专利名称：低聚体改进剂量和工序的制作方法
低聚体改进剂量和工序
本申请要求于2006年3月31日提交的第60/787,846号专利申请获 得优先权，在此作为参考文献整体引述。
发明范围 本发明涉及一种治疗人类增生性疾病的方法，例如由一种 目标基因(包括但不限于致癌基因，包括癌症促发基因或抗药基因)过 度表达造成的癌症，或自体免疫疾病，或导致疾病更难治愈，该方法是， 在给予病患有效量的核苷基合成物抑制基因的表达之前，给予病患有效 量的预治疗。该预治疗是放射线疗法中的一种或多种，例如，X射线、 质子束、电子束；升温治疗、超声波治疗、化学疗法和生物疗法。该发 明也涉及 一 种需要采用核苷基基因表达抑制剂以治疗 一 种人类疾病的 改进剂量和工序。 背景以前治疗增生性疾病，包括由于缺乏特异性导致癌症的方 法。多数已经开发出来的药物都是天然药物或衍生物，阻断代谢途径 (Araujo,爭乂，2W6, Cwm 4症秀參《标.6,' 77-S7)或与DNA随意 发生作用。而且，大多数癌症的治疗措施都伴随由于较低的治疗指数 导致的严重的剂量限制性毒性。例如，大多数给予病患的抗癌药不仅会 杀死癌细胞，也会杀死非癌症细胞。由于有这些毒害作用，需要采用能 更准确地影响癌症细胞的治疗方法。由于对肿瘤发展中的分子机制理解上的进步，确定了许多 潜在的基因目标,包括致癌基因、抗药基因，以及涉及细胞变形和癌症状 态维护的生长和细胞周期调节基因。很明显，干扰基因转录或抑制其蛋 白物的作用可产生良好的治疗效果。在Bish叩于1987年，在《科学>> 杂志235: 305-311,所发表的文章"细胞致癌基因和逆转录酶病毒"一 文中，对许多人类癌症病原中的致癌基因的作用进行了评估。例如，在 许多人类癌症中， 一种被称为Bcl-2 (B细胞淋巴瘤/白血病-2)的基因 就为过度表达基因，而且,该过度表达可能与致肿瘤性相关(Tsujimoto等 人，1985年在《科学》杂志228:1440-1443中，所发表的文章，，人类滤
泡性淋巴瘤中Bcl-2基因的参与")。Bcl-2基因被认为主要通过延长 细胞生存率，而非通过加快细l包分裂，从而有助于癌症的发病，并乂于治 疗起抵制作用。
人类的Bcl-2基因被认为与某种白血病、淋巴瘤、成神经细 胞瘤，以及鼻咽癌、前列腺癌、乳&,癌和结肠癌的病因有关联。(Croce 等人，于1987年在《病毒肿瘤学进展》7: 35-51中所发表的文章"人 类B和T细胞瘤形成的分子基础，，，G.Klem (编辑))，纽约Raven press 出版社；Reed等人,于1991年在《癌症研究〉〉51:6529-38中所发表的文 章"Bcl-2原癌基因在成神经细胞瘤和其他人类神经起端肿瘤细胞系中 的差异表达，，；Yums等人,于1989年在《新格兰医学期刊〉〉320:1047-54 中所发表的文章"大细胞淋巴瘤预后中Bcl-2和其他染色体畸变"； Campos等人，于1993年在《血液》81: 3091-6中所发表的文章"Bcl-2 蛋白在急性髓系白血病中的高表达与对化学疗法的不良反应相关"； McDonnell等人，于1992年在《癌症研究》52: 6940-4中所发表的文章 "原癌基因Bcl-2的表达和其与雄性荷尔蒙-非依赖性前列腺癌发生的关 系，，；Lu等人，于1993年在《国际癌症杂志》53: 29-35中所发表的文 章"Bcl-2原癌基因在EB( Epstem Barr )病毒相关鼻咽癌的表达"；Bonner 等人，于1993年在《实验室研究》68: 43A中所发表的文章"与推荐 形态和分子顺序有关的Bcl-2原癌基因和肠道黏膜肿瘤进展模式")。已 经发现Bcl-2在多种肿瘤中有过度表达，包括非霍奇金淋巴瘤、肺癌、 乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肾癌和急'隄性白血病(Reed,于1995年 在胂瘤时论(Curr. Opm.Oncol) 7:541-6中所发表的文章，，Bcl隱2族蛋白 的凋亡调节和其在癌症和化学抗性中的作用")。 反义低(聚)核苷酸技术对致癌基因和其他目标基因功能的 破坏提供了潜在的治疗手段。这些低聚物对目标基因的DNA或 pre-mRNA或mRNA区具有序列补偿或部分补偿作用，并形成氢键基对 复式结构。该混合物可以干扰目标mRNA和其编码的蛋白的表达，从而 可以妨碍下游的相互作用和信号传專lr。由于一个mRNA分子可引起多蛋 白复制，所以对pre-mRNA或mRNA的抑制可以更加有效，并且比在蛋 白质级进行干扰，例如，抑制酶的活性部位或其他基于蛋白结构的功能 更力口有效。
已经采用c-myc致癌基因mRNA的低(聚)核苷酸补偿以
专门抑制c-myc蛋白的复制，从而阻止体外人类白血病细胞的生长(Holt 等人，于1988年在《分子和细胞生物学》8: 963-73中所发表的文章； Wickstrom等人，于1988年在《美国国家科学院院刊》85: 1028-32中
所发表的文章)。在逆转录酶病毒抑制剂中也采用了低(聚)核普酸，包 括人类免疫缺乏病毒(Zamecnik和Stephenson于1978年在《美国国家 科学院院刊》75: 280-4中所发表的文章；Zamecnik等人于1986年在《美 国国家科学院院刊》83: 4143-6中所发表的文章)。 使用具有标靶和抑制单个癌症相关基因的反义低(聚)核苷 酸，在潜伏期癌症模型和临床试验中已经展现出良好的前景。疏代磷酸 酯反义低(聚)核苷酸已经表现出抑制Bcl-2体外表达的活性，并可根除淋 巴瘤异种移植的老鼠模型内的肿瘤。已认为某些癌症的抗化学治疗性与 Bcl-2致癌基因的表达相关(Grover等人，于1996年在《欧洲肺瘤外禾+》 22 ( 4) : 347-9中所发表的文章"Bcl-2在恶性黑[色]素瘤中的表达和其 预后显性")。Bcl-2标革巴低(聚)核苷酸给药可以选择性降低实验鼠体内 肿瘤异种移植物内的Bcl-2蛋白水平(Jansen等人，于1998年在《自然 医学》4 (2) : 232-4中所发表的文章"Bcl-2反义治疗SCID老鼠体内 化学感应人类(恶性)黑素瘤")。另外，Bcl-2反义低(聚)核苷酸给药 能使实验鼠体内的胂瘤异种移植物更易受到化学疗法药的影响Jansen 等人，于1998年在《自然医学》4 (2) : 232-4中所发表的文章"Bcl-2 反义治疗SCID老鼠体内化学感应人类(恶性)黑素瘤，，)。采用Bcl-2 反义低(聚)核苷酸进行系统治疗减少了老鼠体内的Bcl-2蛋白并促进了 细胞凋亡。单独采用Bcl-2反义低(聚)核苷酸治疗具有适度的抗癌性，并 且在配合其他传统疗法，例如化学疗法药物时能增强抗癌性。在对多种 肿瘤的临床试验中，已经证实了 Bcl-2反义低(聚)核苷酸的活性。但是， 通常由于对这些治疗形态的抵制作用，使这些反应引起克隆存活和疾病 发展。因此，急切需要将这些抗癌治疗予以扩大，以抵抗人类癌症。 尽管生物疗法,药物疗法和联合治疗日益有效，但是许多癌 症患者仍然表现出预后不良。例如，尽管氮烯唑胺(DTIC)普遍用于治 疗转移性黑色素瘤，却无任何患者的病情能够得到长期的改善。事实上， 在第三期临床试验中，当采用DTIC配合其他化学疗法药剂，例如，顺 氯氨铂、卡氯芥和他莫西芬时，存活率并无任何改善(Chapman等人， 于1999年在《临床胂瘤杂志》中所发表的文章"Dartmouth regimen和
氮烯唑胺在转移性黑色素瘤患者的三期多中心随;k试l全中的比4支"， 17(9):2745-51 )。另外，尽管许多采用Bcl-2反义低(聚)核苷酸，随带传 统疗法的临床研究一直鼓励采用化学疗法药物，仍然需要进一步调查。 但是，有个长期未解决的问题是，如何以医学上可行的、便利和经济的 方式将足够剂量的低(聚)核苷酸送至靶细胞。
本发明概述 —方面,本发明提供了一种治疗增生性疾病患者的方法，该 方法包括，在每一治疗周期，给予病患有效量的预治疗；随后，给予病 患有效量的低聚物。另一方面，增生性疾病是一种胂瘤性疾病或一种自 体免疫疾病。肺瘤性疾病可以是一种癌症， 一种实体瘤或一种恶性血'液 病。预治疗在低聚物给药前进行，在优选实施例中包括一种或多种放射 疗法、抗肿瘤疗法，包括化学疗法、声学疗法和热疗法。在一实施例中， 低聚物或反义低(聚)核苷酸从一种或多种反义低(聚)核苷酸、siRNA、 microRNA、核酸适体、吗啉代、诱导分子和核糖核酸酶中选择。低聚 物可以定向抑制在 一 个细胞，例如肿瘤细胞内过度表达的基因的表达， 从而导致或促发增生性疾病。该基因包括但不限于，致癌基因、抗凋亡
