)(DMJ)、苦马豆素(Sw)、莫能星(Monensin)(Mn)。本发明抗RAGE抗体的变体可利用标准重组技术(包括定点诱变或重组克隆)来制造。抗RAGE抗体的多样化谱可经由基因排列及基因转变方法在转基因非人类动物中制备(美国专利公开案第2003/0017534号)，随后利用功能测定对其相关活性予以测试。在本发明特定实施例中，可如下获得变体利用用于CDR突变的亲和力成熟方案(杨(Yang)等人(1995)分子生物学254:392-403)、链改组(马克(Marks)等人(1992)生物技术(所otec/mo/ogyfTV19)10:779-783)、使用大肠杆菌增变菌株(洛(Low)等人(1996)分子生物学260:359-368)、DNA改组(帕藤(Patten)等人(1997)现代生物技术观点(Ci^r.Qp/".历ofec/mo/.)8:724-733)、噬菌体展示(汤普森(Thompson)等人(1996)分子生物学256:77-88)、及有性PCR(科瑞迈瑞(Crameri)等人(1998)自然391:288-291)。对于免疫疗法应用，相关功能测定包括本文下文中所述的与人类RAGE抗原特异性结合、抗体内化、及当投与到具有肿瘤的动物中时靶向肿瘤位点。本发明进一步提供表达本发明抗RAGE抗体的细胞及细胞系。代表性宿主细胞包括哺乳动物及人类细胞，例如CHO细胞、HEK-293细胞、HeLa细胞、CV-1细胞及COS细胞。在将异源构建体转化到宿主细胞中后产生稳定细胞系的方法已为所属
技术领域：
的技术人员所习知。代表性非哺乳动物宿主细胞包括昆虫细胞(波特(Potter)等人(1993)免疫学国际评论(/W.iev./画画/.)10(2隱3):103-112)。也可在转基因动物(侯德滨(Houdebine)(2002)现代生物技术观点，13(6):625-629)及转基因植物((Schillberg)等人(2003)细胞分子生命科学(Ce//Mo/.h/e60(3):433陽45)中制造抗体。如上文所论述，已通过(例如)缺失、添加或取代抗体的其它部分(例如，恒定区)'修饰的单克隆、嵌合及人类化抗体也在本发明范围内。例如，可如下对抗体进行修饰(i)通过缺失恒定区；(ii)通过用另一恒定区(例如，意欲延长抗体半衰期、增加抗体的稳定性或亲和力的恒定区、或来自另外物种或抗体种类的恒定区)代替所述恒定区；或(iii)通过修饰恒定区中的一或多个氨基酸以改变(例如)糖基化位点数目、效应子细胞功能、Fc受体(FcR)结合、补体固定(这些只是其中的一部分)。用于改变抗体恒定区的方法已为所属
技术领域：
的技术人员所习知。具有经改变功能的抗体(例如对于效应子配体(例如细胞上的FcR或补体的Cl组件)亲和力改变)可通过用不同残基代替抗体恒定部分中的至少一个氨基酸残基来制造(参见，例如，欧洲专利第388,151Al号、美国专利第5,624,821号及美国专利第5,648,260号，所有这些专利的内容都以引用方式并入本文中)。可以提及相似类型的改变，如果将其应用到鼠科动物或其它物种免疫球蛋白会降低或消除这些功能。例如，可通过以下来改变抗体(例如，IgG，例如人类IgG)Fc区域对于FcR(例如，FcYRl)或Clq结合的亲和力用在其侧链上具有合适官能度的残基代替特定残基、或引入带电荷的官能团(例如谷氨酸盐或天冬氨酸)、或也许芳香族非极性残基(例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或丙氨酸)(参见，例如，美国专利第5,624,821号)。可使抗体或其结合片段与细胞毒素、治疗剂或放射性金属离子偶联。在一个实施例中，偶联的蛋白质是抗体或其片段。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何药剂。非限制性实例包括卡奇霉素(calicheamidn)、紫杉醇(taxol)、细胞松弛素B(cytochalasinB)、短杆菌肽D(gramicidinD)、溴化乙锭、依米丁(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊武(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、长春亲万碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicin)、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、二,5基炭疽菌素二酮(dihydroxyanthracindione)、米托蒽酉昆(mitoxantrone)、光辉霉素(mithramycin)、放线菌素D(actinomycinD)、1-去氢睾留酮(l-dehydrotestosterone)、糖皮质激素、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)、嘌呤霉素(puromycin)、及类似物、或其同系物。治疗剂包括(但不限于)抗代谢物质(例如，甲氨蝶呤(methotrexate)、6-巯嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫代鸟嘌呤(6誦thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、及5-氟尿嘧啶氨烯咪胺(5-fluorouracildecarbazine))、烷基化剂(例如，氮芥(mechlorethamine)、苯丁酸氮芥(thioepachlorambucil)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BSNU)及洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、cyclothosphamide、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、链脲霉素(streptozotocin)、丝裂霉素C(mitomycinC)、及顺二氯二胺钼(cis-dichlorodiamineplatinum(II))(DDP)、顺钼)、蒽环抗生素(例如，柔红霉素及多柔比星)、抗生素(例如，更生霉素(dactinomycin)、博来霉素(bleomycin)、光辉霉素、及氨茴霉素(anthmmycin))、及抗有丝分裂剂(例如，长春新碱及长春碱)。将所述部分偶联到蛋白质上的技术已为所属
技术领域：
的技术人员所熟知。或者，现在能够产生转基因动物(例如，小鼠)，所述转基因动物经免疫后能够在不存在内源免疫球蛋白的情况下产生整组人类抗体。例如，已阐述嵌合及种系突变小鼠中抗体重链连接区(JM)基因的纯合缺失会导致完全抑制内源抗体产生。将人类种系免疫球蛋白基因阵列转入这些种系突变小鼠中可在受到抗原攻击后引起人类抗体的产生。参见(例如)耶科波维斯(Jakobovits)等人，美国国家科学院院刊卯:2551(1993);耶科波维斯等人，自然362:255-258(1993);布如格曼(Bruggermann)等人，免疫学年刊(YearinImmunol.)7:33(1983);及杜科萨(Duchosal)等人，自然355:258(1992)。人类抗体也可源自噬菌体展示文库(胡根布(Hoogenboom)等人，分子生物学227:381(1991);马克等人，分子生物学222:581-597(1991);沃恩(Vaughan)等人，自然生物技术(NatureBiotech)14:309(1996))。在某些实施例中，可将本发明抗体与作为组合疗法一部分的其它药剂组合投与。例如，在炎症性病状情况下，可将标的抗体与一或多种可用于治疗炎症性疾病或病状的其它药剂组合投与。在心脏血管疾病病状(且尤其那些起于认为具有实质炎症性组份的粥样硬化蚀斑者)情况下，可将标的抗体与一或多种可用于治疗心脏血管疾病的其它药剂组合投与。在癌症情况下，可将标的抗体与一或多种抗血管生成因子、化学治疗剂组合投与或标的抗体作为放射疗法的佐剂。进一步预见，可与许多不同癌症治疗剂组合的标的抗体的投与将作为癌症治疗方案的一部分。在IBD情况下，可将标的抗体与一或多种消炎剂一起投与，且另外可与改良的食养组合。抑制RAGE-LBE与RAGE-BP间相互作用的方法本发明包括抑制RAGE与RAGE-BP间的相互作用或调节RAGE活性的方法。优选地，所述方法可用于治疗RAGE相关病症。所述方法可包含投与本文所揭示的在RAGE下培育的抗体。所述方法包含投与与RAGE蛋白的一或多个表位特异性结合的抗体，所述RAGE蛋白具有SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、或SEQIDNO:13中所述的氨基酸序列。在再一实施例中，所述方法包含投与可抑制RAGE与一或多种RAGE-BP结合的化合物。识别所述化合物的实例性方法在下文中予以论述。在某些实施例中，所述相互作用是在活体外经抑制，例如在包含经纯化蛋白质、细胞、生物样品、组织、人工组织等的反应混合物中。在某些实施例中，所述相互作用是在活体内经抑制，例如，通过投与与RAGE结合的抗体或其RAGE结合片段。所述抗体或其片段与RAGE结合并抑制RAGE-BP的结合。本发明包括通过抑制RAGE与RAGE-BP间的相互作用或调节RAGE活性来预防或治疗RAGE相关病症的方法。所述方法包括以可有效抑制相互作用的量在足以预防或治疗所述病症的时间段内投与对抗RAGE的抗体。核酸核酸是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其呈单链、双链或三股螺旋形式的聚合物。除非明确限制，否则核酸可含有与参考天然核酸具有类似特性的天然核苷酸的已知类似物。核酸包括基因、cDNA、mRNA及cRNA。核酸可合成，或可源自任何生物来源(包括任何有机体)。本发明的代表性核酸包含编码SEQIDNO:6、8、10、12中任一者所示RAGE的核苷酸序列(对应于所揭示的编码狒狒、食蟹猴及兔RAGE的cDNA)或编码SEQIDNO:15中所示RAGE的核苷酸序歹iK对应于编码狒狒RAGE的基因组DNA序列)。本发明核酸也包含编码SEQIDNO:16-49中所示任一抗体可变区氨基酸序列的核苷酸序列。本发明核酸也可包含与SEQIDNO:6、8、10、12及15中任一者基本上一致的核苷酸序列，包括与SEQIDNO:6、8、10、12及15中任一者至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、或99.9%—致的核苷酸序列。本发明核酸也可包含编码RAGE蛋白的核苷酸序列，所述RAGE蛋白具有与SEQIDNO:7、9、11及13中所示的任一氨基酸序列基本上一致的氨基酸序列，所述核苷酸序列包括与SEQIDNO:7、9、11及13中任一者至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、或99.9%—致的核苷酸序列。本发明核酸也可包含编码抗RAGE抗体可变区的核苷酸序列，所述抗RAGE抗体可变区具有与SEQIDNO:16-49中所示的任一氨基酸序列基本上一致的氨基酸序歹U，所述核苷酸序列包括编码与SEQIDNO:16-49中任一者至少85。/。、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、或99.9%—致的氨基酸序列的核苷酸序列。如本文下文中阐述利用序列比较算法使用编码全长可变区的SEQIDNO:16-49中的任一序列(编码具有SEQIDNO:16-49中所示任一序列的全长可变区的核苷酸序列)作为询问序列或通过目测来比较序列的最大对应性。基本上一致的序列可为多形态序列，B卩，群体中的替代序列或等位基因。等位基因差异可小至一个碱基对。基本上一致的序列也可包含诱变序列，包括包含沉默突变的序列。突变可包含改变一或多个残基、缺失一或多个残基或插入一或多个额外残基。基本上一致的核酸也识别为与SEQIDNO:6、8、10、12、或15中任一者的全长或编码SEQIDNO:7、9、11及13中所示RAGE氨基酸序列或编码SEQIDNO:16-49中所示抗体可变区氨基酸序列的任一核苷酸序列的全长在严格条件下特异性杂交或基本上杂交的核酸。在核酸杂交的上下文中，所比较的两个核酸序列可称为探针及靶。探针是参考核酸分子，且靶是测试核酸分子，通常见于核酸分子的不均一群体中。耙序列与测试序列同义。对于杂交研究，有用探针与本发明核酸分子的至少约14个至40个核苷酸序列互补或相仿。优选地，探针包含SEQIDNO:6、8、10、12、或15中任一者、或编码SEQIDNO:7、9、11及13中所示RAGE氨基酸序列、或编码SEQIDNO:16-49中所示抗体可变区氨基酸序列的任一核苷酸序列的14个至20个核苷酸、或(若期望)甚至更长，例如30个、40个、50个、60个、100个、200个、300个、或500个核苷酸或至多全长。所述片段可容易地通过(例如)片段的化学合成、通过使用核酸扩增技术或通过将所选序列引入到用于重组产生的重组载体中来制备。特异性杂交是指在严格条件下分子仅与特定核苷酸序列结合、形成双链或杂交，当所述序列存在于复杂核酸混合物(例如，全细胞DNA或RNA)中时。特异性杂交可视杂交条件的严格性而容纳探针与靶序列间的错配。在诸如南方及北方墨点分析等核酸杂交实验上下文中的严格杂交条件及严格杂交洗涤条件是序列及环境二者依赖性的。较长的序列将在较高温度下特异性杂交。核酸杂交的详尽指导可见于提森(Tijssen)(1993)生物化学及分子生物学实验室技术-与核酸探针杂交(L^mMyTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes),第I部分第2章，爱思唯尔(Elsevier)，纽约。通常，所选高度严格杂交及洗涤条件为在已确定的离子强度和pH下比特定序列的热熔点(TJ低约5°C。一般来说，在严格条件下探针将与其靶子序列特异性杂交，而不与其它序列杂交。Tm是在其下50%的耙序列与完美匹配的探针杂交的温度(在已确定的离子强度和pH下)。对于特定探针，所选非常严格的条件是等于Tm。具有多于约100个互补残基的互补核酸的南方或北方墨点分析的严格杂交条件的实例是在50%甲酰胺与1mg肝素中于42。C下杂交过夜。高度严格洗涤条件的实例是在0.1XSSC中于65°C下15分钟。严格洗涤条件的实例是在0.2XSSC缓冲液中于65'C下15分钟。参见萨姆布鲁克(Sambrook)等人编辑，(1989)分子克隆实验室手册(MolecularCloning:ALaboratoryManual),冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约对于SSC缓冲液的阐述。通常，高度严格洗涤之前为低度严格洗漆以清除背景探针信号。对于多于约100个核苷酸的双链体来说，培养基严格洗涤条件的实例是在IXSSC中于45'C下15分钟。对于多于约100个核苷酸的双链体来说，低度严格洗漆的实例是在4X至6XSSC中于40'C下15分钟。对于较短探针(例如，约10个至50个核苷酸)，严格条件一般涉及在pH7.0-8.3下小于约lMNa+离子的盐浓度、一般约0.01至lMNa+离子浓度(或其它盐)且温度一般为至少约3(TC。严格条件也可经添加诸如甲酰胺等去稳定剂达成。通常来说，在特定杂交分析中信噪比为对于无关探针所观察者2-倍(或更高)表示检测到特异性杂交。以下是可用于识别与本发明参考核苷酸序列基本上一致的核苷酸序列的杂交及洗涤条件的实例探针核苷酸序列优选与靶核苷酸序列在7M十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、lmMEDTA中于5CTC下杂交，然后在2XSSC、0.1%SDS中于5(TC下洗涤；更优选地，探针与靶序列在7。/。十二垸基硫酸钠(SDS)、0.5MNaP04、lmMEDTA中于50。C下杂交，然后在1XSSC、0.1Q/。SDS中于50。C下杂交；更优选地，探针与靶序列在7。/。十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、lmMEDTA中于5(TC下杂交，然后在0.5XSSC、0.1。/。SDS中于5(TC下洗涤；更优选地，探针与耙序列在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、lmMEDTA中于50。C下杂交，然后在0.1XSSC、0.1%SDS中于5(TC下洗涤；更优选地，探针与靶序列在7。/。十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaP04、lmMEDTA中于50。C下杂交，然后在O.IXSSC、0.1%SDS中于65"下洗涤。两个核酸序列基本上一致的进一步指示是由核酸编码的蛋白质基本上一致、共享总体三维结构、或为生物功能等效物。这些术语在本文下文中进一步予以定义。如果对应蛋白质基本上一致，则在严格条件下彼此不杂交的核酸分子仍基本上一致。此可在(例如)两个核苷酸序列包含基因代码允许的保守取代变体时发生。保守取代变体是具有简并密码子取代的核酸序列，其中一或多个所选(或全部)密码子的第三位置经混合碱基及/或脱氧肌苷残基取代。参见巴特兹(Batzer)等人(1991)核酸研究(M/c/e/cA油L)19:5081;大塚(Ohtsuka)等人(1985)生物化学C/扁.C/2，.)260:2605-2608;及罗斯里尼(Rossolini)等人(1994)分子细胞探针(Mo/.Ce〃尸ra6e力8:91-98。本发明核酸也包含与SEQIDNO:6、8、10、12、或15中任一者互补的核酸、或编码SEQIDNO:7、9、11及13中所示RAGE氨基酸序列或编码SEQIDNO:16-49中所示抗体可变区氨基酸序列的核苷酸序列及其互补序列。互补序列是包含能够在碱基对间形成氢键后彼此配对的反向平行核苷酸序列的两个核苷酸序列。本文所用的术语互补序列意指基本上互补的核苷酸序列(此可通过下文所述的相同核苷酸比较方法评价)或定义为能够在本文所述那些相对严格条件下与所研究核酸节段杂交。互补核酸节段的特定实例是反义寡核苷酸。子序列是包含较长核酸序列的一部分的核酸序列。实例性子序列是本文上文所述的探针或引物。本文所用的术语引物是指包含所选核酸分子的约8个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、优选10-20个核苷酸、且更优选20-30个核苷酸的连续序列。本发明引物涵盖具有足够长度及合适序列以在本发明核酸分子上开始聚合的寡核苷酸。伸长序列包含纳入到核酸中的额外核苷酸(或其它类似分子)。例如，聚合酶(例如，DNA聚合酶)可在核酸分子的3'端添加序列。另外，可使核苷酸序列与其它DNA序列组合，例如启动子、启动子区域、增强子、聚腺苷酸化信号、内含子序列、额外限制性酶位点、多个克隆位点、及其它编码节段。因此，本发明也提供包含所揭示核酸的载体，包括用于重组表达的载体，其中使本发明核酸与功能启动子可操作连接。当与核酸可操作连接时，启动子与核酸在功能上组合，由此启动子区域控制并调控核酸转录。载体是指能够在宿主细胞中复制的核酸，例如质粒、粘粒、及病毒载体。本发明核酸可克隆、合成、改变、诱变或其组合。可用于分离核酸的标准重组DNA及分子克隆技术已为所属
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的技术人员所习知。定点诱变以产生碱基对改变、缺失或小插入也已为所属
技术领域：
