1.本发明涉及一种多功能聚合物诊疗一体化纳米探针、制备方法及应用，属于纳米材料与生物医学工程技术领域。
背景技术：
2.现在临床上用来判断乳腺癌淋巴结转移的常用的无创影像学检查方法主要包括超声、钼靶x线摄片、ct及mri检查等，但这些检查大多都是基于解剖形态结构改变来观察病灶；虽然各有优点，但其面临的不足又导致其应用领域的局限性；因此对早期转移的诊断不够理想，容易导致误诊和漏诊。由此可见，寻求一种能明确诊断乳腺癌淋巴结转移的影像学检查方法就显得尤为重要。
3.目前已有多种成像方法应用到临床研究中；然而不同的成像方法因其原理各不相同，可以获取不同的影像信息，因此具有各自的优缺点。例如mri具有安全、无创、空间分辨率高、不受组织深度限制等优点，但其敏感性低，需要使用对比剂来提高病灶与正常组织之间的成像对比度。pet和spect则具有很高的特异性和灵敏度，但是成像空间分辨率低，给病灶的准确定位带来困难。ct具有较高的空间分辨率，而且不受组织穿透深度的限制，但检测灵敏度较低，且利用x射线成像，具有辐射损伤和致癌的风险。超声成像则对组织穿透性强、空间分辨率高、安全无创等优点，但是灵敏度和特异性较差。光学成像具有灵敏度高、时间分辨率高、安全等优点，但是成像空间分辨率低、探测深度有限。光声成像集合了光学成像技术的高灵敏度和超声成像技术的高分辨率、高穿透深度的优点，克服了光学成像穿透深度的局限性，使探测深度达到4 cm以上；但不能进行全身及深部组织成像。由此可见，使用单一的成像方法已经不能满足肿瘤及其转移早期诊断的需求，可能导致肿瘤及其转移的漏诊、误判和误诊，从而耽误最佳的治疗时间。
技术实现要素：
4.本发明的目的在于提供一种多功能聚合物诊疗一体化纳米探针、制备方法及应用，以解决现有技术中存在的使用单一成像方法不能满足肿瘤及其转移早期诊断的需求，可能导致肿瘤及其转移的漏诊、误判和误诊的技术问题。
5.为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：本发明提供了一种多功能聚合物诊疗一体化纳米探针，该纳米探针是由plga（聚乳酸-羟基乙酸共聚物）有机分子包载fe3o4纳米颗粒和近红外ii区荧光染料ir-1061得到的纳米微球。
6.进一步地，所述纳米探针的电子粒径为98.4 nm，水合粒径为182 nm。
7.本发明还提供了一种多功能聚合物诊疗一体化纳米探针的制备方法，包括以下步骤：将fe3o4纳米颗粒的二氯甲烷油相溶液与近红外ii区荧光染料ir-1061的二氯甲烷油相溶液混合，超声分散得到fe3o4/ir-1061复合油相；将fe3o4/ir-1061复合油相与plga的二氯甲烷油相溶液混合得到油相混合物；将油相混合物加入到含有pva的水相溶液中，经超声分
散得到水包油乳液，室温搅拌使二氯甲烷完全挥发，得到所述纳米探针的原液。
8.进一步地，所述制备方法，还包括：对所述原液进行分离纯化的步骤。
9.进一步地，所述分离纯化采用磁分离装置进行，所述磁分离装置包含磁铁和镍珠。
10.本发明还提供了前述多功能聚合物诊疗一体化纳米探针在乳腺癌淋巴结转移瘤磁共振成像（mri）、光学成像（oi）、光声成像（pai/）和单光子发射计算机断层成像（spect）中的应用。
11.本发明还提供了前述多功能聚合物诊疗一体化纳米探针在制备乳腺癌淋巴结转移瘤诊断试剂中的应用。
12.本发明还提供了前述多功能聚合物诊疗一体化纳米探针在制备治疗乳腺癌淋巴结转移瘤药物中的应用。
13.相比于现有技术，本发明的多功能聚合物诊疗一体化纳米探针是一种新型自组装的多模态纳米探针，具有良好的胶体稳定性、光学特性和体外光热效应，且无明显的细胞毒性；具有良好的mri/oi/pai/spect多模态成像效果，实现了活体乳腺癌淋巴结转移的精确定位示踪；具有良好的光热治疗效果，能够用于乳腺癌淋巴结转移患者的光热治疗。
附图说明