基因、转录激活因子、蛋白激酶，涉及信号转导通路的基因、代谢途径 和调节细月包生长和死亡的基因。另一方面，本发明提供了一种治疗细胞,抑制致癌基因表达 的方法，例如一种抗凋亡基因。在一优选实施例中，该基因为Bcl-2基 因、c-Myb基因或c-Myc基因。在另一实施例中，反义低(聚)核苷酸为 奥利默森(oblimersen)。在另一实施例中，反义低(聚)核香酸为G4460 或INX-3001, —种反义低(聚)核苷酸，使c-Myb mRNA杂交(Genta， 新泽西Berkeley Heights 7>司)。另一方面，本发明提供了一种治疗增生性疾病患者的方法， 该方法包括给予病患有效量的低聚物，该低聚物间断给药。在一优选实 施例中，两次低聚物给药之间间隔至少一天。在另一实施例中，两次低 聚物给药至少间隔一天，如果间隔至少3天则更好，如果间隔至少5天 则最好。在另一实施例中，上述低聚物每周给药，每两周或每3-4周给 药。另一方面，本发明是一种治疗人类癌症患者的方法，包括
一种或多种治疗周期，在治疗中，首先给予患者一有效量的预治疗，之后，给予患者有效量的低聚物。在一优选实施例中，预治疗为放射治疗，
低聚物为奥利默森(oblimersen)。在另一实施例中，低聚物给药频率 不超过隔天一次，更适宜的是，不超过每三天一次。在本发明的一方面， 低聚物给药为每周、每两周或每三周。在本发明的另一方面，在一周期 首次预治疗给药后，低聚物给药至少一天一次，较适宜的是至少两天一 次，更适宜的是至少三天一次。在本发明的另一方面，肿瘤性疾病为肺 癌、乳腺癌、前列腺癌、(恶性)黑素瘤、慢性髓系白血病或淋巴瘤。 本发明的另一方面提供了一种治疗人类癌症患者的方法， 包括一个或多个治疗周期，在周期内，给予患者1至50mg/kg、较适宜 的是5至30mg/kg、更适宜的是7至25mg/kg和最适宜的是10至30mg/kg 剂量的低聚物，且该低聚物的给药频率不超过隔天一次，更适宜的是隔 三天一次。在另一实施例中，上述低聚物为奥利默森(oblimersen)。 在另一实施例中，上述低聚物的给药量为，平均最高血药浓度为至少6 jug/mL, 4支适宜的是至少8jLig/mL,更适宜的是至少10 ju g/mL。在另一 实施例中，平均最高血药浓度为至少为10jug/mL,更适宜的是至少15 lug/mL,最适宜的是至少20jug/mL。在另一实施例中，低聚物为奥利 默森(oblimersen ),且给药量为，平均最高血药浓度至少为6 |u g/mL, 4交适宜的是至少8iug/mL,更适宜的是至少10iug/mL。在另一实施例中， 平均最高血药浓度为至少10pg/mL,更适宜的是至少15yg/mL,最适 宜的是至少20yg/mL。 本发明的另一方面，使用低聚物生产药物，与预治疗联合 使用，治疗增生性疾病。在一优选实施例中，增生性疾病为肿瘤性疾病。 本发明的另一方面是，使用低聚物生产药物，与预治疗联合使用，治疗 增生性疾病，其中，上述低聚物为间断给药。在一优选实施例中，预治 疗从放射治疗、化学治疗、声学治疗、生物治疗、热治疗或以上Jf关合治 疗中选捧。 本发明的另一方面是，使用低聚物生产药物，与预治疗联 合使用，治疗增生性疾病，其中，该低聚物为间断给药。本发明的另一 方面是，使用一种抗Bcl-2的反义低(聚)核苷酸，以制造一种药物，与一 种放射疗法的预治疗l关合，以治疗增生性疾病，其中，所述的抗Bcl-2 反义低(聚)核苷酸为间断给药。在一优选实施例中，Bcl-2低(聚)核苷酸
为奥利默森(oblimersen)。 本发明的另一方面是，使用奥利默森(oblimersen),以制 造一种药物，与一种放射疗法的预治疗联合，以治疗一种肿瘤性疾病， 其中，奥利默森(oblimersen)为间断给药，以取得平均最高血药浓度 为至少6 in g/mL。在一优选实施例中，奥利默森(oblimersen)为间断给 药，以取得平均最高血药浓度为至少8jug/mL,较适宜的是至少10jug/mL, 更适宜的是至少15iug/mL。在本发明的另一实施例是，使用奥利默森 (oblimersen),以制造一种药物，与 一种》文射疗法的预治疗联合，以 治疗一种肿瘤性疾病，其中，奥利默森(oblimersen)为间断给药，以 取得平均最高血药浓度为至少20jug/mL。 本发明另一方面是，使用抗Bcl-2的反义低(聚)核苷酸，该 反义低(聚)核普酸为奥利默森(oblimersen),用于生产一种药物，其中 所述抗Bcl-2的反义低(聚)核普酸为间断给药，每剂量从5mg/kg至 50mg/kg。本发明的一优选实施例是，使用一种抗Bcl-2反义低(聚)核苷 酸，该反义低(聚)核苷酸为奥利默森(oblimersen),用于生产一种药物， 其中所述奥利默森(oblimersen)为间断给药，每剂量乂人10mg/kg至 50mg/kg。本发明的另一优选实施例是，使用抗Bcl-2反义低(聚)核苷酸， 该反义低(聚)核苦酸为奥利默森(oblimersen),用于生产一种药物，其 中所述奥利默森(oblimersen)为间断给药，每剂量,人15mg/kg至 50mg/kg。 本发明的另一方面是一种每日或隔日治疗疾病的方法，该 方法在预治疗后通过皮下或静脉给药奥利默森(oblimersen)实施，该 药剂量为少于3mg/kg,或少于2mg/kg，或少于lmg/kg,另外每日实施 伴随疗法，最多一周实施5天。
图示简介
图1A显示对携带异种移植肺瘤的老鼠给药的荧光标记 G3139的给药剂量和时间线。
图1B显示接受腹腔灌注IP治疗的老鼠的异种移植肺瘤吸 收荧光标记的G3139低(聚)核苷酸、FAM-G3139、 Bcl-2反义低(聚) 核苷酸的情况，腹腔灌注(IP)给药量为每日给药5mg FAM-G3139/kg (OBL5,小剂量)7天(左面板)，和15mg FAM-G3139/kg (OBL15,大
剂量)隔两天间断给药(1、 4、 7)。在肿瘤组织吸收FAM-G3139给药 后第8天(中间面板)和第12天(右面板)，对肿瘤组织进行检查。图2A显示对携带异种移植肺瘤的老鼠给药5mg/kg荧光标 记的G3139低(聚)核苷酸、FAM-G3139 ( OBL5 )和X射线的剂量和 时间线，其中X射线(XPT)在治疗的首天于G3149给药前实施，或在 治疗最后一天于G3139最终给药前实施。图2B显示老鼠异种移植肺瘤内荧光标记G3139低(聚) 核苷酸、FAM-G3139的吸收情况，该老鼠接受7天静脉治疗，每日5mg FAM-G3139/kg,在治疗的第一天(左面板)和(B)最后一天(右面板) 实施X射线照射。第11天对胂瘤组织吸收情况进行检查。图3 (A)显示对携带异种移植肺瘤的老鼠，给药15mg/kg 荧光标记的G3139低(聚)核普酸、FAM-G3139 (OBL15)和X射线 的剂量和时间线。其中，X射线(XRT)在第一天于G3139给药前实施， 或在最后一天于G3139给药后实施。图3 ( B )显示老鼠异种移植胂瘤内荧光标记G3139低(聚) 核苷酸、FAM-G3139的吸收情况，该老鼠间隔2天(1、 4、 7)间断接 受15mgFAM-G3139/kg (OBL15)静脉治疗，其中X射线于第一天实施 (左面板)和(B)最后一天(右面板)实施。第11天对肿瘤组织吸收 情况进行检查。图4显示，老鼠的异种移植肿瘤组织吸收低(聚)核苷酸 后，荧光标记G3139^氐(聚)核苷酸、FAM-G3139的长期疗效。在该 老鼠携带肿瘤的右腰上实施首次X射线预治疗，随后5日每日静脉给药 6mg/kg FAM-G3139 (左上面板)；每隔一天静脉给药10 mg/kg FAM-G3139 (既，在第1、 3、 5日给药)，给药三次(中上面板)；在 X射线预治疗当日给药30mg/kgFAM-G3139,给药一次(右上面^反)。 所有老鼠在第8天解剖，评估肿瘤对FAM-G3139的吸收情况。将 FAM-G3139的吸收情况与各只老鼠未接受照射治疗和FAM-G3139治疗 的左腰上控制肺瘤对比[底部面板]。
图5显示图4中老鼠肺瘤的FAM-3139定量。
图6显示对A549 NSCLC异种移植老鼠给药G3139的试验 时间表和剂量。给药时间为每日或隔日，或隔两日或隔三日给药，给药 量为2.5、 5、 7.5、 10、 20、 30和40mg/kg。图7显示按图8所示给药时间和给药量的肿瘤的生长曲线。