的技术人员所习知。参见，例如，萨姆布鲁克等人(编辑)(1989)分子克隆实验室手册。冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；斯哈维(Silhavy)等人(1984)基因融合实验(Experimentsw池s)。冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；格洛夫及黑穆斯(Glover&Hames)(1995)DNA克隆实用方法(DNACloning:APracticalApproach),第2版，牛津大学出版社IRL出版社，牛津/纽约；奥苏贝尔(Ausubel)(编辑)(1995)分子生物学简略方案(ShortProtocolsinMolecularBiology),第3版，威立(Wiley)，纽约。治疗方法本发明是关于且包括治疗RAGE相关病症(RAGE-related或RAGE-associated)的方法。RAGE相关病症的特征通常在于包括其中受侵袭细胞展示RAGE或一或多种RAGE配体的提高表达的任何病症。RAGE相关病症也可称为可通过降低RAGE功能来治疗(即，可消除或改善一或多个症状)的任何病症。例如，可通过投与破坏RAGE与RAGE-BP间相互作用的药剂(例如RAGE抗体)来降低RAGE功能。RAGE的增加表达与数种病理学状态有关，例如糖尿病性血管病变、肾病、视网膜病变、神经病变、及包括血管壁免疫/炎症性反应及脓毒症在内的其它病症。RAGE配体在受许多炎症性病症侵袭的组织中产生，所述炎症性病症包括关节炎(例如风湿性关节炎)。在糖尿病性组织中，RAGE产生认为是由晚期糖化终产物的过度产生造成。此导致氧化性应激及导致糖尿病患者血管疾病的内皮细胞功能障碍。本发明包括治疗个体炎症及特征在于炎症性细胞因子级联活化的疾病或病状的方法，其包含投与有效量的抗RAGE抗体或其RAGE结合片段及/或包含抗RAGE抗体或其RAGE结合片段的组合物(例如，医药组合物)。例如，已显示S100/钙粒蛋白包含密切相关的特征在于由结合肽连接的两个EF-手区域的钙结合多肽家族(例如，参见斯卡菲尔(Schafer)等人，1996，生物化学科学走向(TIBS)，21:134-140;齐默(Zimmer)等人，1995，脑研究公报(BrainRes.Bull.)，37:417-429;哈穆斯(Rammes)等人，1997，生物化学，272:9496-9502;鲁格瑞(Lugering)等人，1995，欧洲临床研究(Eur.J.Clin.Invest.),25:659-664)。尽管其缺少信号肽，但早已习知S100/l丐粒蛋白可进到细胞外隙中，尤其慢性免疫/炎症性反应位点，如在囊性纤维化及风湿性关节炎中。RAGE是S100/钙粒蛋白家族中许多成员的受体，其介导所述S100/钙粒蛋白家族成员对诸如淋巴细胞及单核吞噬细胞等细胞的促炎性效果。而且，对迟发型过敏反应、IL-10裸小鼠结肠炎、胶原诱导关节炎、及实验型自身免疫性脑炎模型的研究表明RAGE-配体相互作用(推测与S-100/钙粒蛋白)在炎症性级联中具有最接近作用。适于本文所述治疗方法的炎症性病状可为其中炎症性细胞因子级联经活化者。炎症性细胞因子级联可造成全身性反应，与脓毒性休克所发生的一样。本发明抗RAGE抗体及其RAGE结合片段可用于治疗脓毒症、脓毒性休克及全身性利斯特菌病。脓毒症是对感染的全身性炎症性反应，且会伴随器官功能障碍、灌注不足或低血压。在脓毒性休克(严重形式的脓毒症)中，尽管流体复苏充足，但仍引起低血压。利斯特菌病是由进食经细菌单核细胞增生性利斯特菌(Listeriamonocytogenes)污染的食物而造成的严重感染。已显示RAGE介导脓毒性休克的致死效应(里来塞克(Liliensek)等人，2004，113:11641-50)。脓毒症的生理学极为复杂，表现为全身性炎症及器官功能障碍，包括体温、心脏血管参数及白细胞计数异常；肝酶提高及大脑功能改变。脓毒症是对夸大及失调的感染或刺激的反应。脓毒症的鼠科动物CLP模型导致多种微生物感染，伴有腹部脓肿及菌血症，并重新产生人类疾病中所观察到的血液动力学及代谢阶段。用本文所述脓毒症的鼠科动物CLP模型获得的实验结果显示RAGE在脓毒症发病机制中起重要作用。数据也展示在手术时以及在手术后至多36小时时投与与RAGE特异性结合的抗RAGE抗体可对小鼠提供显著治疗性保护，此通过提高的存活率及提高的病理学分数证实。可用于治疗脓毒症、利斯特菌病、及其它RAGE相关疾病的抗体可为与RAGE的V结构域结合并防止RAGE配体或结合配偶体与RAGE蛋白结合的抗体。本发明抗体及方法治疗或预防的炎症性病状可由局限炎症性细胞因子级联介导，如风湿性关节炎。可使用本发明抗RAGE抗体及其RAGE结合片段及/或组合物有效治疗的炎症性病状的非限制性实例包括(例如)与胃肠道及有关组织相关的疾病(例如肠梗阻、阑尾炎、消化性溃疡、胃溃疡及十二指肠溃疡、腹膜炎、胰腺炎、溃疡性、假膜性、急性及缺血性结肠炎、憩室炎、会厌炎、失弛缓症、胆管炎、胆囊炎、腹部疾病、肝炎、克隆氏病、肠炎、及惠普尔氏病(Whipple'sdisease));全身性或局部性炎症性疾病及病状(例如哮喘、过敏症、过敏性休克、免疫复合物疾病、器官缺血、再灌注损伤、器官坏死、花粉症、脓毒症、败血症、内毒素性休克、恶病质、体温过高、嗜酸细胞性肉芽肿、肉芽肿病、及肉样瘤病)；与泌尿生殖系统及有关组织相关的疾病(例如脓毒性流产、附睾炎、阴道炎、前列腺炎、及尿道炎)；与呼吸系统及有关组织相关的疾病(例如支气管炎、肺气肿、鼻炎、囊性纤维化、肺炎、成人呼吸性窘迫综合征、硅酸盐沉着病、肺泡炎、细支气管炎、咽炎、胸膜炎、及鼻窦炎)；由各种病毒(例如流感病毒、呼吸道合胞病毒、HIV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒及疱疹病毒)、细菌(例如弥散性菌血症、登革热(Denguefever))、真菌(例如念珠菌病)及原生动物及多细胞寄生虫(例如疟疾、丝虫病、阿米巴病(amebiasis)及包虫囊肿)感染引起的疾病；皮肤的皮肤病学疾病及病状(例如烧伤、皮炎、皮肌炎、晒伤、荨麻疹疣、及风疹块)；与心脏血管系统及有关组织相关的疾病(例如狭窄、再狭窄、血管炎、脉管炎、心内膜炎、动脉炎、动脉粥样硬化、血栓性静脉炎、心包炎、充血性心力衰竭、心肌炎、心肌缺血、结节性动脉周围炎、及风湿热)；与中枢或周围神经系统及有关组织相关的疾病(例如脑膜炎、脑炎、多发性硬化、脑梗死、脑栓塞、格-巴二氏综合征(Guillame-Barresyndrome)、神经炎、神经痛、脊髓损伤、麻痹、及葡萄膜炎)；骨、关节、肌肉及结缔组织疾病(例如各种关节炎及关节痛、骨髓炎、筋膜炎、佩吉特氏病(Paget'sdisease)、痛风、牙周病、风湿性关节炎、及滑膜炎)；其它自身免疫性及炎症性病症(例如重症肌无力、甲状腺炎、全身性红斑狼疮、肺出血肾炎综合征(Goodpasture'ssyndrome)、贝赫切特综合征(Behcets'ssyndrome)、同种异体移植物排斥、移植物抗宿主病、I型糖尿病、强直性脊柱炎、贝格尔氏病(Berger'sdisease)、及莱特尔综合征(Retier'ssyndrome));以及各种癌症、肿瘤及增殖性病症(例如霍奇金病(Hodgkinsdisease));及任何情形下对任何原发性疾病的炎症性或免疫宿主反应。本发明抗RAGE抗体及其RAGE结合片段可用于治疗癌症。肿瘤细胞显示RAGE配体的增加表达，所述RAGE配体尤其为已显示与RAGE相互作用的两性蛋白，其为高迁移率族I非组蛋白染色体DNA结合蛋白(萝芙拉(Rauvala)等人，生物化学，262:16625-16635(1987);帕克嫩(Parkikinen)等人，生物化学，268:19726-19738(1993))。两性蛋白促进神经突增生，以及用作纤维蛋白溶解系统中蛋白酶复合物装配的表面(也称为有助于细胞运动性)，此表明癌症也是RAGE相关病症。慢性炎症的氧化效应及其它方面也对某些肿瘤的生成具有促进效果。另外，例如，已在原发性肿瘤模型(C6胶质瘤)、路易士(Lewis)肺转移模型(田口(Taguchi)等人，2000，自然405:354-360)、及表达v-Ha-ras转基因的小鼠自发产生乳头状瘤(莱德(Leder)等人，1990，国家科学院院刊，87:9178-9182)中观察到阻断RAGE的局部肿瘤生长抑制效果。本发明抗体或其结合片段可用于治疗或预防糖尿病、糖尿病并发症及与糖尿病相关的病理学病状。已显示，最终导致形成晚期糖化终产物(AGE)的大分子的非酶糖基化在炎症位点、在肾衰竭中、在高血糖症及与全身性或局部性氧化剂应激相关的其它病状存在下增强(戴尔(Dyer)等人，临床研究(J.Clin.Invest.),91:2463-2469(1993);瑞迪(Reddy)等人，生物化学(Biochem.)，34:10872-10878(1995);戴尔等人，生物化学，266:11654-11660(1991);德根哈特(Degenhardt)等人，细胞和分子生物学(CellMol.Biol.)，44:1139-1145(1998))。AGE在脉管系统中的堆积可聚集发生，如在由可见于患有与透析相关淀粉样变性的患者中的AGE-(32-微球蛋白构成的关节淀粉样蛋白(宫田(Miyata)等人，临床研究，92:1243-1252(1993);宫田等人，临床研究，98:1088-1094(1996))，或(通常来说)如患有糖尿病患者的脉管系统及组织所例示(施密特(Schmidt)等人，自然医学(NatureMed.)，1:1002-1004(1995))。AGE在糖尿病患者中的时间进行性堆积表明内源清除机制在.AGE沉积位点处不能有效起作用。所述堆积的AGE能够通过数种机制改变细胞特性。尽管RAGE在正常组织及脉管系统中以低水平表达，但己显示在其中受体配体堆积的环境中RAGE上调(李(Li)等人，生物化学，272:16498-16506(1997);李等人，生物化学，273:30870-30878(1998);田中(Tanaka)等人，生物化学，275:25781-25790(2000))。RAGE表达在糖尿病性脉管系统的内皮、平滑肌细胞及浸润单核吞噬细胞中增加。而且，细胞培养研究已展示AGE-RAGE相互作用造成在血管内平衡中极为重要的细胞特性变化。抗RAGE抗体或其结合片段也可用于治疗勃起功能障碍。RAGE活化经由NADH氧化酶样酶产生氧化剂，由此抑制一氧化氮循环，一氧化氮是导致阴茎勃起的海绵体平滑肌松弛的主要刺激物。通过抑制RAGE信号转导路径活化，可减少氧化剂产生。本发明抗体或其结合片段可用于治疗或预防动脉粥样硬化。已显示，缺血性心脏病在糖尿病患者中发病率尤其高(罗伯逊(Robertson)等人，实验室研究(LabInvest),18:538-551(1968);卡奈尔(Kannel)等人，美国医学会会刊(J.Am.Med.Assoc.),241:2035-2038(1979);卡奈尔等人，糖尿病护理(Diab.Care)，2:120-126(1979))。另外，研究显示，动脉粥样硬化在糖尿病患者中比在不患有糖尿病的患者中更加速且更为广泛(参见，例如沃勒(Waller)等人，美国医学(Am.JMed.)，69:498-506(1980);科瑞奥(Crall)等人，美国医学，64:221-230(1978);海贝(Hamby)等人，胸科(Chest.)2:251-257(1976);及普瑞拉(Pyorala)等人，糖尿病代谢评论(Diab.Metab.Rev.)，3:463-524(1987))。尽管在糖尿病环境中加速动脉粥样硬化的原因有很多，但已显示AGE降低可减少蚀斑形成。因此，可用本发明组合物治疗或预防的RAGE相关病症的列示包括急性炎症性疾病(例如脓毒症)、休克(例如，脓毒性休克、出血性休克)、慢性炎症性疾病(例如风湿性及银屑病关节炎、骨关节炎、溃疡性结肠炎、过敏性肠病、多发性硬化、银屑病、狼疮、全身性狼疮肾炎、及炎症性狼疮肾炎、及其它自身免疫性疾病)、心脏血管疾病(例如，动脉粥样硬化、中风、脆性蚀斑病症、绞痛症及再狭窄)、糖尿病(且尤其糖尿病患者的心脏血管疾病)、糖尿病并发症、勃起功能障碍、癌症(例如，肺癌、鳞状上皮细胞癌、前列腺癌、人类胰腺癌、肾细胞癌黑素瘤)、脉管炎及其它脉管炎综合征(例如坏死性血管炎病)、肾病、视网膜病变、及神经病变。本发明提供抗RAGE抗体及RAGE结合片段的活体内投与。标的抗体可以医药组合物形式投与，并且也可与一或多种额外药剂一起投与。标的抗体的投与可为治疗特定病状的治疗方案的一部分。可通过投与单独抗体或通过投与标的抗体与其它药剂的组合予以治疗的病状包括RAGE相关病症。举例来说，RAGE相关病症包括'(但不限于)风湿性关节炎、骨关节炎、炎症性肠病、动脉粥样硬化、脉管炎及其它脉管炎综合征(例如坏死性血管炎病)、阿兹海默氏症(Alzheimer'sdisease)、癌症、糖尿病并发症(例如糖尿病性视网膜病变)、自身免疫性疾病(例如银屑病及狼疮)。RAGE相关病症进一步包括急性炎症性疾病(例如，脓毒症)、慢性炎症性疾病、及经炎症恶化的其它病状(即，其症状可通过减轻炎症而改善)。基于抗体组合物的投与方法可为所属
技术领域：
的技术人员所熟知的大量方法中的任一种方法。这些方法包括局部性或全身性投与且进一步包括真皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、经口、及鼻内途径投与，包括使用喷雾器及吸入剂。另外，可能期望通过任何适宜途径(包括心室内及鞘内注射)将本发明医药组合物引入到中枢神经系统中。心室内注射可借助(例如)附接到储集器(例如奥马耶储集器(Ommayareservoir))上的心室内导管。引入方法也可通过可再装载或生物可降解的装置(例如，储槽)来实施。而且，预期投与也可通过涂覆装置、植入物、支撑架或假肢发生。，例如，受诸如风湿性关节炎及骨关节炎等关节病状严重损伤的软骨可整体或部分地由各种假肢代替。存在多种适宜可移植材料，包括那些基于以下者胶原-糖胺聚糖模板(斯通(Stone)等人(1990)临床骨科及相关研究(Clin.Orthop.Relat.Res.)252:129)、经分离软骨细胞(格兰德(Grande)等人(1989)骨科研究(JOrthopRes)7:208;及塔利戈瓦(Taligawa)等人(1987)骨与矿物质研究(BoneMiner)2:449)、及附接到天然或合成聚合物上的软骨细胞(瓦莉塔尼(Walitani)等人(1989)骨及关节外科(JBoneJtSurg)71B:74;瓦肯提(Vacanti)等人(1991)塑料及修补外科学(PlastReconstrSurg)88:753;冯'施罗德(vonSchroeder)等人(1991)生物医学材料研究(JBiomedMaterRes)25:329;福瑞德(Freed)等人(1993)生物医学材料研究27:11;及瓦肯提等人，美国专利第5,041,138号)。例如，软骨细胞可在生物可降解、生物相容性高度多孔支架上的培养物中生长，所述支架自诸如聚乙醇酸、聚乳酸、琼脂糖凝胶等聚合物或随时间随聚合物骨架水解成无害单体而降解的其它聚合物形成。基质经设计应允许充足的营养物及气体交换到细胞直至发生移植物植入。可在活体外培养细胞，直至待要植入的细胞生长到充足细胞体积及密度。所述基质的一个优点是其可基于各自情况经浇注或塑造成期望形状，因此最终产品精密地类似(例如)患者自己的耳朵或鼻子，或可使用允许在植入时进行处理(如在关节处)的挠性基质。这些及其它植入物及假肢可用标的抗体或其结合片段进行处理并用以投与标的抗体或其结合片段。例如，可将包括抗体或结合片段的组合物施加到或涂覆于植入物或假肢上。这样，所述抗体或其片段可直接投与到特定受侵袭组织(例如，受损伤的关节)上。标的抗体可作为组合疗法的一部分与其它药剂一起投与。组合疗法是指两种或更多种不同治疗化合物的任何组合投与形式，由此当先前投与的治疗化合物在体内仍有效时投与第二种化合物(例如，所述两种化合物在患者中同时有效，此包括所述两种化合物的协同效应)。例如，不同治疗化合物可以相同调配物或以单独调配物相伴或依序投与。因此，接受所述治疗的个体可具有不同治疗化合物的组合(联合)效应。例如，在炎症性病状情况下，可将标的抗体与一或多种可用于治疗炎症性疾病或病状的其它药剂组合投与。可用于治疗炎症性疾病或病状的药剂包括(但不限于)消炎剂或消炎药。消炎药包括(例如)糖皮质激素，例如可的松(cortisone)、氢化可的松(hydrocortisone)、泼尼松(prednisone)、泼尼松龙(prednisolone)、氟可特龙(fluorcortolone)、曲安西龙(triamcinolone)、甲泼尼龙(methylprednisolone)、泼尼立定(prednylidene)、巾白拉米松(paramethasone)、地塞米松(dexamethasone)、倍他米松(betamethasone)、倍氯米松(beclomethasone)、氟泼尼定(fluprednylidene)、脱氧米塞松(desoxymethasone)、肤轻松(fluocinolone)、氟米松(flumethasone)、二氟可龙(diflucortolone)、氯可托龙(clocortolone)、氯倍他索(clobetasol)及氟考丁酯(fluocortinbutylester);免疫抑制剂，例如抗TNF剂(例如，依那西普(etanercept)、英夫利昔单抗(infliximab))及IL-l抑制剂；青霉胺(penicillamine);非类固醇类消炎药物(NSAID)，其包括消炎、止痛、及退热药物，例如水杨酸、塞来考昔(celecoxib)、氟苯水杨酸及来自经取代苯乙酸盐或2-苯基丙酸盐者，例如阿氯芬酸(alclofenac)、异丁芬酸(ibutenac)、布洛芬(ibuprofen)、科林耐酸(clindanac)、苯克洛酸(fenclorac)、酮洛芬(ketoprofen)、非诺洛芬(fen叩rofen)、吲哚洛芬(indoprofen)、芬氯酸(fenclofenac)、双氯芬酸(diclofenac)、氟比洛芬(flurbiprofen)、哌洛芬(piprofen)、萘普生(naproxen)、苯噁洛芬(benoxaprofen)、卡洛芬(carprofen)及环洛芬(cicloprofen);昔康(oxican)衍生物，例如吡罗昔康(piroxican);邻氨基苯甲酸衍生物，例如甲芬那酸(mefenamicacid)、氟芬那酸(flufenamicacid)、氟芬那酸(tolfenamicacid)及甲氯芬那酸(meclofenamicacid)、经苯胺基取代的烟酸衍生物，例如灭酸酯类尼氟灭酸(niflumicacid)、氯尼辛(clonixin)及氟尼辛(flunixin);杂芳基乙酸，其中杂芳基为2-吲哚-3-基或吡咯-2基，例如吲哚美辛(indomethacin)、奥沙美辛(oxametacin)、B引四唑(intrazole)、阿西美辛(acemetacin)、桂美辛(cinmetacin)、佐美酸(zomepirac)、托美丁(tolmetin)、克哌洛酸(colpirac)及噻洛芬酸(tiaprofenicacid);舒林酸(sulindac)类型的idenylaceticacid;具有止痛活性的杂芳基氧基乙酸，例如苄达酸(bendazac);保泰松(phenylbutazone);依托度酸(etodolac);萘丁美酮(nabumetone);及缓解疾病的抗风湿性药物(DMARD)，例如甲氨蝶呤、氯金化钠、羟氯喹(hydroxychloroquine)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、环孢素(ciclosporin)、硫唑嘌呤(azathioprine)、及来氟米特(leflunomide)。可用于治疗炎症性疾病或病状的其它治疗剂包括抗氧化剂。抗氧化剂可为天然或合成抗氧化剂。抗氧化剂是(例如)超氧化物歧化酶(SOD)、21-氨基甾类/氨基色满、维生素C或E等。许多其它抗氧化剂已为所属
技术领域：
的技术人员所熟知。可与许多不同消炎剂组合的标的抗体可用作炎症性病状治疗方案的一部分。例如，可将标的抗体与一或多种NSAID、DMARD或免疫抑制剂组合投与。在所述应用的一个实施例中，可将标的抗体或其片段与甲氨蝶呤组合投与。在另一实施例中，可将标的抗体与TNF-ct抑制剂组合投与。在心脏血管疾病病状且尤其那些起于粥样硬化蚀斑(认为其具有实质炎症性组份)的病状的情况下，可将标的抗体与一或多种可用于治疗心脏血管疾病的其它药剂组合投与。可用于治疗心脏血管疾病的药剂包括(但不限于)(3-阻断剂，例如卡维地洛(carvedilol)、美托洛尔(metoprolol)、布新洛尔(bucindolol)、比索洛尔(bis叩rolol)、阿替洛尔(atenolol)、普萘洛尔(propranolol)、纳多洛尔(nadolol),噻吗洛尔(timolol)、吲哚洛尔(pindolol)、及拉贝洛尔(labetalol);抗血小板剂，例如阿司匹林(aspirin)及噻氯匹定(ticlopidine);血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂，例如卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)、赖诺普利(lisin叩ril)、贝那普利(benazepril)、福辛普禾lj(fosin叩ril)、喹那普禾U(quinapril)、雷米普利(ramipril)、螺普利(spirapril)、及莫昔普利(moexipril);及降脂剂，例如美伐他汀(mevastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、普伐他汀(pravastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、及罗舒伐他汀(rosuvastatin)。在癌症情况下，可将标的抗体与一或多种抗血管生成因子、化学治疗剂组合投与，或标的抗体作为放射疗法的佐剂。进一步预见，可与许多不同癌症治疗剂组合的标的抗体的投与将作为癌症治疗方案的一部分。可将抗体或其结合片段与细胞毒素或放射疗法连接或结合以杀死表达RAGE的癌细胞。可将所述抗体或其片段投与给患者，由此所述抗体将与表达RAGE的癌细胞结合。在IBD情况下，可将标的抗体与一或多种消炎剂一起投与，且另外可与改良的食养组合。对于治疗脓毒症及脓毒症相关病症或病状(例如脓毒性休克)以及对于治疗全身性利斯特菌病，可将本发明抗RAGE抗体与治疗脓毒症及脓毒症相关病症或病状或治疗全身性利斯特菌病的其它药剂及治疗方法组合投与。例如，脓毒症或利斯特菌病可通过投与标的抗体与为患者特定症状及状态标准护理的抗生素及/或其它医药组合物来治疗。一方面，本发明也提供抑制个体中AGE与RAGE相互作用的方法，其包含向所述患者投与治疗有效量的通过本发明方法识别的化合物。治疗有效量是能够防止个体中AGE/RAGE相互作用的量。因此，此量将随所治疗的个体而变化。化合物的投与可为每小时一次、每天一次、每周一次、每月一次、每年一次或单次事件。例如，化合物的有效量可包含约1pg/kg体重至约100mg/kg体重。在一个实施例中，化合物的有效量包含约1叱/kg体重至约50mg/kg体重。在又一实施例中，化合物的有效量包含约10pg/kg体重至约10mg/kg体重。实际有效量将使用业内标准方法通过剂量/反应分析来确定(约翰逊(Johnson)等人，糖尿病，42:1179，(1993))。因此，如所属