14.图1 fip nps的电镜图（a）以及对应的粒径统计图（b）；图2 fip nps水合粒径分布图（a）及在水中的水合粒径和电势的稳定性（b）；图3 fip nps及其合成原料的紫外光谱（a）和荧光光谱图（b）；图4 4t1细胞与不同浓度fip nps共孵育24 h后的细胞存活率；图5注射fip nps之前及之后（30 min、2 h、4 h、6 h、8 h）小白鼠腘窝淋巴结转移瘤区域t2wi图像及以上不同时间点转移瘤区域的t2信号强度变化图（插图）；图6注射fip nps之前及之后（1 h、2 h、3 h、6 h、8 h）小白鼠腘窝淋巴结转移瘤区域nir-ii区成像图像（粗白箭头：淋巴结转移瘤，细白箭头：原发肿瘤）及以上不同时间点转移瘤区域的荧光信号强度变化图（插图）；图7注射fip nps之前及之后（1 h、2 h、3 h、6 h、8 h）小白鼠腘窝淋巴结转移瘤区光声成像图像（黑正方形：淋巴结转移瘤，白圆形：原发肿瘤）及以上不同时间点转移瘤区域的光声信号强度变化图（插图）；图8注射
99m
tc标记fip nps之前及之后（1 h、2 h、3 h、6 h、8 h）小白鼠腘窝淋巴结转移瘤区spect成像图像（a，黑箭头：淋巴结转移瘤，白箭头：原发肿瘤）及以上不同时间点转移瘤区域的信号强度变化图（b）；图9不同处理组的小白鼠左侧腘窝淋巴结转移瘤的生长情况及生物发光信号变化图；图10不同处理组别的小白鼠在接受治疗45天后淋巴结转移瘤治疗效果图（a）和肺部转移情况（b）（白箭头：大体标本转移灶，虚线黑圈：病理切片转移灶）。
具体实施方式
15.下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
16.实施例1
fe3o4&ir-1061@plga纳米探针（简称fip nps）的制备：采用单一乳化-溶剂挥发法。在具体实验中，先用移液枪分别取25ml（0.25 mg，10 mg/ml）fe3o4（氯仿油相）和80ml（0.2 mg，2.5 mg/ml）ir-1061（dcm油相），各自加入到1 ml的ep管中，在室温下通风橱内自然挥发。接着，将10 mg plga溶解在500 ml dcm中，并在超声清洗仪中超声2分钟使其充分溶解形成油相（o）；将50 mg pva（0.5%）溶解在10 g 超纯水中，并在超声清洗仪中超声2分钟使其充分溶解形成水相（w）。然后在之前已挥发干的fe3o4和ir-1061 ep管中各加入200 ml dcm，并在超声清洗仪中超声分散2分钟；之后用移液枪将200 ml fe3o4（dcm油相）加入到200 ml ir-1061（dcm油相）中，并在超声清洗仪中超声分散2分钟；所得fe3o4& ir-1061（dcm油相）加入到plga（dcm油相）ep管中，并用100 ml dcm冲洗fe3o4& ir-1061 ep管使洗涤液一并加入plga（dcm油相）ep管中，将所得油相混合物加入到0.5% pva水相ep管中，并用超声波细胞粉碎机超声分散1分钟后成为乳液，之后用吸管将其加入至广口瓶中，同时用锡纸包裹该广口瓶以避光，并在室温磁力搅拌下反应24 h，使dcm完全挥发，得到fe3o4&ir-1061@ plga（fip）原液。
17.将所得fip原液加入自制含有磁铁和镍珠的磁分离装置进行磁分离纯化，首先用吸管将fip原液沿镍珠表面逐滴加入，并静置30 min，以使纯fip纳米探针（fip nps）被磁铁和镍珠吸住，而未被plga包载的游离fe3o4和ir-1061被分离出来；接着将进行磁分离后的原液吸出，并加入同样体积的超纯水冲洗镍珠，并用吸管将洗涤液完全吸出；然后将装有镍珠的ep管从磁分离装置上取下，收集该ep管中纯化后的fip nps溶液，并用移液枪吸出至用锡纸包裹的ep管中，以邻菲罗啉法测定fip nps铁浓度后，放入4
°
c保存备用。
18.实施例2 fip nps的表征：1）fip nps电镜样制备及拍照、粒径测量对实施例1制备的fip nps稀释至合适浓度进行电镜测试，电镜图如图1 (a)所示，粒径统计结果如图1 (b)，表明其平均尺寸为98.4
±
28.5 nm。
19.2）fip nps水合尺寸、电势及稳定性测试a. 取适量fip nps溶液，稀释至合适的浓度后移至比色皿中，不同时间点测量同一样品的粒径和电势，以比较是否有变化。
20.b. 为了探讨fip nps在生物体内的稳定性，特取适量fip nps液，加入到5 ml 10%的fbs中，在不同的时间点测量同一样品的粒径和电势，以观察其是否发生变化。