图8显示携带A549 NSCLC异种移植肿瘤老鼠在按图8所 示各种剂量给药后的存活率百分比。
本发明详细i兌明 本发明通过间断地给药低聚物伴随或不伴随预治疗，提供 了治疗人类增生疾病的方法和制剂，该疾病包括自免疫性疾病和肿瘤性 疾病，包括癌症、恶性血液病和实体瘤。该发明为一种4支术，交替用于 涉及实体瘤和恶性血液病的癌症、肿瘤、肿瘤性疾病或肿瘤。本发明的
另一方面是通过一个或多个治疗周期治疗增生条件，其中，各周期包括 一预治疗，该预治疗包括一种或多种ii射治疗、化学治疗、声学治疗和 生物治疗，该预治疗在该周期4氐聚物给药前实施。该预治疗包4舌一种治 疗，该治疗将改善接受预治疗的细胞吸收低聚物的吸收情况。 一优选实 施例为一治疗，通过一种或多种反义低聚物，包括但不限于Bcl-2反义 低(聚)核苷酸治疗致癌基因相关疾病，例如癌症，低聚物给药配合一 种预治疗实施，例如，it射治疗、热治疗或声学治疗，由此，预治疗在 反义低聚物给药前实施，反义低聚物按间断给药时间给药，该给药时间 改善了药物至疾病细胞的输送和治疗情况。术语低聚物、核苷低聚物或 反义低聚物，以及反义低(聚)核苷酸应理解为包括反义低(聚)核苦 酸、siRNA、 microRNA、核酸适体、吗淋、分子资导和衍生物。如本文 所用，术语"衍生物"指可用于制药的相应于本发明医药合成物的天然 或人工同系物、相似物、或碎片。预治疗应按有效量实施，即，应足以 改善接受预治疗的细胞对低聚物的吸收能力，该治疗量应对未给予低聚 物的疾病有治疗效果。有效量应理解为，包括在治疗增生性条件时，日 常给予的预治疗量。同样地，低聚物的有效量为足以减少相关靶分子数 量的有效量。
相关基因表达的核苷酸低聚物和其他抑制剂"低聚物"为上述通称，但也指核酸的短小碎片，该碎片 使基因或其mRNA部分杂交从而对基因部分进行补充，该基因在待抑制 疾病细胞内过度表达。疾病细胞包括但不限于瘤细胞或胂瘤细胞和造成 其他增生性疾病的细胞，例如自体免疫疾病。胂瘤细胞内过度表达的基
因包括但不限于，致癌基因、抗凋亡基因、转录激活因子、蛋白激酶、 涉及信号转导通路的基因，以及与细胞生长和死亡相关的基因。致癌基 因表达导致恶性肿瘤发病频率增加或与之相关。另外，细胞已经发展出 方法，使细胞在接受放射疗法或其他抗肺瘤药剂治疗，和特定基因例如 抗细胞凋亡基因的上调治疗(该治疗可以导致恶意肿瘤或抗治疗疾病的 发展)中免于自然死亡或受到损伤。该蛋白通过产生上述基因，约束和
限制调节细胞死亡的蛋白，例如半胱氨酸蛋白酶、p53、 BAD、 BAX和 其他细胞死亡激动剂从而抑制凋敝。因此，本发明中预期的反义低聚物 包括核普酸低聚物，该低聚物与致癌基因、抗凋亡基因和与蛋白激酶族 相关的基因、转录激活因子和细胞生长调节因子杂交。在本发明的一个 实施例中，预期的反义低聚物被引导至致癌基因，该致癌基因包括但不 限于，c-Myb、 c-Myc、 ErbB、 Jun、 Src、 TGF-p以及MCC。在另一实 施例中，反义低聚物为抗凋亡基因族的反义低(聚)核苦酸，例如Bcl-XL、 MDM-2、 IAPs (细胞凋亡蛋白抑制剂)，例如cIAPl、 cIAP2和x链IAP (XIAP) 、 Survivin、 Bfl-l、 LMP1,包括同族体、相似体和书f生物。在 另一实施例中，反义低聚物被引导至涉及信号转录通道的基因，例如 FADD、 TRADD和TRAFF。在一优选实施例中，反义低聚物为Bcl-2反 义低聚物。
小干预RNAs (siRNAs)为短双螺旋RNAs (dsRNAs),长度 为21个核苷酸，两端悬挂有2-3个核普酸。因此，分子的各股有一^岸酸 酯基团在5，端，有一羟基团在3，端。和反义RNAs相同，siRNA已 经证明可以在转录级干扰基因表达，因此，有利于抑制相关特定基因， 特别是与癌症相关的基因。尽管siRNA是由于一种酶(Dicer酶)(该 酶可将长的dsRNA或发卡RNAs转变为siRNAs )的分裂而在细胞内自 然形成，合成siRNAs可以指定攻击任何相关基因。但是，由于两端的 悬挂物，当人工将siRNA引入细胞时，siRNA具有极短的寿命。因此， 本发明的另一目标是提供一种方法，有效传递和吸收siRNA,并通过使 用siRNA加强人类抗凋亡相关疾病的治疗。在另一实施例中，本发明提 供了一种方法，在预治疗，包括但不限于治疗剂量或小剂量的放射疗法 后，改善siRNA的传递和吸收。 Micro-RNA或miRNA为单股RNA,长度为20-25个核普， 并一皮认为在转录级用于调节其他基因的表达。和siRNA不同，成熟
miRNA为非线性复式结构，该结构突起于从DNA转录的一个较长的 miRNA分子。这些RNA分子不被转录进蛋白，但于mRNA结合，例如， E2F-1,并且抑制转录到基因产物，例如E2F-1蛋白，该蛋白为一种调 节细胞增生的蛋白。在一实施例中，本发明提供了一种方法，该方法改 善了 miRNA的传递和吸收，由此，miRNA充分补充了与调节细l包增生 的蛋白，例如E2F-I的pre-mRNA或mRNA。在另 一实施例中，本发明 提供了一种方法，在实施损害细胞或引起炎症的预治疗，例如但不限于 治疗剂量或小剂量的力文射疗法后，该方法改善miRNA的传递和吸收。 核酸适体为结合到其他分子上的小分子。更准确的说法是， 核酸适体可以划分为DNA或RNA核酸适体。DNA或RNA核酸适体是 选择性序列，该序列能通过形成结合口袋识别特定的配合基。RNA或 DNA核酸适体可以与核酸、蛋白或小的无才几化合物结合。核酸基核酸适 体的一个例子是环状AMP反应元(CRE K秀导核酸适体(新泽西Berkeley Heights, Genta公司)。CRE-诱导核酸适体与蛋白复合体结合，并阻断 蛋白复合体，该蛋白复合体通常引发受到CRE调节的基因，由此抑制 肺瘤细^^的生长。 在一实施例中，本发明提供了一种方法，该方法改善了核 酸适体的传递和吸收，其中，核酸适体被指定在转录级或转译级专门抑 制基因。在另一实施例中，本发明提供了一种改善核酸适体的传递和吸 收的方法，其中，该核酸适体专门与一种调节细胞增生或凋亡的蛋白结 合，该核酸适体在预治疗，包括但不限于放射疗法后间断给药。
预治疗
本发明的 一个方面涉及一个或多个治疗周期，包括一种低聚物治疗 前的预治疗。该预治疗包括一种或多种传统治疗，详情如下 放射疗法放射疗法是治疗癌症，特别是治疗乳腺癌、肺 癌和前列腺癌的一种主要治疗手段。(有关放射疗法的情况，参见De Vita、 Jr等人，在J.B. Lippincott公司(出版商)出版的《胂瘤学原理和 实践》第三版中的文章"癌症，，，第15章-"放射疗法原理")。在放 射疗法中，或放射疗法结合有效的传统化学疗法中，病患经常接受大剂 量的辐射。尽管由于采用了复杂的规划和先进的大剂量放射传递方法， 从而提高了治愈率，但是仍然会出现治疗失败的情况。通常，使用放射
疗法需要结合其他抗瘤药物，例如化疗药物、抗生素或激素。在某一癌 症中，由于致癌基因的过度表现，将对放射疗法和抗瘤药剂产生^t氐抗， 从而导致凋亡通路的抑制，该通路通常在放射疗法或其他抗瘤药剂而使 细胞受损后被激活。例如，Bcl-2的过度表达， 一种凋亡抑制因子在多 种癌症中起作用，包括(恶性)黑素瘤、慢性髓性白血病和其他癌症。同
样，抑制Bcl-2功能可以加强胂瘤细胞对放射的敏感度。 明显地，所有结合其他抗瘤治疗的反义^氐聚物的治疗方案 都需要初期给药反义低聚物，该低聚物被认为是在给予抗瘤治疗前，抑 制抗凋亡基因表达所必须的物质。使用反义低(聚)核苷酸，例如Bcl-2 反义低(聚)核苷酸的临床研究应经实施，由此，低(聚)核苷酸每日 给药，典型地在传统治疗前，通过10天连续静脉注射或通过14天连续 皮下注射给药。(参见，G.Marcucci等人(2003 )《血液》101: 425-432; 和J.S.Waters等人(2000)《临床肿瘤》18: 1812-1823 )。该战略的基 本原理是，在给予更传统的治疗前，必须确保细胞内低(聚)核苷酸的 局部水平足够高，以便能立即抑制Bcl-2基因的表达，从而防止细胞免 于受到例如，放射疗法或抗瘤药剂治疗的伤害。这些研究的结果令人鼓 舞，但仍不是最理想的。 在<<良好生产规范>>(GMP)要求下，临床级低(聚)核普 酸的合成通常成本较高，因此，大剂量的低(聚)核苷酸给药，特别是 按曰给药/连续给药安排对于许多患者和/或健康保险过于昂贵。在一实 施例中，本发明提供了更经济的治疗方法。 进入细胞质是一个关键问题，因为低(聚)核苷酸必须能 够再分配进入细胞，在细胞内，低(聚)核苷酸能够与mRNA杂交，以 抑制具有抗凋亡基因产物的表达。尽管，目前对于低(聚)核苷酸的天 然吸收机制还不了解，但是认为低(聚)核苷酸可以通过被动扩散或内 体泄漏进入细胞质。但是，通过被动扩散，特别是带点低(聚)核苷酸 的吸收效果微弱，而且健康细胞通常不会发生泄漏。另外，I期临床试 验中的药物(代谢)动力研究表明，根据给药的剂量和模式，消除低(聚) 核苷酸的血浆平均半衰期为30分钟至8小时。目前为止，传递低聚物 至肺瘤细胞的能力被认为是暴露在循环低聚物下的肿瘤细胞的持续时 间的函数，治疗战略要求给予足够长的暴露时间，强化持续时间和每曰 给药安排。 一个关键问题是，如何优化肿瘤细胞对低(聚)核苷酸的吸