技术领域：
的技术人员所习知，有效量将随化合物的生物利用性、生物活性及生物可降解性而定。例如，将本发明抗RAGE抗体及组合物以足以抑制促炎性细胞因子自细胞释放及/或治疗炎症性病状的量投与给需要其的患者。本发明包括将促炎性细胞因子释放抑制至少10%、20%、25%、50%、75%、80%、90%、或95%，如使用本文所述或所属
技术领域：
的技术人员所习知的其它方法所评价。在实施例中，个体是动物。在实施例中，个体是人类。在实施例中，个体患有AGE相关疾病，例如糖尿病、淀粉样变性、肾衰竭、衰老或炎症。在另一实施例中，个体包含患有阿兹海默氏症的个体。在替代实施例中，个体包含患有癌症的个体。在再一实施例中，个体包含患有全身性红斑狼疮或炎症性狼疮肾炎的个体。可将标的抗体或其结合片段以约1pg/kg体重至约100mg/kg体重的剂量投与。在一个实施例中，化合物的有效量包含约1ng/kg体重至约50mg/kg体重。治疗的持续时间频率将尤其随特定疾病状态以及患者状态而定。生物标记可对测量脓毒症疾病活动的生物标记(例如CRP、IL-6、原降钙素、原肾上腺髓素、及聚沉参数(D-二聚体、PAI-1水平、蛋白质-C、纤维蛋白原))予以监测以定性个体的疾病状态及用本发明抗RAGE抗体治疗的潜在及实际反应。另外，在血衆中可发现呈自细胞膜分泌形式或裂解形式的可溶性RAGE(sRAGE)。已研发出用于测量sRAGE血浆含量的测定法且也可用于定性个体。由于本发明抗体与sRAGE结合，因此若存在的sRAGE浓度接近抗体浓度，则患者血浆中存在的sRAGE可能影响用本发明抗体治疗的药效学。药物筛选分析在某些实施例中，本发明提供用于识别抑制RAGE-BP(例如，HMGB1、AGE、A|3、SAA、S100、两性蛋白、S100P、S100A、S100A4、A100A8、S100A9、CRP、卩2-整联蛋白、Mac-l、及p150，95)与受体多肽(例如，如上文所述的RAGE或RAGE-LBE)结合的测试抗体的测定法。在某些实施例中，所述测定法检测调节RAGE受体信号转导活性的测试抗体，所述RAGE受体信号转导活性是由选自由下列组成的群组的RAGE-BP诱导HMGB1、AGE、A卩、SAA、S100、两性蛋白、S100P、S100A、S100A4、A100A8、S100A9、CRP、卩2-整联蛋白、Mac-l、及pl50,95。所述信号转导活性包括(但不限于)与其它细胞组份结合、活化酶(例如促分裂原活化蛋白激酶(MAPK))、活化NF-KB转录活性及诸如此类。上述RAGE结合蛋白与信号转导路径有关，所述信号转导路径与包括癌细胞生长在内的细胞生长及增殖有关。例如，S100P是钙结合蛋白S100家族(大于20个成员)的成员且是首先自胎盘分离出的95氨基酸蛋白质。所有胰腺肿瘤中大于90%的胰腺肿瘤表达并分泌S100P且表达随胰腺癌进展而增加。S100P也在肺、乳房、前列腺及结肠癌中表达，在结肠细胞系中的表达与对化学疗法的抗性相关，且在肺癌中，S100P的高表达预示预后较差。S100P的基因转移或细胞外添加增加肿瘤细胞增殖、运动性、侵入及活体外细胞存活及活体内肿瘤生长及转移，而使S100P表达沉默可达成增殖及转移降低。S100P的唯一已知受体是RAGE，其表达与胃癌及胶质瘤的侵入及转移相关。RAGE抑制剂取消了S100P-RAGE相互作用对细胞信号转导、增殖及存活的影响且源自两性蛋白的抑制性蛋白质起S100P-RAGE相互作用拮抗剂的作用。抗RAGE抗体及显性阴性RAGE的表达抑制了S100P的效应。多种分析形式将有能力胜任，且根据本揭示内容，所属
技术领域：
的技术人员将仍然理解那些未经本文清楚阐述者。接近所述蛋白质复合物形成、酶活性条件的分析形式可以许多不同形式产生，且包括基于无细胞系统(例如，经纯化蛋白质或细胞裂解物)的分析以及使用完整细胞的基于细胞的分析。简单结合测定可用于检测抑制RAGEBP(例如，HMGB1、AGE、Ap、SAA、SIOO、两性蛋白、S100P、S100A、S100A4、A100A8、S100A9、CRP、卩2-整联蛋白、Mac-l、及p150,95)与受体多肽(例如，RAGE或RAGE-LBE)间相互作用的化合物。拟测试的化合物可由(例如)细菌、酵母或其它有机体(例如，天然产物)产生、化学产生(例如，小分子，包括模拟肽)、或重组产生。在许多实施例中，将细胞与候选化合物培育后进行处理并测定由RAGEBP(例如，HMGB1、AGE、A卩、SAA、SIOO、两性蛋白、S100P、S100A、S100A4、A100A8、S100A9、CRP、(32-整联蛋白、Mac-l、及pl50，95)诱导的RAGE受体的信号转导活性。在某些实施例中，所述活性的生物测定可包括NF-KB活性测定(例如，NF-KB荧光素酶或GFP报告基因测定)。实例性NF-KB荧光素酶或GFP报告基因测定可如修纳(Shona)等人(2002)欧洲生物化学学会快报(FEBSLett.)515:119-126中所述实施。简单来说，将表达RAGE受体或其变体的细胞用NF-KB-荧光素酶报告基因转染。随后将经转染的细胞与候选化合物一起培育。随后，在经化合物处理或未经化合物处理的细胞中测量经NF-KB-刺激的荧光素酶活性。或者，可将细胞用NF-KB-GFP报告基因(Stratagene)转染。随后将经转染的细胞与候选化合物一起培育。随后，通过用荧光/可见光显微镜装备测量GFP表达或通过FACS分析来监测经NF-KB-刺激的基因活性。在某些实施例中，本发明提供包括受体多肽(例如，RAGE或RAGE-LBE)及一或多种RAGE-BP(例如，HMGB1、AGE、Ap、SAA、S100、两性蛋白、S100P、S100A、S100A4、A100A8、S100A9、CRP、(32-整联蛋白、Mac-l、及p150,95)的重构蛋白质制备品。本发明测定法包括标记的活体外蛋白质-蛋白质结合测定法、蛋白质结合免疫测定法及诸如此类。经纯化的蛋白质也可用以测定可用于模拟分子间相互作用的三维晶体结构。经纯化的抗体也可用以测定可用于模拟分子间相互作用的三维晶体结构。在本发明测定法的某些实施例中，RAGE-BP多肽(例如，HMGB1、AGE、A(3、SAA、SIOO、两性蛋白、S100P、S100A、S100A4、A100A8、S100A9、CRP、P2-整联蛋白、Mac-l、及pl50,95)或受体多肽(例如，RAGE)对于所选细胞可为内源性的以支持所述测定法。或者，RAGE-BP多肽或受体多肽(例如，RAGE或RAGE-LBE)可源自外源来源。例如，可通过重组技术(例如通过使用表达载体)以及通过微注射多肽本身或编码多肽的mRNA将多肽引入到细胞中。在所述测定法的又一实施例中，RAGE-BP与受体多肽的复合物可利用支持标的测定法的细胞培养技术在全细胞中产生。例如，如下文所述，复合物可在真核细胞培养系统(包括哺乳动物及酵母细胞)中建立。在完整细胞中产生标的测定法的优点包括能够检测在与化合物治疗应用环境更紧密类似的环境中起作用的化合物。而且，所述测定法的某些活体内实施例(例如下文所给出的实例)适于候选化合物的高通量分析。在本发明测定法的某些活体外实施例中，重构复合物包含至少经半纯化蛋白质的重构混合物。所谓经半纯化意指在重构混合物中所用的蛋白质先前已与其它细胞蛋白质分离。例如，与细胞裂解物相比，复合物形成中涉及的蛋白质在混合物中以相对于混合物中所有其它蛋白质至少50%的纯度存在，在一个实施例中以90-95%的纯度存在，且在又一实施例中以95-99%的纯度存在。在标的方法的某些实施例中，所述重构蛋白质混合物是通过将经高度纯化的蛋白质混合由此重构混合物基本上没有可能干扰或否则改变测量复合物装配及/或分解能力的其它蛋白质(例如细胞来源的蛋白质)而获得。在某些实施例中，在候选化合物存在及不存在下的测定可在适于含有反应物的任何容器中实施。实例包括微量滴定板、试管及微量离心管。在某些实施例中，可实施药物筛选分析，所述药物筛选分析基于测试抗体干扰RAGE-BP(例如，HMGB1、AGE、A(3、SAA、SIOO、两性蛋白、S100P、S100A、S100A4、A100A8、S100A9、CRP、及(32-整联蛋白、Mac-l、及pl50,95)与受体多肽(例如，RAGE或RAGE-LBE)复合物装配、稳定性或功能的能力检测测试抗体。在实例性结合测定中，使所关注化合物与包含RAGE-LBE多肽及诸如HMGB1、AGE、A卩、SAA、SIOO、两性蛋白、S100P、S100A、S100A4、A100A8、S100A9、CRP、卩2-整联蛋白、Mac-l、及pl50，95等RAGE-BP的混合物接触。复合物的检测及量化提供测定化合物抑制复合物两种组份间相互作用的功效的手段。化合物功效可通过自使用各种浓度测试抗体所获得的数据产生剂量反应曲线来评价。而且，也可实施对照测定以提供比较基线。在对照测定中，在不存在测试抗体下对形成的复合物进行定量。在某些实施例中，复合物中两种多肽(例如，RAGE-BP及受体多肽)间的缔合可通过多种技术来检测，其中许多实际上已在上文中予以阐述。例如，对复合物形成的调节可使用(例如)以可检测方式标记(例如，经放射标记、荧光标记或酶标记)的蛋白质通过免疫测定、通过双杂交测定或通过色谱检测来定量。也可使用表面等离子共振系统(例如那些可从巴考国际AB(BiacoreInternationalAB)(乌普萨拉(Uppsala)，瑞典)购得者)来检测蛋白质-蛋白质相互作用。在某些实施例中，可将包含RAGEBP及受体多肽的复合物中的一种多肽固定以助于复合物与另一多肽的未复合形式分离以及允许测定自动化。在例示性实施例中，提供添加允许抗体与不溶性基质结合的结构域的抗体。例如，可将抗体吸附到谷胱甘肽琼脂糖珠粒(西格玛化学(SigmaChemical),圣路易斯(St.Louis)，密苏里州(MO))或源自谷胱甘肽微量滴定板上或直接或间接附接到磁性珠粒上，随后将所述磁性珠粒与潜在相互作用蛋白质(例如，经"S-标记的S100多肽或经其它标记的RAGE-BP)组合，并在有益于复合物形成的条件下对测试抗体进行培育。培育后，洗涤珠粒以去除任何未结合的相互作用抗体，并直接测定结合基质珠粒的放射标记(例如，珠粒置于闪烁体中)或在复合物解离后于上清液中测定(例如当使用微量滴定板时)。或者，在洗净未结合抗体后，可将复合物自基质解离，通过SDS-PAGE凝胶分离，并使用标准电泳技术自凝胶定量在结合基质部份中发现的相互作用多肽的含量。在另一实施例中，可使用双杂交测定(也称为相互作用捕获测定)来检测RAGE-LBE与RAGE-BP复合物中两种多肽的相互作用(也参见，美国专利第5,283,317号；泽尔沃斯(Zervos)等人(1993)细胞72:223-232;马都拉(Madura)等人(1993)生物化学268:12046-12054;巴特尔(Bartel)等人(1993)生物技术(Biotechniques)14:920-924;及岩渊(Iwabuchi)等人(1993)癌基因(Oncogene)8:1693-1696)，并随后检测抑制RAGE-LBE与RAGE-BP多肽间结合的测试抗体。此测定包括提供宿主细胞，例如，酵母细胞(优选)、哺乳动物细胞或细菌细胞类型。宿主细胞含有报告基因，所述报告基因具有诱饵蛋白中所用转录激活因子的DNA结合结构域的结合位点，因此当报告基因经转录激活时所述报告基因表达可检测基因产物。提供能够在宿主细胞中表达并编码"诱饵"多肽的第一嵌合基因。也提供能够在宿主细胞中表达并编码"鱼"多肽的第二嵌合基因。在一个实施例中，将第一及第二嵌合基因二者均以质粒形式引入到宿主细胞中。然而，优选地，第一嵌合基因存在于宿主细胞的染色体中且将第二嵌合基因作为质粒的一部分引入到宿主细胞中。在某些实施例中，本发明提供双杂交测定，其识别抑制RAGE-BP多肽(例如，HMGB1、AGE、A卩、SAA、S100、两性蛋白、S100P、S100A、S100A4、A100A8、S100A9、CRP、卩2-整联蛋白、Mac-l、及p150,95)与受体多肽(例如，RAGE或RAGE-LBE)结合的测试抗体。为阐释，将包含受体多肽的"诱饵"多肽及包含RAGE-BP多肽(例如，HMGB1、AGE、Ap、SAA、SIOO、两性蛋白、S100P、S100A、S100A4、A100A8、S100A9、CRP、卩2-整联蛋白、Mac-l、及p150,95)的"鱼"多肽引入到宿主细胞中。在一个实施例中，诱饵包含人类或鼠科动物RAGE的V-结构域或与人类或鼠科动物RAGE的V-结构域具有80-99%—致性的仍可结合RAGE-BP的序列。使细胞经受如下条件在所述条件下诱饵及鱼多肽以足以激活报告基因的量表达。两种融合多肽的相互作用导致由报告基因表达产生的可检测信号。因此，在存在测试抗体下或不存在测试抗体下两种多肽间相互作用的水平可通过检测每一情况下报告基因的表达水平来评价。可按照本发明方法使用各种报告基因构建体且包括(例如)产生选自由下列组成群组的可检测信号的报告基因酶信号、荧光信号、磷光信号及药物抗性。在测试化合物及天然提取物库的许多药物筛选程序中，我们期望高通量分析以使给定时间段内所考察化合物的数量最大化。在无细胞系统中实施的本发明测定(例如可用经纯化或半纯化蛋白质或用裂解物实施)通常优选为"主要"筛选，因为其可实施以允许快速实施及相对容易地检测测试抗体介导的分子靶的改变。而且，测试抗体的细胞毒性及/或生物利用性效应在活体外系统中通常可以忽略，而测定主要集中在药物对分子靶的影响上，因为分子靶与其它蛋白质的结合亲和力变化或酶特性的改变可能较为明显。在某些实施例中，RAGE-BP与受体复合物的形成可通过免疫沉淀及分析共免疫沉淀蛋白质或亲和力纯化及分析共纯化蛋白质来评价。也可使用基于荧光共振能量转移(FRET)的测定法来测定所述复合物形成。使具有适当发射及激发光谱的荧光分子彼此紧密接近可展示FRET。选择的荧光分子应使一个分子(供体分子)的发射光谱与另一个分子(受体分子)的激发光谱重叠。供体分子在供体激发光谱内由合适强度的光激发。随后供体以荧光形式发射所吸收的能量。其产生的荧光能量由受体分子压制。FRET可表现为来自供体的荧光信号强度降低、其激发态寿命縮短、及/或荧光在受体较长特征波长(较低能量)处再发射。当以物理方式分离出荧光蛋白时，FRET效应降低或消除(参见，例如，美国专利第5,981,200号)。发生FRET也造成供体荧光部分的荧光寿命縮短。荧光寿命的此改变可使用称为荧光寿命成像技术(FLIM)的技术来测量(外威尔(Verveer)等人(2000)科学(Science)290:1567-1570;斯怪尔(Squire)等人(1999)显微镜学(J.Microsc.)193:36;外威尔等人(2000)生物物理(Bi叩hys.J.)78:2127)。已研发出用于分析FLIM数据的整体分析技术。这些算法利用如下协定供体荧光部分仅以有限数量的状态存在，每一状态具有不同的荧光寿命。每一状态的定量图可基于逐像素产生。为实施基于FRET的分析，将RAGE-BP多肽(例如，HMGB1、AGE、A(3、SAA、SIOO、两性蛋白、S100P、S100A、S100A4、A100A8、S100A9、CRP、卩2-整联蛋白、Mac-l、及pl50，95)及受体多肽(例如，RAGE或RAGE-LBE)均经荧光标记。适宜荧光标记己为所属
技术领域：
的技术人员所熟知。下文中提供实例，但所属
技术领域：
的技术人员也可得到且可使用未具体论述的适宜荧光标记。荧光标记可通过将多肽表达为带有荧光蛋白的多肽来达成，例如自海蜇、珊瑚虫及其它腔肠动物分离的荧光蛋白。实例性荧光蛋白包括多管水母(Aequoriavictoria)绿色荧光蛋白(GFP)的许多变体。变体可更为明亮、更为暗淡或具有不同的激发及/或发射光谱。某些变体可经改变以不再呈现绿色，且可呈现蓝色、青色、黄色或红色(分别称为BFP、CFP、YFP、及REP)。可通过多种共价及非共价键将荧光蛋白稳定附接到多肽上，包括(例如)肽键(例如，表达为融合蛋白)、化学交联及生物素-抗生蛋白链菌素偶联。对于荧光蛋白实例，参见美国专利第5,625,048号、第5,777,079号、第6,066,476号及第6，124，128号；普瑞舍(Prasher)等人(1992)基因(Gene)，111:229-233;瑞恩(Reign)等人(1994)美国国家科学院院刊，91:12501-04;沃德等人(1982)光化学及光生物学(Photochem.Photobiol.)，35:803-808;莱文(Levine)等人(1982)比较生物化学与生理学(Comp.Biochem.Physiol.)，72B:77-g5;特斯科(Tersikh)等人(2000)科学290:1585-88。可在基于细胞的测定及无细胞测定中使用基于FRET的测定。基于FRET的测定适于包括荧光激活细胞分选及微量滴定分析的荧光扫描在内的高通量筛选方法。通常来说，在筛选测定是结合测定(无论蛋白质-蛋白质结合、化合物-蛋白质结合等)的情况下，可将一或多种分子偶联或连接到标记上，其中标记可直接或间接提供可检测信号。各种标记包括放射性同位素、荧光剂、化学发光物、酶、特异性结合分子、粒子(例如磁性粒子)及诸如此类。特异性结合分子包括诸如生物素与抗生蛋白链菌素、地高辛(digoxin)及抗地高辛药(antidigoxin)等对。对于特异性结合成员，互补成员通常按照已知程序用提供检测的分子标记。多种其它试剂可包括于筛选测定中。这些包括用于促进蛋白质-蛋白质结合优化及/或降低非特异性或所争论相互作用的诸如盐、中性蛋白(例如，白蛋白)、去污剂等试剂。可使用能够提高测定效率的诸如蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、抗微生物化合物等试剂。按可提供需要结合的顺序添加组份混合物。培育是在任何适宜温度(一般介于4'C与4(TC之间)下实施。所选培育时间段应有利于使活性最佳，但也可经优化以有助于快速高通量筛选。在某些实施例中，本发明提供不依赖于复合物的测定法。所述测定法包含识别为RAGE-BP与受体多肽(例如，RAGE或RAGE-LBE)结合候选抑制剂的测试抗体。在实例性实施例中，可使用受体RAGE-LBE多肽来识别与受体多肽结合的化合物。在例示性实施例中，可提供添加允许蛋白质与不溶性基质结合的额外结构域的RAGE-LBE。例如，可将与GST蛋白融合的RAGE-LBE吸附到谷胱甘肽琼脂糖珠粒(西格玛化学，圣路易斯(St.Louis)，密苏里州(MO))或谷胱甘肽衍生微量滴定板上，随后将其与潜在标记的结合化合物组合并在有益于结合的条件下进行培育。培育后，洗涤珠粒以去除任何未结合的化合物，并直接测定结合基质珠粒的标记或在结合化合物解离后于上清液中测定。在某些实施例中，标记可直接或间接提供可检测信号。各种标记包括放射性同位素、荧光剂、化学发光物、酶、特异性结合分子、粒子(例如磁性粒子)及诸如此类。特异性结合分子包括诸如生物素与抗生蛋白链菌素、地高辛及抗地高辛药等对。对于特异性结合成员，互补成员通常按照已知程序用提供检测的分子标记。在某些实施例中，所述方法包含在活体外形成混合物。在某些实施例中，所述方法包含通过在活体内形成混合物的基于细胞的测定。在某些实施例中，所述方法包含使表达受体多肽(例如，RAGE或RAGE-LBE)或其变体的细胞与测试抗体接触。在某些实施例中，测定是基于无细胞系统(例如，经纯化蛋白质或细胞裂解物)的测定，以及使用完整细胞的基于细胞的测定。简单结合测定可用于检测与受体多肽相互作用的化合物。拟测试的化合物可由(例如)细菌、酵母或其它有机体(例如，天然产物)产生、化学产生(例如，小分子，包括模拟肽)、或重组产生。视情况，自这些测定法识别的测试抗体可用于治疗RAGE相关病症。医药制备品本发明标的蛋白质或核酸最优选以合适组合物形式投与。作为合适组合物，可提及通常用于全身或局部投与药物的所有组合物。医药上可接受的载剂应基本上惰性，以不与活性组份作用。适宜惰性载剂包括水、乙醇、聚乙二醇、矿物油或石油凝胶、丙二醇、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、注射用抑菌水(BWFI)、注射用无菌水(SWFI)及诸如此类。所述医药制备品(包括标的抗体或编码标的抗体的核酸)可经调配以任何方便方式投与用于人类或兽医医学。因此，本发明另一方面提供包含有效量抗体的医药上可接受的组合物，所述抗体与一或多种医药上可接受的载剂(添加剂)及/或稀释剂一起调配。如下文详述，可为投与将本发明医药组合物特别调配成固体或液体形式，包括那些适于下列投与方式者(1)经口投与，例如，施用于舌的兽用顿服药(水性或非水性溶液或悬浮液)、片剂、大药丸、粉剂、颗粒剂、糊剂；(2)非经肠投与，例如，以(例如)无菌溶液或悬浮液形式经皮下注射、肌内注射或静脉内注射投与；(3)局部施用，例如，以乳霜、软膏或喷雾剂形式施用于皮肤；或(4)经阴道内或直肠内投与，例如，以阴道栓剂、乳霜或泡沫剂形式投与。然而，在某些实施例中，可将标的药剂简单溶解或悬浮于无菌水中。在某些实施例中，医药制备品无热原，即，不提高患者体温。非经肠投与(尤其皮下及静脉内注射)是投与的优选途径。在某些实施例中，一或多种药剂可含有碱性官能团(例如氨基或烷基氨基)，且因此能够与医药上可接受的酸形成医药上可接受的盐。在此方面中，术语"医药上可接受的盐"是指本发明化合物的相对无毒的无机及有机酸加成盐。这些盐可在本发明化合物最后分离及纯化期间原位制备，或通过使呈游离碱形式的本发明经纯化化合物与适宜有机或无机酸单独反应并分离由此形成的盐来制备。代表性盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐及月桂基磺酸盐类及诸如此类。(参见(例如)伯格(Berge傳人，(1977)"医药盐(PharmaceuticalSalts)",药物科学(J66:1-19)。药剂的医药上可接受的盐包括来自(例如)无毒有机或无机酸的化合物的常规无毒盐或季铵盐。例如，所述常规无毒盐包括那些衍生自无机酸(例如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸及诸如此类)者及自有机酸(例如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯基乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲垸磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙磺酸及诸如此类)制备的盐。在其它情况下，所述一或多种药剂可含有一或多种酸性官能团且因此能够与医药上可接受的碱形成医药上可接受的盐。这些盐同样可在化合物最终分离及纯化期间原位制备，或通过使呈游离酸形式的经纯化化合物与适宜碱(例如医药上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)、与氨、或与医药上可接受的有机伯胺、仲胺或叔胺单独反应来制备。代表性碱金属或碱土金属盐包括锂、钠、钾、钙、镁及铝盐及诸如此类。可用于形成碱加成盐的代表性有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪及诸如此类。(参见，例如，伯格等人，见上文)润湿剂、乳化剂及润滑剂(例如月桂基硫酸钠及硬脂酸镁)以及着色剂、脱模剂、包覆剂、甜味剂、矫味剂及加香剂、防腐剂及抗氧化剂也可存在于所述组合物中。医药上可接受的抗氧化剂的实例包括(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠及诸如此类；(2)油溶性抗氧化剂，例如棕榈酸抗坏血酯、丁羟基苯甲醚(BHA)、丁羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、a-生育酚及诸如此类；及(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸及诸如此类。本发明调配物包括那些适于经口、经鼻、局部(包括含服及经舌下)、经直肠、经阴道及/或非经肠投与者。调配物可方便地以单位剂型存在且可通过所属制药