21.如图2 (a)所示，fip nps在水中的流体力学尺寸为182 nm，尺寸分布图为单峰。如图2(b)所示，fip nps在水中的流体力学电势平均值为-21.2 mv，在15 d内，fip nps的水合粒径基本不变，且在水相中电势变化甚微；此外，上述时间点fip nps在10%的fbs中粒径和电势也变化甚微，与水相中基本相符。
22.3）fip nps紫外光谱和荧光光谱取适量fip nps溶液稀释到一定浓度后转移至比色皿中，用紫外光谱仪和荧光光谱仪测定fip nps溶液的紫外光谱和荧光光谱。
23.如图3(a)所示，通过检测fip nps及其合成原料游离ir-1601的紫外光谱，发现在700~900 nm 的范围内，fip nps有很强的紫外吸收光谱，并且紫外吸收光谱峰值在750 nm处；而在940~1120 nm 的范围内，ir-1061（dcm油相）有很强的紫外吸收光谱，其吸收光谱峰值在1060 nm处。如图3(b)所示，通过检测fip nps及其合成原料游离ir-1601的荧光发射光
谱，发现在808 nm激发光激发下，fip nps荧光发射光谱峰值在1095 nm处，而游离ir-1061（dcm油相）荧光发射光谱峰值在1175 nm处。
24.测试表明：fip nps紫外和荧光光谱相比于游离ir-1061均发生了蓝移。
25.实施例3细胞毒性实验将不同浓度的fip nps分别与小鼠乳腺癌4t1细胞共孵育24 h后，通过噻唑蓝比色法（mtt）对fip nps进行体外细胞毒性研究。
26.图4为4t1乳腺癌细胞与fip nps共孵育24 h后的细胞存活率，由图可以看出，4t1细胞存活率与fip nps浓度存在依赖关系，fip nps浓度越高，细胞存活率越低。但是，即使fip nps浓度为24 mg /ml，4t1细胞的存活率也在70%以上。
27.实验结果显示，较高浓度fip nps对4t1细胞无明显毒性作用。
28.实施例4 fip nps用于乳腺癌淋巴结转移的多模态成像实验1）构建乳腺癌淋巴结转移瘤模型先取对数生长期的4t1-luc小鼠乳腺癌肿瘤细胞，接着将细胞用胰酶消化后，放入离心机用1000 rpm 离心5 min，后弃去上清，用pbs洗3遍，之后加入适量的pbs，调整4t1-luc乳腺癌肿瘤细胞密度在1
×
107个/ ml，后匀速吹打肿瘤细胞悬液，制成单细胞悬液，放于冰上备用。采用75%的乙醇对balb/c小白鼠后肢的足垫进行消毒，接着将已制备好的4t1-luc乳腺癌肿瘤细胞的单细胞悬液吸入到胰岛素注射器中，并将其注射到小白鼠后肢足垫的皮下，注射约40 μl/只，构建小白鼠4t1-luc乳腺癌淋巴结转移瘤模型。
29.2）mr成像实验取1只4t1-luc小白鼠乳腺癌淋巴结转移瘤动物模型，在纳米探针注射前和通过后肢足垫瘤內注射fip nps (含铁量6 mg)后30 min、2 h、4 h、6 h和8 h不同时间点进行被动靶向mri t2wi扫描，由图5可看出，随着时间的延长，该小白鼠腘窝处淋巴结转移瘤区域的t2信号逐渐降低，在注射fip nps后2小时的信号最低，达到最佳的成像效果图，之后时间到8 h内t2信号逐渐恢复。
30.3）光学成像实验取1只4t1-luc小白鼠乳腺癌淋巴结转移瘤动物模型，在纳米探针注射前及通过后肢足垫瘤內注射fip nps (含铁量6 mg)后1 h、2 h、3 h、6 h和8 h不同时间点进行被动靶向nir-ii区成像。由图6可看出，随着时间的延长，该小白鼠腘窝处淋巴结转移瘤区域的荧光信号逐渐增强，在注射fip nps后2小时荧光信号最强，达到最佳的nir-ii区成像效果图，之后时间直至8小时内其荧光信号逐渐降低；与mr成像信号改变基本吻合。
31.4）光声成像实验取1只4t1-luc小白鼠乳腺癌淋巴结转移瘤动物模型，在纳米探针注射前及通过后肢足垫瘤内注射fip nps (含铁量6 mg)后1 h、2 h、3 h、6 h和8 h不同时间点进行被动靶向光声成像。由图7可看出，随着时间的延长，该小白鼠腘窝处淋巴结转移瘤区域的光声信号逐渐增强，在注射fip nps后3小时光声信号最强，达到最佳的光声成像效果图，之后时间直至8小时内其光声信号逐渐降低。