收能力，以提供最大有效且经济的治疗值。 本发明部分上基于一意外发现，即，间断地向异种移植老 鼠给予一种大剂量的抗Bcl-2抗凋亡低(聚)核苷酸，比按传统治疗方 式，每日向该动物给药核苷酸的方式，更能提高老鼠体内肿瘤细胞对低 (聚)核苦酸的吸收率。对异种移植肿瘤的老鼠，在第1、 4和7天(3 日间隔间断给药安排)按15mg/kg剂量，给予荧光标记Bcl-2反义低(聚) 核苷酸，与每日给药相比，甚至在5天后治疗之后，仍明显改善了标记 低(聚)核苷酸的吸收率和保持性。(参见
图1B)。在给予Bcl-2反义 低(聚)核苷酸之前，通过对胂瘤肺块的预治疗，例如放射疗法，可进 一步提高吸收率。已经显示，首先对动物给予预治疗，然后间断给予低 聚物而非传统的连续/每日给药，能取得最佳疗效。与当前实践相反， 一个非同寻常的发现是，与IO天每曰给 予5mg/kg的低(聚)核苷酸后(参见图2B,左面板)，于第10天给予 相同剂量的放射治疗，或不实施放射疗法(参见图2B,右面板)的方 案相比，在10天每日5mg/kg的低(聚)核苷酸的Bcl-2反义治疗之前， 在第l天实施放射治疗(X射线5Gy)的方案，更能极大地提高荧光标 签Bcl-2反义低(聚)核普酸的吸收率。另外，在给予放射预治疗后， 在第1、 4、 7和10天(隔三天间断给药安排，总剂量为4次给药，每 次15mg/kg)间断给予相同总剂量的Bcl-2反义低(聚)核苷酸，也会 明显改善吸收率(参见图3B)。与第10天给予Bcl-2反义低(聚)核 苷酸治疗之后对胂瘤进行照射治疗的方案相比，低聚物间断治疗方案， 尽管也能提高吸收率，但是，在首日低聚物给药前，对肿瘤实施照射治 疗，可以达到最大吸收率。 —个非同寻常的发现是，和间断给予低聚物治疗一样，放 射预治疗可以提高低聚物的吸收率，而放射预治疗后给予间断低聚物治 疗，可以取得最高吸收率，另一非同寻常的发现是，在给予低聚物治疗 前给予放射预治疗，也可以改善/延长低聚物在预先接受放射治疗的细胞 内的保持率。在至少5天至7天后治疗的细胞内，存留有大量的低聚物。 另外，对于接受放射治疗后接受一次性大剂量低聚物给药的动物，比接 受间接给药的动物，具有更高药物保持率，而接受间接给药的动物比每 曰给药的动物具有更高的药物保持率。在所有病例中，已经接受预治疗 的动物体内具有较大的药物保持率。特别是，与实施放射预治疗，随后
隔日(第1、 3和5天)给予10mg/kg的低(聚)核苷酸，或5天每日 给予6mg/kg的低聚物的方案相比，在首日实施放射疗法，之后于当曰 给予单次30mg/kg低(聚)核苷酸的方案，其低(聚)核苷酸的保持率 可以达到至少5至7天。(参见图4和图5)。
这些研究的结果表明，使用预治疗，例如放射疗法，不仅 可以提高低(聚)核苷酸的吸收率和保持率，还提供了一种治疗方法， 该方法以更便利的方式，更少的低(聚)核苷酸给药量，改善了治疗的 效力。通过改善反义低(聚)核苷酸的吸收率和延长保持率，本治疗方 法提供了一种改进的方法，该方法抑制抗凋亡基因的表达，从而改进了 该条件的治疗。(参见图7和图8)。这些研究提供了一种方法，在癌 症治疗中，改进反义核苷酸治疗的临床应用。另夕卜，无论是否降低低(聚) 核苷酸的给药量，较低频率的给药，减少了患者至治疗中心的看病频率， 节约了看病时间和费用。基于上述结果，本发明设想了一种治疗方案，该方案包括 一种或多种治疗周期，包括在每一周期内，实施一次或多次预治疗，在 预治疗后，更适宜地以间隔方式，给予大剂量或小剂量低聚物，例如但 不限于Bcl-2反义低(聚)核苷酸。该治疗方案将随意按周期给药，直 到取得最佳结果，达到预设的周期数量或治疗药师确定在治疗中已经发 生了适当的变化。本发明也设想了一种方法，该方法通过在间断给予大 剂量合成制剂前，实施一种或多种预治疗，从而改进/增强了抑制抗凋亡 基因表达制剂的传递。该预治疗涉及一种能够破坏细胞膜和/或引起一种 发炎反应的治疗方法。在本发明的一个实施例中，预治疗的选择基于对 细胞的伤害和/或发炎反应的控制能力。上述预治疗可以是物理治疗、生 物治疗或药物治疗。物理预治疗的一个例子是电》兹辐射，例如^f旦不限于 X射线、伽马射线、贝塔粒子、紫外线、红外线、无线电波和微波。无 线电波的另 一 实施例是质子束或电子脉冲。 X射线或伽马射线为最普遍的用于治疗癌症的放射疗法， 并且是最主要的治疗恶性肿瘤的有效治疗手段。但是，临床医师从未将 该射线治疗作为一种增强低聚物吸收率的方法。使用X射线或伽马射线 的一个优势是，能够通过辐射深透体腔，从而导入指定区域，而不会被 身体吸收。本发明也设想采用该疗法进行全身辐照(TBI)、皮肤辐照 以治疗皮月夫'淋巴瘤，并在适当环境下进行近距》文射疗法。 在本发明的一个实施例中，电磁辐射为贝塔粒子。在本发 明的另一实施例中，电磁辐射为一种无线电波或一种微波。在本发明的 一优选实施例中，电磁辐射为伽马射线，而在本发明的一更优选的实施 例中，电；兹辐射为X射线。
电磁辐射可以通过传统方式，定向方式或全身辐照方式对 病患实施。定向辐照是一种较精确的方法，可以将射线输送到肿瘤上， 而不会损伤周围的正常组织。辐射可以为单次传统分割辐射或辅助野超 分割辐射。 在本发明的一个实施例中，在进行低聚物治疗前，以定向 方式或传统方式对病患实施放射治疗。在本发明的另一实施例中，以定 向方式实施方欠射治疗，随后在预治疗后的1至24小时或以上时间内》会 予低聚物治疗。该预治疗的时间可达数天或数周，期间，给予低聚物治 疗，前提条件是，预治疗必须于低聚物治疗前实施。 在本发明的一个更优选实施例中，以定向方式实施》文射治 疗，随后在预治疗后的1至IO天内间断给予低聚物治疗.例如,在本发明 的一个实施例中，低聚物的给药频率不超过隔天一次。在另一实施例中， 低聚物为每两天、三天或四天给药一次。在一优选实施例中，低聚物每 五天给予一次。在本发明的一更优选实施例中，低聚物为每周、每两周、 每月或每两月给予一次。在另一优选实施例中，低聚物在预治疗后当天 给予一次，或在与治疗后的1至7天内给予。 在本发明的另一实施例中，在低聚物治疗前，以定向方式对 病患实施》文射疗法。在本发明的另一实施例中，在以定向方式对病患实 施放射疗法后，在3至24小时内间断地给药低聚物或抑制剂。在本发 明的一更优选的实施例中，以分割方式实施放射疗法，随后在预治疗后 的2至10天内，间断给药低聚物。 在另一优选实施例中，在以定向方式实施》文射疗法后，3妄 2至IO天间隔期，间断给药低聚物治疗。例如，在本发明的一实施例中， 低聚物给药频率不超过隔天一次。在另一实施例中，低聚物给药频率为 每两天、每三天或每四天一次。在一优选实施例中，低聚物给药频率为 每五天或每六天一次。在本发明的一更优选实施例中，低聚物给药频率 为每周、每两周、每月或每两月一次。
放射疗法在预治疗中的实施剂量为所属领域的技术人员显
而易见的剂量。剂量根据胂瘤的种类、形状和大小而定。除此以外，也 应该考虑到正常器官结构或组织的接近度。在一实施例中，放射疗法的 预治疗剂量为传统非治疗性剂量。该剂量也是所属领域的技术人员显而 易见的剂量，并且可以用于前期已经治疗过的区域，或不能适应更高的 传统治疗性放射量的区域。在另一实施例中，预治疗的实施剂量和方式 为单独治疗时的治疗性剂量，或与化学疗法或其他通用抗瘤制剂联合治 疗时的治疗性剂量。 在另 一 实施例中，本发明设想了 一种减少在 一 治疗周期内 低聚物的给药量的方法，该方法首先实施预治疗，随后按一次剂量或多 次剂量给药低聚物，该低聚物的给药频率为隔天一次或每七天一次。声学治疗本发明也设想了，在低聚物给药前，利用低或 高强度聚焦超声对癌症患者进行非侵入式预治疗。与放射疗法相同，声 学疗法也提供了 一种非侵入式的方法，该方法可使声波深透体腔到达指 定区域，减少了对正常组织的伤害。