技术领域：
的技术人员所熟知的任何方法制备。可与载剂材料组合以产生单独剂型的活性成份的量将随所治疗的宿主、特定投与方式而变化。可与载剂材料组合以产生单独剂型的活性成份的量通常应为能产生治疗效果的化合物的量。通常来说，除100%外，此活性成份的量将介于约1%至约99%之间，优选自约5%至约70%，最优选自约10%至约30%。制备这些调配物或组合物的方法包括使药剂与载剂及(视情况)一或多种助剂成份混合的步骤。一般来说，所述调配物通过以下来制备使本发明药剂与液体载剂或微细分散固体载剂或二者均匀且充分地混合，且随后(若必要)使产物成形。适于经口投与的本发明调配物可呈下列形式胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、菱形片剂(使用矫味基质，通常为蔗糖及阿拉伯胶或黄蓍胶)、粉剂、颗粒剂；或作为存于水性或非水性液体中的溶液或悬浮液；或作为水包油型或油包水型液体乳液；或作为酏剂或糖浆；或作为软片剂(使用惰性基质，例如明胶及甘油、或蔗糖及阿拉伯胶)及/或作为漱口剂及诸如此类，每一都含有预定量的本发明化合物作为活性成份。本发明化合物也可以大丸剂、冲服剂或糊剂投与。在用于经口投与的本发明固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖衣药丸、粉剂、颗粒剂及诸如此类)中，可将活性成份与一或多种医药上可接受的载剂(例如柠檬酸钠或磷酸二转)及/或任一以下成份混合(1)填充剂或增量剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇及/或硅酸；(2)结合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯垸酮、蔗糖及/或阿拉伯胶；(3)保湿剂，例如甘油；(4)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐及碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，例如石蜡；(6)吸收加速剂，例如季铵化合物；(7)润湿剂，例如鲸蜡醇及单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，例如高岭土及膨润土；(9)润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠及其混合物；及(IO)着色剂。在胶囊、片剂及丸剂情况下，所述医药组合物也可包含缓冲剂。在使用诸如乳糖(lactose或milksugar)以及高分子量聚乙二醇及诸如此类等赋形剂的软质及硬质填充明胶胶囊中，也可使用类似类型的固体组合物作为填充剂。可通过压制或模制来制备片剂，其视情况含有一或多种助剂成份。可使用结合剂(例如，明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，羟乙酸淀粉钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂来制备压縮片剂。可通过在适宜机器中模制经惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物来制备模制片剂。本发明医药组合物的片剂及其它固体剂型(例如糖衣药丸、胶囊、丸剂及颗粒剂)可视情况经刻痕或使用诸如肠溶包膜及其它医药调配技术中熟知的包膜等包膜及外壳来制备。也可使用(例如)提供期望释放性质的不同比例的羟丙基甲基纤维素、其它聚合物基质、脂质体及/或微球体对其进行调配以便在其中提供活性成份的缓慢或控制释放。这些固体剂型可经由(例如)通过细菌截留过滤器过滤或经由纳入灭菌剂来灭菌，所述灭菌剂呈可在使用前即刻溶于无菌水或一些其它无菌可注射介质中的无菌固体组合物形式。这些组合物也可视情况含有遮光剂且可为视情况以延迟方式仅(或优选)在胃肠道的某一部分释放活性成份的组合物。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。若合适，所述活性成份也可呈含有一或多种上述赋形剂的微胶囊形式。用于本发明化合物经口投与的液体剂型包括医药上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆及酏剂。除活性成份外，所述液体剂型可含有业内常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂、增溶剂及乳化剂，例如，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(具体而言，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油及芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇及山梨醇酐脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀释剂外，经口调配物也可包括诸如润湿剂、乳化剂及悬浮剂、甜味剂、矫味剂、着色剂、加香剂及防腐剂等佐剂。除活性化合物以外，悬浮液也可含有悬浮剂，例如经乙氧基化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇及山梨醇酐酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂及黄蓍胶及其混合物。用于直肠或阴道投与的本发明医药组合物的调配物可以栓剂形式存在，其可通过使一或多种本发明化合物与一或多种适宜非刺激性赋形剂或载剂混合来制备，所述适宜非刺激性赋形剂或载剂包含(例如)可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸酯，且其在室温下是固体但在体温下是液体，且因此将在直肠或阴道腔内融化并释放药剂。适于阴道投与的本发明调配物也包括含有业内习知适宜载剂的阴道栓剂、阴道塞、乳霜、凝胶、糊剂、泡沫剂或喷雾剂调配物。用于本发明化合物局部或经皮投与的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏、糊剂、乳霜、洗液、凝胶、溶液、贴剂及吸入剂。可在无菌条件下将活性化合物与医药上可接受的载剂及与可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。除本发明活性化合物之外，所述软膏、糊剂、乳霜及凝胶可含有赋形剂，例如动物及植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、聚硅氧、膨润土、硅酸、滑石粉和氧化锌或其混合物。除本发明化合物之外，粉剂及喷雾剂可含有赋形剂，例如乳糖、滑石粉、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙及聚酰胺粉末或这些物质的混合物。喷雾剂可另外含有习用推进剂，例如氯氟烃类及挥发性未经取代的烃类(例如丁烷及丙垸)。经皮贴剂具有额外优点，即提供本发明化合物到身体的控制递送。所述剂型可通过将药剂溶解或分散于适宜介质中来制备。也可以使用吸收促进剂来增加穿过皮肤的药剂流量。所述流量的速率可通过提供速率控制膜或将化合物分散于聚合物基质或凝胶中加以控制。眼用调配物、眼用软膏、粉剂、溶液及诸如此类也涵盖于本发明范围内。适于非经肠投与的本发明医药组合物包含一或多种本发明化合物与一或多种医药上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液、或无菌粉剂，所述无菌粉剂可在使用前即刻重构成无菌可注射溶液或分散液，所述医药组合物可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、可使调配物与预期接受者的血液等渗的溶质或悬浮剂或增稠剂。可用于本发明医药组合物的适宜水性及非水性载剂的实例包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇及诸如此类)及其适宜混合物、植物油(例如橄榄油)及可注射有机酯(例如油酸乙酯)。适当流动性可通过(例如)使用包膜材料(例如卵磷脂)、通过维持所需粒径(在分散液情况下)及通过使用表面活性剂来维持。.这些组合物也可含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂及分散剂。微生物作用的预防可通过引入各种抗细菌及抗真菌剂来确保，例如，对羟基苯甲酸、氯丁醇、苯酚山梨酸及诸如此类。所述组合物中也可能需要包括等渗剂，例如糖类、氯化钠及诸如此类。另外，通过纳入延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝及明胶)可达成可注射医药形式的长效吸收。在一些情况下，为延长药剂功效，需要减缓来自皮下或肌内注射的药剂的吸收。此可通过使用具有较差水溶性的结晶或无定形物质的液态悬浮液来达成。因而，药剂吸收速率需视其溶解速率而定，而溶解速率又需视晶体大小及结晶形式而定。或者，非经肠投与药剂的延迟吸收可通过将所述药剂溶解或悬浮于油性媒剂中来实现。注射用储积形式是通过在生物可降解聚合物(例如聚交酯-聚乙醇酸交酯)中形成标的化合物的微胶囊基质而制备。视药剂与聚合物的比例及所用特定聚合物的性质来控制药剂释放速率。其它生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)及聚(酸酐)。储积注射用调配物也可通过将药剂俘获入与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。当本发明化合物是作为药物投与到人类及动物中时，其可以原状或作为含有(例如)0.1-99.5%(更优选0.5-90%)活性成份与医药上可接受的载剂的医药组合物给与。除上述组合物外，还可使用含有合适量治疗剂的覆盖物，例如，石膏、绷带、包扎用品、纱布垫及诸如此类。如上文详述，治疗性组合物可在支撑架、装置、假肢及植入物上投与或递送。用于分析的组织样品一般为来自患者的血液、血浆、血清、粘液样流体或脑脊髓液。对样品的(例如)RAGE肽抗体的含量或分布予以分析，例如，人类化抗体的含量或分布。检测对RAGE具有特异性的抗体的ELISA方法阐述于实例中。被动免疫后的抗体分布一般在指数式衰减后立即显示抗体峰浓度。在不进一步投与剂量的情况下，视所投与抗体的半衰期而定，衰减在数天到数月内接近治疗前水平。在一些方法中，患者中的RAGE抗体基线测量是在投与前实施，第二次测量是在其后不久实施以测定峰抗体含量，且一或多次进一步测量是以一定间隔实施以监测抗体含量的衰减。当抗体含量降低到基线值或峰值的预定百分比(例如，50%、25%或10%)减基线值时，实施进一步抗体剂量投与。在一些方法中，将峰值或或随后测量含量减去背景后与先前测定的参考含量进行比较以制定其它患者的有益预防性或治疗性治疗方案。如果所测量的抗体含量显著低于参考含量(例如，低于平均值减去受益于治疗的患者群体中的一个标准参考值偏差)，则表明应投与额外剂量的抗体。实例现已对本发明进行概括阐述，通过参考以下实例将更容易地理解本发明，所涵盖的实例仅用于阐释本发明某些方面及实施例，且并不意欲限制本发明。实例lRAGE构建体的制备鼠科动物RAGE(mRAGE，Genbank登记号NP—031451;SEQIDNO:3)及人类RAGE(hRAGE，Genbank登记号NP—00127.1;SEQIDNO:1)的氨基酸序列显示于图1A-1C中。将编码mRAGE的全长cDNA(登记号NM—007425.1;SEQIDNO:4)及编码hRAGE的全长cDNA(登记号NM—001136;SEQIDNO:2)插入到Adori1-2表达载体中，所述Adoril-2表达载体包含推动cDNA序列表达的巨细胞病毒(CMV)启动子，并含有用于产生病毒的腺病毒元件。通过将人类RAGE的氨基酸1-344追加到人类IgG的Fc结构域而形成的人类RAGE-Fc融合蛋白是通过在培养细胞中使用Adori表达载体表达编码所述融合蛋白的DNA构建体来制备。通过将人类RAGE的氨基酸1-118追加到人类IgG的Fc结构域而形成的人类RAGEV-区-Fc融合蛋白以类似方式制备。通过将抗生蛋白链菌素(链球菌)标签序歹U(WSHPQFEK)(SEQIDNO:5)分别追加到人类或鼠科动物RAGE的氨基酸1-344而形成的人类及鼠科动物RAGE-链球菌标签融合蛋白是通过表达编码所述RAGE-链球菌标签融合蛋白的DNA构建体来制备(也使用Adori表达载体)。所有构建体都通过广泛限制酶切消化分析及通过质粒内cDNA插入片段的序列分析来证实。表达全长RAGE、hRAGE-Fc及hRAGEV-结构域-Fc的重组腺病毒(Ad5Ela/E3缺失)是通过在人类胚胎肾细胞系293(HEK293)(ATCC，罗克兰(Rockland)，马里兰州)中同源重组产生。将重组腺病毒分离并随后在HEK293细胞中进行扩增。通过三个周期的冻融将病毒自受感染的HEK293细胞中释放出来。将病毒通过两个氯化铯离心梯度进一步纯化并对磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH7.2在4'C下透析。透析后，添加甘油以使浓度为10M并将病毒储存在-8(TC下直至使用。对病毒构建体的感染性(在293细胞上的蚀斑形成单位)、病毒的PCR分析、编码区域的序列分析、转基因的表达及内毒素测量进行定性。使用脂转染试齐!j(lipofectin)(英杰生命技术有限公司(Invi加gen))将含有编码人类RAGE-Fc、人类RAGE-V区域-Fc及人类及鼠科动物RAGE-链球菌标签融合蛋白的DNA的Adori表达载体稳定转染到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中。在20nM及50nM甲氨蝶呤中选择稳定转染子。自各克隆体收获条件化培养基并利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及西方墨点法予以分析以证实RAGE表达。(考夫曼(Kaufman，R丄)，1990，酶学方法(MethodsinEnzymology)，185:537-66;考夫曼，腦，酶学方法，185:487-511;皮特曼(Pittman，D.D.)等人，1993，酶学方法，222:236-237)。对CHO或经转导HEK293细胞(表达可溶性RAGE融合蛋白)进行培育以收获用于蛋白质纯化的条件化培养基。利用所指示的亲和力-标签方法对蛋白质进行纯化。使经纯化蛋白质经历还原及非还原SDS-PAGE，通过考马斯蓝染色(现代蛋白质科学实验方案(CurrentProtocolsinProteinSciences),威立公司(WileyInterscience))观察，并显示具有预期分子量。实例2鼠科动物抗RAGE单克隆抗体的产生使用基因枪装置(伯乐(BioRad)，赫拉克勒市(Hercules)，加利福尼亚州(CA))经皮下使6-8周龄雌性BALB/c小鼠(査理士河(CharlesRiver)，安杜佛市(Andover)，马萨诸塞州(MA))免疫。在皮下投与之前将含有编码全长人类RAGE的cDNA的pAdori表达载体预吸附到胶体金颗粒(伯乐，赫拉克勒市，加利福尼亚州)上。用3吗载体对小鼠进行免疫，每周两次，持续两周。在最后免疫后一周对小鼠进行抽血并评价抗体滴度。在细胞融合之前三天使具有最高RAGE-抗体滴度的小鼠接受一次额外注射，为lO吗重组人类RAGE-链球菌蛋白。使用50。/。聚乙二醇(MW1500)(罗氏诊断公司(RocheDiagnosticsCorp)，曼海姆，德国)使脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞P3X63Ag8.653(ATCC，罗克维尔(Rockville)，马里兰州(MD))以4:1比例融合。融合后，在96-孔板中以1x105个细胞/孔在含有20%FBS、5。/o三甲氧唑辛(Origen)(IGEN国际公司(IGENInternationalInc.)，盖瑟斯堡(Ga他ersburg)，马里兰州(MD))、2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100吗/ml链霉素、lOmM羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)及lx次黄嘌呤-氨基蝶吟-胸苷(西格玛，圣路易斯，密苏里州)的RPMI1640选择培养基中对细胞进行接种及培育。实例3大鼠抗RAGE单克隆抗体的产生使用基因枪(伯乐，赫拉克勒市，加利福尼亚州)经皮下使LOU大鼠(哈兰(Harlan)，哈兰(Harlan)，马萨诸塞州(MA))免疫。在皮下投与之前将含有编码全长鼠科动物RAGE的cDNA的pAdori表达载体预吸附到胶体金颗粒(伯乐，赫拉克勒市，加利福尼亚州)上。用3吗载体对大鼠进行免疫，每两周一次，免疫四次。在最后免疫后一周对大鼠进行抽血并评价抗体滴度。在细胞融合之前三天使具有最高RAGE-抗体滴度的大鼠接受一次额外注射，为10吗重组鼠科动物RAGE-链球菌蛋白。使用50。/o聚乙二醇(MW1500)(罗氏诊断公司，曼海姆，德国)使脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞P3X63Ag8.653(ATCC，罗克维尔，马里兰州)以4:1比例融合。融合后，在96-孔板中以1x1()S个细胞/L在含有20。/()FBS、5%三甲氧唑辛(IGEN国际公司，盖瑟斯堡，马里兰州)、2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100pg/ml链霉素、lOmM羟乙基哌嗪乙磺酸及lx次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(西格玛，圣路易斯，密苏里州)的RPMI1640选择培养基中对细胞进行接种及培育。实例4杂交瘤筛选通过使用基因枪及表达鼠科动物或人类RAGE全长编码区域的Adori表达质粒进行cDNA免疫产生大鼠抗鼠科动物RAGE及鼠科动物抗人类RAGEmAb组。在瞬时表达RAGE的人类胚胎肾细胞(HEK-293)上通过ELISA及FACS分析针对与重组人类或鼠科动物RAGE-Fc的结合对杂交瘤上清液进行筛选。针对中和RAGE与配体HMGB1结合的能力对阳性上清液进行进一步测试。识别出七种大鼠单克隆抗体(XT-M系列)及七种小鼠单克隆抗体(XT-H系列)。通过连续稀释将所选杂交瘤亚克隆四次及通过FACS分选亚克隆一次。自稳定杂交瘤培养物收获条件化培养基并使用蛋白质A抗体纯化管住(密理博(MilliporeBillerica)，马萨诸塞州)纯化免疫球蛋白。