32.5）spect成像实验取1只4t1-luc小白鼠乳腺癌淋巴结转移瘤动物模型，在纳米探针注射前及通过后肢足垫瘤內注射
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tc标记的fip nps (含铁量6 mg)后1 h、2 h、3 h、6 h和8 h不同时间点进行
被动靶向spect成像。由图8可看出，随着时间的延长，该小白鼠腘窝处淋巴结转移瘤区域的信号逐渐增强，在注射
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tc标记的fip nps后3小时信号最强，达到最佳的spect成像效果图，之后时间直至8小时内其信号比较平稳的降低；其与光声成像信号改变趋势基本吻合。
33.实施例5fip nps对活体乳腺癌淋巴结转移瘤的光热治疗实验先将12只18~20 g 的雌性balb/c小白鼠建立4t1-luc乳腺癌淋巴结转移瘤模型。之后随机分为3组，每组4只；分别为单纯fip nps组、生理盐水+ptt组和fip nps+ptt组：其中单纯fip nps组小白鼠先通过后肢足垫处原发肿瘤瘤内注射fip nps溶液（浓度为120 mg/ml）50 μl，不给予激光照射，然后对其接种侧原发肿瘤后肢进行截肢处理；生理盐水+ptt组小白鼠先通过后肢足垫处原发肿瘤瘤内注射生理盐水50 μl，接着对腘窝处淋巴结转移瘤部位给予功率为1.25 w/cm
2 的808 nm激光照射10 min，之后对其接种侧原发肿瘤后肢进行截肢处理；fip nps+ptt组小白鼠先通过后肢足垫处原发肿瘤瘤内注射fip nps溶液（浓度为120 mg/ml）50 μl，接着对腘窝处淋巴结转移瘤部位给予功率为1.25 w/cm
2 的808 nm激光照射10 min，之后对其接种侧原发肿瘤后肢进行截肢处理。之后3组小鼠在同等条件下饲养，每天定期观察小白鼠腘窝淋巴结转移瘤的生长情况和进食、活动及精神状态；每隔4天在小白鼠腹腔内注射底物d-荧光素钠盐100 μl（30 mg/ml），然后采用小动物ivis lumina xrms活体成像系统检测小白鼠腘窝淋巴结转移瘤和全身其他部位有无荧光素酶的生物发光信号，并定量分析和比较各时间点腘窝淋巴结转移瘤的荧光信号强度值。
34.在治疗后第45天，先通过颈椎脱臼法处死各组小白鼠，之后将该小白鼠解剖，取出小白鼠腘窝淋巴结和肺组织，并浸泡于福尔马林固定液中，之后将固定好的组织按照脱水透明、浸蜡与包埋、切片、贴片、烘片、染色、脱水、封片的过程来制作病理切片，切片晾干后，放于病理显微镜下观察组织形态是否有改变。
35.由图9可以发现，随着时间的延长，单纯fip nps组和生理盐水+ptt组小白鼠腘窝淋巴结转移瘤的生长情况相似，转移瘤逐渐长大，其生物发光信号值和范围也相应的增大；但是，fip nps+ptt组腘窝淋巴结转移瘤却逐渐缩小，其生物发光信号值和范围也相应的减小。在第45天时，单纯fip nps组和生理盐水+ptt组转移瘤的生物发光信号值和范围不仅显著增大，而且在单纯fip nps组中有3只，在生理盐水+ptt组中有1只，总共4只小白鼠肺内出现了转移性的生物发光信号；但是，此时fip nps+ptt组转移瘤及其生物发光信号已消失。而且此时，单纯fip nps组和生理盐水+ptt组小白鼠精神营养状态及活动能力极差，呈恶液质表现，转移瘤瘤体中央由于供血不足出现大面积溃烂；相反，fip nps+ptt组小白鼠精神营养状态好，活动自如，如图10（a）。
36.由图10（a）可以得知，小白鼠治疗45天后，单纯fip nps组和生理盐水+ptt组瘤体情况没有太大差别，均已发生大面积溃烂；而fip nps+ptt组瘤体消失，未见明显复发及转移；如图10（b）所示，人为处死各治疗组的小鼠后离体解剖，单纯fip nps组和生理盐水+ptt组大体肺组织标本及h&e染色的病理切片均发现肺部有肿瘤转移，而fip nps+ptt组均未发现肺部有肿瘤转移；与图9情况相符。
37.以上已以较佳实施例公布了本发明，然其并非用以限制本发明，凡采取等同替换或等效变换的方案所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。