在本发明的 一 实施例中，高低强度的超声预治疗在低聚物 治疗前实施。在本发明的另一实施例中，在实施了高低强度超声波后， 于1至24小时内，间断给药低聚物。在本发明的一更优选实施例中， 对人来癌症患者实施高^氐强度的超声治疗，随后在2至10天内，间断 给药低聚物。例如，在本发明一实施例中，低聚物的给药频率不超过隔 天一次。在另一实施例中，低聚物的给药频率为每两天、三天或四天一 次。在一优选实施例中，低聚物的给药频率为每五天一次。在本发明的 一更优选实施例中，低聚物的给药频率为每周、每两周、每月或每两月 实施一次。 超声治疗的剂量为所属领域的技术人员显而易见的剂量。 超声治疗强度根据肿瘤的种类、大小形状而定。另外，必须考虑与肿瘤 区相关的正常结构或组织的邻近区域，即，无论该肿瘤位于体腔深凹处， 或皮肤表面。本发明的一实施例中，采用0.1至3W/cr^的能量。在本 发明的另一个实施例中，能量强度为3至10W/cm2 。在本发明的另一实 施例中，能量强度为100至1000W/cm2。 热疗 一种热疗的形式是高温疗法，该方法是对体组织实 施45 。C的高温治疗，该治疗通常对正常组织的伤害极小。
设想在一实施例中，通过各种技术将局部高温施加到肺瘤
块内一个小区域内从而加热肺瘤。这些技术包括但不限于微波、射频和 超声。局部高热疗法也包括针对皮肤内或皮肤下肿瘤的外部方法，或4f 对体腔内或靠近体腔的肺瘤的腔内方法，针对体内较深区域肺瘤的间隙 方法，以及隔离灌注法，例如隔离月支体灌注。 在另一实施例中，局部高温疗法可以用于加热大面积肿瘤 组织。在本发明的另一实施例中，全身高温疗法可以用于治疗扩散至全 身的转移癌。在本实施例中体温可以升至4rC至42°C 。
在另 一 实施例中,预治疗包括局部或全身交替高温疗法。 在本发明的 一优选实施例中，高温预治疗在^氐聚物给药前 实施,随后实施2天或10天间隔间断给药低聚物或不给药。例如，在本 发明的一实施例中，低聚物的给药频率不超过隔天一次。在另一实施例 中，低聚物的给药频率为每两天、三天或四天一次。在一优选实施例中， 低聚物的给药频率为每五天一次。在本发明的一更优选实施例中，低聚 物每周、每两周、每月或每两月给药一次。 在本发明的 一 更优选实施例中，高温预治疗在低聚物给药 前1至24小时内实施,随后按2至10天间隔间断给药低聚物。在本发明 的一实施例中，低聚物的给药频率不超过隔天一次。在另一实施例中， 低聚物的给药频率为每两天、三天或四天一次。在一优选实施例中，4氐 聚物的给药频率为每五天一次。在本发明的一更优选实施例中，低聚物 每周、每两周、每月或每两月给药一次。药学疗法另外，本发明也设想了使用化学疗法作为人类 增生性疾病包括但不限于癌症的预治疗。这些药剂于低聚物给药前给 药，给药量为肿瘤预治疗有效量。有效量为技术人员认为显而易见的剂 量，包括但不限于传统的药剂治疗性剂量或亚治疗剂量。药剂包括但不 限于属于抗瘤药剂、抗生素、脂肪酶、洗涤剂、小分子、激酶激动剂或 对抗剂，或其衍生物以及相似体一类的化学药剂。抗瘤药剂类包括^旦不 限于烷[烃]化剂、拓朴异构酶抑制剂、植物碱和萜类、核苷酸/核苷酸相 似体，以及抗代谢剂。预期的抗瘤药剂包括^旦不限于硼替佐米 (bortezomib ), 吉西4也;宾(gemcitabine ) , j尹马替尼(Imatinib), 氟4立 达滨(fludarabine),奥沙利铂(Oxaliplatin ),多烯紫衫醇(Docetaxel), 紫衫醇(palcitaxel ),沙立度胺(thalidomide) , 5-FU ，多柔比星 (Doxorubicin)，阿糖胞苦(arabinoside-C)，卡柏(Carboplatin),柔
红霉素(daunomycin), 地塞米松(Dexamethasone ) 和依托泊戒 (etoposide )。 在本发明的一实施例中，在低聚物给药前，对人类癌症患 者，实施一个或多个周期的预治疗，随后实施2天或10天间隔间断》会药 低聚物或不给药。例如，在本发明的一实施例中，低聚物的给药频率不 超过隔天一次。在另一实施例中，低聚物的给药频率为每两天、三天或 四天给药一次。在一优选实施例中，低聚物的给药频率为每5天或10 天给药一次。在本发明一更优选实施例中，基因表达低聚物的给药频率 为每周、每两周、每月或每两月给药一次。 在本发明的另一实施例中，药物疗法预治疗在低聚物症会药 前的1至24小时内实施，随后按2天至10天间隔间断给药低聚物。在 本发明的一实施例中，低聚物的给药频率不超过隔天一次。在另一实施 例中，低聚物的给药频率为每两天、三天或四天给药一次。在一优选实 施例中，低聚物的给药时间为每五天给药一次。在本发明一更优选的实 施例中，低聚物的给药频率为每周、每两周、每月或每两月给药一次。生物疗法本发明另外提供了一种包括一种或多种生物预 治疗的药物合成法。生物预治疗包括但不限于抗生素、蛋白，例如穿孔 蛋白、蛋白酶、荷尔蒙、细胞活素类、生长因子和前列腺素。 在本发明的一实施例中，人类癌症患者接受预治疗配合纟会 药一种或多种生物合成物。生物预治疗合成物剂量为亚治疗剂量，并且 可以在给药后，立即给药预治疗抑制剂，随后间隔2至10天间断给药 低聚物或不给药。 在本发明的另一优选实施例中，在低聚物给药前的1至24 小时内给药生物预治疗合成物，随后间隔2至10天间断给药低聚物。 例如，在本发明的一实施例中，低聚物的给药频率不超过隔天一次。在 另一实施例中，低聚物的给药频率为每两天、三天或四天给药一次。在 一优选实施例中，低聚物的给药时间为每五至10天给药一次。在本发 明一更优选的实施例中，低聚物的给药频率为每周、每两周、每月或每 两月给药一次。
抗凋亡基因表达抑制剂 本发明设想使用 一种或多种抗凋亡基因抑制剂，包括但不
限于Bcl-2反义低(聚)核苷酸，例如奥利默森(oblimersen) ( Genasense ; G3139),或其衍生物、相似体、片段、混合物、拟态和致癌基因。 本文所用，术语"衍生物"指相对于本发明药物合成物的任何可制药的 天然或合成同系物、相似体或片段。适于本发明所用的反义低(聚)才亥 苷酸包括核苷酸低聚物，长度从5至10基、10至20基、20至50基、 50至75基、75至100基；较优选的长度是10至40基；更优选的长度 是15至25基；最优选的长度是18基。反义核苷酸结合的靶序列可以 为使患病或癌症细胞内蛋白高表达的RNA或DNA。靶序列可以为单月更 或双股。粑分子包括但不限于pre-mRNA、 mRNA、 DNA和蛋白质。在 一实施例中，輩巴分子为mRNA。在一优选实施例中，粑分子为Bcl-2 pre-mRNA或Bcl-2 mRNA。在一特定实施例中，反义低(聚)核苷酸与 Bcl-2 pre-mRNA或mRNA上的任意一处的蛋白杂交。该反义低(聚) 核苷酸最好从与Bd-2 pre-mRNA或mRNA的转导起始点、供体剪接点、 受体剪接点、输送点或降解点杂交的低(聚)核苷酸中选择。 前期已经对几种Bcl-2反义低(聚)核苷酸进行了评估，取得 了各种结果(参见，SEQ.ID.NOS:美国专利号5, 831， 066)。美国 专利申请号08/217,082 (现为美国专利号5,734,033 ),美国专利号 08/465，485 (现为美国专利号5,831,066 );和美国专利号09/080,285 (现 为美国专利号6,040,181 )对可用于本发明的Bcl-2反义低(聚)核苷酸 进行了详细说明，以上各文件在此作为参考文献整体引述。 在一实施例中,Bcl-2反义低(聚)核苷酸对Bcl-2pre-mRNA或 mRNA的部分，或与Bcl-2有关的pre-mRNA或mRNA的部分给予了充 分补充。在一优选实施例中，Bcl-2反义低(聚)核苷酸与pre-mRNA编码 链的转导起始点杂交。在另一更优选实施例中，Bcl-2反义低(聚)核苷酸 与包括人类Bcl-2基因转译起始点的pre-mRNA编码链的 一个部分杂交。 更优选的实施例中，Bcl-2反义低(聚)核苷酸包括一个TAC序列，该序 列对Bcl-2 pre-mRNA或RNA的AUG起始序列互补。 在另 一实施例中，Bcl-2反义低(聚)核普酸与人类Bcl-2基因 的pre-mRNA编码链的剪接供体点的一部分杂交。较优选的是，该核香 酸包括一个CA序列，与Bcl-2基因的GT剪接供体序列互补，更优选的 是，包括5至50基的侧翼部分，更优选的是，包括10至20基，与Bcl-2 基因编码链侧面剪接供体点部分杂交。 在另一实施例中，Bcl-2反义低(聚)核苷酸与人类Bcl-2基 因的pre-mRNA编码链的剪接供体点的一部分杂交。4交优选的是，该核 苷酸包括一个TC序列，与Bcl-2基因的AG剪接供体序列互补，更优选 的是，包括5至50基的侧翼部分，更优选的是，包括10至20基，与 Bcl-2基因编码链侧面剪接供体点部分杂交。在另一实施例中，Bcl-2反 义低(聚)核苷酸与涉及剪接、传导或降解的pre-mRNA或mRNA的部分 杂交。