如上所示用小鼠mAb同种型试剂盒或大鼠mAb同种型试剂盒(IsoStrip;勃林格曼海姆公司(BoehringerMannheimCorp.))测定每一mAb的Ig类别。所选大鼠及小鼠单克隆抗体的同种型陈述于表1(下文)中。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>实例5FACS分析用人类及鼠科动物RAGE腺病毒感染人类293细胞。将受感染细胞以4x104个细胞/ml的密度悬浮于含有1%BSA的PBS中。将细胞与100|il样品(经稀释免疫血清、杂交瘤上清液或经纯化抗体)在4"C下培育30min。洗涤后，将细胞与经PE标记的山羊、抗小鼠、IgG、F(ab')2(DAKO公司，葛洛斯绰普(Glostrup)，丹麦)在4"C下于黑暗中培育30min。与细胞有关的荧光信号是通过流式细胞计(FACScan)流式细胞荧光测量仪(flowcytofluorometer)(百科顿迪克森(BectonDickinson))使用5000个细胞/处理来测量。使用碘化丙啶来识别死细胞，将其自分析中除去。FACS分析显示，七种鼠科动物单克隆抗体XT-H1到XT-H7及七种大鼠单克隆抗体XT-MI到XT-M7与细胞表面hRAGE结合(表2)。实例6ELISA结合测定使用标准程序自杂交瘤上清液中提纯抗体。利用ELISA针对与RAGE可溶性形式的结合对经纯化抗体进行评价。将九十六孔板(康宁(Corning)，康宁，纽约)涂覆100nl重组人类RAGE-Fc或重组人类RAGEV-区-Fc(l吗/ml)并在4"C下培育过夜。在用含有1%BSA及0.05。/o吐温(Tween)-20的PBS洗涤并阻断后，添加100pl样品(样品呈数种形式经稀释免疫血清、杂交瘤上清液或经纯化抗体，如上文所述)并在室温下培育1小时。将板用PBS(pH7.2)洗涤并使用偶联过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG(H+L)(IgG)(皮尔斯(Pierce)，洛克福特(Rockford)，伊利诺斯州(IL))检测结合的抗RAGE抗体，随后与底物TMB(BioFX实验室，欧文斯米尔市(OwingsMills)，马里兰州实验室)一起培育。在分光光度计中于450nm处测定吸光度值。单克隆抗体的浓度是使用经过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(FcY)(皮尔斯，洛克福特，伊利诺斯州)来测定并由纯化的同种型匹配小鼠IgG产生标准曲线。七种鼠科动物抗体XT-H1到XT-H7及七种大鼠抗体XT-M1到XT-M7与hRAGE-Fc、hRAGEV-区-Fc、mRAGE-Fc、及mRAGE-链球菌结合的能力的ELISA结果概述于表2中。如图2及3所示，大鼠抗体XT-M4及鼠科动物抗体XT-H2二者均与人类RAGE-Fc及hRAGE的V-结构域结合。XT-M4与人类RAGE及与人类RAGEV-结构域结合的EC50值分别为300pM及100pM。XT-H2与人类RAGE及人类RAGEV-结构域结合的EC50_值分别为90pM及100pM。<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>实例7RAGE配体与抗体竞争ELISA结合测定为测定RAGE单克隆抗体是否影响RAGE配体(HMGB1;西格玛，圣路易斯，密苏里州)与RAGE的结合，实施竞争ELISA结合测定。在4'C下将九十六孔板涂覆1ng/mlHMGB1过夜。如上所述对孔进行洗涤及阻断并在室温下于100pl预培育混合物中暴露l小时，所述预培育混合物是O.l(ig/mlRAGE-Fc或TrkB-Fc(非特异性Fc对照)加上各种形式的上述抗体制备品(免疫血清稀释物、杂交瘤上清液或经纯化抗体)的混合物。将板用PBS(pH7.2)洗涤并使用偶联过氧化物酶的山羊抗人类IgG(Fc力(皮尔斯，洛克福特，伊利诺斯州)检测结合配体的重组人类RAGE-Fc，随后与底物TMB(欧文斯米尔市BioFX实验室，欧文斯米尔市马里兰州实验室，马里兰州)一起培育。无任何抗体或具有经稀释免疫前血清下重组人类RAGE-Fc与配体的结合作为对照并定义为100y。结合。通过竞争ELISA结合测定而测定的七种鼠科动物抗体XT-H1至ijXT-H7及七种大鼠抗体XT-M1至ljXT-M7阻断HMGB1与hRAGE-Fc结合的能力显示于表3中。表3也概述通过类似竞争ELISA结合测定而测定的鼠科动物抗体XT-H1、XT-H2及XT-H5阻断不同hRAGE配体、淀粉样蛋白卩1-42肽与RAGE结合的能力及大鼠抗体XT-M1到XT-M7阻断HMGB1与鼠科动物RAGE-Fc结合的能力。如图4中所示，大鼠抗体XT-M4及鼠科动物抗体XT-H2二者均阻断HMGB1与人类RAGE的结合。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>使用类似竞争方法测定抗体对间的相对结合表位。首先，在4"C下将lpg/ml重组人类RAGE-Fc涂覆在九十六孔板上过夜。洗涤并阻断(参见上文)后，将孔在室温下于100pl预培育混合物中暴露1小时，所述混合物是生物素化靶抗体与竞争抗体稀释物的混合物。使用偶联过氧化物酶的抗生蛋白链菌素(皮尔斯)来检测结合的生物素化抗体。使用类似竞争方法测定抗体对间的相对结合表位。首先，在4"C下将l昭/ml重组人类RAGE-Fc涂覆在九十六孔板上过夜。洗涤并阻断(参见上文)后，将孔在室温下于100pl预培育混合物中暴露1小时，所述混合物是生物素化靶抗体与竞争抗体稀释物的混合物。使用偶联过氧化物酶的抗生蛋白链菌素(皮尔斯，洛克福特，伊利诺斯州)检测结合的生物素化抗体，随后与底物TMB(BioFX实验室，欧文斯米尔市，马里兰州实验室)一起培育。无任何竞争抗体下生物素化抗体与重组人类RAGE-Fc的结合作为对照并定义为100%。分析大鼠与鼠科动物抗体竞争与hRAGE结合的竞争ELISA结合测定的结果显示于表3中。图5呈现来自竞争ELISA结合测定的数据图，所述竞争ELISA结合测定对大鼠XT-M4与抗体XT-H1、XT-H2、XT-H5、XT-M2、XT-M4、XT-M6、及XT-M7竞争与hRAGE结合予以分析。图5中所示的竞争ELISA结合数据显示XT-M4及XT-H2与人类RAGE上的重叠位点结合。实例8鼠科动物及大鼠抗RAGE抗体与人类及鼠科动物RAGE-Fc结合的BIACORETM结合测定A.与人类及鼠科动物RAGE结合通过BIACORE⑧直接结合测定来分析所选鼠科动物及大鼠抗RAGE抗体与人类及鼠科动物RAGE及与人类及鼠科动物RAGE的V结构域的结合。使用以高密度(2000RU)利用标准胺偶联涂覆在CM5芯片上的人类或鼠科动物RAGE-Fc来实施测定。使两种浓度(50nm及100nm)的抗RAGE抗体溶液一式两份流过经固定的RAGE-Fc蛋白。BIACORETM技术利用抗RAGE抗体与经固定RAGE抗原结合时表面层上的折射率改变。通过自表面折射的激光的表面等离子共振(SPR)来检测结合。BIACORE直接结合测定的结果概述于表4中。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>通过BIACORETM直接结合测定来测定鼠科动物及大鼠抗RAGE抗体与人类及鼠科动物RAGE结合的动力学速率常数(ka及kd)及缔合及解离常数(Ka及Kd)。信号动力学数据分析缔合速率及解离速率使得能够区别非特异性及特异性相互作用。通过BIACORETM直接结合测定测定的鼠科动物XT-H2抗体及大鼠XT-M4抗体与hRAGE-Fc结合的动力学速率常数及平衡常数显示于表5中。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>B.与人类RAGEV-结构域结合鼠科动物及大鼠抗RAGE抗体与人类RAGEV-结构域结合的动力学速率常数及缔合及解离常数也通过BIACORETM直接结合测定来测定。由涂覆在CM5芯片上的抗人类Fc抗体俘获人类RAGEV-结构域-Fc，且如上所述实施鼠科动物及大鼠抗RAGE抗体与经固定hRAGEV结构域-Fc结合的BIACORETM直接结合测定以测定其与全长RAGE-Fc的结合。实例9抗RAGE抗体可变区的氨基酸序列对编码鼠科动物抗RAGE抗体XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5及XT-H7及大鼠抗RAGE抗体XT-M4的轻链及重链可变区的DNA序列进行克隆并测序，并测定所述可变区的氨基酸序列。这六种抗体的重链可变区的比对氨基酸序列显示于图6中，且轻链可变区的比对氨基酸序列显示于图7中。实例io编码RAGE的兔、狒狒及食蟹猴cDNA序列的分离分离编码RAGE的cDNA序列并利用标准逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法迸行克隆。使用Trizol(英杰公司Gibco(GibcoInvitrogen)，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚州)经由制造商方案提取RNA并去除肺组织。使用TaqMan逆转录试剂(罗氏应用科学(RocheAppliedScience),印第安纳波利斯(Indianapolis)，印第安纳州(IN))及制造商方案对mRNA进行逆转录以产生cDNA。使用英杰公司TaqDNA聚合酶(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)及方案及添加印eI及五coiF限制位点的寡核苷酸(5'-GACCCTGGAAGGAAGCAGGATG(SEQIDNO:59)及5'-GGATCTGTCTGTGGGCCCCTCAAGGCC)(SEQIDNO:60)自cDNA扩增食蟹猴(成束猴師cacafascicularis))及狒狒(草原狒狒(Papiocva露ephalus))RAGE序列。将PCR扩增产物用5^I/五coRV消化并克隆到质粒pAdoril-3中的对应位点中。利用如上所述RT-PCR使用添加^el及A^I位点的寡核苷酸5'-ACTAGACTAGTCGGACCATGGCAGCAGGGGCAGCGGCCGGA(SEQIDNO:61)及5'-NO:62)克隆兔RAGE，并克隆到pAdoril-3中的对应位点中。测定所得质粒中编码狒狒RAGE、猴RAGE及兔两种RAGE同种型的经克隆cDNA序列的核苷酸序列。编码狒狒RAGE的核苷酸序列显示于图8(SEQIDNO:6)中，且编码食蟹猴RAGE的核苷酸序列显示于图9(SEQIDNO:8)中。编码兔两种RAGE同种型的核苷酸序列显示于图10(SEQIDNO:10)及图11(SEQIDNO:12)中。实例ll编码狒狒RAGE的基因组DNA序列的分离使用标准基因组克隆技术(例如，参见萨姆布鲁克等人，分子克隆实验室手逊，第2版，1989，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)分离编码RAGE的狒狒基因组DNA序列。使用32P随机引物人类RAGEcDNA对XDASHII载体中的狒狒(草原狒狒)X基因组文库(Stratagene,拉霍亚，加利福尼亚州)进行筛选。分离阳性噬菌体蚀斑并使其经历两轮额外筛选以获得单一分离物。制备XDNA，用NotI消化，并使用常用程序进行尺寸分级分离以自X基因组臂中分离出插入片段DNA。将Notl片段连接到经Notl消化的pBluescriptSK+中，并使用RAGE特异性引物对插入片段进行测序。所获得的克隆体称为克隆体18.2。编码狒狒RAGE的经克隆狒狒基因组DNA的核苷酸序列显示于图12A-12-E(SEQIDNO:15)中。实例12嵌合XT-M4抗体通过使大鼠抗鼠科动物RAGE抗体XT-M4的轻链及重链可变区分别与人类k轻链及IgGl重链恒定区融合产生嵌合XT-M4。为降低抗体的潜在Fc介导的效应子活性，将嵌合突变L234A及G237A引入到XT-M4中(人类IgGlFc区域中)。将所述嵌合抗体分子编号为XT-M4-A-1。嵌合XT-M4抗体含有93.83%的人类氨基酸序列及6.18%的大鼠氨基酸序列。实例13评价嵌合XT-M4与RAGE的结合通过ELISA及BIACORETM结合测定来测量嵌合抗体XT-M4及所选大鼠及鼠科动物抗RAGE抗体与人类RAGE及其它物种的RAGE结合及阻断RAGE配体的结合的能力。A.通过BIACORETM结合测定测量与可溶性人类RAGE的结合通过BIACORETM俘获结合测定来测量嵌合抗体XT-M4、亲本大鼠抗体XT-M4及鼠科动物抗体XT-H2及XT-H5与可溶性人类RAGE(hRAGE-SA)的结合。所述测定是通过将抗体以5000-7000RU涂覆到CM5BIA芯片上来实施。使100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.12nM、1.56nM及0nM浓度的标记有抗生蛋白链菌素的经纯化可溶性人类RAGE(hRAGE-SA)溶液一式三份流过经固定的抗体，并测定与hRAGE-SA结合的动力学速率常数(ka及kd)及缔合及解离常数(Ka及Kd)。结果显示于表6中表6与hRAGE-SA结合的动力学速率常数及平衡常数ka(l/Ms)kd(1/s)Ka(l/M)K"M)R~MaxX2XT-M43.78X1061.86X10-22.03X1084.92X10-961.50.563嵌合抗体XT-M44.39X1062.48XI(T21.77X1085.66X10-933.10.436XT-H21.10X1061.16X1CT39.48X1081.06X10—948.12.7XT-H51.66X1064.51XI(T33.69X1082.71X10-924.50.996XT-M4抗体及嵌合抗体XT-M4以类似动力学与单体可溶性人类RAGE结合。嵌合XT-M4对人类可溶性单体RAGE的亲和力约为5.5nM。B.RAGE配体竞争ELISA结合测定如实例7中所述，通过配体竞争ELISA结合测定来测定嵌合抗体XT-M4抗体及大鼠抗体XT-M4阻断RAGE配体HMGB1、淀粉样蛋白(31-42肽、S100-A及S100-B与hRAGE-Fc结合的能力。如图13中所示，嵌合抗体XT-M4及XT-M4阻断HMGB1、淀粉样蛋白|31-42肽、S100-A及S100-B与人类RAGE结合的能力几乎相同。C.抗体竞争ELISA结合测定以实例7中所述方式，通过抗体竞争ELISA结合测定来测定嵌合抗体XT-M4抗体与大鼠抗体XT-M4及鼠科动物抗体XT-H2竞争与hRAGE-Fc结合的能力。如图14中所示，嵌合抗体XT-M4与大鼠抗体XT-M4及鼠科动物抗体XT-H2竞争与hRAGE-Fc结合。实例14通过基于细胞的ELISA测量抗体与不同物种RAGE的结合。细胞转染将人类胚胎肾293细胞(美国组织典型培养物(AmericanTissueTypeCulture),马纳萨斯(Manassas)，弗吉尼亚州(VA))以5x106个细胞/10cr^铺板于组织培养物板上并在37匸下培养过夜。第二天，利用制造商方案使用LF2000试剂(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)用RAGE表达质粒(编码小鼠、人类、狒狒、食蟹猴或兔RAGE的pAdoril-3载体)以试剂:质粒DNA为4:1的比例将细胞转染。在转染后48小时使用胰蛋白酶收获细胞，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，随后以2xl()S个细胞/ml的浓度悬浮于无血清生长培养基中。基于细胞的ELISA将1昭/ml—级抗体以1:2或1:3连续稀释于96-孔板中含有1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS中。将以2x106个细胞/1111存于无血清生长培养基中的经RAGE转染的293细胞或对照亲本293细胞(50pl)添加到U-形底％孔板中，最后浓度为1x105个细胞/孔。将细胞在1600rpm下离心分离2分钟。经一次旋转用手轻轻弃除上清液并轻拍所述板使细胞团粒松散。向细胞中添加存于含有10。/。胎牛血清(FCS怖冷PBS中的经稀释一级抗RAGE抗体或同种型匹配对照抗体(IOOW)并在冰上培育1小时。.将细胞用100经稀释二级抗IgG抗体HRP偶联物(皮尔斯生物技术公司，洛克福特，伊利诺斯州)在冰上染色1小时。一级抗体及二级抗体培育的每一步骤后都用冰冷PBS将细胞洗涤3次。向板中添加100pl底物TMB1组份(BIOFX，TMBW-0100-01)并在室温下培育5-30分钟。通过添加100^10.18MH2S04终止显色。对细胞进行离心分离并将上清液转移到新鲜板上并在450nm处读数(软件MAXpro4.0，分子装置公司(MolecularDevicesCorporation),桑尼维尔(Sunnyvale)，加利福尼亚州)。通过基于细胞的ELISA测定的抗体嵌合XT-M4及XT-M4与人类及狒狒RAGE结合的能力显示于图14中。通过基于细胞的ELISA测定的嵌合抗体XT-M4及XT-M4与由293细胞表达的细胞表面人类、狒狒、猴、小鼠及兔RAGE结合的EC50值显示于表7中。<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>实例15通过免疫组织化学染色测定与不同物种RAGE的结合通过肺组织切片的免疫组织化学(IHC)染色来测定嵌合抗体XT-M4、大鼠XT-M4抗体及鼠科动物抗体XT-H1、XT-H2、及XT-H5与人类、食蟹猴、狒狒、及兔肺组织中内源细胞表面RAGE的结合能力。经稳定转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞经设计以表达鼠科动物及人类RAGE全长蛋白。将鼠科动物及人类RAGEcDNA克隆到哺乳动物表达载体中，线性化并使用脂转染试剂方法转染到CHO细胞中(考夫曼，1990，酶学方法，185:537-66;考夫曼，1990，酶学方法，185:487-511;皮特曼等人，1993，酶学方法，222:236)。在20nM甲氨蝶呤中对细胞进行进一步选择并自各克隆体中收获细胞提取物并通过SDS十二垸基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及西方墨点法予以分析以证实表达。利用标准技术实施自过表达人类RAGE的狒狒、食蟹猴、兔或中国仓鼠卵巢细胞或对照CHO细胞分离的RAGE肺组织的免疫组织化学。使用1-15mgRAGE抗体及大鼠IgG2b同种型对照或小鼠同种型对照。使嵌合XT-M4、XT陽M4-hVH-V2.0陽2m/hVL-V2.10、XT-M4-hVH-V2.0陽2m/hVL-V2.11、XT-M4-hVH-V2.0-2m/hVL-V2.14生物素化并使用0.2、1、5及10pg/ml的西格玛(sigma)IgGl生物素化对照抗体。在用HRP及AlexaFluor594、AlexaFluor488或偶联FITC的抗生物素检测后，也用4'-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)将切片染色。图15显示嵌合抗体XT-M4与食蟹猴、兔及狒狒肺组织中的RAGE结合。在其中产生RAGE的细胞与嵌合XT-M4接触的样品中可以看到阳性IHC-染色形式，但在不存在RAGE或RAGE结合抗体的样品中则不能。图16显示大鼠抗体XT-M4与正常人类肺及患有慢性阻塞性肺疾病(COPD)的人类肺中的RAGE结合。通过肺组织切片的IHC染色测定的大鼠XT-M4抗体及鼠科动物抗体XT-H1、XT-H2及XT-H5与脓毒性狒狒肺及正常食蟹猴肺中内源细胞表面RAGE的结合概述于表8中。使用经表达载体稳定转染的CHO细胞作为阳性对照，所述表达载体表达编码hRAGE的DNA。表8通过IHC测定的与非人类灵长类动物肺中RAGE的结合<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>实例16人类化鼠科动物抗人类RAGE抗体XT-H2的分子模型鼠科动物抗人类RAGE抗体XT-H2HV结构域的分子模型基于对蛋白质数据库(PDB)序列数据库进行BLASTP搜索选择用于模拟鼠科动物XT-H2重链的抗体结构模板。鼠科动物XT-H2的分子模型是使用InsightII同源模组(艾克乐瑞斯(Accelrys)，圣地亚哥(SanDiego))基于6个模板结构构建，1SY6(抗CD3抗体)、1MRF(抗RNA抗体)、及1RIH(抗肿瘤抗体)。基于每一分子的Ca距离矩阵测定模板的结构保守区域(SCR)并基于SCR中对应原子的最小RMS偏离使模板结构迭加。将靶蛋白大鼠XT-H2VH的序列与所迭加模板蛋白的序列进行比对并将SCR的原子坐标指定为耙蛋白的对应残基。基于每一SCR中靶与模板间序列的相似程度，不同SCR使用来自不同模板的坐标。未包括在SCR内的环及可变区的坐标通过同源模组中所实施的搜索环(SearchLoop)或产生环(GenerateLoop)方法产生。简单来说，搜索环方法通过将侧接SCR残基的Ca距离矩阵与源自具有相同数目侧接残基及给定长度间插肽节段的蛋白质结构的预计算矩阵进行比较对酷似2个SCR间区域的蛋白质结构进行扫描。对搜索环方法的结果进行评价以首先找出侧接SCR残基中具有最小RMS偏离及最大序列一致性的匹配。随后着手评价潜在匹配与耙环序列间的序列相似性。在搜索环方法未发现最佳匹配的那些情况下重新使用产生环方法来产生原子坐标。