所属领域一般技术人员可识别，适用于本范明的反义核普 酸也可以对Bcl-2 pre-mRNA或mRNA上的其他点位进行实质性互补， 而形成杂交。技术人员也了解与以下Bcl-2 pre-mRNA或mRNA的部分 杂交的反义核苷酸更优越，能够保持治疗的专一性，该Bcl-2 pre-mRNA 或mRNA的序列在无关基因转录中并不常见。 Bcl-2反义低(聚)核苷酸的序列设计可以通过试验和临床疗 效结果确定，而无论其与Bcl-2基因、Bcl-2 pre-mRNA、 Bcl-2 mRNA或 Bcl-2相关核苷酸序列的同习性程度或杂交程度如何。所属领域的技术 人员应了解，在临床治疗中也证明了其反应，与优选实施例相比，具有 较少的序列同系性、较多或较少的改性核苷酸、较长或较短的长度的 Bcl-2反义核苷酸也在本发明范围内。 上诉反义4氏(聚)核苷酸可以是RNA或DNA或其衍生物。 反义低(聚)核苷酸的特定形式可以影响低聚物的药物代谢参数，例如， 生物利用度、新陈代谢和半衰期等。同样，本发明设想的反义低(聚)核 苷酸衍生物具有改善细胞吸收率、加强核酸酶抗性、提高与靶序列结合 度或增强靶序列分裂度或降解度的性能。该反义低(聚)核苷酸可以包含 基础构成物，例如硫代磷酸酯或甲基膦酸脂。该反义低(聚)核苷酸，可 以为混合低聚物，包含磷酸二酯、硫代磷酸酯和/或(尤其是)曱基膦酸 核苷酸。该低聚物也许具有变体，该变体包括但不限于2-0-烃基或2-0-卣代糖变体、骨干变体(例如，曱基膦酸核苷酸、硫代磷酸酯、甲基缩 醛、3-硫甲缩醛、砜、氨基磺酸盐、硝基氧骨干、吗啉代衍生物和肽核 酸(PNA)衍生物)，或者基半族已经改质的衍生物(Eghoim等人，于 1992年，所发表的文章"带有一个非手性肽骨干的肽核酸(PNA)-低(聚) 核苷酸相似体"，Arghya和Norden,于2000年，在《美国实验生物学 会联合会》(FASEB) 14: 1041-1060上发表的文章"肽核酸(PNA):
医疗和生物技术应用和前景")。在另一实施例中，反义低(聚)核苷酉交
包括低(聚)核普酸配对和衍生物(Goodchild,于1990年在《生物配只十 化学》1 ( 3 ): 165-87中所发表的文章"低(聚)核苷酸配对和改性低(聚) 核香酸合成和性能回顾")。 在体内治疗中，采用Bcl-2反义低(聚)核苷酸的一种硫代石粦 酸酯衍生物可以达到较好效果，部分原因在于，该化学物具有极高的抗^ 降解性。在一实施例中，Bcl-2反义低(聚)核苷酸为包含硫代磷酸酯基的 杂交低聚物。在另一实施例中，Bcl-2反义低(聚)核苷酸包括至少一条石危 代磷酸酯链。在另一实施例中，Bcl-2反义低(聚)核苷酸包括至少三条石克 代磷酸酯链。在另一实施例中，Bcl-2反义低(聚)核苷酸包括至少三条连 续的硫代磷酸酯链。在另一实施例中，Bcl-2反义低(聚)核苷酸包括整个 硫代磷酸酯链。对于低(聚)核苷酸衍生物的制备，在所属领域已知，参 见，Stem等人，于1988年在《核苷酸研究》16: 3209-21 (硫代磷酸酯) 中所发表的文章；Blake等人，于1985年在《生物4t学》24: 6132-38 中所发表的文章(甲基膦酸核苷酸)；Morvan等人，于1986年在《#亥 苷酸研究》14: 5019-32中所发表的文章(oc-脱氧核苷酸)；Monia等 人，于1993年在《生物化学杂志》268: 14514-22中发表的文章"对作 为基因表达反义抑制剂的包含2脱氧裂隙的2-改性低(聚)核苷酸的评 价"(2-0-甲基-核苷)；Asseline等人，于1984年在《美国国家科学院 院刊》81: 3297-3301中所发表的文章(吖啶)；Knorre等人，于1985 年，在《生物化学》67: 783-9中所发表的文章；Vlassov等人，于1986 年在《核苷酸研究》14: 4065-76中所发表的文章(N-2-氯乙胺盐酸盐 和吩溱)；Webb等人，于1986年在《核苷酸研究》14: 7661-74 ( 5-曱基-N4-N4-乙醇胞嘧。定)；Boutorm等人，于1984年，在《美国实马全生 物学会联合会》172: 43-6中所发表的文章(乙二胺四乙酸(EDTA )和 相似体)；Chi-Hong等人，于1986年在《美国国家科学院院刊》83: 7147-51中发表的文章(5-胺基乙醯根-1, 10-o-邻二氮杂菲)；和Chu 等人，于1985年在《美国国家科学院院刊》82: 963-7中发表的文章(二 亚乙基三胺五乙酸(DTPA)衍生物)。 Bcl-2反义低(聚)核苷酸的有效剂量为，0.1至50mg/kg/每 剂，较好的剂量为1至50 mg/kg/每剂，更适合的剂量为5至30mg/kg/ 每剂，最适合的剂量为10至30mg/kg/每剂。Bcl-2反义低(聚)核苷酸的
给药量可以根据给药方式而定。例如，静脉给药Ba-2反义低(聚)核苷酸， 比使用包含了 Bcl-2反义低(聚)核苷酸的药物合成物的药物局部灌输更 能提高全身剂量。在一实施例中，Bcl-2反义低(聚)核苷酸采用皮下给药， 给药量为1至50mg/kg/每剂；更适宜的剂量为4至30mg/kg/每剂，最适 宜的剂量为5至15mg/kg/每剂。在另一实施例中，Bcl-2反义低(聚)核苷 酸采用静脉给药，给药量为1至50mg/kg/每剂；更适宜的剂量为4至 30mg/kg/每剂；最适宜的剂量为5至15mg/kg/每剂。在另一实施例中， Bcl-2反义低(聚)核苷酸采取局部给药，给药量为1至50mg/kg/每剂；较 适宜的剂量为4至30mg/kg/每剂；更适宜的剂量为5至15mg/kg/每剂。 对于所属领域技术人员，很明显，局部给药导致全身给药量较低。例如， 局部给药方式，例如胂瘤内给药、眼球内注射或灌注会导致局部Bcl-2 反义低(聚)核苷酸的高浓度，但是全身剂量却相对较低。因此，在该案 例中，设想Bcl-2反义低(聚)核苷酸的局部给药量，将导致全身剂量达到 0.1至50mg/kg/每剂。 在另一实施例中，Bcl-2反义低(聚)核苷酸的规定大剂量为 10至50 mg/kg/每剂，该剂量在治疗周期内给予。另外， 一个特定的Bcl-2反义低(聚)核苷酸的有效剂量也要 根据其他一些因素而定，这些因素包括，癌症的种类、疾病的状态或阶 段、低(聚)核普酸的毒性、癌症细胞对低(聚)核苷酸的吸收率，以及接受 反义低(聚)核苷酸给药的病患的体重、年龄和健康状况。由于体内有i午 多因素将干扰Bcl-2反义低(聚)核苦酸的作用或生物活性，所属领域的技 术人员认识到，Bcl-2反义低(聚)核苷酸的有效量将因人而异，并由此认 识到，对特定患者应采用不同的合适剂量。 本发明的另一实施例中，Bcl-2反义低(聚)核苷酸奥利默4兔 (oblimersen )将以至少为6 ju g/ML的平均峰值血药浓度(Cmax)为一 个剂量，间断给药，较适宜的剂量为至少8pg/ML,更适宜的剂量为至 少10jug/ML，而更适宜的剂量为至少15jug/ML,更适宜的剂量为至少 20jug/ML。在另一实施例中，平均峰值血药浓度为至少40jLig/ML,而 更适宜的剂量为50jug/ML。 一个非同寻常的发现是，当根据本发明间 断给药时，可以达到更高的有效峰值血浆水平，而且不会出现明显的临 床毒性。平均峰值血药浓度应根据至少4个病例的血药浓度而定，并且 应在奥利默森(oblimersen)初次给药后15分钟至24小时内，进^f亍测
量， 一边确定各样例的峰值血药浓度。奥利默森(oblimersen)的血药 浓度可以通过阴离子交换高性能法进行侧梁，然后求得峰值血药浓度平 均值。液相镨。简要地说明，在控制血浆中可以产生复制的标准曲线， 奥利默森(oblimersen)的血药浓度为0.25、 0.5、 1、 2、 5、 10和20mg/mL。 采用苯酚、氯仿和异戊醇提取标准曲线和病例中的血浆。可以V吏用 GenPak-Fax柱管(英国沃特福德waters )进行层离。通过Li(OH) 220mmol /L中的LiCl22mol/L的生物梯度，洗提奥利默森(oblimersen )。通过