若模板与靶中的氨基酸残基相同，则使氨基酸侧链的构象与模板中的构象保持相同。然而，实施旋转异构体的构象搜索并将在能量方面最有利的构象保留给那些在模板及靶中不相同的残基。为优化两个相邻SCR(其坐标根据不同模板确定)间及SCR与环间的剪接点，使用同源模组的剪接修复功能。剪接修复实施分子力学模拟以在2个SCR间或SCR与可变区间的剪接点上获得最佳键长及键角。最后，对模型实施能量最小化，直至使用最陡下降算法时最大导数为5kcal/(mo1A)或500个循环及使用共轭梯度算法时最大导数为5kcal/(mo1A)或2000个循环。使用同源模组的ProStat/S加ct—检查(ProStat/Struct—Check)功用对模型质量进行评价。人类化抗RAGEXT-H2HV结构域的分子模型人类化(CDR移植)抗RAGE抗体XT-H2重链的分子模型是用InsightII按照与对于小鼠XTH2抗体重链所述相同的程序构建，只是使用不同的模板。在此情况下使用的结构模板是1L7I(抗ErbB2抗体)、1FGV(抗CD18抗体)、UPS(抗组织因子抗体)及1N8Z(抗Her2抗体)。框架回复突变的模型分析及预测-人类化比较亲本小鼠抗体模型与CDR移植人类化形式模型在一或多个以下特征方面的相似性及差异CDR-框架接触、影响CDR构象的潜在氢键、及各区域(例如框架l、框架2、框架3、框架4及3个CDR)的RMS偏离。经预测，以下回复突变(单独或组合)对于通过CDR移植进行的成功人类化甚为重要E46Y、R72A、N77S、N74K、R67K、K76S、A23K、F68A、R38K、A概。实例17人类化大鼠抗RAGE抗体XT-M4的分子模型大鼠抗鼠科动物RAGE抗体XT-M4HV结构域的分子模型基于对蛋白质数据库(PDB)序列数据库进行BLASTP搜索选择用于模拟大鼠XT-M4重链的抗体结构模板。大鼠XT-M4的分子模型是使用InsightII同源模组(艾克乐瑞斯，圣地亚哥)基于6个模板结构构建1QKZ(抗肽抗体)、1IGT(抗犬科动物淋巴瘤单克隆抗体)、8FAB(抗对-偶氮苯基胂酸盐抗体)、1MQK(抗细胞色素C氧化酶抗体)、1H0D(抗血管生成素抗体)、及1MHP(抗alpi抗体)。基于每一分子的Ca距离矩阵测定模板的结构保守区域(SCR)并基于SCR中对应原子的最小RMS偏离使模板结构迭加。将靶蛋白大鼠XT-M4VH的序列与所迭加模板蛋白的序列进行比对并将SCR的原子坐标指定为靶蛋白的对应残基。基于每一SCR中靶与模板间序列的相似程度，不同SCR使用来自不同模板的坐标。未包括在SCR内的环及可变区的坐标通过同源模组中所实施的搜索环或产生环方法产生。简单来说，搜索环方法通过将侧接SCR残基的Ca距离矩阵与源自具有相同数目侧接残基及给定长度间插肽节段的蛋白质结构的预计算矩阵进行比较对酷似2个SCR间区域的蛋白质结构进行扫描。对搜索环方法的结果进行评价以首先找出在侧接SCR残基中具有最小RMS偏离及最大序列一致性的匹配。随后着手评价潜在匹配与靶环序列间的序列相似性。在搜索环方法未发现最佳匹配的那些情况下重新使用产生环方法来产生原子坐标。若模板与靶中的氨基酸残基相同，则使氨基酸侧链的构象与模板中的构象保持相同。然而，实施旋转异构体的构象搜索并将在能量方面最有利的构象保留给那些在模板及靶中不相同的残基。为优化两个相邻SCR(其坐标根据不同模板确定)间及SCR与环间的剪接点，使用同源模组的剪接修复功能。剪接修复实施分子力学模拟以在2个SCR间或SCR与可变区间的剪接点上获得最佳键长及键角。最后，使模型能量最小化，直至使用最陡下降算法时最大导数为5kcal/(mo1A)或500个循环及使用共轭梯度算法时最大导数为5kcal/(mo1A)或2000个循环。使用同源模组的ProStat/Struct—检査功用对模型质量进行评价。XT-M4轻链可变结构域XTM4轻链可变结构域的结构模型是用Modeler8v2使用1K6Q(抗组织因子抗体)、1WTL、1D5B(抗体AZ-28)及1B0G(抗p24抗体)作为模板产生。对于每一个靶，在100个初始模型中，选择经分子概率密度函数定义对限制具有最低违背的一个模型来进一步优化。对于模型优化，使用Charmm27力场(艾克乐瑞斯软件公司)及构建于DiscoveryStudio1.6(艾克乐瑞斯软件公司)中的广义波恩虚拟溶剂模型(GeneralizedBornimplicitsolvation)实施由最陡下降、共轭梯度及所采纳基础牛顿拉富生方法(AdoptedBasisNewtonRaphsonmethod)组成的能量最小化级联，直至满足RMS梯度为0.01。在能量最小化期间，使用IO质量力的谐波约束限制骨架原子的运动。人类化抗RAGEXT-M4VH结构域的分子模型人类化(CDR移植)抗RAGE抗体XT-M4抗体重链的分子模型是用InsightII按照与对于大鼠XTM4抗体重链所述相同的程序构建，只是使用不同的模板。在此情况下使用的结构模板是1MHP(抗alpl抗体)、1IGT(抗犬科动物淋巴瘤单克隆抗体)、8FAB(抗对-偶氮苯基胂酸盐抗体)、1MQK(抗细胞色素C氧化酶抗体)及1H0D(抗血管生成素抗体)。人类化XT-M4轻链可变结构域人类化(CDR移植)抗RAGE抗体XTM4抗体轻链的分子模型是使用Modeler8v2按照与对于大鼠XTM4抗体轻链所述相同的程序构建，只是使用不同的模板。在此情况下使用的结构模板是1B6D、1FGV(抗CD18抗体)、1UJ3(抗组织因子抗体)及1WTL作为模板。框架回复突变的模型分析及预测-人类化比较亲本大鼠抗体模型与CDR移植人类化形式模型在一或多个以下特征方面的相似性及差异CDR-框架接触、影响CDR构象的潜在氢键、各区域(例如框架1、框架2、框架3、框架4及3个CDR)的RMS偏差、及所计算的残基-残基相互作用能量。将所识别的潜在回复突变(单独或组合)纳入使用InsightII或Modeler8v2构建的另一组模型中并将突变体的模型与亲本大鼠抗体模型进行比较以在电脑上评价突变体的适宜性。经预测，以下回复突变(单独或组合)对于通过CDR移植进行的成功人类化甚为重要重链L114M、T113V及A88S;轻链K45R、L46R、L47M、D70I、G66R、T85D、Y87H、T69S、Y36F、F71Y。实例18具有鼠科动物XT-H2及大鼠XT-M4抗体的CDR的人类化可变区人类化重链可变区是通过将鼠科动物XT-H2及大鼠XT-M4抗体的CDR移植到表9中所示的人类种系框架序列上并引入所选回复突变制备。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>人类化鼠科动物XT-H2重链及轻链可变区的氨基酸序列分别显示于图17(SEQIDNO:28-3l)及图18(SEQIDNO:32-35)中。人类化大鼠XT-M4重链及轻链可变区的氨基酸序列分别显示于图19(SEQIDNO:36-38)及图20A-20B(SEQIDNO:39-49)中。框架序列衍生自其的种系序列及人类化可变区中的特定回复突变在表10中给出。将编码人类化可变区的DNA序列亚克隆到含有编码人类免疫球蛋白恒定区的序列的表达载体中，并使用标准程序在COS细胞中表达编码全长轻链及重链的DNA序歹i」。将编码重链可变区的DNA亚克隆到pSMED2hlgGlm—(L234,L237)cDNA载体中，产生人类化IgGl抗体重链。将编码轻链可变区的DNA亚克隆到pSMEN2hK载体中，产生人类化k抗体轻链。参见图21。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>竞争ELISA实验方案人类化XT-H2及XT-M4抗体及嵌合XT-M4与人类RAGE-Fc的结合是通过竞争酶联免疫吸附测定(ELISA)来定性。为产生竞争者，将亲本大鼠XT-M4抗体生物素化。将ELISA板涂覆1吗/ml人类RAGE-Fc过夜。将不同浓度的生物素化XT-M4一式两份添加到孔中(0.11-250ng/ml)，培育，洗涤并用抗生蛋白链菌素-HRP检测。所计算的经生物素化亲本大鼠XT-M4的ED50值为5ng/ml。当与12.5ng/ml生物素化亲本XT-M4抗体竞争时，计算嵌合及每一人类化XT-M4抗体的IC50值。简单来说，将板涂覆l吗/ml人类RAGE-Fc过夜。将不同浓度的与12.5ng/ml生物素化亲本大鼠XT-M4混合的嵌合或人类化抗体一式两份添加到孔中(介于9ng/ml到20吗/ml范围内)。用抗生蛋白链菌素-HRP检测生物素化亲本大鼠XT-M4抗体并计算IC50值。通过竞争ELISA分析测定的人类化抗体的IC50值显示于表11中。表11<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>人类化XT-H2抗体与人类RAGE-Fc结合的ED50值通过竞争ELISA以类似方式测定且显示于图22中。实例20嵌合及人类化XT-M4抗体与其它细胞表面受体的交叉反应性测试人类化XT-M4抗体XT-M4-hVH-V2.0-2m/hVL-V2.10及XT-M4-hVH-V2.0-2m/hVL-V2.U连同嵌合XT-M4与其它RAGE样受体的交叉反应性。选择这些受体是因为其与RAGE—样为细胞表面表达，且其与配体的相互作用类似地依赖于电荷。所测试的受体是rhVCAM-l、rhlCAM-l-Fc、rhTLR4(C-端His标签)、rhNCAM-l、rhB7-Hl-Fcml—oxl-Fc、hi—oxl-Fc及hRAGE-Fc(作为阳性对照)。将ELISA板用1pg/ml所列示的受体蛋白涂覆过夜。将各种浓度的上文列示人类化及嵌合XT-M4抗体一式两份添加到孔中(0.03至20pg/ml)，培育，洗涤并用抗人类IgGHRP检测。表12显示嵌合及人类化XT-M4抗体与人类及小鼠细胞表面蛋白结合的直接结合ELISA分析的结果。所显示数据是所检测的受体与20^g/ml(所测试的最高浓度)抗体结合的OD450值。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>'实例21与可溶性人类RAGE结合的BIACORETM结合测定通过BIACORETM俘获结合测定来测量嵌合抗体XT-M4及人类化XT-M4抗体与可溶性人类RAGE(hRAGE-SA)及可溶性鼠科动物RAGE(mRAGE-SA)的结合。通过将抗人类Fc抗体以5000RU(pH5.0，7min,)涂覆到流动池1-4中的CM5BIA芯片上实施测定。通过以2.0吗/ml流过流动池2-4中的抗Fc抗体俘获每一抗体(流动池1用作参考)。使100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM、1.25nM及0nM浓度的标记有抗生蛋白链菌素的经纯化可溶性人类RAGE(hRAGE-SA)溶液一式两份流过经固定的抗体，解离5分钟，并测定与hRAGE-SA结合的动力学速率常数(ka及kd)及缔合及解离常数(Ka及Kd)。嵌合XT-M4及人类化抗体XT-M4-V10、XT-M4-V11、及XT-M4-V14与hRAGE-SA及mRAGE-SA结合的结果分别显示于图23及24中。实例22前导抗体XT-H2的物种交叉反应性的优化物种交叉反应性通过以下过程设计使XT-H2抗体随机突变，产生蛋白质变体文库并选择性地富集那些具有导致小鼠-人类RAGE交叉反应性的获得性突变的分子。利用核糖体展示(黑尼斯(Hanes)等人，2000，酶学方法，328:404-30)及噬菌体展示(McAfferty等人，1989，自然，348:552-4)技术。基于抗体XT-H2及HT-M4制备ScFv抗体。A.基于XT-H2的ScFv抗体合成包含XT-H2的V区域的两种ScFv构建体，所述两种构建体是借助DGGGSGGGGSGGGGSS(SEQIDNO:50)挠性连接体连接的VH/VL形式或VL/VH形式。构型为VL-VH及VH-VL的ScFv构建体的序列分别显示于图25(SEQIDNO:51)及图26(SEQIDNO:52)中。B.基于XT-M4的ScFv抗体合成包含XT-M4的V区域的两种ScFv构建体，所述两种构建体是借助DGGGSGGGGSGGGGSS(SEQIDNO:50)挠性连接体连接的VH/VL形式或VL/VH形式。构型为VL-VH及VH-VL的ScFv构建体的序列分别显示于图27(SEQIDNO:54)及图28(SEQIDNO:53)中。图29显示活体外转录及翻译的M4及H2构建体的ELISA数据。将ELISA板用存于碳酸氢盐缓冲液中的人类RAGE-Fc(5pg/ml)或BSA(200pg/ml)在4'C下涂覆过夜，用PBS+吐温0.05%洗涤并在室温下用2%奶粉PBS阻断1小时。在室温下将板与活体外翻译的ScFv培育2小时。将板阻断并用抗Flag抗体(1/1000稀释)随后兔抗小鼠HRP(1/1000稀释)检测。数据显示，VL/VH或VH/VL构型的XT-H2及XT-M4抗RAGE抗体的可变区的ScFv构建体可产生与人类RAGE特异性结合的功能折叠蛋白。使用通过BIACORETM测定的两种形式ScFv的Kd值来确定用于选择实验的最佳抗原浓度。C.回收具有改良的小鼠/人类RAGE交叉反应性的变体的选择及筛选策略通过错配PCR创建变体文库(革兰(Gram)等人，1992，PNA89:3576-80)。此诱变策略在ScFv基因的整个长度上引入随机突变。随后使用已确定程序(例如，黑尼斯等人，2000，酶学方法，328:404-30)在活体外转录及翻译所述文库。使此文库在人类-RAGE-Fc上经历第l轮选择，洗掉未结合的核糖体复合物，并对结合抗原的核糖体复合物进行溶析。回收RNA，通过RT-PCR转化成cDNA并在小鼠RAGE-Fc上经历第2轮选择。此交互选择策略优先富集与人类及小鼠RAGE-Fc二者均结合的克隆体。随后使来自此选择的产物经历第2次错配PCR。随后使所产生的文库经历第3轮选择且所述选择轮分别在人类-RAGE-Fc及小鼠RAGE-Fc上进行。视需要重复此过程。将来自每一选择步骤的RNA产物集合转化成cDNA并克隆到蛋白质表达载体pWRIL-l中以评价变体ScFv的物种交叉反应性。也对多样性集合进行测序以评价多样性来确定选择是否朝向具有物种交叉反应性的显性克隆体。实例23前导抗体XT-M4的亲和力成熟提高的亲和力转化成剂量降低或剂量频率减小及/或功效提高的潜在益处。hRAGE的亲和力通过亲和力成熟利用VH-CDR3靶向诱变与随机错配PCR诱变的组合过程(革兰等人，1992，PNA89:3576-80)来提高。此产生抗体变体文库，自此文库回收对于人类-RAGE具有提高的亲和力同时保持对于小鼠-RAGE-Fc的物种交叉反应性的分子。利用核糖体展示技术(黑尼斯等人，1997，见上文)及噬菌体展示技术(McAfferty等人，1989，见上文)。图30显示pWRIL-l中呈VL-VH形式的XT-M4及XT-H2ScFv构建体的ELISA结合数据，所述构建体在大肠杆菌中以可溶性蛋白形式表达并在人类RAGE-Fc及BSA上测试结合。ActRIIb代表自作为阴性对照的相同载体表达的非结合蛋白。将ELISA板用存于碳酸氢盐缓冲液中的人类RAGE-Fc(5吗/ml)或BSA(200吗/ml)在4r下涂覆过夜，用PBS+吐温0.05%洗漆并在室温下用2%奶粉PBS阻断1小时。使用标准程序实施20ml大肠杆菌培养物的周质制备。未经纯化ScFv抗体的周质制备品的最终体积为1ml，用2M奶粉PBS将其中50|11与以1/1000稀释的抗His抗体(总体积为100pl)在室温下预培育1小时。将交联周质制备品添加到ELISA板中并在室温下再培育2小时。将所述板用PBS+0.05n/o吐温洗涤两次并用PBS洗涤两次并与以1/1000稀释的兔抗小鼠HRP—起在2%奶粉PBS中预培育。如先前所述洗涤所述板并使用标准TMB试剂检测结合。数据显示，VL/VH构型的XT-M4及XT-H2抗体的ScFv构建体可在大肠杆菌中产生与人类RAGE特异性结合的功能折叠可溶性蛋白。使用通过BIACORETM测定的两种形式ScFv的起始Kd值来确定用于亲和力选择的最佳抗原浓度。实例24回收对于hRAGE-Fc具有提髙的亲和力同时保持物种交叉反应性的变体的选择及筛选策略通过XT-M4VH-CDR3的掺加诱变利用PCR创建变体文库。图31示意性地展示如何使用PCR将掺加突变引入到XT-M4的CDR中。(1)掺加寡核苷酸被设计为在CDR环长度上携带多样性区(regionofdiversity)并且两侧为与FR3及FR4中的靶V基因同源的区域。(2)在与特异性引物的PCR反应中使用寡核苷酸，所述特异性引物退火到靶V基因的5'末端并与FR1区域同源。图32显示XT-M4VL-VHScFv构建体的C末端的核苷酸序列(SEQIDNO:56)。VH-CDR3加以下划线。也显示两种掺加寡核苷酸(SEQIDNO:57-58)，在每一突变位点上具有显示用于所述位点突变的掺加比的数字。也显示与所述数字对应的掺加比的核苷酸组成。将XT-M4-VHCDR3掺加PCR产物以Sj7/片段克隆到核糖体展示载体pWRIL-3中以产生文库。利用核糖体展示(黑尼斯及普拉克顿(Pluckthun)，2000)在人类生物素化RAGE上对此文库进行选择。使用经生物素标记的抗原是因为此允许基于溶液的选择，所述基于溶液的选择允许对过程予以更动力学控制并增加优先富集较高亲和力克隆体的可能性。可在平衡方式下以相对于起始亲和力渐减的抗原浓度实施选择或在动力学方式下实施选择，其中特别选择高解离速率以在根据经验确定的时间范围内利用与未经标记抗原的竞争。洗掉未结合的核糖体复合物，对结合抗原的核糖体复合物进行溶析，回收RNA,通过RT-PCR转化成cDNA并在生物素化小鼠-RAGE-Fc上实施第二轮选择以保持物种交叉反应性。随后使来自此选择步骤的含有在VH-CDR3中具有突变的ScFv变体的产物经历第2周期诱变步骤。此诱变步骤涉及使用错配PCR产生随机突变。随后使所产生的文库在生物素化人类-RAGE-Fc上以十分之一的抗原浓度经历第3轮选择。视需要重复此过程。将来自每一选择步骤的RNA产物集合转化成cDNA并克隆到蛋白质表达载体pWRIL-l中以将变体ScFv的亲和力和物种交叉反应性分级。也对多样性集合进行测序以评价多样性来确定选择是否朝向显性克隆体。实例25利用噬菌体展示使XT-M4亲和力成熟将VH-CDR3掺加文库克隆到图34中所示的噬菌体展示载体pWRIL-l中以在生物素化hRAGE上进行选择。使用经生物素标记的抗原是因为此形式更适合溶液中的亲和力驱动选择。可在平衡方式下以相对于起始亲和力渐减的抗原浓度实施选择或在动力学方式下实施选择，其中特别选择高解离速率以在根据经验确定的时间范围内利用与未经标记抗原的竞争。利用噬菌体展示的标准程序。ScFv可二聚，此使得选择及筛选程序变得复杂。二聚体ScFv潜在显示基于亲合力的结合并且此增加的结合活性可支配选择。ScFv二聚能力的所述改进而非亲和力的任何内在改进与最终治疗性抗体(其通常为IgG)具有较少相关性。为避免由二聚能力改变产生的制造物，使用Fab抗体形式，因为其通常不会二聚。将XT-M4重新格式化为Fab抗体并克隆到新的噬菌体展示载体pWRIL-6中。此载体具有横跨VH及VL两个区域且在人类种系V基因中不会频繁相交的限制位点。这些限制位点可用于VL及VH谱的改组及组合装配。在一种策略中，将VH-CDR3及VL-CDR3掺加文库二者均组合装配于图34中所示的Fab展示载体中，并针对提高的亲和力进行选择。实例26嵌合抗体XT-M4的物理定性通过高效液相色谱(HPLC)/质谱(MS)肽谱及网上MS检测的亚单位分析的初步定性已证实氨基酸序列与来自嵌合XT-M4DNA序列的预测相同。这些MS数据也表明，在ASn299SerThr处的预期W-连接寡糖序列共有序列位点已被占据且两种主要物质是分别含有零个或一个末端半乳糖残基的复合物N-连接二天线核心岩藻糖化聚糖。除位于分子Fc区域中的预期N-连接寡糖外，也在嵌合XT-M4重链的CDR2区域中的序列共有序列位点(Asn"AsnSer)上观察到N-连接寡糖。此额外N-连接寡糖主要仅见于一条重链上且通过CEX-HPLC分析测定其占分子的约38%(可能存在不能由一级结构区分的其它酸性物质，其可构成酸性物质总百分比)。主要物质是具有两个唾液酸的核心岩藻糖化二天线结构。使用吸光度通过测量A28Q值来计算浓度。经计算，嵌合XT-M4的理论吸光度为1.35mLmg"cm"。通过非还原SDS-PAGE测定的嵌合XT-M4的表观分子量约为200kDa。抗体迁移比自其序列预期的较为缓慢。对于迄今分析的所有重组抗体都观察到此现象。在还原条件下，嵌合XT-M4具有在约50kDa处迁移的单重链带及在约25kDa处迁移的单轻链带。也存在正好在重链带上方迁移的额外带。此带的特征在于自动埃德曼降解(Edmandegradation)且经测定具有与嵌合XT-M4的重链对应的顺2-端。这些结果连同通过SDS-PAGE所观察到的分子量增加表明，所述额外带与在CDR2区域中具有额外N-连接寡糖的重链一致。基于氨基酸序列预测的嵌合XT-M4的等电点(pl)为7.2(在重链中没有COOH-端Lys)。等电聚焦(正F)使嵌合XT-M4解析成在约7.4-8.3的pl范围内迁移的十条带，其中一条显著的带在pl约7.8处迁移。通过毛细管电泳等电聚焦测定的pl约为7.7。通过阳离子交换高效液相色谱(CEX-HPLC)对显色材料进行分析可提供对分子电荷不同的嵌合XT-M4物质的进一步解析。所观察到的多半电荷异质性最可能归于在位于重链CDR2区域中的额外N-连接寡糖上发现的唾液酸的贡献。小部分电荷异质性可能归因于COOH-端赖氨酸的异质性。实例27去除糖基化位点如图36中所示，通过与hRAGE-Fc的直接结合ELISA分析测定，使抗体XT-M4重链可变区中位置52(根据卡百特编号)上的天冬酰胺(N)转化成天冬氨酸(D)的突变可使XT-M4抗体与人类RAGE的结合得以改良。N52D突变是在抗体XT-M4重链可变区的CDR2中。实例28脓毒症及利斯特菌病的治疗已显示，抗RAGE抗体在多种微生物、腹内脓毒症的标准鼠科动物模型中提供显著治疗益处。所述结果也显示，RAGE表达对经单核细胞增生性利斯特菌全身攻击的动物非常有害，此可由与野生型动物相比纯合RAGE基因剔除小鼠及杂合体中观察到的显著存活益处予以证实。A.材料及方法除非另外说明，否则所有试剂及化学品都购自西格玛(圣路易斯，密苏里州)。在上文中已阐述大鼠单克隆抗体XT-M4IgG对鼠科动物二聚体RAGE的亲和力常数为0.3nM。抗肿瘤坏死因子a(TNF)单克隆抗体TN3.1912是源自仓鼠的中和IgG抗体，其与鼠科动物TNF结合的亲和力较高。单核细胞增生性利斯特菌的攻击菌株购自美国典型细胞培养物(AmericanTypeCellCultures)(ATCC#19115，马纳萨斯，弗吉尼亚州)。这些实验中使用的所有小鼠品系都是2-6月龄且为维持在生物安全水平2条件下的无特殊病原体动物。BALB/c(査理士河实验室公司，威尔明顿，马萨诸塞州)野生型雄性小鼠、纯合RAGE—A129SvEvBrd雄性小鼠、杂合RAGE+/'129SvEvBrd雄性小鼠、及野生型129SvEvBrd雄性小鼠(在韦思(Wyeth)的住宅中饲养)。在韦思研究中将RAGE基因剔除小鼠设计成基因靶向条件化基因剔除129SvEv-Brd小鼠，其中Cre重组酶切除外显子2、3及4(LexiconGenetics公司，伍德兰(TheWoodlands),TX)。所得缺失导致RAGE蛋白移码截短且并不产生蛋白质。RAGE对于小鼠的生存能力并不是必需的。RAGE裸小鼠不具有明显表型且正常饲养。在CLP或单核细胞增生性利斯特菌攻击后长达七天对小鼠存活进行评价。对CLP及利斯特菌病两种实验后尸检时自小鼠获得的器官样品实施定量微生物学。血液样品是在牺牲时自存活动物获得，并采集血清并立即置于冰上以用于细胞因子测定。血清细胞因子是通过酶联免疫吸附测定多重测定使用MesoScaleDelivery(盖瑟斯堡，马里兰州)提供的定制板及方案来测量。所测定的细胞因子是MCP-l、IL-ip、TNFa、干扰素Y及IL-6。自肺、肝及脾中采集组织样品。腹膜液是通过用5ml无菌盐水灌洗腹膜腔并抽出流体获得。将器官组织称重并随后粉碎以产生存于TSB中的组织悬浮液。将样本连续稀释并在37t:下在TSB(对于革兰阴性及革兰阳性细菌)及麦氏琼脂(MacConkeyagar)(对于革兰阴性细菌)上进行好氧培养以获得标准化的定量细菌计数/克器官重量或CFU/ml腹膜灌洗液。也由不知情每一动物治疗分配的病理学家对动物组织(肺、回肠远端)进行组织学分析并在自0(正常)到4(扩散及大范围组织坏死)分级的界定病理学分数上进行评分。自肺组织的湿干比计算作为肺水肿液测量的肺总水量。-统^学没#-及^^分析。每一实验中的主要终点是存活率。动物实验是使用使研究者不知情动物基因型或抗体治疗(相对于血清对照)的数字代码系统实施，直至完成研究。数字代码以平均值(+ASEM)呈现。通过卡-梅氏(Kaplan-Meier)存活率图及对数秩统计学(log-rankstatistic)来分析存活差异。使用非参数单程变异数分析统计学科-瓦氏(non-parametriconewayANOVAstatisticKruskal-Wallis)(对于多个群组)或曼-惠特尼U检验(Mann-WhitneyUtest)(对于两个群组)来分析群组间的差异。使用测试后迪恩多项比较(Du皿'smultiplecomparisonspost-test)来证实当分析比较涉及多个群组时的差异。双尾P值小于0.05视为显著。B.盲肠结扎及穿孔模型先前己详细阐述CLP程序[伊藤彻(Echtenacher)等人，1990，免疫学，145:3762-6]。简单来说，经腹膜内注射200微升氯胺酮(贝德福德(Bedford)公司，贝德福德市(Bedford),俄亥俄州(OH))(9mg/ml)与赛拉嗪(xylazine)(菲尼克斯(Phoenix)，圣路易斯市，密苏里州)(1mg/ml)组合使动物麻醉。通过中线剖腹术由腹中取出约1cm长度的盲肠。随后将盲肠在回盲部远端处用5.0单丝结扎(大于90%的盲肠经结扎)。用23号针头将盲肠的肠系膜对侧反复穿孔。随后使少量腔内容物通过两个穿孔位点以确保开放性。将盲肠返回到腹腔中，并分别用6.0单丝及外科缝合线缝合筋膜及皮肤切口。在手术后将P/。利多卡因(lidocaine)及杆菌肽(bacitracin)局部应用到手术位点上。所有动物都在手术后立即接受20mg/kg剂量的曲伐沙星(辉瑞(Pfizer)，纽约)(单次肌内注射)，并经皮下注射l.Oml生理盐水实施标准流体复苏。随后使测试动物返回到其各自笼中并使用热灯恢复体温，直至其恢复正常姿势及运动性。在CLP之前30-60分钟或在CLP后以如下时间间隔6、12、24、或36小时将7.5mg/kg或15mg/kg剂量(或血清对照)的抗RAGEmAbXT-M4—次静脉内给与野生型小鼠。作为额外对照，使五只动物经历假手术(经盲肠活动化及外置术实施剖腹手术，但并不结扎或穿孔)。结果A.CLP后纯合RAGE基因剔除小鼠、RAGE杂合体及野生型动物的存活。图37显示与野生型对照动物(11=15)相比纯合RAGE基因剔除小鼠(n-15)及RAGE杂合体(n-23)二者均具有显著存活优势(P小于0.001)。RAGE杂合体以及纯合RAGE基因剔除小鼠经保护几乎免于致命性多种微生物脓毒症(RAGE一对RAGE+A，P=ns)。与预期一样，所有假手术动物(n-5)都存活。在CLP之前30分钟给与另外15只野生型129SvEvBrd动物群组抗RAGEmAb且与野生型、血清治疗、对照动物相比其具有与RAGE基因剔除小鼠类似的存活优势。图38显示CLP后好氧革兰阳性及革兰阴性肠道细菌有机体的组织菌落计数。所有三个群组的肝及脾组织及腹膜液的组织浓度类似(P=ns)，但所有都显著高于假手术动物(P小于0.05)。与其它群组相比，纯合RAGE基因剔除小鼠具有最少量肺水，尽管此没有达到显著性(湿干比:4.8士0.2-RAGE;对5.0±0.4-RAGE仏对5.3士0.3陽wt;P=ns)。图39显示在CLP之前30-60分钟给与对照血清的BALB/c动物(r^l5)及给与抗RAGE抗体的动物(7.5mg/kg群组[n45]或15mg/kg群组[n45])的存活率具有显著差异。在15mg/kg抗RAGEmAb时达成最佳保护效果(相对7.5mg/kg群组P小于0.05;相对血清对照P小于0.001)且因此可在随后CLP后延迟mAb治疗的实验中使用此剂量。与对照动物相比，给与抗RAGE抗体的动物没有显著增加的器官细菌接种量，但两个群组均具有比假治疗对照动物(11=5)显著较多的菌落形成单位(CFU)/gm脾及肝组织。参见表1。在血清对照组中尸检时肺组织及小肠粘膜的组织病理学显著异常，而在抗RAGEmAb群组及假手术群组中病理学所见显著减少(表13)<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>图40显示在CLP后延长到至多36小时以时间间隔延迟投与单次剂量15mg/kg抗RAGE抗体的效果。在CLP后长达24小时的延迟单克隆抗体治疗提供显著的对抗致命性的保护(P小于O.Ol)。在CLP后长达36小时延迟投与mAb显示有利存活趋势，但与血清治疗对照组相比差异不再显著(P=0.12)。好氧肠道革兰阴性及革兰阳性细菌的组织浓度在治疗群组间无差异(P=ns)。延迟投与抗RAGE抗体后发现存活益处具有重要的临床应用，因为在脓毒性患者刺激事件后一般不能立即给与诸如抗RAGE抗体治疗等干预。这些数据支持使用抗RAGEmAb作为患有已确定严重脓毒症的患者的补救疗法。C.鼠科动物利斯特菌病攻击模型在这些实验中使用BALB/c野生型雄性小鼠、野生型雄性小鼠、杂合RAGE+A-129SvEvBrd雄性小鼠及纯合RAGE;-129SvEvBrd雄性小鼠。单核细胞增生性利斯特菌的标准接种物是自于37。C下在胰蛋白酶解酪蛋白大豆培养液(TSB)(BBL，Cockseyville，马里兰州)中生长18小时的培养物制备。将细菌在10,000g下于4°C下离心分离15min并再悬浮于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。通过分光光度测定调节细菌浓度并通过在胰蛋白酶解酪蛋白大豆琼脂板上用5。/。绵羊RBC(BBL，Cockseyville,马里兰州)实施定量稀释板计数来检査。经静脉内投与介于103-106个菌落形成单位(CFU)单核细胞增生性利斯特菌范围内的连续稀释物以测定野生型小鼠、纯合RAGE—:基因剔除小鼠、RAGE+/—杂合体及在细菌攻击前1小时静脉内给与15mg/kg抗RAGEmAb的野生型小鼠的1^5()值。在实施单核细胞增生性利斯特菌静脉内攻击后7天内跟踪动物并对存活者实施无痛致死术以用于组织分析及微生物学研究。对于详细差别定量微生物学及细胞因子测定，在静脉内输注抗RAGEmAb(15mg/kg)、抗TNFmAb(20mg/kg)或等体积1%自体鼠科动物血清(作为对照)后1小时经腹膜内给与104个CFU的标准接种物。在此标准接种后48小时也对野生型、RAGE+z'及RAGE一(r^5/群组)进行研究。在单核细胞增生性利斯特菌攻击后48小时对动物实施无痛致死术并通过切碎组织样品并在血液琼脂板上连续稀释实施肝及脾组织的定量微生物学。结果野生型小鼠的1^>5()值为(10§|())3.31±0.2CFU，而杂合RAGE基因剔除小鼠的LDso值为5.98±0.39，且纯合RAGE基因剔除小鼠的1^5()值为5.10±0.47。与野生型小鼠相比，对于RAGE杂合体及纯合体，全身性利斯特菌病LDM)值的此多于两个数量级的差异是统计学上显著的(P小于0.01)。单次剂量的XY-M4抗RAGE抗体也给野生型小鼠提供显著对抗全身性利斯特菌病的保护，LDso值为4.69士0.55(相对野生型对照P小于0.05)。抗RAGEmAb提供的对抗利斯特菌病的保护程度与RAGE;动物中观察到的类似，但不及RAGE+^动物获得的高(P小于0.05)。在野生型对照动物、给与抗RAGE抗体的动物、纯合RAGE基因剔除动物或RAGE杂合体的各群组(1!=10/群组)中实施1(^个CFU的标准全身性攻击后肝及脾组织中分离的单核细胞增生性利斯特菌的含量无统计学显著差异。参见图41。然而，在投与抗TNF抗体后在给与相同单核细胞增生性利斯特菌接种物的动物中器官细菌浓度具有高度统计学显著提高(P小于0.001)。图42显示治疗后干扰素Y的血清含量。利斯特菌攻击后的细胞因子测定显示与对照BALB/c动物相比纯合RAGE基因剔除动物中干扰素y的含量显著较低。与BALB/c对照相比，给与抗TNFmAb的BALB/c动物具有显著较高的干扰素y含量，而给与抗RAGEmAb的动物的干扰素Y含量与对照动物的干扰素y含量无统计学差异。IL-6观察到类似结果(抗TNFmAb群组-459±121pg/ml，相对对照组-38±14pg/ml;P小于0.01)及MCP-1(抗TNFmAb-1363±480pg/ml，相对对照组566±70pg/ml;P小于0.05)。与对照组相比，在RAGE缺失动物中或在抗RAGE抗体治疗群组中未发现IL-6或MCP-1含量的显著差异。其它细胞因子测定显示无显著差异。全身性单核细胞增生性利斯特菌攻击是用于小鼠先天性及获得性免疫应答研究的经典模型。利斯特菌攻击实验显示，纯合RAGE基因剔除动物及杂合体比野生型动物对此感染的容忍性显著较好，此表明在非伴随多种微生物脓毒症的炎症性状态下可以见到RAGE的有害效应。给与抗RAGEmAb的野生型动物及RAGE基因剔除动物以及野生型动物似乎清除单核细胞增生性利斯特菌。此与给与抗TNF抗体的动物相反，在给与抗TNF抗体的动物中组织样品中的单核细胞增生性利斯特菌菌落计数显著增加。类似地，在给与抗TNFmAb的动物中利斯特菌攻击后细胞因子含量增加，但所述含量与给与抗RAGEmAb的动物中的对照含量类似。这些发现表明RAGE在脓毒症发病机制中起重要作用。在两项单独CLP研究中，与注射1.0%自体小鼠血清的小鼠(20%存活率)相比，单次剂量XT-M4(7.5mg/kg，在CLP后1-6小时)在第7天时显示显著保护(65%存活率)。与接受经稀释BALB/c血清的小鼠约25%存活率相比，两次剂量XT-M4(7mg/kg，在CLP后6及12小时)在第7天时保护约85%的小鼠。与对照动物相比，在CLP后24小时投与单次剂量抗RAGEXT-M4也具有保护性。上述实验表明，RAGE在脓毒症的发病机制中起重要作用且表明抗RAGE抗体可能为治疗脓毒症的有用治疗剂。实例29在鼠科动物CLP模型中进一步评价抗RAGE抗体脓毒症的鼠科动物CLP模型导致多种微生物感染，伴有腹部脓肿及菌血症，且重新产生在人类疾病中观察到的血液动力学及代谢阶段。在此模型中，通过中线剖腹术由腹中取出约l厘米长度的盲肠，随后结扎，并用23号针头将盲肠的肠系膜对侧穿孔。将盲肠返回到腹腔中，并缝合筋膜及皮肤切口。动物接受一次曲伐沙星(20mg/kg)肌内注射，并用1.0ml生理盐水经皮下实施标准流体复苏。在CLP后7天内观察动物，在全天间隔检査注意到死亡时作记录。作为额外对照，使动物经历由盲肠活动化及外置术的剖腹手术组成的假手术，但并不结扎或穿孔。通过卡-梅氏存活率图比较存活结果并用非参数变异数分析测试予以分析。在鼠科动物CLP模型中评价RAGE抗体的预防性及治疗性投药功效及RAGE基因修饰小鼠。如图43中所示，与亲本野生型小鼠相比，纯合RAGE裸小鼠(RAGE,显示对抗盲肠结扎及穿孔致死效应的显著保护程度。到CLP后第8天为止，与野生型小鼠存活35%相比，80%的RAGE;小鼠在CLP后存活下来。RAGE^动物与RAGE;动物的表现类似。自存活时间分析可以看出，RAGE—z—动物比野生型动物在CLP后具有显著存活优势。这些发现表明RAGE在脓毒症发病机制中起重要作用。RAGE对于小鼠的生存能力并不是必需的。纯合RAGE缺失小鼠无明显表型。RAGE一、RAGE仏及RAGE+"位于129SvEvBrd背景菌株上。腹膜内(IP)投与、放射标记、XT-M4(4mg/kg)的药物代谢动力学分析显示T1/2为73h且Tm^为6h。XT-M4也在数种小鼠品系中展示有利的药物代谢动力学。经静脉内投与5mg/kgXT-M4到雄性BALB/c小鼠中展示非常低的血清清除率且Tl/2为4~5天。经腹膜内投与5mg/kgXT-M到雄性db/db小鼠中也显示类似药物代谢动力学。在两项单独CLP研究中，与注射1.0%自体小鼠血清的小鼠(15%-20%存活率)相比，单次剂量XT-M4(7.5mg/kg，在CLP后0-6小时)在第7天时显示对抗CLP影响的显著保护(大于50%存活率)。参见图44及45。与对照组的15%存活率相比，两次剂量XT-M4(7mg/kg，在CLP后6及12小时，最终剂量为15mg/kg)在第7天时保护约90%的小鼠(图45)。在15mg/kgXT-M4情况下观察到最佳保护。经CLP小鼠的病理学分数在抗RAGE抗体治疗动物中降低将到第8天为止存活的所有动物杀死并经历尸检以实施器官损伤的组织学证实及肺及小肠的病理学评分。应用自0(正常)到4(扩散及大范围组织坏死)分级的界定病理学分数。在血清对照组中尸检时肺组织及小肠粘膜的组织病理学显著异常，而在抗RAGEXT-M4(15mg/kg)治疗群组及假手术群组中病理学所见显著减少。参见图46。组织病变减少与提高的存活率符合。好氧肠道革兰阴性及革兰阳性细菌的组织浓度在治疗群组间无差异。对自CLP后存活的小鼠尸检时获得的器官样品实施定量微生物学。组织样品是自肺、肝及脾采集。腹膜液是通过灌洗腹膜腔获得。定量细菌计数标准化为每克器官重量或菌落形成单位(CFU)/ml腹膜灌洗液。与对照动物相比，给与XT-M4抗体或RAGE—z—的动物无显著增加的器官细菌接种量(p:ns)，但两个群组均具有比假治疗对照动物(11=5)显著较多的菌落形成单位(CFU)/gm脾及肝组织(p小于0.05)。抗RAGE抗体在具有抗生素的鼠科动物CLP模型中具有保护性在存在或不存在抗生素下静脉内投与30mg/kgXT-M4可保护动物对抗CLP的致死效应。参见图47。使小鼠在第Oh经历CLP。小鼠接受30mg/kgXT-M4或等体积1%自体小鼠血清(静脉内注射)。所有群组在0时间接受曲伐沙星剂量(20mg/kg肌内注射(IM))。另外，在CLP后O、12、24、36及24h时投与曲伐沙星(20mg/kg肌内)(在24及48h时给与)或万古霉素(20mg/kglP)。单独注射万古霉素导致存活率降低。参见图48。投与万古霉素或曲伐沙星时未观察到额外效应。抗RAGE抗体在鼠科动物CLP模型(具有延迟投与)中具有保护性在CLP后以各种时间间隔给予抗RAGEmAb延迟治疗的动物相对血清对照治疗动物盲肠结扎及穿孔后的卡-梅氏存活率分析(图49)。在CLP后6、12或24小时以15mg/kg剂量经静脉内延迟投与XT-M4到雄性BALB/c小鼠中也达成动物的显著存活(N=15，对照；n=14)。在CLP后长达24小时的延迟单克隆抗体治疗提供显著对抗致死性的保护(p小于O.Ol)。在CLP后长达36小时的延迟投与显示有利的存活趋势(9/15动物存活)，但与血清治疗对照组相比差异不再显著&=0.12)。好氧肠道革兰阴性及革兰阳性细菌的组织浓度在治疗群组间无差异(P=ns)。实例30RAGE调节不会恶化全身性单核细胞增生性利斯特菌感染RAGE的抑制或缺失不会破坏微生物病原体的宿主机制或清除。单核细胞增生性利斯特菌攻击是用于小鼠先天性及获得性免疫应答研究的熟知模型。野生型小鼠的LDso值为(log10)3.31±0.2CFU，而杂合RAGE+A的LDsJ直为5.98±0.39，且纯合RAGE-A的LDM)值为5.10±0.47。与野生型小鼠相比，对于RAGE杂合体及纯合体二者，全身性利斯特菌病LD5o值的此多于两个数量级的差异是统计学上显著的(P小于O.Ol)。在投与抗体或对照血清后1小时经全身性投与单核细胞增生性利斯特菌U(^个菌落形成单位(CFU))对小鼠进行攻击。给与抗RAGEXT-M4的野生型动物及RAGEV-动物以及野生型动物似乎清除单核细胞增生性利斯特菌。与对照组相比，投与XT-M4抗体(15mg/kg)未改变肝脏及脾组织中或无RAGE动物及RAGE杂合动物中的单核细胞增生性利斯特菌含量(CFU/gm)。相反，投与抗TNF-a抗体(单克隆抗体TN3.1912，20mg/kg)使含量增加。见图IOB。与预期一样，抗TNF单克隆抗体显著提高小鼠对利斯特菌病的感染性。在此模型中RAGE缺失或抑制不会恶化感染。实例31嵌合抗RAGE抗体功效的活体内临床前测定A.药物代谢动力学(PK)对于嵌合XT-M4，评价经静脉内投与单次剂量5mg/kg到雄性BALB/c小鼠(11=3)中后嵌合抗体嵌合XT-M4的血清浓度。用IgGELISA测量抗体随时间的血清浓度。嵌合XT-M4的平均血清暴露量是(23，235ghr/mL)且半衰期约为1周(152小时)。参见图51。B.CLP后不同剂量嵌合XT-M4的保护效果评价嵌合抗体XT-M4及亲本大鼠XT-M4抗体延长CLP后雄性BALB/c小鼠存活的能力是在手术时静脉内投用3.5mg/kg、7.5mg/kg及30mg/kg后测量，并与血清对照动物进行比较。存活率图显示于图52中。与注射1.0%自体小鼠血清的小鼠(20%存活率)相比，嵌合XT-M4的单次静脉内剂量(7.5mg/kg，在CLP后0小时)在CLP后第七天保护约90%的小鼠(p小于0.05)。投用3.5mg/kg及30mg/kg嵌合XT-M4在CLP后第七天也提供对小鼠的显著保护(与对照相比约70。/。，p小于0.05)。C.在CLP后24小时给与嵌合XT-M4所提供保护的评价在具有延迟治疗的动物中在盲肠结扎及穿孔后通过卡-梅氏存活率图来分析存活率差异(p小于O.Ol，两个抗体治疗群组与血清对照组相比)。当在CLP后24小时以15mg/kg剂量静脉内投与时嵌合与大鼠抗RAGEXT-M4的可比性绘示于图53中。当在CLP后24小时以治疗方式投与时，CLP模型中嵌合XT-M4所提供的保护程度与亲本大鼠XT-M4抗体所提供的保护程度类似。结果总结使RAGE不存在可保护小鼠对抗CLP诱导的脓毒症的致死效应。单次剂量XT-M4可保护小鼠对抗CLP的致死效应。全身性利斯特菌攻击后48小时在RAGE-/-或抗体治疗小鼠中单核细胞增生性利斯特菌的组织浓度无显著差异，此表明无总体免疫抑制。数据显示，用人类恒定区代替大鼠抗体XT-M4的恒定区不会影响抗体的结合活性。另外，以预防方式投用嵌合XT-M4在CLP模型中的功效显示以7.5mg/kg剂量可保护90%的动物。当在CLP后24小时以治疗方式投与时，嵌合XT-M4及亲本XT-M4抗体在CLP模型中提供类似保护程度。本文所提及的所有出版物及专利的全文都以引用方式并入本文中，如同将每一个别出版物或专利特定地及个别地指示以引用方式并入本文中一般。在矛盾情况下，则以本申请案(包括本文中的任何定义)为准。尽管己论述本发明的具体实施例，但上文说明书是阐释性而非限制性的。阅读此说明书后，所属