2 5 4 n m光"i普完成才全测。将0 . 5 m L的血浆加入到2.45ml, 0.4% 浓度的十二烷基石危酸钠，5 OmM氯4b钠，1 OmM乙二胺四乙酉臾， p H值为7 . 4的1 0 mM平衡酚中，然后搅拌两分钟，便可以提取低(聚) 核苷酸。高性能液体色谱(H P L C )的情况高性能液体色谱(H P L C ) 系统包4舌两个K o n t r o n泵， 一个4 6 O梯度-仪和一个K o n t r o n 自动取样器。紫外线检查采用一个Un i c am二极管阵列检测器，检 测波长为2 5 4 n m。高性能液体色谱(H P L C )柱管为W a t e r s GenPak-Fax柱管(4.63 100mm),緩沖液A为20%的乙腈/10mM LiOH)2, 緩沖液B为200/c)的乙腈/10mM LiOH)2/2M LiCl2。线性梯度为，以 0.5ml/mm的流速，用30分钟，将緩沖液B从10%加至100%。 80微升 的样品注入自动取样器。采用Packard1122馏分收集器采集分镏出的化 学成分(0.5ml),然后将5ml的Hiomc Fluor闪烁液加入样品，计凄丈5 分钟。参见《临床肿瘤》第18巻，9 (五月)2000: ppl812-1823以及
《药理学期刊》和《试验疗法》第281巻，l号，420-427, 1997，以上 各文件在此作为参考文献。 Marcucci等人，已经证明在对两个同龄组的病人，分别按 4mg/kg/每剂和7mg/kg/每剂的剂量，以静脉注射的方式，连续10天注射 Bcl-2反义4氐(聚)核苷酸(Genasense眠G3139)后，24小时内可以达到血 药稳态浓度(Css),但是血药浓度却呈单指数衰减，并且在4小时内 变得不可检测。血浆的半衰期为60分钟。(G. Marcucci等人，于2003 年在《血液》101: 425-432中所著文章)。当采用连续14天皮下注射 G3139时，在输液开始后48小时内，可达到血药稳态浓度。消除浓度 的平均血液半衰期为7.46小时(参见Waters等人(2000)在《临床肿 瘤期刊》18: 1812-1823中所发表的文章)。另一方面，Yuen等人，曾 报道过在连续静脉注射低(聚)核苷酸开始后24小时的PKC- a的20-长度
硫代磷酸酯低(聚)核苷酸的血药浓度，与笫21天所测得的血药浓度相
同，既，血药稳态浓度Css在第24小时即'刻达到(参见A.R.Yuen等人， 于1999年在《临床癌症研究》5: 3357-3363中所发表的文章)。当剂 量为l.Omg/kg/每剂量时，血药半衰期为40分钟，当剂量为3.0mg/kg/ 每剂量时，血药半衰期为60分钟。这些观测数据表明，给药方式对于 取得足够血药浓度以将低(聚)核苷酸输入细胞，从而有效抑制Bcl-2抗凋 亡作用非常重要。 可以在一个治疗天内，通过连续输液(分钟或小时，最好 为小时)或可采用推注输液，进行大剂量给药。单次大剂量给药可能导 致Bcl-2反义低(聚)核普酸的循环血药浓度在瞬间超过30 ju g/mL。另夕卜， 单次大剂量给药Bcl-2反义低(聚)核苷酸可能导致在不到12小时时间
内，Bd-2反义低(聚)核苷酸达到平均峰值血药浓度Cmax。本发明的一实
施例-没想，大剂量给药可以间隔2至10天，间断给药，4支适宜的皇会药 频率为每隔3至9天给药，更适宜的给药频率是每隔5至7天给药一次。 在一优选实施例中，在一个治疗周期内，可采用单次高浓度给药以达到 平均峰值血药浓度Cmax，从而可以降低治疗肿瘤所需要的低(聚)核苷酸 的给药量。在另一实施例中，可以通过隔天给药的方式，长时间小剂量 给药，以实现低(聚)核香酸的大剂量给药。另外，Bcl-2反义低(聚)核苷酸的剂量会根据所使用的特定 Bcl-2反义低(聚)核香酸的类型不同而有所改变。 在确定Bcl-2反义低(聚)核苷酸的有效剂量时,应考虑的其 他因素包括在低(聚)核苷酸给药时,是否需要配合其他治疗。在此情况 下，大剂量的Bcl-2反义核苷酸的治疗，允许采用联合治疗，其中，可 以减少其他治疗的剂量，从而减小毒性。例如，对一个病患，按10至 50mg/kg/每剂量，。间断给药Bcl-2反义低(聚)核苷酸，可以增加受治疗 者对癌症疗法的敏感度。在此情况下，根据本发明给药的大剂量Bcl-2 反义低(聚)核苷酸治疗，与其他治疗手段相结合，例如，小剂量的癌症 治疗药剂，可以提高患者的治疗效果。 在一实施例中j妄2至10天间隔，间断给药18基硫代石庳酸 酯Bcl-2反义低(聚)核苷酸指定G3139(奥利默森(oblimersen); R丄Klasa 等人(2002)在《反义和核酸药物发展>>12:193-213中所发表的文章)， 该化学物对Bcl-2mRNA的首6个密码子互补,并与各自的RNA靶基杂
交。 在另 一 实施例中，奥利默森(oblimersen)按0.1至10 mg/kg/ 每次给药。在一具体实施例中，奥利默森(oblimersen)按1至50 mg/kg/ 每次给药，间隔2至10天，间断给药；更适宜的给药量为4至30mg/kg/ 每次给药；最适宜的给药量为5至15 mg/kg/每次给药。在另一实施例中， 奥利默森(oblimersen)按上述剂量，间隔3至9天间断给药。在另 一实 施例中，奥利默森(oblimersen)按上述剂量，间隔4至7天间断给药。 在一优选实施例中，奥利默森(oblimersen)按上述剂量，间隔3至5 天间断给药。在一最优选的实施例中，奥利默森(oblimersen)按5至 30 mg/kg/每剂量，间隔3至14天间断给药。本发明根据所使用的特定 Bcl-2反义低(聚)核苷酸，或特定的给药方式，或Bcl-2反义低(聚)核苷 酸给药同时配合其他治疗，例如癌症治疗药剂，设想了其他的优选治疗 方案。可以在一次或多次治疗期间完成间断给药。
给药和时间周期 本发明提供了低聚物给药和给药周期的方法和组合物，该 低聚物在上述预治疗实施后给药。迄今，研究中已经采用低聚物包括治 疗癌症的Bcl-2反义低(聚)核苷酸的，按日剂量给药对患者进行治疗，例 如，以14或21天为周期给予Bcl-2反义低(聚)核苷酸治疗，随后从第 14天至21天，在剩余7天内实施传统疗法，例如方文射治疗或化学治疗。 尽管这些研究结果令人鼓舞，但是，根据本发明的方法治疗携带异种移 植肺瘤的老鼠时，即，在间断大剂量给予Bcl-2反义低(聚)核苷酸前实施 X射线预治疗，已经观察到Bcl-2反义低(聚)核苷酸的吸收率得到进一步 提高。因此,在本发明的一实施例中设想， 一个治疗周期包括在预 治疗实施后，按大剂量给予患者一种或多种低聚物，其中，低聚物间隔 2至10天间隔给药。剩余的一至四个星期内，可以进行第二个治疗周期。 可以对患者实施 一 至六个周期或以上的治疗。应理解,本文中公开的本发明原理的变化可以由所属领i或 的技术人员实施,并且,该变更应包括在本发明范围内。以上各文件在此作为参考文献整体引述。
实施例 下文实验中使用的低(聚)核普酸全部为靶向bcl-2的硫代石粦 酸酯低(聚)核苷酸.所使用的低(聚)核苷酸为高性能液体色语(HPLC),于 使用前在消毒盐水中清洗和溶解。
G3139' 5-TCTCCCAGCGTGCGCCAT-3，抗bcl-2(基+l至于+18)。 FAM-G3139F-TCTCCCAGCGTGCGCCAT-3，焚光标记G3139 G3622， 5-TACCGCGTGCGACCCTCT-3，反才及控制
实施例1:荧光标记低(聚)核苷酸的高吸收率，大剂量低(聚)核苷酸间断 治疗携带异种移植肿瘤的老鼠体内的G3139。
体内肿瘤^t型在雄性无胸腺棵鼠腰部注入lx106个细i包 的lmg/mL的Matrigel,以培养PC-3-Bcl-2异种移植胂瘤。当肺瘤平均 尺寸达到65mm3时，随机选择实验鼠，并在7天内按5mg/kg的日剂量 (小剂量)，通过腹腔灌注(IP)对老鼠给药荧光Bcl-2反义低(聚)核苷酸 (FAM-G3139),或分别在第1、 4和7天，以15mg/kg的剂量(大剂 量)间断给药，即，两次给药间隔三天(