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的技术人员可明了本发明的许多变更。应参照权利要求书以及其等效内容的完整范围及说明书以及所述变更来确定本发明的完整范围。权利要求1、一种抗体，其与RAGE特异性结合且(a)与选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4组成的群组的抗体竞争结合RAGE；(b)与RAGE的表位结合，所述RAGE的表位与选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4组成的群组的抗体结合；(c)包含选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4组成的群组的抗体的轻链或重链的一或多个互补决定区(CDR)；或(d)为如(a)、(b)或(c)所述的抗体的RAGE结合片段。2、如权利要求1所述的抗体，其所包含的轻链可变区包含选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4组成的群组的抗体的轻链可变区的至少两个CDR。3、如权利要求2所述的抗体，其所包含的轻链可变区包含选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4组成的群组的抗体的轻链可变区的三个CDR。4、如权利要求1所述的抗体，其所包含的重链可变区包含选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4组成的群组的抗体的重链可变区的至少两个CDR。5、如权利要求4所述的抗体，其所包含的重链可变区包含选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4组成的群组的抗体的轻链可变区的三个CDR。6、如权利要求1所述的抗体，其包含轻链可变区，所述轻链可变区包含选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4组成的群组的抗体的轻链可变区的三个CDR;及重链可变区，所述重链可变区包含选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4组成的群组的抗体的重链可变区的三个CDR。7、如权利要求1所述的抗体，其所包含的轻链及重链可变区分别包含选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4组成的群组的抗体的轻链可变区的三个CDR及重链可变区的三个CDR。8、如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体与人类RAGE结合，其解离常数(Kd)介于至少约1x10'7M至约1x10—1QM的范围。9、如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体与人类RAGE的V结构域结合。10、如权利要求l所述的抗体，其中所述抗体与表达RAGE的细胞在活体外特异性结合。11、如权利要求l所述的抗体，其中所述抗体与表达RAGE的细胞在活体内特异性结合。12、如权利要求l所述的抗体，其中所述抗体与RAGE结合并抑制RAGE结合配偶体(RAGE-BP)与所述RAGE的结合。13、一种抗体，其与RAGE特异性结合，且(a)包含选自由下列组成的群组的轻链可变区XT-H1—VL(SEQIDNO:19)、XT-H2一VL(SEQIDNO:22)、XT-H3一VL(SEQIDNO:25)、XT-H5一VL(SEQIDNO:23)、XT陽H7—VL(SEQIDNO:27)、及XT-M4—VL(SEQIDNO:17)，或(b)包含具有与选自以下的氨基酸序列至少90%—致的氨基酸序列的轻链可变区SEQIDNO:19、SEQIDNO:22、SEQIDNO:25、SEQIDNO:23、SEQIDNO:27、及SEQIDNO:17;或(c)为如(a)或(b)所述的抗体的RAGE结合片段。14、一种抗体，其与RAGE特异性结合且(a)包含选自由下列组成的群组的重链可变区IXT-H1_VH(SEQIDN0:18)、XT-H2—VH(SEQIDNO:21)、XT-H3VH(SEQIDNO:24)、XT-H5—VH(SEQIDNO:20)、XT-H7—VH(SEQIDNO:26)、及XT-M4—VH(SEQIDNO:16)，或(b)包含具有与选自以下的氨基酸序列至少90%—致的氨基酸序列的重链可变区SEQIDNO:18、SEQIDNO:21、SEQIDNO:24、SEQIDNO:20、SEQIDNO:26、及SEQIDNO:16;或(c)为如(a)或(b)所述的抗体的RAGE结合片段。15、如权利要求13所述的抗体，其(a)进一步包含选自由下列组成的群组的重链可变区XT-HI—VH(SEQIDNO:18)、XT-H2—VH(SEQIDNO:21)、XT-H3—VH(SEQIDNO:24)、XT-H5—VH(SEQIDNO:20)、XT-H7—VH(SEQIDNO:26)、及XT-M4—VH(SEQIDNO:16)，或(b)进一步包含具有与选自以下的氨基酸序列至少90%—致的氨基酸序列的重链可变区SEQIDNO:18、SEQIDNO:21、SEQIDNO:24、SEQIDNO:20、SEQIDNO:26、及SEQIDNO:16;或(c)为如(a)或(b)所述的抗体的RAGE结合片段。16、如权利要求l所述的抗体，其所包含的轻链及重链可变区分别具有选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4组成的群组的抗体的轻链及重链可变区的氨基酸序列。17、如权利要求1所述的抗体，其选自由下列组成的群组嵌合抗体、人类化抗体、人类抗体、单链抗体、四聚体抗体、四价抗体、多特异性抗体、结构域特异性抗体、结构域缺失抗体、融合蛋白、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、ScFv片段、Fd片段、单结构域抗体、及dAb片段。18、如权利要求1所述的抗体，其在轻链或重链可变区中包含至少一个去除糖基化位点的氨基酸突变。19、一种嵌合抗体或其RAGE结合片段，其包含轻链可变区氨基酸序列及重链可变区氨基酸序列，且进一步包含源自人类恒定区的恒定区，所述轻链可变区氨基酸序列与所述XT-M4轻链可变区氨基酸序列(SEQIDNO:17)至少90%—致，所述重链可变区氨基酸序列与所述XT-M4重链可变区氨基酸序列(SEQIDNO:16)至少90%一致。20、一种嵌合抗体或其RAGE结合片段，其包含具有XT-M4轻链可变区的氨基酸序列(SEQIDNO:17)的轻链可变区，具有XT-M4重链可变区序列的氨基酸序列(SEQIDNO:16)的重链可变区，人类k轻链恒定区及人类IgGl重链恒定区。21、一种人类化抗体或其RAGE结合片段，其包含至少一个人类化轻链可变区，所述人类化轻链可变区与选自由下列组成的群组的人类化轻链可变区的氨基酸序列至少90%—致XT-H2—hVL—V2.0(SEQIDNO:32)、XT-H2—hVL—V3.0(SEQIDNO:33)、XT-H2_hVL_V4.0(SEQIDNO:34)、XT-H2—hVL—V4.1(SEQIDNO:35)、XT-M4—hVL一V2.4(SEQIDNO:39)、XT-M4—hVL_V2.5(SEQIDNO:40)、XT-M4—hVL一V2.6(SEQIDNO:41)、XT-M4—hVL_V2.7(SEQIDNO:42)、XT-M4—WL—V2.8(SEQIDNO:43)、XT-M4_hVL—V2.9(SEQIDNO:44)、XT-M4—hVL一V2.10(SEQIDNO:45)、XT匿M4一hVL—V2.11(SEQIDNO:46)、XT-M4hVL_V2.12(SEQIDNO:47)、XT-M4—hVL—V2.13(SEQIDNO:48)、及XT-M4—hVL—V2.14(SEQIDNO:49)。22、一种人类化抗体或其RAGE结合片段，其所包含的人类化重链可变区与选自由下列组成的群组的人类化重链可变区的氨基酸序列至少90%—致XT-H2—WH—V2.0(SEQIDNO:28)、XT-H2—hVH—V2.7(SEQIDNO:29)、XT-H2—hVH—V4(SEQIDNO:30)、XT-H2—hVH_V4.1(SEQIDNO:31)、XT德—hVH一Vl.O(SEQIDNO:36)、XT-M4—hVH—Vl.l(SEQIDNO:37)、及XT-M4hVH—V2.0(SEQIDNO:38)。23、如权利要求21所述的人类化抗体或其片段，其进一步包含人类化重链可变区，所述人类化重链可变区与选自由下列组成的群组的人类化重链可变区的氨基酸序列至少90%—致XT-H2—hVHV2.0(SEQIDNO:28)、XT-H2—hVH_V2.7(SEQIDNO:29)、XT-H2—hVH—V4(SEQIDNO:30)、XT-H2—WH—V4.1(SEQIDNO:31)、XT-M4—hVHV1.0(SEQIDNO:36)、XT-M4—hVH—Vl.l(SEQIDNO:37)、及XT-M4—hVH一V2.0(SEQIDNO:38)。24、一种与RAGE特异性结合的人类化抗体或其RAGE结合片段，所述抗体是人类化XT-M4抗体。25、一种与RAGE特异性结合的人类化抗体或其RAGE结合片段，所述抗体是人类化XT．H2抗体。26、一种抗体，其与RAGE特异性结合并阻断RAGE体配偶体的结合，所述抗体所具有的CDR具有以下特征中的至少8个a．在ⅦCDRl中的氨基酸序列为Y．x．M(Y32；X33；M34)，其中x优选为W或N；b．在VHCDR2中氨基酸序列为I．N—x．S(151；N52；X53及$54)，其中x为P或N；C．在ⅧCDR2中位置58上的氨基酸为苏氨酸；d．在ⅦCDR2中位置60上的氨基酸为酪氨酸；e．在VHCDR3中位置103上的氨基酸为苏氨酸；f在VHCDR3中存在一或多个酪氨酸残基；g．在VLCDRl中位置24上为带正电荷的残基(Arg或Lys)；h．在VLCDRl中位置26上为亲水性残基(Thr或Ser)；i．在VLCDRl中位置25上为小残基Ser或Ala；．i．在VLCDRl中位置33上为带负电荷的残基(Asp或Glu)；k．在VLCDRl中位置37上为芳香族残基(Phe或Tyr或Trp)；I．在VLCDR2中位置57上为亲水性残基(Ser或Thr)；m．在VLCDR3的末端为P—X．T序列，其中X可为疏水性残基Leu或Trp；其中氨基酸位置分别如SEQIDNO22及SEQIDNO16中的所述轻链及重链氨基酸序列中所示。27、一种经分离核酸，其所包含的核苷酸序列编码选自由下列组成的群组的抗RAGE抗体可变区XT-H1一呢fSEQIDNO19)、XT-H2一汜(SEQIDNO22)、XT—H3一汜(SEQIDNO25)，XT—H5一∥zfSEQIDNO23)、XT—H7一"L(SEQIDNO27)、XT—M4一∥z(SEQIDNO17)、XT-H1一VH(SEQIDNO18)、XT—H2一VH(SEQIDNO21)、XT—H3一VH(SEQIDNO24)、XT—H5一VH(SEQIDNO20)、XT—H7一VH(SEQIDNO26)、及XT-M4一VH(SEQIDNO16)。28、一种经分离核酸，其在严格杂交条件下与一核酸特异性杂交，该核酸具有的核苷酸序列是编码选自由下列组成的群组的抗RAGE抗体可变区的核苷酸序列的互补序列XT-H1_、几(SEQIDNO19)、XT—H2j，L(SEQIDNO22)、XT—H3一VL(SEQIDNO25)、XT-H5一汜fSEQIDNO23)1XT—H7一呢(SEQIDNO27)、XT—M4一汜(SEQIDNO17)、XT-H1一VH(SEQIDNO18)、XT—H2一VH(SEQIDNO21)、XT-H3二VH(SEQIDNO24)、XT-H5_VH(SEQIDNO20)、XT—H7一VH(SEQIDNO26)、及XT—M4一VH(SEQIDNO16)。29、一种经分离核酸，其所包含的核苷酸序列编码选自由下列组成的群组的抗RAGE抗体可变区XT-H2—hVL—V2.0(SEQIDNO:32)、XT-H2—WL—V3.0(SEQIDNO:33)、XT-H2—hVL—V4.0(SEQIDNO:34)、XT-H2一hVL一V4.1(SEQIDNO:35)、XT-M4—WL—V2.4(SEQIDNO:39)、XT-M4—hVL—V2.5(SEQIDNO:40)、XT-M4—hVL—V2.6(SEQIDNO:41)、XT-M4—hVL—V2.7(SEQIDNO:42)、XT-M4hVL—V2.8(SEQIDNO:43)、XT-M4—hVL一V2.9(SEQIDNO:44)、XT-M4—hVL—V2.10(SEQIDNO:45)、XT-M4—hVL_V2.11(SEQIDNO:46)、XT-M4—hVL_V2.12(SEQIDNO:47)、XT-M4—WLV2.13(SEQIDNO:48)、及XT-M4—hVL—V2.14(SEQIDNO:49)、XT-H2—hVH—V2.0(SEQIDNO:28)、XT陽H2一hVH—V2.7(SEQIDNO:29)、XT-H2_hVH—V4(SEQIDNO:30)、XT-H2—hVH—V4.1(SEQIDNO:31)、XT-M4—hVH—V1.0(SEQIDNO:36)、XT-M4—hVH—Vl.l(SEQIDNO:37)、及XT-M4—hVH一V2.0(SEQIDNO:38)。30、一种经分离核酸，其在严格杂交条件下与一核酸特异性杂交，该核酸具有的核苷酸序列是编码选自由下列组成的群组的抗RAGE抗体可变区的核苷酸序列的互补序列XT-H2_hVL_V2.0(SEQIDNO:32)、XT-H2—hVL_V3.0(SEQIDNO:33)、XT-H2hVL—V4.0(SEQIDNO:34)、XT-H2—hVL—V4.1(SEQIDNO:35)、XT-M4—hVL—V2.4(SEQIDNO:39)、XT-M4—WL—V2.5(SEQIDNO:40)、XT-M4hVLV2.6(SEQIDNO:41)、XT-M4—hVL—V2.7(SEQIDNO:42)、XT-M4—hVL—V2.8(SEQIDNO:43)、XT-M4一hVL一V2.9(SEQIDNO:44)、XT-M4—hVL_V2.10(SEQIDNO:45)、XT-M4—hVL_V2.11(SEQIDNO:46)、XT-M4—hVL—V2.12(SEQIDNO:47)、XT-M4—hVL—V2.13(SEQIDNO:48)、及XT-M4—hVL—V2.14(SEQIDNO:49)、XT-H2—WHV2.0(SEQIDNO:28)、XT-H2—hVH—V2.7(SEQIDNO:29)、XT-H2—hVH—V4(SEQIDNO:30)、XT-H2—hVH—V4.1(SEQIDNO:31)、XT-M4—hVH—V1.0(SEQIDNO:36)、XT-M4—hVH—Vl.l(SEQIDNO:37)、及XT-M4一hVH一V2.0(SEQIDNO:38)。31、一种经分离核酸，其包含(a)编码狒狒、猴或兔RAGE的核苷酸序列，所述RAGE具有选自由SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、及SEQIDNO:13组成的群组的氨基酸序列；(b)与(a)的互补序列特异性杂交的核酸；或(c)当询问覆盖度(querycoverage)为100%时与编码狒狒、猴或兔RAGE的核苷酸序列95%—致的核苷酸序列，所述编码狒狒、猴或兔RAGE的核苷酸序列选自由SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、及SEQIDNO:12组成的群组。32、一种治疗患有RAGE相关疾病或病症的个体的方法，其包含向所述个体投与治疗有效量的抗体，所述抗体(a)与选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4组成的群组的抗体竞争结合RAGE;(b)与RAGE的表位结合，所述RAGE的表位与选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4组成的群组的抗体结合；(c)包含选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4组成的群组的抗体的轻链或重链的一或多个互补决定区(CDR);或(d)为如(a)、(b)或(c)所述的抗体的RAGE结合片段。33、如权利要求32所述的方法，其中所述RAGE相关疾病或病症选自由下列组成的群组脓毒症、脓毒性休克、利斯特菌病、炎症性疾病、癌症、关节炎、克隆氏病(Crohn'sdisease)、慢性急性炎症性疾病、心脏血管疾病、勃起功能障碍、糖尿病、糖尿病并发症、脉管炎、肾病、视网膜病变、及神经病变。34、如权利要求32所述的方法，其包含投与所述抗体或其RAGE结合片段与一或多种可用于治疗所述待要治疗的RAGE相关疾病或病症的药剂。35、如权利要求34所述的方法，其中所述药剂选自由下列组成的群组消炎剂、抗氧化剂、(3-阻断剂、抗血小板剂、ACE抑制剂、降脂剂、抗血管生成剂、及化学治疗剂。36、一种治疗人类个体脓毒症或脓毒性休克的方法，其包含向所述个体投与治疗有效量的嵌合或人类化抗RAGE抗体，所述嵌合或人类化抗RAGE抗体包含源自人类恒定区的恒定区，且(a)与选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4组成的群组的抗体竞争结合RAGE;(b)与RAGE的表位结合，所述RAGE的表位与选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4组成的群组的抗体结合；(c)包含选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4组成的群组的抗体的轻链或重链的一或多个互补决定区(CDR);或(d)为如(a)、(b)或(c)所述的抗体的RAGE结合片段。37、一种治疗人类个体脓毒症或脓毒性休克的方法，其包含向所述个体投与治疗有效量的嵌合抗RAGE抗体或其RAGE结合片段，所述嵌合抗RAGE抗体或其RAGE结合片段包含具有XT-M4轻链可变区的氨基酸序列(SEQIDNO:17)的轻链可变区，具有XT-M4重链可变区序列的氨基酸序列(SEQIDNO:16)的重链可变区，人类k轻链恒定区及人类IgGl重链恒定区。38、一种治疗人类个体全身性利斯特菌病的方法，其包含向所述个体投与治疗有效量的嵌合或人类化抗RAGE抗体，所述嵌合或人类化抗RAGE抗体包含源自人类恒定区的恒定区，且(a)与选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4组成的群组的抗体竞争结合RAGE;(b)与RAGE的表位结合，所述RAGE的表位与选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4组成的群组的抗体结合；(c)包含选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4组成的群组的抗体的轻链或重链的一或多个互补决定区(CDR);或(d)为如(a)、(b)或(c)所述的抗体的RAGE结合片段。39、一种治疗人类个体利斯特菌病的方法，其包含向所述个体投与治疗有效量的嵌合抗RAGE抗体或其RAGE结合片段，所述嵌合抗RAGE抗体或其RAGE结合片段包含具有XT-M4轻链可变区的氨基酸序列(SEQIDNO:17)的轻链可变区，具有XT-M4重链可变区序列的氨基酸序列(SEQIDNO:16)的重链可变区，人类k轻链恒定区及人类IgGl重链恒定区。40、一种抑制哺乳动物个体中RAGE结合配偶体(RAGE-BP)与RAGE结合的方法，其向所述个体投与抑制量的嵌合或人类化抗RAGE抗体，所述嵌合或人类化抗RAGE抗体包含源自人类恒定区的恒定区，且(a)与选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4组成的群组的抗体竞争结合RAGE;(b)与RAGE的表位结合，所述RAGE的表位与选自由XT-HI、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4组成的群组的抗体结合；(c)包含选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7及XT-M4组成的群组的抗体的轻链或重链的一或多个互补决定区(CDR);或(d)为如(a)、(b)或(c)所述的抗体的RAGE结合片段。41、如权利要求l所述的抗体，所述抗体与可溶性RAGE(sRAGE)特异性结合。42、如权利要求41所述的抗体，所述抗体与选自由鼠科动物sRAGE及人类sRAGE组成的群组的sRAGE特异性结合。43、如权利要求42所述的抗体，所述抗体与sRAGE特异性结合，其解离常数(Kd)介于约1x10'9M至约5x10—9M的范围。全文摘要本发明揭示与晚期糖化终产物受体(RAGE)特异性结合的抗体及其RAGE结合片段。本发明也揭示包含所述抗RAGE抗体及其RAGE结合抗体片段的医药组合物及其用于治疗RAGE相关疾病的用途。文档编号A61P31/00GK101405300SQ200780009746公开日2009年4月8日申请日期2007年3月21日优先权日2006年3月21日发明者利乌米拉·奇斯蒂亚科夫,妮科尔·皮什-尼古拉斯,颖孙,安杰拉·维多姆,布赖恩·克兰西,戴比·皮特曼,珍妮特·保尔森,科丹加蒂·斯里库尔玛,谭向阳申请人:惠氏公司