图1A)。 荧光标记G3139 4氐(聚)核苷酸的吸收率.在第8和第12天, 解剖小鼠，切除皮下组织和器官。将切除的各组织的一部分(a)进行光 学相干断层扫描(Miles实验室)或(b)冻存管中和速冻液(N2液) 中以进行水冻切片(8-10juM厚度)，或者放置到防脱载玻片(Fisher) 上。使用立体显微镜(Zeiss, 40)和飞点扫描摄像机(QImaging)对荧 光强度进行记录。
图1B中的结果表明，与8天每日以5mg/kg剂量，给予老 鼠低(聚)核苷酸的方案相比，在第1、 4和7天，以15mg/kg的剂量(大 剂量，中间面板)，对老鼠间断给予低(聚)核苷酸的方案，可以提高老 鼠肺瘤组织对荧光标记G3139的吸收率。而在第12天，采取15mg/kg G3139剂量(右侧面板)间断治疗的老鼠，体内的荧光标记G3139的吸 收率更高。
实施例2: X射线预-预治疗加强了携带异种移植肿瘤老鼠的荧光标签低 (聚)核普酸G3139的吸收率，该老鼠间断接受大剂量低(聚)核苷酸治疗。
体内肺瘤模型如例l,在雄性无胸腺棵鼠腰部培养
PC-3-Bcl-2异种移植肿瘤。当肺瘤平均尺寸达到65mm3时，随才几选择实 验鼠，采用5Gy X射线对老鼠进行治疗，随后通过腹腔灌注IP,按每日 5mg/kg(小剂量),连续7天给药，或按15mg/kg(大剂量)，在第1、 4和7 天间断给药FAM-G3139低(聚)核苷酸，或在最后一天，G3139给药后， 进行X射线治疗。(图2A)。 荧光标记G3139低(聚)核苷酸的吸收率。在第11天，解剖 小鼠,切除皮下组织和器官。将切除的各组织的一部分按上例1进行处 理。4吏用立体显樣i镜(Zeiss, 40)和飞点扫描揭/f象才几(QImaging)对荧 光强度进行记录。 图2B显示在一个治疗周期开始时，在5mg/kg G3139给药 前，实施5Gy的X射线预治疗的方案比首先给予5mg/kg G3139,随后 在治疗结束时实施X射线治疗的方案，更能提高肿瘤细胞对荧光标记 G3139的吸收率。 图3显示，在间断给予15mg/kgG3139期间，在一个治疗周 期开始时，对老鼠实施5GyX射线预治疗，可以进一步提高吸收率。
实施例3: X射线预-预治疗延长了焚光标记低(聚)核苷酸的保持率； G3139单剂量治疗携带异种移植肿瘤老鼠，其体内G3139的情况。体内肺瘤才莫型如例l,在雄性无胸A,棵鼠腰部培养 PC-3-Bcl-2异种移植肺瘤。当肺瘤平均尺寸达到65mm4t,随机选择实 验鼠,采用5Gy X射线对右腰携带异种移植肺瘤的老鼠进行预治疗，随后 通过静脉注射,按每日6mg/kg(小剂量)，连续5天给药(左上面板)，或按 10mg/kg(大剂量),在第1、 3和5天(上中面板)间断给药荧光标记G3139 低(聚)核苷酸，或在最后一天，在实施X射线预治疗后，单剂量给药 30mg/kg。(右上面板)；以及未治疗的携带异种移植胂瘤的左腰(下面板 3).各老鼠接受总剂量为30mg/kg的荧光标记G3139。荧光标记G3139低(聚)核普酸的吸收率。在治疗的第8天， 解剖小鼠，切除皮下组织和器官，并采用DAPI对比染色，对核染色进 行内部染色控制。切除的组织如上例l处理，使用立体显微镜(Zeiss, 40)和飞点扫描摄像机(QImaging)对荧光强度进行记录。在各样本上 的三个区域记录信号强度，并采用计算机成像分析系统MCID Elite (成 像研究)量化，并求取平均数，以取得报告强度。图6显示,在第1天采用X射线进行预治疗，随后给予单剂 量30mg/kgG3139的方案，证明不仅有助于提高低(聚)核苷酸的吸收率， 并且在放射治疗和G3139给药后，能在体内存留7天。采取10mg/kg G3139(上中面板)间断给药治疗的老鼠，与采取6mg/kgG3139(左上面 板)连续5天给药治疗的老鼠相比，对荧光标记G3139的吸收率更高。 在未实施X射线敏化治疗的左腰上的肿瘤细胞并无明显的染色。图5显示三组实-睑鼠的肿瘤内的FAM-3139的定量。该图 显示与接受间断给药10mg/kg (隔天给药，总共三个剂量)治疗的老鼠， 以及接受连续5天每日给药6mg/kg治疗的老鼠相比，首先接受X射线 治疗，随后给予单剂量30mg/kg FAM-3139治疗的老鼠，其组织对药物 的吸收率最高。
实施例4:间断给药Bcl-2反义低聚物增加了单剂量给药的抗瘤活性。体内肺瘤才莫型:通过皮下注射5至9xl06 A549肿瘤细月包于雄 性无胸腺棵鼠腰部，而培养NSCLC异种移植肿瘤。当肿瘤平均尺寸达 到65mm3时，随机选择小鼠，并在4周内(28天)按每日2.5, 5， 7.5mg/kg 的剂量，4周内(28天)按每日10mg/kg的剂量，4周(总共14天)隔天 给药，4周(总共10天)隔两天给药，以及4周(总共7天)隔三天给 药，以腹腔灌注(IP)的方式灌注G3139。也可采取4周(总共14天)隔 天注射20mg/kg的治疗方式。在30mg/kg和30mg/kg的剂量下，分别隔 两天或隔三天灌注。(图6)。置入后15-55天，检测肿瘤生长情况， 并根据以下公式计算肿瘤体积[(宽度)2 x长度]/2。图7显示，隔曰接 受20mg/kg G3139治疗的老鼠体内的胂瘤生长速度慢于每日接受 10mg/kg(总共280mg/kg)灌注治疗的老鼠体内的肿瘤生长速度。间隔2 至3天，间断接受大剂量灌注治疗的老鼠体内的肿瘤的生长速度慢于每 日接受小剂量治疗的老鼠体内的肿瘤生长速度。对携带异种移植肿瘤的老鼠的成活率进行75天置入后监 测。图8显示，按以上剂量给药的老鼠的成活率百分比。
权利要求
1. 治疗人类肿瘤性疾病或自体免疫疾病的一种方法，包括对病人实施至少一个治疗周期的治疗，其中，所述治疗周期包括i. 一种预治疗的一个有效量，其中预治疗从一种或多种治疗手段中选择，包括放射疗法、声学疗法、热疗和抗肿瘤治疗；并且ii. 一种低聚物的一个有效量提供的低聚物平均峰值血药浓度为6μg/mL至50μg/mL。
2. 权利要求1的方法，其中低聚物从奥利默森(oblimersen)、G4460 和INX-3001中选择。
3. 权利要求l的方法，其中平均峰值血药浓度至少为40jug/mL。
4. 权利要求l的方法，其中平均峰值血药浓度至少为20jug/mL。
5. 权利要求l的方法，其中平均峰值血药浓度至少为15jug/mL。
6. 权利要求1的方法，其中，抗瘤治疗从以下一种或多种治疗中 选择，包括药物治疗和生物治疗。
7. 权利要求1的方法，其中低聚物的给药频率从隔两天、隔三天 或隔四天中选捧。
8. 权利要求1的方法，其中在治疗周期内，预治疗为放射治疗， 于单剂量低聚物给药前一天实施。
9. 权利要求8的方法，其中在治疗周期内，预治疗包括放射治疗， 并在放射治疗当天，以30mg/kg的单剂量给药低聚物。
10. 权利要求1的方法，其中在治疗周期内，预治疗包括按首次 4mg/kg至30mg/kg的剂量,给药低聚物，在此前一天实施放射疗法预治 疗，并至少给予一次随后给药，其中，在给予初始给药一至5天后给予 首次随后给药。
11. 权利要求10的方法，其中低聚物的随后给药包括每日给药 6mg/kg至10mg/kg。
12. 权利要求11的方法，其中低聚物的随后给药包括5天每日给药 6mg/kg/每剂量。
13. 权利要求10的方法，其中低聚物的随后给药为15mg/kg/每剂量。
14. 权利要求13的方法，其中低聚物的随后给药在初始给药两天后。
15. 权利要求10的方法,其中低聚物为奥利默森(oblimersen)。
16. —种治疗人类肺瘤疾病或自体免疫疾病的合成药物，上述疾病 在一治疗周期内通过》文射疗法预治疗，所述合成药物适用于，在每一治疗周期内，对患者给予有效量的奥利默森(oblimersen),使低聚物的 平均峰值血药浓度达到6 ju g/mL至50 iu g/mL。
全文摘要
本发明涉及一种治疗人类增生性疾病的方法，例如由一种目标基因(包括但不限于致癌基因，包括癌症促发基因或抗药基因)过度表达造成的癌症，或自体免疫疾病，或导致疾病更难治愈，该方法是，在给予病患有效量的核苷基合成物抑制基因的表达之前，给予病患有效量的预治疗。该预治疗是放射线疗法中的一种或多种，例如，X射线、质子束、电子束；升温治疗、超声波治疗、化学疗法和生物疗法。该发明也涉及一种需要采用核苷基基因表达抑制剂以治疗一种人类疾病的改进剂量和工序。
文档编号A01N47/00GK101394744SQ200780008029
公开日2009年3月25日 申请日期2007年3月31日 优先权日2006年3月31日
发明者B·D·布朗 申请人:真塔公司